Genotoksičnost, odnosno štetno djelovanje pojedinog spoja na genom, i karcinogenost povezane su pojave. Metoda DNA kometa omogućuje procjenu stupnja oštećenja genomske DNK kako u eksperimentu, tako iu eksperimentu znanstvene svrhe, au rješavanju praktičnih problema: procjena utjecaja okoliš ili uvjeti rada, kontrola transplantacijskog materijala tijekom odmrzavanja, u tkivnom inženjerstvu. Oštećenje DNK otkriveno DNK komet testom može ukazivati ​​i na sklonost onkologiji i na promjene povezane s njom. Povećanje oštećenja DNK koje detektiraju DNK kometi karakteristično je za tumorske stanice. I, iako je u desetljećima od svog razvoja metoda postala raširena samo u specijaliziranim područjima, može naći primjenu u dijagnostici i praćenju liječenja raznih bolesti. Prednosti DNA kometa su osjetljivost, mali zahtjevi za količinom materijala, brzi protokol rada, relativna jednostavnost i niska cijena.

Za proučavanje se koristi DNA komet metoda različite vrste stanica, kako u kulturi tako i u uzorcima bioloških tekućina i tkiva. Glavni uvjet za analizu DNK kometa je prijenos stanica tkiva u suspenziju, stoga, prilikom seciranja laboratorijskih životinja, uklonjeni fragmenti organa moraju biti podvrgnuti odgovarajućoj obradi, a stanice sadržane u krvi ili spermi mogu se izravno ispitati. 80% zloćudnih novotvorina je epitelnog porijekla. Epitel izložen i vanjskim i vanjskim utjecajima unutarnje okruženje organizama najprikladniji su za procjenu genotoksičnosti DNA komet metodom. Neinvazivna metoda za dobivanje humanih epitelnih stanica je bris epitela usne šupljine i selekcija eksfolijativnog materijala iz epitela suznog kanala. Oralne epitelne stanice žive 10-14 dana, a prisutnost oštećene DNA u njima ukazuje na nedavnu izloženost genotoksičnom spoju. Studije DNK integriteta oralnog epitela mogu pomoći u praćenju učinaka tvari povezanih s profesionalna djelatnost i prehrambeni proizvodi.

Stanice smještene u agarozu na staklu tretiraju se otopinom za liziranje i, ako je potrebno, enzimima specifičnim za određene poremećaje. Razdvajanje se provodi u alkalnom puferu. DNK izlazi iz stanice i putuje do anode, tvoreći oblak koji se može vidjeti pomoću fluorescentnog mikroskopa. Što je više prekida u DNK, to je izraženije kretanje njezinih fragmenata. Nakon postupka stakalca se neutraliziraju i boje interkalirajućim bojama za vizualizaciju DNK. Elektroforetska pokretljivost DNA procjenjuje se pomoću fluorescentnog mikroskopa. Kada je gotovo cijeli DNK stanice fragmentiran, to je obično mrtva stanica. Ako pojedinačne stanice imaju ovaj stupanj oštećenja genoma, one su isključene iz analize.

Najčešće korišten alkalni DNA komet protokol (odvajanje na pH > 13) omogućuje detekciju jednolančanih lomova, križnih veza u DNA i između DNA i proteina. Korištenje alkalnog tretmana tijekom pripreme uzorka povećava osjetljivost metode, budući da većina genotoksičnih agenasa ne unosi dvolančani prekid u lanac DNA, već stvara jednolančane prekide ili regije s preosjetljivost na lužine. Dodatno, koriste se enzimi koji uvode prekide u regijama DNA sa specifičnim oštećenjima. Formamidopirimidin DNA glikozilaza reže DNA lance u području oksidiranih nukleotida, formamid pirimidina (otvoreni prsten adenina i gvanina) i drugih derivata gvanina; OGG1 detektira oksidirane purine i formamidopirimidine, endonukleaza III detektira oksidirane pirimidine, T4 endonukleaza V prepoznaje pirimidinske dimere, 3-metiladenin DNA glikozilaza II (AlkA) specifična je za 3-metiladenin; a uracil DNA glikozilaza otkriva uracil pogrešno umetnut u DNA. Takvi protokoli obrade materijala mogu biti potrebni za rješavanje specifičnih problema, na primjer, sadržaj oksidiranih pirimidina i T4 mjesta endonukleaze V raste u smrznutim tkivima, dok se drugi poremećaji ne opažaju. Metoda DNA komet s odgovarajućim enzimskim tretmanom može se koristiti za procjenu stanja presatka prije transplantacije.

Jedno od područja kliničke dijagnostike u kojem se koristi DNA komet tehnologija je dijagnostika muške neplodnosti. Zbog strukture spermija, rizik od oštećenja strukture DNK u tim stanicama je povećan, a sustavi popravka ne kompenziraju u potpunosti nastale povrede. Kod muške neplodnosti uočava se povećan stupanj oštećenja DNA spermija. Broj lomova DNA u spermatozoidima normalno doseže ~10 6 - 10 7 po genomu, kako kod ljudi tako i kod laboratorijskih miševa, što je puno više od broja lomova genoma u limfocitima ili stanicama crvene koštane srži. Oplodnja spermijem koji sadrži oštećenu DNA aktivira procese popravka u oociti koji obnavljaju ta oštećenja, ali se povećava rizik od mutacija i kongenitalnih bolesti kod djeteta. Učestalost pobačaja korelira sa stupnjem oštećenja DNK spermija. To je povezano s povećanom učestalošću kongenitalnih bolesti i razvojnih poremećaja u djece s ICSI-jem.

Metoda DNK kometa koristi se ne samo za procjenu stanja DNK, već i za proučavanje procesa popravka u stanicama. U ovom slučaju, stanice koje se proučavaju se uništavaju, a dobiveni homogenat se obrađuje DNK, u koju se prethodno unosi oštećenje određene vrste, u smjesu se dodaju nukleotidi i ATP potrebni za popravak. Sposobnost homogenata da obnovi određena oštećenja koristi se za procjenu aktivnosti sustava popravka u stanicama. Vrsta oštećenja koja se unosi u DNK ovisi o mehanizmu popravka koji se proučava. Na primjer, svjetlom oštećena DNA koja sadrži 8-oksoguanin koristi se za procjenu popravka ekscizijom baze, a DNA ozračena UV-om koja sadrži pirimidinske dimere koristi se za popravak ekscizijom nukleotida. Jednolančani prekidi uvode se obradom s vodikovim peroksidom, X-zrakama ili gama zračenjem, alkilacija DNA provodi se obradom s metil metansulfonatom. Za proučavanje popravka ekscizijom nukleotida koristi se procjena nakupljanja lomova DNA kada se blokiraju polimeraze uključene u ovaj proces pomoću afidokolina ili arabinozida citozina u kombinaciji s hidroksiureom.

Analiza ekspresije gena povezanih s popravkom ne mora uvijek biti objektivan pokazatelj stanja DNA u stanicama; stoga metoda DNA kometa omogućuje dobivanje vrijednih Dodatne informacije. Povećana aktivnost sustava za popravak ukazuje ne samo na to da su stanice otpornije na oštećenje genoma, već i na to da su izložene genotoksičnom agensu, uslijed čega se aktivira sinteza proteina uključenih u popravak. Dodatak prehrani s Q10, vitaminom C u sporo otapajućim kapsulama, povećava aktivnost popravljanja baze ekscizije. Sličan se učinak opaža ako se umjesto lijekova koristi voće i povrće bogato antioksidansima. Time se smanjuje aktivnost sustava za popravak ekscizije nukleotida, jer on više nije potreban.

Mikronukleus test izravan je pokazatelj karcinogenosti, ICH smjernice preporučuju njegovu upotrebu u kombinaciji s DNK kometa. Metoda DNA kometa može se kombinirati s fluorescentna hibridizacija FISH kako bi se utvrdilo utječu li promjene na određene regije genoma. Za analizu velikog broja DNK perjanica dobivenih kao rezultat postupka DNK kometa. preporučuju se automatizirana rješenja. Time će se smanjiti subjektivnost procjene i točnije procijeniti veličina i oblik nastalih perjanica, što je posebno važno s obzirom na potrebu prikupljanja podataka o velikom broju perjanica u svakom preparatu. Comet DNA može se koristiti kao metoda za kliničku dijagnostiku iu istraživačke svrhe – za procjenu genotoksičnosti pojedinog spoja.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Nedavni napredak u ispitivanju genotoksičnosti in vivo: predviđanje karcinogenog potencijala korištenjem kometnog i mikronukleusnog testa na životinjskim modelima / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - Str. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epitelne stanice kao alternativne ljudske biomatrice za ispitivanje kometa / Front Genet. - 2014. V5. broj 386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O "Neill Gaivão I, Collins A. Comet assay za mjerenje popravka DNA: pristup i primjene / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Izvor i značaj oštećenja DNA u ljudskim spermatozoidima; komentar o dijagnostičkim strategijama i slamnim zabludama / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. N.8. - Str. 475-85.

Procjena utjecaja gama zraka na DNA limfocita metodom DNA komet. Mikroskopske fotografije (A) i obrađene slike (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Evaluation of the Comet Assay for Assessing the Dose-Response Relationship of DNA Šteta izazvana ionizirajućim zračenjem / Int. J. Mol. sci. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.

Učinak vodikovog peroksida na DNK spermija školjkašaHoromitilov zbor

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Procjena genomskog integriteta u spermi Choromytilus chorus (Molina, 1782) ispitivanjem kometa / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - Str.36-44.

Metoda jednostanične gel elektroforeze ili DNA komet metoda je vrlo osjetljiva i pruža visoku pouzdanost dobivenih rezultata, ujedno je relativno jednostavna i brza za izvođenje, a također je međunarodno standardizirana (OECD br. 489). Ova metoda najviše obećava za rješavanje sljedećih problema:

Biomonitoring ljudi i okoliša, odnosno utvrđivanje posljedica inducirane mutageneze kada osoba dođe u kontakt s ksenobioticima (lijekovi, aditivi u hrani, pesticidi, parfemi i kozmetika, kemikalije za kućanstvo, kao i najčešći vodeni, zračni i industrijski opasnosti, nanomaterijali);

Istraživanja u području onkologije;

Studije sustava za popravak DNK;

Metoda se temelji na registraciji različite pokretljivosti u konstantnom električnom polju oštećene DNA i/ili DNA fragmenata pojedinačnih liziranih stanica, zatvorenih u tankom agaroznom gelu na standardnom stakalcu. Istodobno, stanična DNA migrira, stvarajući elektroforetski trag koji vizualno nalikuje "repu kometa", čiji parametri ovise o stupnju oštećenja DNA. Nakon završetka elektroforeze stakalca se boje i analiziraju pomoću fluorescentne mikroskopije.

Snimanje slike i obrada podataka provodi se pomoću hardversko-softverskog kompleksa koji uključuje visokoosjetljivu kameru u kombinaciji s mikroskopom i specijalizirani softver.

Univerzalni inteligentni softver uključen u ovaj kompleks pruža:

Automatizirana analiza slika DNA kometa "jedan klik", uključuje sve osnovne mjerne parametre uključujući % DNK u repu kometa;

- visoka ponovljivost;

Analiza parametara DNK kometa provodi se iu "stvarnom vremenu" i iz pohranjenih digitalnih slika;

Program obrađuje podatke i prikazuje ih u obliku protokola u skladu s međunarodnim zahtjevima GLP-a;

Analiza i usporedba podataka;

Program je u potpunosti validiran i u skladu s međunarodnim GLP zahtjevima. Ima hijerarhijski pristup i sustav zaštite podataka.

Komplet uključuje:

1. Luminescentni biomedicinski mikroskop Nikon Eclipse Ni-E.

2. Sustav epi-fluorescentne rasvjete od 50 W, kompleti filter-dihroičnih ogledala-filtara za DAPI, FITC, TRITC boje.

3. Jednobojna CCD IEEE1394 FireWire kamera za luminiscenciju. Basler Scout scA1300-32fm. Veličina piksela - 3,75 µm x 3,75 µm. Rezolucija - 1296 px x 966 px. Veličina senzora 1/3 inča. Matrica - Sony. Prijenos podataka preko brzog porta - 1394 BUS. Brzina kadrova pri maksimalnoj rezoluciji - 32 sličice / sek. Omogućuje rad s objektima u stvarnom vremenu

4. Comet Assay IV - programski paket za Windows s generatorom proračunskih tablica za Microsoft Excel, za rad s monokromatskom CCD IEEE1394 FireWire video kamerom u stvarnom vremenu (mjerenja i analize su mogući i na video streamu i na fotografijama), uputa priručnik i CD za instalaciju i provjeru valjanosti programa.

5. Jednogodišnja licenca za četiri korisnika.

6. Učenje na daljinu putem Internet mreže od četiri korisnika.

Dodatno u ponudi:

1. Operater podataka za korištenje Comet Assay IV u XML verzijama baza podataka za pretraživanje, filtriranje i izdvajanje podataka i reviziju kroz sigurnu Oracle bazu podataka spremljenu u MS Excel formatu proračunske tablice. Uključuje mogućnost pregledavanja automatski spremljenih slika, potpisa, arhiviranih podataka i podataka automatske revizije. Dodatno uključuje mogućnost izvoza nepotpisanih i digitalno potpisanih podataka u XML format. Uključuje samo Crypto-Key-Prove za pregled digitalno potpisanih podataka u različitim formatima.

2. Pristup upravitelja GLP sustavu. Access Manager je program za kontrolu i upravljanje pristupom zaposlenika bazama podataka. Sustav unificiran za PI genetsku toksikologiju. Uključuje sveobuhvatnu reviziju sustava. Eksterna revizija. Administracija korisničkih računa i korisničkih aktivnosti vezanih uz programe, pristup, lozinke, revizije itd. Koristi Oracle za sigurnu zaštitu korisnika i podataka revizije. Potpuna usklađenost s konačnim pravilima FDA 21 CFR Part 11 za elektroničke zapise i elektroničke potpise.

3. Obuka jednog korisnika temeljena na instrumentima Perceptive u Velikoj Britaniji

Metoda se sastoji u tome da se iz biološkog preparata montiranog na fluorescentni mikroskop s video kamerom u računalo unosi slika s kometolikim objektima - "kometima", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih točaka različite svjetline. Potom se ti "kometi" traže na snimci, izdvaja im se kontura uz definiranje granica "glave" i "repa", te se radi mikroskopska morfometrija. Prije traženja "kometa" na slici, optimiziraju se razine svjetline slike i izvodi se niskopropusno filtriranje kako bi se pojedinačne točke "kometa" kombinirale u mutna područja. Zatim se provodi segmentacija rezultirajuće slike na temelju praga svjetline, definiranog kao pomak u odnosu na pozadinu, pronalaženje kontura "kometa" ispunjavanjem ograničenog područja "sa sjemenom", gdje je sjeme proizvoljna točka koja pripada "komet", pronalaženje središta glave svakog "kometa", određivanjem težišta točaka s intenzitetom sjaja blizu maksimalnog. Definiranje virtualne granice "glave" i "repa" provodi zrcalna refleksija raspodjele intenziteta sjaja točaka prednjeg dijela glave kometa, zatim se provodi mikroskopska morfometrija "kometa" mjerenjem: duljine "kometa", "repa", promjera Glava". Zatim se izračuna postotak DNK u cijelom "kometu", u "repu" i mjere oštećenja DNK. Ove se operacije provode automatski, istovremeno na svim "kometima" u nizu slika. Tehnički rezultat je povećanje točnosti i brzine obrade i analize slika "kometa".

Metoda obrade i analize slika kometolikih objekata dobivenih metodom "DNA-comets" (comet assay ili single cell gel electrophoresis - SCGE), u biološkim preparatima, odnosi se na područje obrade i analize slika objekata - "kometa", a namijenjen je kompjuterizaciji (automatizaciji) procesa morfometrijskih studija u području biomedicine, koji se provode radi određivanja stupnja oštećenja molekula DNA izazvanih različitim čimbenicima iz okoliša, za proučavanje popravka molekula DNA na razini pojedinačnih stanica, za procjenu integralnog integriteta genoma, za određivanje individualne radiosenzitivnosti pacijenata oboljelih od raka koji su podvrgnuti radioterapiji, za bioindikaciju obalnih morskih voda, drugim riječima, za praćenje širokog spektra oštećenja DNA uzrokovanih mutagenim čimbenicima okoliša.

Slike „kometa“ su skup stopljenih i odvojenih fluorescentnih točaka različite svjetline, dobivene gel elektroforezom liziranih pojedinačnih stanica (metoda „DNA-kometa“), stoga ih nije moguće obraditi i analizirati metodama namijenjenim slike običnih (čvrstih) predmeta.

Trenutno se slike "DNK kometa" analiziraju ili vizualnim promatranjem pod fluorescentnim mikroskopom i njihovim razlikovanjem prema stupnju oštećenja DNK ili pomoću računalnih alata za obradu slike.

U vizualnoj analizi (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for the determination of photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), str.44-57) "DNA kometi" su rangirani u pet uvjetnih tipova s ​​odgovarajućom numeričkom vrijednošću od 0 do 4. Stupanj oštećenja DNA izražava se indeksom "DNA kometi" (I dna), određena formulom

I dna =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

gdje je n 0 -n 4 broj "DNA kometa" svake vrste, zbroj izbrojanih "DNA kometa".

Ova metoda obrade i analize je vrlo dugotrajna, subjektivna, ima samo pet stupnjeva diferencijacije "DNK-kometi" i samim time ima nisku točnost, a samim time i nisku pouzdanost rezultata.

Najbliža predloženom tehničkom rješenju je metoda računalne analize slika "DNA kometa", implementirana u softver SCGE-Pro (vidi Chaubery R.C. Computerized Image analysis software for the komet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106) uzet kao prototip. Ova metoda analize "kometa" manje je naporna i posebno je potrebna za objektivnu procjenu njihovih parametara (na primjer, duljina "kometa", duljina "repa", promjer "glave", postotak DNA u "glavi" ili "repu" itd.), koji se koriste kao pokazatelji koji karakteriziraju razinu oštećenja DNA u proučavanim stanicama. Metoda omogućuje pronalaženje "kometa" na slici i izračunavanje njihovih parametara ručno i automatski.

Nedostatak poznate metode je metoda određivanja granica "kometa" pomoću pravokutnog područja, što smanjuje točnost izračuna parametara potrebnih za procjenu oštećenja (osobito ako je oštećenje blago) DNK, jer u ovom slučaju, smetnje koje su u blizini također se mogu pripisati kometu. . Osim toga, ovom metodom analize granica "glave" i "repa" definirana je kao ravna linija, okomita na os "kometa" i dijeli komet na "glavu" i "rep", što uvelike smanjuje točnost izračuna duljine “repa kometa” i postotka DNA u “glavi” iu “repu”.

Tehnički rezultat izuma je povećanje točnosti i brzine obrade i analize slika "kometa" dobivenih metodom "DNA-kometa", uključujući filtriranje, segmentaciju "kometa", isticanje njihove konture s definicijom granica "glave" i "repa", što omogućuje povećanje pouzdanosti rezultata mikroskopske morfometrije potrebne za kompjuterizaciju biometrijskih istraživačkih procesa koji se provode u praćenju širokog spektra oštećenja DNK uzrokovanih različitim mutagenim čimbenicima okoliša.

Tehnički rezultat postiže se time što je metoda obrade i analize slika kometolikih objekata dobivenih metodom "DNK-kometi" koja se sastoji u tome da se unosi slika s kometolikim objektima - "kometima". u računalo iz biološkog preparata instaliranog na fluorescentnom mikroskopu s video kamerom, koji predstavlja skup spojenih i odvojenih fluorescentnih točaka različite svjetline, traže te "komete" na slici, odabiru njihovu konturu s definicijom granice “glave” i “repa” izvršiti mikroskopsku morfometriju, dok se prije traženja “kometa” na slici vrši optimizacija razina svjetline slike i niskopropusno filtriranje kako bi se pojedinačne točke “kometa” spojile u mutna područja , zatim se segmentacija rezultirajuće slike izvodi na temelju praga svjetline, definiranog kao pomak od pozadine, pronalaženja kontura "kometa" ispunjavanjem ograničenog područja "sjemenom", pronalaženja središnje "glave" svakog " komet", definiranjem podjela težišta točaka s intenzitetom sjaja blizu maksimalnog, određivanje virtualne granice "glave" i "repa", zrcaljenjem raspodjele intenziteta sjaja točaka prednjeg dijela " glava kometa”, zatim se provodi mikroskopska morfometrija “kometa” mjerenjem: kometa”, “repa”, promjera “glave” i izračunavanjem postotka DNK u cijelom “kometu”, “u repu” “, mjere oštećenja DNK i mnoge druge parametre koji karakteriziraju stupanj oštećenja DNK ovisno o problemu koji se rješava, a navedene operacije se provode automatski, istovremeno nad svim „kometima” na slici ili nizu slika.

Metoda se provodi izvođenjem niza sljedećih postupaka:

1. Unos u računalo iz biološkog uzorka postavljenog na fluorescentni mikroskop s video kamerom, slike s objektima nalik na komete - "kometima", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih točaka različite svjetline.

2. Optimizacija razina svjetline slike. Nulta svjetlina je pozadina, maksimalna svjetlina je središte glave "kometa".

3. Gaussovo niskopropusno filtriranje (zamućenje) s velikim polumjerom jednakim 1/10 polumjera prosječnog "kometa" provodi se kako bi se pojedinačne točke "kometa" spojile u zamagljena područja. Kako bi se spriječilo spajanje "kometa" koji su blizu jedan drugome, interaktivno se koristi podešavanje radijusa zamućenja.

4. Segmentacija rezultirajućih mutnih područja izvodi se na temelju praga svjetline. Prag se automatski određuje kao pomak u odnosu na pozadinu (nema stranih inkluzija i drugih objekata na slici osim "kometa"), ali se prag može ispraviti interaktivno.

5. Pronalaženje obrisa "kometa" popunjavanjem ograničene površine "semenom", gdje je seme proizvoljna točka koja pripada "kometu".

Pronalaženje središta glave kometa. Za određivanje se mogu koristiti dvije metode: maksimalnom raspodjelom intenziteta sjaja točaka "kometa" duž horizontalne osi ili težištem točaka čiji intenzitet sjaja prelazi 80% od maksimalnog.

Određivanje virtualne granice "glave" i "repa", zrcaljenjem distribucije intenziteta sjaja točaka prednjeg dijela "glave kometa" (prednji dio je dio do prednje granice "glava kometa").

Izvođenje mikroskopske morfometrije "kometa" mjerenjem: duljine "kometa", duljine "repa", promjera "glave" i izračunavanjem postotka DNK u cijelom "kometu", "u repu" “, mjere oštećenja DNK i mnoge druge parametre koji karakteriziraju stupanj oštećenja DNK, ovisno o zadatku koji se rješava.

9. Izlaz vrijednosti dobivenih parametara svakog kometa izvodi se u MS EXCEL tablici za implementaciju korisničkog zadatka, na primjer, za daljnje Statistička analiza ili klasifikacija "kometa" prema stupnju oštećenja strukture DNA.

Dakle, u predloženoj metodi, svako područje kometa određeno je njihovom složenom konturom, što povećava točnost izračunavanja parametara, za razliku od poznate metode, gdje se granice "kometa" određuju pomoću pravokutnog područja, što smanjuje točnost izračuna parametara potrebnih za procjenu oštećenja (osobito ako je oštećenje slabo izraženo) "DNA-kometa", budući da se u tom slučaju smetnje koje su u blizini također mogu pripisati "kometu". Osim toga, u poznatoj metodi, granica "glave" i "repa" definirana je kao ravna linija, okomita na os kometa i koja dijeli komet na "glavu" i "rep". Predložena metoda koristi virtualnu granicu, određenu izračunavanjem središta "glave kometa" i zrcaljenjem distribucije intenziteta sjaja točaka prednjeg dijela "glave kometa". Time se značajno poboljšava točnost izračuna duljine repa kometa i postotka DNK u glavi i repu.

Treba napomenuti da se sve navedene operacije izvode automatski istovremeno na svim "kometima" na slici ili nizu slika.

ZAHTJEV

Metoda obrade i analize slika kometolikih objekata dobivenih metodom "DNA-kometi", koja se sastoji u uvođenju slike kometolikih objekata - "kometa", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih točaka različitih svjetlinu, traženje ovih "kometa" na slici, naglašavanje njihove konture s definicijom granice "glave" i "repa", izvođenje mikroskopske morfometrije, karakterizirano time da prije traženja "kometa" na slici, svjetlina slike razine su optimizirane i niskofrekventno filtriranje za kombiniranje pojedinačnih točaka "kometa" u zamućena područja, zatim se segmentacija rezultirajuće slike izvodi na temelju praga svjetline, definiranog kao odmak od pozadine, pronalaženje kontura "kometa" pomoću ispunjavanje ograničenog područja "sa sjemenom", gdje je sjeme proizvoljna točka, koja pripada "kometu", nalaz središte glave svakog "kometa" određivanjem težišta točaka s intenzitetom sjaja blizu maksimalnog, određivanjem virtualne granice "glave" i "repa" zrcaljenjem distribucije intenziteta sjaja točke prednjeg dijela glave kometa, zatim se provodi mikroskopska morfometrija "kometa" mjerenjem duljine "kometa", "repa", promjera "glave" i izračunavanjem postotka DNK u cijelom "kometu", u "repu" i mjere oštećenja DNK, a navedene operacije se izvode automatski, istovremeno na svim "kometima" u nizu slika.

Članak za natječaj "bio/mol/tekst": Znate li da komete ne proučavaju samo astronomi, već i molekularni biolozi? Njihov rad s prostorom je povezan samo posredno. Gledaju komete kroz mikroskop. Služi kao zvjezdano nebo gel slajd- mikroskopsko staklo presvučeno agarozom sa stanicama koje se proučavaju. To je omogućeno otkrićem 1984. godine metode analize DNK nazvane DNK komet metoda.

O popularnosti u brojkama

Slika 2. Primjeri oštećenja DNK uslijed djelovanja čimbenika različite prirode

Kao što možete vidjeti, "pljačkaši" mogu počiniti ogroman raspon "zločina" i uzrokovati značajnu štetu integritetu DNK. No, u stanici sigurnost DNK čuvaju sustavi za popravak, “iscjelitelji” koji ispravljaju oštećenje molekule uz pomoć posebnih “lijekova” - enzima koji mogu “krpati rane” uzrokovane genotoksikantima. Postoji mnogo enzima za popravak. Trenutno je poznato da ekscizijski popravak oštećenje DNK, tj. u operacijama, kada se mjesto prvo izreže, a zatim ponovno sastavi, sudjeluje 13 enzima!

Međutim, nije sve tako glatko kao što se čini na prvi pogled. Poslovi u "odjelu za popravak" ne završavaju uvijek uspješno, tj. obnavljanje izvorne molekule DNA. Rezultat rada sustava za oporavak može biti nova šteta. Razlog tome je vrlo gusto pakiranje DNA lanaca u jezgri.

Ali što je sa znanstvenicima? Oni djeluju kao "policajci" koji trebaju identificirati "komponente zločina", tj. pronaći "zločinca" i njegove "suučesnike" (odrediti genotoksikante, njihove doze i koncentracije) i utvrditi težinu "zločina" (prepoznati stupanj oštećenja DNA). Upravo u takvim situacijama pomaže DNA komet metoda.

Podrijetlom iz Švedske

Pokušaji s ciljem proučavanja nuklearnih struktura stanice i kvantitativnog određivanja oštećenja DNA lanaca u pojedinačnim stanicama organizama učinjeni su još 1980-ih. XX. stoljeća od strane znanstvenika kao što su Cook i Brazell, Rydberg i Johanson. Međutim, tek su 1984. godine švedski istraživači Ostling i Johanson razvili novu metodu za otkrivanje oštećenja DNK. Oni su primijetili da slike fragmenata DNK koji migriraju u električnom polju nalikuju astronomskim kometima. Postojala je sličnost. "Kometi" koje su dobili znanstvenici iz Švedske imali su glavne karakteristike svemirske "braće": imali su "glavu" i "rep". Odatle je došao tako romantičan naziv - metoda DNK kometa.

Metoda ima niz drugih naziva - gel elektroforeza pojedinačnih (izoliranih) stanica i elektroforeza u mikrogelu . Prvo ime netočno odražava bit analize. Elektroforeza se ne provodi u pojedinačnim stanicama, već u agaroznom gelu, gdje se DNA izolirana iz tih istih stanica pomiče s jednog pola na drugi. Drugo je točno, jer elektroforeza se provodi u agaroznom gelu nanesenom na stakalce. Ali ovaj izraz nije zaživio. Ovi nazivi nisu jako popularni i rijetko se koriste, za razliku od "DNA komet metode".

Čarolija za dobivanje "kometa"

Slika 3. Struktura "kometa".

Laboratorijski "kometi" zanimljivi su objekti. Njihov izgled izravno ovisi o čimbenicima utjecaja, njihovoj snazi ​​i uvjetima analize. Podaci o "kometima" nisu tajna, obavijena tamom, pa se o njihovom sastavu, strukturi i nastanku zna gotovo sve.

U publikaciji iz 1984. Šveđani Ostling i Johanson nazvali su DNK koja je migrirala "repom", a DNK koja je ostala u šupljini "centrom". Sada se praktički ništa nije promijenilo: "komet" se konvencionalno razlikuje po "glavi" i "repu" (slika 3).

Mora se jasno shvatiti da se "komet" ne formira iz stanice živog organizma, već iz njegove DNK. ugrađen u sloj agaroze stanična suspenzija stvara šupljine, koje pritom liza zauzima DNK ovih stanica. Sve daljnje manipulacije u DNA komet metodi provode se s DNK.

“Kometi” nastaju u procesu migracije (kretanja) DNK u električnom polju (kada postoji struja i napon). Što se događa tijekom liza i elektroforeza? Manje biomolekule koje čine stanicu tijekom difuzije "pobjegnu" u otopinu za lizu, za razliku od DNK koja zbog svoje izrazito velika veličina ne može se kretati. Kada se stakalca s DNK podvrgnu elektroforezi, netaknuta DNK formira "glavu kometa", a oštećeni dijelovi molekula počinju "trčati" prema pozitivno nabijenom izvoru struje - anodi (jer je DNK negativno nabijena), tvoreći "rep" ". Da bi se vidjeli dobiveni "kometi", oni se boje fluorescentnim bojama (etidijev bromid, akridin narančasta itd.), a zatim se vizualiziraju pomoću fluorescentnog mikroskopa pri velikom povećanju (slika 4).

Ostling i Johanson pišu sljedeće: “Kad je stanica ugrađena u gel, ona u njemu stvara udubljenje. Nakon lize stanice, njezina DNA zauzima ovo udubljenje. Većina drugih biomolekula lako difundira kroz agarozni gel. Tako gotovo svi izlaze iz šupljine koju je ostavila stanica u otopinu za lizu. Jedina iznimka je DNK, koja zbog svoje velike Molekularna težina ostaje u gelu. - ur.

Slika 4. Slijed koraka DNA komet metode(počevši od vrha u smjeru kazaljke na satu). * - Korak je potreban samo u alkalnoj verziji metode (pH > 13,0) za neutralizaciju NaOH lužine.

Što je jače oštećenje DNK (a stupanj oštećenja ovisi o dozi mutagena), to je “rep kometa” izraženiji. Kao što ste već shvatili, dugačak "rep" nije baš dobar.

Univerzalni vojnik

DNA komet metoda je alat širokog raspona. Uz njegovu pomoć znanstvenici “riješe zločine” vezane uz napad na ljudsko zdravlje i sigurnost okoliša (naravno, sve to kroz proučavanje oštećene DNK). Metoda je stekla takvu popularnost zbog svojih atraktivnih karakteristika - jednostavnosti, brzine, ekonomičnosti i dovoljno visoke osjetljivosti, što omogućuje otkrivanje oštećenja DNK uzrokovana čak i čimbenicima niskog intenziteta (na primjer, niske doze zračenja). Među brojnim metodama za procjenu oštećenja DNA, DNA komet metoda je jedna od najprikladnijih u ovom području. Uz gore navedene prednosti, nadmašuje, primjerice, poznate citogenetske metode (ana-telofazičan, metafazne analize, mikronukleus test), i iz drugih dobrih razloga.

DNA komet metoda omogućuje rad s bilo kojim stanicama koje sadrže DNK, za razliku od mikronukleus testa koji najčešće uključuje stanice krvi ili koštane srži. Ako su anatelofazne i metafazne metode ograničene u popisu utvrđenih kromosomske aberacije, tada DNA komet metoda pruža širok raspon svojih modifikacija, zahvaljujući kojima istraživač može otkriti različita oštećenja DNK: jednostruka, dvostruka oštećenja, alkalno-labilna mjesta, apoptoza i drugi. Upravo te mogućnosti čine ga "univerzalnim vojnikom" i otvaraju put metodi u različitim područjima. znanstveno istraživanje , :

• praćenje okoliša- procjena stanja okoliša prema stupnju oštećenja DNK organizama koji žive na istraživanom području (u pravilu se uspoređuju razine oštećenja DNK jedinki iz kontaminiranog i kontrolnog područja);
• biološki monitoring- proučavanje utjecaja prehrane i drugih čimbenika vanjske okoline na tijelo u smislu stupnja oštećenja DNA, akumulacije oštećenja i popravka;
• genotoksične studije farmakološki pripravci, nove i postojeće kemikalije (kućna kemikalija, pesticidi i dr.);
• klinička istraživanja usmjeren na prenatalnu dijagnozu u fazi intrauterinog razvoja, identificiranje predispozicije za bolesti;
• oznaka učinkovitosti terapija raka i njegova kontrola.

Promjena se uči usporedbom

Promatranje stanja okoliša tzv. praćenje okoliša, pomaže istraživačima da prepoznaju promjene u okolišu i na vrijeme uzbune (osobito u hitnim situacijama, na primjer, u nuklearnoj elektrani Černobil 1986. ili u nuklearnoj elektrani Fukushima Daiichi 2011.). Kod onečišćenja okoliša dobro dođe DNA-comet metoda u kombinaciji s indikatorskim organizmima. Popisi organizama karakterističnih za različite sredine staništa i najosjetljiviji na promjene u stanju okoliša, prilično su ekstenzivni i uključuju vrste od bakterija Escherichia coli i alge iz roda Chlamydomonas i završava višim biljkama ( Lemna minor, Pinus sylvestris), sisavci ( Microtus oeconomus) i, naravno, osoba (slika 5). U DNA komet metodi u pravilu nisu uključeni cijeli organizmi, već njihovi “sastavni dijelovi” - stanice koje su posebno osjetljive na promjene čimbenika okoliša, odnosno tkiva iz kojih se te stanice mogu dobiti. Krvne stanice obično se uzimaju od životinja: eritrocita i limfociti, hemociti(analozi eritrocita u beskičmenjaka), kolomociti(stanice koje obavljaju imunološku funkciju kod glista); u biljkama - stanice meristema, intenzivno dijeljenje tkiva.

Bilješka: U analizi oštećenja DNA mogu se koristiti i cijele jedinke ako su predstavljene jednom stanicom, kao npr. Chlorella vulgaris.

Slika 5. Primjeri indikatorskih organizama korištenih za procjenu stanja okoliša DNA komet metodom.

stranice scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com,functionecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Kako metoda DNK kometa funkcionira u ovom slučaju? Znanstvenici uspoređuju stupanj oštećenja DNK indikatorskih organizama koji žive na proučavanim (kontaminiranim) i kontrolnim (nekontaminiranim) teritorijima: izloženi kontaminiranom tlu, vodi itd., i isti, ali žive u normalnim kontrolnim uvjetima, tj. kada nema utjecaja proučavanog faktora ili je neznatan. Procjena stupnja oštećenja DNA također se provodi u laboratorijima, u strogo kontroliranim uvjetima, kada postoji uzorak organizama izloženih proučavanom čimbeniku ili skupini čimbenika (zračenje, metali, pesticidi), te obavezno kontrolna skupina ( ne doživljavajući ovaj učinak).

Primjer: Dana 11. ožujka 2011., kao posljedica najjačeg potresa u Japanu i tsunamija koji je uslijedio, dogodila se ozbiljna radijacijska nesreća u nuklearnoj elektrani Fukushima Daiichi. Japanski znanstvenici su 2014. godine proveli istraživanje. Odabrali su dva mjesta pogođena nesrećom, jedno s visokom razinom zračenja (2,85 µSv/h) i jedno s niskom razinom (0,28 µSv/h), kao kontrolne. U glistama obitelji Megascolecidae s tih mjesta analiziran je stupanj oštećenja DNA. Pokazalo se da je ovaj pokazatelj znatno veći kod osoba izloženih visokim razinama zračenja nego kod osoba u području s niskom razinom izloženosti.

Scenariji mogu varirati. Stupanj oštećenja DNA u stanicama može se povećati, smanjiti ili ostati nepromijenjen. Povećan stupanj oštećenja DNA u organizmima iz kontaminiranog područja može ukazivati ​​na unutarnje promjene u funkcioniranju stanica koje dovode do brojnih "kvarova" DNA.

Primjeri: Neki metali, ulazeći u tijelo, induciraju reaktivne kisikove vrste (ROS), uzrokujući oštećenje DNA; ionizirajuće zračenje doprinosi stvaranju slobodnih radikala, koji su također "prestupnici" DNK. Djelovanje ultraljubičastih zraka može dovesti do stvaranja dimeri u DNK, prekidajući vezu svojih dvaju lanaca i tako mijenjajući konformaciju molekule.

Smanjeno oštećenje DNK ili nikakva razlika sugerira da su se organizmi nosili s "ugnjetavanjem" genotoksikanata i prilagođena životu u ovim nepovoljni uvjeti. Ta se prilagodba naziva adaptacija. Ali to je sasvim druga priča.

Nasljedstvo je strašna sila

Jeste li čuli za bolesti kao što su sindrom loma kromosoma (sindrom Nijmegen oštećenja), xeroderma pigmentosa i trichothiodystrophy? Javljaju se samo kada su oba roditelja nositelji defektnog gena (slika 6).

U literaturi postoje podaci o mogućnosti primjene DNA komet metode u dijagnostici ovih nasljednih bolesti, što je posebno važno u prenatalnoj fazi, tj. tijekom trudnoće.

Sindrom ozljede u Nijmegenu (Nijmegen sindrom loma, NBS) je bolest povezana s trajnim povredama integriteta DNK. Problem je u tome što gen NBS1 dolazi do mutacije koja se "isključuje" nibrin- protein koji kontrolira popravak uparenih lomova DNK izazvanih zračenjem. Zbog toga su osobe koje pate od ovog sindroma izrazito radiosenzitivne. Božena Novotna s Praškog instituta za eksperimentalnu medicinu u svojoj studiji tvrdi da je metoda DNK kometa izvrsna u identificiranju heterozigotnih nositelja gena NBS1 po nenormalno visoka razina oštećenje DNA lanaca u "kometima" limfocita.

Ništa manje opasni nisu pigmentna kseroderma i trihotiodistrofija. To su ozbiljne ljudske bolesti koje su naslijeđene. U prvom slučaju, s kratkim izlaganjem suncu kod djece na otvorenim dijelovima kože (ruke, vrat, lice), prvo se pojavljuju crvene mrlje, koje se kasnije pretvaraju u izraženu pigmentaciju do stvaranja tumora. Druga bolest se izražava u krhkoj kosi i noktima, mentalnoj retardaciji i anomalijama u strukturi lubanje.

Ove bolesti su ujedinjene kršenjem u radu popravka ekscizije nukleotida. Na temelju uspješnosti popravljanja ekscizije nukleotida u fetalnim stanicama metodom DNA komet moguće je odrediti hoće li dijete oboljeti od ovih bolesti. Slučajevi takve dijagnoze opisani su u literaturi.

Istraživači su se suočili sa zadatkom da prije rođenja otkriju hoće li djeca oboljeti od pigmentne kseroderme i trikotiodistrofije. Pokusi su provedeni u obiteljima u kojima su roditelji nositelji gena xeroderma pigmentosum ( X obitelj) i trihotiodistrofija ( Y obitelj) i već imaju djecu s tim bolestima .

Obitelj X: trudnoća 15 tjedana, majka je nositeljica gena xeroderma pigmentosa, postoji dijete od 3 godine s ovom bolešću.

Obitelj Y: trudnoća 10 tjedana, otac i majka - nositelji gena trichothiodystrophy, dvoje djece s trichothiodystrophy umrlo je u dobi od 22 mjeseca i 6 godina, još jedno - kao posljedica spontanog pobačaja (pobačaja).

Sve su stanice bile izložene ultraljubičastom zračenju 45 minuta.

X Obiteljska studija: Razina oštećenja DNA u fetalnim stanicama, određena DNA komet metodom, bila je blizu razine oštećenja DNA u fibroblastima majke nositeljice, tj. odgovarao razini oštećenja lanca pod normalnim uvjetima popravka ekscizije DNA. Zaključak - plod je zdrav. Ovaj zaključak je potvrđen nakon rođenja normalnog djeteta.

Studija obitelji Y: u stanicama fetusa, u usporedbi s fibroblastima oca i majke, otkriven je defekt u radu ekscizijskog popravka, što je također potvrđeno drugom metodom koja se ne temelji na proučavanju popravka. Otkriva se da je plod bolestan. Nakon razgovora s obitelji odlučeno je da se radi o pobačaju.

Industrija je neprijatelj ljudskog zdravlja

Zdravlje ljudi koji rade u industrijskim pogonima ili žive u ekološki nepovoljnim područjima svakodnevno je u opasnosti. Opasnost ne leži samo u svakodnevnom bliskom kontaktu tijela s genotoksikantima (ionizirajuće zračenje, teški metali i druge kemikalije), već iu vjerojatnosti hitnih situacija (vidi gore navedene primjere), čije posljedice mogu biti katastrofalne za organizam. Promjene u stanju organizma mogu biti vrlo različite, od blagih tegoba poput glavobolje do raka.

Metoda DNK kometa može se koristiti kao obećavajući alat početna evaluacija stanje genoma ljudi koji rade ili žive u ekološki nepovoljnim uvjetima. To znači da se DNA kometi mogu koristiti ne samo u ovim područjima istraživanja, već iu drugim područjima u budućnosti, proširiti mogućnosti korištenja metode u kliničkim istraživanjima, medicini i još mnogo toga.

Primjeri: U Poljskoj je nesreća u tvornici baterija izložila radnike visokim razinama olova i kadmija, što je rezultiralo malim, ali značajnim povećanjem oštećenja DNK u usporedbi sa skupinom ljudi koji nisu iskusili takav stres. Genotoksični učinak plinskih aerosola za zavarivanje koji sadrže teške metale - mangan, krom, nikal, kadmij, kobalt, olovo, molibden, željezo - na DNK leukocita otkriven je kod ljudi čiji je posao dugo bio povezan sa zavarivanjem.

Postoje neke poteškoće

Kako biste pravilno koristili metodu DNA komet, morate “iz viđenja znati” ne samo njezine mogućnosti i prednosti u odnosu na druge metode, već, naravno, i nedostatke, ograničenja i poteškoće na koje morate paziti. Metoda zahtijeva optimizacija lizu, elektroforezu i druge uvjete ovisno o vrsti stanica koje znanstvenik koristi i ciljevima istraživanja.

Obrazloženje: Biljne i životinjske stanice zahtijevaju različite uvjete za oslobađanje DNK, tj. liza. Zbog prisutnosti celulozne stanične stijenke, biljnim stanicama treba više vremena za lizu nego životinjskim stanicama.

Iz prve poteškoće slijedi druga neugodnost: prilagodba metode problemima analize može biti vrlo teška. naporan proces(iako je sama tehnika jednostavna i razumljiva), pogotovo ako nitko nije radio s objektom vaše studije metodom DNK kometa. Dešava se da "podešavanje" metodologije u ovom slučaju zahtijeva puno vremena.

Ponekad ih ima poteškoće u tumačenju rezultati dobiveni prema stupnju oštećenja DNK, budući da se stupanj oštećenja ne može uvijek povezati s dozom faktora utjecaja.

Obrazloženje: Takav problem može biti povezan s nedovoljnom optimizacijom metode, kada se neke vrste oštećenja miješaju s drugima i time iskrivljuju rezultate. Sustavi popravka, koji ispravljaju dio nastalih povreda, također mogu "poremetili" stvarni stupanj oštećenja DNK.

Jedna od najvećih poteškoća može biti usporedba rezultata dobiveni metodom DNA kometa od strane različitih znanstvenika u različitim laboratorijima i istraživačkim institutima. Za procjenu oštećenja DNK koriste se metode s modifikacijama i potpuno drugačijim pokazateljima (na primjer, postotak DNK u "repu kometa" ili duljina "repa").

Obrazloženje: Duljina "repa kometa" je udaljenost na koju je DNK migrirala od "glave" repa. Postotak DNK u repu kometa je količina DNK koja je migrirala u rep, izražena kao postotak. IZ kompletan popis Rezultati oštećenja DNK dostupni su na www.cometassayindia.org.

Ulažu se napori da se standardizira korištenje metode DNK kometa, što će znanstvenicima pomoći u usporedbi rezultata. Na primjer, protokoli i smjernice razvijeni su u studijama genotoksičnosti.

Obrazloženje: Smjernice Federalnog centra za higijenu i epidemiologiju Rospotrebnadzora jasno definiraju ispitne objekte (ljudske stanice) i detaljno opisuju sve faze analize. Prema tim preporukama, metodom DNA komet, kućanske kemikalije i proizvodi od polimernih materijala mogu se testirati na genotoksičnost.

Zaključak

„Tko je naoružan, zaštićen je“ – to je moto rada s DNA komet metodom. Poznavanje prednosti i nedostataka korištenja ovu metodu procjena oštećenja DNK omogućuje vam da majstorski upravljate tijekom rada, izbjegnete "zamke" i dobijete točne rezultate.

DNA komet metoda igra ulogu "čarobnog štapića" u procjeni općeg stanja tijela, u pravilu, na rani stadiji udarac nepovoljni faktori okoliš. Na početno stanje upravo je oštećenje DNA najbrži i stoga jedini mjerljivi odgovor organizma na štetne učinke puno prije pojave promjena na fiziološkoj razini.

Sada znate kako biolozi dobivaju "komete" u laboratorijima i zašto su im toliko potrebni.

Književnost

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Kometni test: osjetljiva metoda za otkrivanje oštećenja DNA u pojedinačnim stanicama. metode. 48 , 46–53;
2. Inge-Vechtomov S.G. Genetika s osnovama selekcije: udžbenik za studente sveuč obrazovne ustanove(3. izdanje, prerađeno i dopunjeno). Sankt Peterburg: N-L, 2015. - 720 str.;
3. Piperakis S.M. (2009). Ispitivanje kometa: kratka povijest. Cell biol. Toxicol. 25 , 1–3;
4. Yarmonenko S.P. Radiobiologija čovjeka i životinja. M.: Više. škola, 2004. - 549 str.;
5. Kuhar P.R. i Brazell I.A. (1976). Karakterizacija nuklearnih struktura koje sadrže superheliknu DNA. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. i Johanson K.J. Procjena jednolančanih prekida u pojedinačnim stanicama sisavaca. U: Mehanizmi popravka DNA / ur. Hanawalt P.C., Friedberg E.C., Fox C.F. NY: Academic, 1978. str. 465–468;
7. Ostling O. i Johanson K.J. (1984). Mikroelektroforetsko istraživanje oštećenja DNA izazvanih zračenjem u pojedinim stanicama sisavaca. Biochem. Biophys. Res. komun. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. i Ferard J.F. (1999). Kometni test u genetskoj ekotoksikologiji: pregled. Okolina. Mol. Mutagen. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Jednostanični gel/komet test: smjernice za in vitro i in vivo genetsko toksikološko testiranje. Okolina. Mol. Mutagen. 35 , 206–221;
10. Filippov E.V. (2014). Korištenje metode "DNA komet" za detekciju i procjenu stupnja oštećenja DNA stanica biljnih, životinjskih i ljudskih organizama uzrokovanih čimbenicima okoliša (prikaz) . Znanost i obrazovanje. 2 , 72–78;
11. Collins A.R. (2004). Kometni test za oštećenje i popravak DNK: principi, primjene i ograničenja. Mol. biotehnologija. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014.). Radioaktivnost iz okoliša oštećuje DNK kišnih glista u prefekturi Fukushima u Japanu. Eur. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005.). Izaziva li izloženost uranu genotoksičnost u teleosteanu Danio rerio? Prvi eksperimentalni rezultati. Radioprotekcija. 40 , 175–181;
14. Kagan M.Yu., Shulakova N.S., Tumirova R.A., Zlodeeva E.A., Reznik N.V. (2012). Nijmegenov sindrom (kliničko promatranje). Pedijatrijska farmakologija. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Comet test kao test popravka za prenatalnu dijagnozu Xeroderma pigmentosum i trichothiodystrophy. J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003.). Genotoksični učinci profesionalne izloženosti olovu i kadmiju. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Tomilin N.V., Petrov A.N., Filko O.A., Khrabrova A.V., Solovieva N.E., Ivanova T.M. i dr. (2015). Procjena stupnja oštećenja nuklearne DNK u perifernim krvnim stanicama ljudi profesionalno povezanih s djelovanjem teških metala. Zdravstvena organizacija. 16 , 383–392;
18. Procjena genotoksičnih svojstava DNA komet metodom in vitro: Smjernice . M.: federalni centar higijene i epidemiologije Rospotrebnadzor, 2010.- 16 str.