Genotoxicita, teda škodlivý účinok konkrétnej zlúčeniny na genóm, a karcinogenita sú súvisiace javy. Metóda DNA kométy umožňuje posúdiť stupeň poškodenia genómovej DNA v experimente aj v vedecké účely a pri riešení praktických problémov: posudzovanie vplyvu životné prostredie alebo pracovné podmienky, kontrola transplantačného materiálu počas rozmrazovania, v tkanivovom inžinierstve. Poškodenie DNA zistené kométovým testom DNA môže poukazovať na predispozíciu k onkológii aj na zmeny s ňou spojené. Pre nádorové bunky je charakteristické zvýšenie poškodenia DNA detekovaného DNA kométami. A hoci sa metóda za desaťročia od svojho vývoja rozšírila len v špecializovaných oblastiach, môže nájsť uplatnenie v diagnostike a monitorovaní liečby rôznych ochorení. Výhodami DNA komét sú citlivosť, nízke nároky na množstvo materiálu, rýchly pracovný protokol, relatívna jednoduchosť a nízka cena.

Na štúdium sa používa metóda DNA kométy rôzne druhy buniek, ako v kultúre, tak aj vo vzorkách biologických tekutín a tkanív. Hlavnou požiadavkou na analýzu DNA komét je prenos tkanivových buniek do suspenzie, preto pri pitve laboratórnych zvierat musia byť odstránené fragmenty orgánov podrobené vhodnému spracovaniu a bunky obsiahnuté v krvi alebo spermiách môžu byť vyšetrené priamo. 80 % malígnych novotvarov je epitelového pôvodu. Epitel vystavený vonkajším aj vonkajším vplyvom vnútorné prostredie organizmy sú najvhodnejšie na hodnotenie genotoxicity metódou DNA kométy. Neinvazívnou metódou na získanie ľudských epitelových buniek je náter z epitelu ústnej dutiny a výber exfoliačného materiálu z epitelu slzného kanálika. Orálne epiteliálne bunky žijú 10-14 dní a prítomnosť poškodenej DNA v nich naznačuje nedávnu expozíciu genotoxickej zlúčenine. Štúdie integrity DNA ústneho epitelu môžu pomôcť pri monitorovaní účinkov súvisiacich látok odborná činnosť a produkty na jedenie.

Bunky umiestnené v agaróze na skle sa ošetria lyzačným roztokom a v prípade potreby enzýmami špecifickými pre určité poruchy. Separácia sa uskutočňuje v alkalickom pufri. DNA opúšťa bunku a cestuje k anóde, pričom vytvára oblak, ktorý je možné vidieť pomocou fluorescenčného mikroskopu. Čím viac zlomov sa vyskytuje v DNA, tým výraznejší je pohyb jej fragmentov. Po zákroku sa sklíčka neutralizujú a zafarbia interkalačnými farbivami na vizualizáciu DNA. Elektroforetická mobilita DNA sa hodnotí pomocou fluorescenčného mikroskopu. Keď je prakticky celá DNA bunky fragmentovaná, je to zvyčajne mŕtva bunka. Ak jednotlivé bunky majú tento stupeň poškodenia genómu, sú vylúčené z analýzy.

Najčastejšie používaný protokol alkalickej DNA kométy (separácia pri pH > 13) umožňuje detekciu jednovláknových zlomov, krížových väzieb v DNA a medzi DNA a proteínmi. Použitie alkalického spracovania počas prípravy vzorky zvyšuje citlivosť metódy, pretože väčšina genotoxických činidiel nezavádza dvojvláknový zlom v reťazci DNA, ale vytvára jednovláknové zlomy alebo oblasti s precitlivenosť na alkálie. Okrem toho sa používajú enzýmy, ktoré zavádzajú zlomy v oblastiach DNA so špecifickým poškodením. Formamidopyrimidín DNA glykozyláza štiepi reťazce DNA v oblasti oxidovaných nukleotidov, formamidových pyrimidínov (adenín a guanín s otvoreným kruhom) a iných derivátov guanínu; OGG1 deteguje oxidované puríny a formamidopyrimidíny, endonukleáza III deteguje oxidované pyrimidíny, T4 endonukleáza V rozpoznáva pyrimidínové diméry, 3-metyladenín DNA glykozyláza II (AlkA) je špecifická pre 3-metyladenín; a uracil DNA glykozyláza deteguje uracil chybne vložený do DNA. Takéto protokoly spracovania materiálu môžu byť potrebné na vyriešenie špecifických problémov, napríklad obsah oxidovaných pyrimidínov a T4 miest endonukleázy V sa zvyšuje v zmrazených tkanivách, zatiaľ čo iné poruchy nie sú pozorované. Na posúdenie stavu štepu pred transplantáciou možno použiť metódu DNA kométy s príslušným enzýmovým ošetrením.

Jednou z oblastí klinickej diagnostiky, v ktorej sa využíva technológia DNA komét, je diagnostika mužskej neplodnosti. V dôsledku štruktúry spermií sa zvyšuje riziko poškodenia štruktúry DNA v týchto bunkách a opravné systémy úplne nekompenzujú vzniknuté porušenia. Pri mužskej neplodnosti sa pozoruje zvýšený stupeň poškodenia DNA spermií. Počet zlomov DNA v spermiách normálne dosahuje ~106 - 107 na genóm, a to u ľudí aj u laboratórnych myší, čo je oveľa viac ako počet zlomov v genóme v lymfocytoch alebo bunkách červenej kostnej drene. Oplodnenie spermiou obsahujúcou poškodenie DNA aktivuje reparačné procesy v oocyte, ktoré tieto poškodenia obnovia, ale zvyšuje sa riziko mutácií a vrodených chorôb u dieťaťa. Frekvencia potratov koreluje so stupňom poškodenia DNA spermií. S tým súvisí zvýšený výskyt vrodených chorôb a vývojových porúch u detí s ICSI.

Metóda DNA kométy sa používa nielen na hodnotenie stavu DNA, ale aj na štúdium procesov opravy v bunkách. V tomto prípade sa skúmané bunky zničia a výsledný homogenát sa spracuje DNA, do ktorej sa predbežne zavedie poškodenie určitého typu, do zmesi sa pridajú nukleotidy a ATP potrebné na opravu. Schopnosť homogenátu obnoviť určité poškodenie sa používa na posúdenie aktivity reparačných systémov v bunkách. Typ poškodenia, ktoré je zavedené do DNA, závisí od toho, ktorý opravný mechanizmus sa študuje. Napríklad DNA poškodená svetlom obsahujúca 8-oxoguanín sa používa na hodnotenie opravy excíziou bázy a DNA ožiarená UV žiarením obsahujúca pyrimidínové diméry sa používa na opravu excíziou nukleotidov. Jednovláknové zlomy sa zavádzajú pôsobením peroxidu vodíka, röntgenovým alebo gama žiarením, alkylácia DNA sa uskutočňuje pôsobením metylmetánsulfonátu. Na štúdium opravy nukleotidovej excízie sa používa hodnotenie akumulácie zlomov DNA pri blokovaní polymeráz zapojených do tohto procesu pomocou afidocolínu alebo arabinozidového cytozínu v kombinácii s hydroxymočovinou.

Analýza expresie génov spojených s opravou nemusí byť vždy objektívnym indikátorom stavu DNA v bunkách, preto metóda DNA kométy umožňuje získať hodnotný Ďalšie informácie. Zvýšená aktivita reparačných systémov naznačuje nielen to, že bunky sú odolnejšie voči poškodeniu genómu, ale aj to, že sú vystavené genotoxickému činidlu, v dôsledku čoho sa aktivuje syntéza proteínov zapojených do opravy. Doplnok stravy s Q10, vitamínom C v pomaly sa rozpúšťajúcich kapsulách, zvyšuje reparačnú aktivitu bázy. Podobný účinok sa pozoruje, ak sa namiesto liekov použije ovocie a zelenina bohatá na antioxidanty. To znižuje aktivitu systému opravy nukleotidovej excízie, pretože to už nie je potrebné.

Mikronukleárny test je priamym indikátorom karcinogenity, smernice ICH odporúčajú jeho použitie v kombinácii s DNA kométy. Metódu DNA kométy možno kombinovať s fluorescenčná hybridizácia FISH na určenie, či zmeny ovplyvňujú určité oblasti genómu. Na analýzu veľkého počtu oblakov DNA získaných ako výsledok postupu DNA kométy. odporúčajú sa automatizované riešenia. Tým sa zníži subjektivita posudzovania a presnejšie sa posúdi veľkosť a tvar výsledných vlečiek, čo je dôležité najmä vzhľadom na potrebu zberu údajov o veľkom počte vlečiek v každom prípravku. Kométnu DNA možno použiť ako metódu pre klinickú diagnostiku a pre výskumné účely – na posúdenie genotoxicity konkrétnej zlúčeniny.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Nedávne pokroky v testovaní genotoxicity in vivo: predikcia karcinogénneho potenciálu pomocou kométového a mikronukleového testu na zvieracích modeloch / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - S. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epitelové bunky ako alternatívne ľudské biomatrice pre kométový test / Front Genet. - 2014. V5. č. 386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O "Neill Gaivão I, Collins A. Comet assay to measurement DNA repair: approach and applications / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Zdroj a význam poškodenia DNA v ľudských spermiách; komentár k diagnostickým stratégiám a slamovým klamom / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. N.8. - S. 475-85.

Hodnotenie vplyvu gama lúčov na DNA lymfocytu metódou DNA kométy. Mikrofotografie (A) a spracované snímky (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Hodnotenie kométového testu na posúdenie vzťahu medzi dávkou a odozvou DNA Poškodenie spôsobené ionizujúcim žiarením / Int. J. Mol. sci. - 2013. - V.14. N.11. - S.22449-22461.

Účinok peroxidu vodíka na DNA spermií mäkkýšovChoromytilus chorus

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Hodnotenie genomickej integrity v spermiách Choromytilus chorus (Molina, 1782) kométovým testom / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - S.36-44.

Metóda jednobunkovej gélovej elektroforézy alebo metóda DNA kométy je vysoko citlivá a poskytuje vysokú spoľahlivosť získaných výsledkov, zároveň je relatívne jednoduchá a rýchla na vykonanie a je aj medzinárodne štandardizovaná (OECD č. 489). Táto metóda je najsľubnejšia na riešenie nasledujúcich problémov:

Biomonitoring človeka a životného prostredia, teda zisťovanie dôsledkov vyvolanej mutagenézy pri kontakte človeka s xenobiotikami (lieky, prídavné látky v potravinách, pesticídy, parfumy a kozmetika, chemikálie pre domácnosť, ako aj najbežnejšie vodné, vzduchové a priemyselné nebezpečenstvá, nanomateriály);

Výskum v oblasti onkológie;

Štúdie systémov na opravu DNA;

Metóda je založená na registrácii rozdielnej pohyblivosti v konštantnom elektrickom poli poškodenej DNA a/alebo fragmentov DNA jednotlivých lyzovaných buniek, uzavretých v tenkom agarózovom géli na štandardnom podložnom sklíčku. Súčasne bunková DNA migruje a vytvára elektroforetickú stopu vizuálne pripomínajúcu „chvost kométy“, ktorej parametre závisia od stupňa poškodenia DNA. Po dokončení elektroforézy sa sklíčka zafarbia a analyzujú pomocou fluorescenčnej mikroskopie.

Získavanie obrazu a spracovanie údajov sa vykonáva pomocou hardvérovo-softvérového komplexu, ktorý zahŕňa vysoko citlivú kameru kombinovanú s mikroskopom a špecializovaný softvér.

Univerzálny inteligentný softvér zahrnutý v tomto komplexe poskytuje:

Automatizovaná analýza obrazu komét DNA „jedným stlačením“ zahŕňa všetky základné parametre merania vrátane % DNA v chvoste kométy;

- vysoká reprodukovateľnosť;

Analýza parametrov DNA komét sa vykonáva v režime „real time“ a z uložených digitálnych snímok;

Program spracováva údaje a zobrazuje ich vo forme protokolu v súlade s medzinárodnými požiadavkami SLP;

Analýza a porovnávanie údajov;

Program je plne validovaný a je v súlade s medzinárodnými požiadavkami SLP. Má hierarchický prístup a systém ochrany údajov.

Súprava obsahuje:

1. Luminiscenčný biomedicínsky mikroskop Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50W epi-fluorescenčný osvetľovací systém, súpravy filtrov a dichroických zrkadlových filtrov pre farbivá DAPI, FITC, TRITC.

3. Monochromatická CCD IEEE1394 FireWire kamera pre luminiscenciu. Basler Scout scA1300-32fm. Veľkosť pixelov – 3,75 µm x 3,75 µm. Rozlíšenie – 1296 px x 966 px. Veľkosť snímača 1/3 palca. Matrix - Sony. Prenos dát cez vysokorýchlostný port - 1394 BUS. Snímková frekvencia pri maximálnom rozlíšení - 32 snímok / s. Poskytuje prácu s objektmi v reálnom čase

4. Comet Assay IV - softvérový balík pre Windows s tabuľkovým generátorom pre Microsoft Excel, pre prácu s monochromatickou CCD IEEE1394 FireWire videokamerou v reálnom čase (merania a analýzy sú možné na video streame aj na fotografiách), návod manuál a CD na inštaláciu a overenie programu.

5. Jednoročná licencia pre štyroch používateľov.

6. Dištančné vzdelávanie prostredníctvom internetovej siete štyroch používateľov.

Okrem toho ponúka:

1. Dátový operátor na používanie Comet Assay IV v XML verziách databáz na vyhľadávanie, filtrovanie a extrakciu dát a auditovanie cez zabezpečenú databázu Oracle uloženú vo formáte MS Excel na prácu s tabuľkami. Zahŕňa možnosť zobraziť automaticky uložené obrázky, podpisy, archivované údaje a údaje automatického auditu. Okrem toho obsahuje možnosť exportovať nepodpísané a digitálne podpísané údaje do formátu XML. Zahŕňa samotný Crypto-Key-Prove na zobrazenie digitálne podpísaných údajov v rôznych formátoch.

2. Manažérsky prístup do systému SLP. Access Manager je program na kontrolu a správu prístupu zamestnancov k databázam. Systém zjednotený pre genetickú toxikológiu PI. Zahŕňa komplexný audit systému. Externý audit. Správa používateľských účtov a používateľských aktivít súvisiacich s programami, prístupmi, heslami, revíziami atď. Používa Oracle na bezpečnú ochranu používateľov a auditovanie údajov. Úplný súlad s konečnými pravidlami FDA 21 CFR Part 11 pre elektronické záznamy a elektronické podpisy.

3. Školenie pre jedného používateľa založené na nástrojoch vnímania v Spojenom kráľovstve

Metóda spočíva v tom, že z biologického preparátu namontovaného na fluorescenčnom mikroskope s videokamerou sa do počítača vloží obraz s objektmi podobnými kométe – „kométami“, ktoré sú súborom zlúčených a oddelených fluorescenčných bodov rôznej jasnosti. Potom sa tieto „kométy“ vyhľadajú na obrázku, rozlíši sa ich obrys s vymedzením hraníc „hlavy“ a „chvosta“ a vykoná sa mikroskopická morfometria. Pred vyhľadávaním "komét" v obraze sa optimalizujú úrovne jasu obrazu a vykonáva sa dolnopriepustná filtrácia, aby sa jednotlivé body "komét" spojili do neostrých oblastí. Potom sa uskutoční segmentácia výsledného obrazu na základe prahu jasu, definovaného ako odsadenie od pozadia, nájdenie kontúr „komét“ vyplnením ohraničenej oblasti „semenom“, kde semienko je ľubovoľný bod patriaci k "kométy", nájdenie stredu hlavy každej "kométy", určením ťažiska bodov s intenzitou žiary blízkou maximu. Definícia virtuálnej hranice "hlavy" a "chvosta" sa vykonáva pomocou zrkadlový odraz rozloženie intenzít žiary bodov prednej časti hlavy kométy, potom sa vykoná mikroskopická morfometria „komét“ meraním: dĺžky „kométy“, „chvosta“, priemeru "hlavy". Potom sa vypočíta percento DNA v celej "kométe", v "chvoste" a miery poškodenia DNA. Tieto operácie sa vykonávajú automaticky, súčasne na všetkých "kométach" v sérii obrázkov. Technickým výsledkom je zvýšenie presnosti a rýchlosti spracovania a analýzy snímok „komét“.

Metóda spracovania a analýzy obrazov komét podobných objektov získaných metódou "DNA-comets" (kométový test alebo jednobunková gélová elektroforéza - SCGE), v biologických prípravkoch, sa týka oblasti spracovania a analýzy obrazov objektov - "kométy" a je určený na informatizáciu (automatizáciu) procesov morfometrických štúdií v oblasti biomedicíny, uskutočňovaných na určenie stupňa poškodenia molekúl DNA spôsobených rôznymi environmentálnymi činiteľmi, na štúdium opravy molekúl DNA na úrovni jednotlivé bunky, na posúdenie integrálnej integrity genómu, na určenie individuálnej rádiosenzitivity pacientov s rakovinou podstupujúcich radiačnú terapiu, na bioindikáciu pobrežných morských vôd, inými slovami, na monitorovanie širokého spektra poškodení DNA spôsobených mutagénnymi faktormi prostredia.

Obrazy „komét“ sú súborom zlúčených a oddelených fluorescenčných bodov rôznej jasnosti, získaných gélovou elektroforézou lyzovaných jednotlivých buniek (metóda „DNA-kométy“), preto ich nie je možné spracovať a analyzovať metódami určenými na obrazy obyčajných (pevných) predmetov.

V súčasnosti sa snímky „DNA komét“ analyzujú buď vizuálnym pozorovaním pod fluorescenčným mikroskopom a ich diferenciáciou podľa stupňa poškodenia DNA, alebo pomocou počítačových nástrojov na spracovanie obrazu.

Vo vizuálnej analýze (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photocomet assay – rýchly skríningový test na stanovenie fotogenotoxicity in vitro. // Výskum mutácií / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), str.44-57) "DNA kométy" sú zoradené do piatich podmienených typov so zodpovedajúcou číselnou hodnotou od 0 do 4. Stupeň poškodenia DNA je vyjadrený ako index "DNA kométy" (I dna), určený vzorcom

A dna =(0n 0 +1 n 1 + 2 n 2 + 3 n 3 + 4 n 4)/ ,

kde n 0 - n 4 je počet "DNA komét" každého typu, je súčet spočítaných "DNA komét".

Tento spôsob spracovania a analýzy je veľmi časovo náročný, subjektívny, má len päť úrovní diferenciačnej gradácie "DNA-kométy" a preto má nízku presnosť, a teda nízku spoľahlivosť výsledkov.

Najbližšie k navrhovanému technickému riešeniu je metóda počítačovej analýzy obrazov "DNA kométy", implementovaná v r softvér SCGE-Pro (pozri Chaubery R.C. Počítačový softvér na analýzu obrazu pre kométový test. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106) braný ako prototyp. Tento spôsob analýzy „komét“ je menej pracný a je potrebný najmä na objektívne posúdenie ich parametrov (napríklad dĺžka „kométy“, dĺžka „chvostu“, priemer „hlavy“, percentá DNA v "hlave" alebo "chvosta" atď.), ktoré sa používajú ako indikátory charakterizujúce úroveň poškodenia DNA v skúmaných bunkách. Metóda umožňuje nájsť „kométy“ v obraze a vypočítať ich parametre manuálne aj automaticky.

Nevýhodou známeho spôsobu je spôsob určovania hraníc „kométy“ pomocou pravouhlej oblasti, čo znižuje presnosť výpočtu parametrov potrebných na posúdenie poškodenia (najmä ak je poškodenie mierne) DNA, keďže v tomto V tomto prípade možno kométe pripísať rušeniu, ktoré je v blízkosti. Okrem toho je pri tejto metóde analýzy hranica „hlavy“ a „chvosta“ definovaná ako priamka, kolmá na os „kométy“ a rozdeľujúca kométu na „hlavu“ a „chvost“. čo výrazne znižuje presnosť výpočtu dĺžky „chvostu kométy“ a percenta DNA v „hlave“ a v „chvostu“.

Technickým výsledkom vynálezu je zvýšenie presnosti a rýchlosti spracovania a analýzy snímok „komét“ získaných metódou „DNA-komét“, vrátane filtrovania, segmentácie „komét“, zvýraznenia ich obrysu s definíciou tzv. hranica „hlavy“ a „chvostu“, čo umožňuje zvýšiť spoľahlivosť výsledkov mikroskopickej morfometrie potrebnej na informatizáciu biometrických výskumných procesov realizovaných pri monitorovaní širokého spektra poškodení DNA spôsobených rôznymi mutagénnymi faktormi prostredia.

Technický výsledok je dosiahnutý tým, že metóda spracovania a analýzy snímok komét podobných objektov získaných metódou „DNA-kométy“, ktorá spočíva v tom, že sa zadá snímka s kométovými objektmi – „kométami“ do počítača z biologického prípravku nainštalovaného na fluorescenčnom mikroskope s videokamerou, ktorý predstavuje súbor zlúčených a oddelených fluorescenčných bodov rôznej jasnosti, hľadajú tieto „kométy“ v obraze, vyberajú ich obrys s vymedzením hranice „hlavy“ a „chvostu“, vykoná mikroskopickú morfometriu, pričom pred hľadaním „komét“ v obraze sa vykoná optimalizácia úrovní jasu obrazu a dolnopriepustné filtrovanie s cieľom spojiť jednotlivé body „komét“ do neostrých oblastí potom sa segmentácia výsledného obrazu vykoná na základe prahu jasu, definovaného ako posun od pozadia, nájdením obrysov „komét“ vyplnením obmedzenej oblasti „semenom“, nájdením stredu „hlavy“ každej „ kométa“, definovaním rozdelenie ťažiska bodov s intenzitou žiary blízko maxima, určenie virtuálnej hranice „hlavy“ a „chvosta“, zrkadlením rozloženia intenzít žiary bodov prednej časti „ hlava kométy“, potom sa vykoná mikroskopická morfometria „komét“ meraním: kométy, „chvostu“, priemeru „hlavy“ a výpočtu percenta DNA v celej „kométe“, „v chvoste“. “, miery poškodenia DNA a mnoho ďalších parametrov, ktoré charakterizujú stupeň poškodenia DNA v závislosti od riešeného problému, pričom uvedené operácie sa vykonávajú automaticky, súčasne na všetkých „kométach“ na obrázku alebo sérii obrázkov.

Metóda sa vykonáva vykonaním postupnosti nasledujúcich postupov:

1. Zadávanie do počítača z biologickej vzorky namontovanej na fluorescenčnom mikroskope s videokamerou, snímky s objektmi podobnými kométe - "kométy", ktoré sú súborom zlúčených a oddelených fluorescenčných bodov rôznej jasnosti.

2. Optimalizácia úrovní jasu obrazu. Nulový jas je pozadie, maximálny jas je stred hlavy „kométy“.

3. Gaussova dolnopriepustná filtrácia (rozmazanie) s veľkým polomerom rovnajúcim sa 1/10 priemerného polomeru "kométy" sa vykonáva s cieľom spojiť jednotlivé body "komét" do rozmazaných oblastí. Aby sa zabránilo zlučovaniu „komét“, ktoré sú blízko pri sebe, interaktívne sa používa úprava polomeru rozostrenia.

4. Segmentácia výsledných rozmazaných oblastí sa vykonáva na základe prahu jasu. Prah je určený automaticky ako posun od pozadia (na obrázku nie sú žiadne cudzie inklúzie a iné objekty okrem „komét“), ale prah je možné korigovať interaktívne.

5. Hľadanie obrysov „komét“ vyplnením ohraničenej oblasti „semenom“, kde semienko je ľubovoľný bod patriaci „kométe“.

Nájdenie stredu hlavy kométy. Na určenie možno použiť dve metódy: podľa maximálneho rozloženia intenzity žiary bodov „kométy“ pozdĺž horizontálnej osi alebo podľa ťažiska bodov s intenzitou žiary presahujúcou 80 % maxima.

Určenie virtuálnej hranice „hlavy“ a „chvosta“ zrkadlením rozloženia intenzít žiary bodov prednej časti „hlavy kométy“ (predná časť je časť až po prednú hranicu kométy). „hlava kométy“).

Vykonávanie mikroskopickej morfometrie „komét“ meraním: dĺžky „kométy“, dĺžky „chvostu“, priemeru „hlavy“ a výpočtom percenta DNA v celej „kométe“, „v chvoste“ “, miery poškodenia DNA a mnoho ďalších parametrov, ktoré charakterizujú stupeň poškodenia DNA v závislosti od riešenej úlohy.

9. Výstup hodnôt získaných parametrov každej kométy sa vykonáva v tabuľke MS EXCEL na implementáciu príkazu používateľa, napr. Štatistická analýza alebo klasifikácia „komét“ podľa stupňa poškodenia štruktúry DNA.

V navrhovanej metóde je teda každá oblasť kométy určená ich komplexným obrysom, čo zvyšuje presnosť výpočtu parametrov, na rozdiel od známej metódy, kde sa hranice „komét“ určujú pomocou obdĺžnikovej oblasti, čo znižuje presnosť výpočtu parametrov potrebných na posúdenie poškodenia (najmä ak je poškodenie slabo vyjadrené) "DNA-kométy", pretože v tomto prípade možno interferencie, ktorá je v blízkosti, tiež pripísať "kométe". Okrem toho v známom spôsobe je hranica „hlavy" a „chvosta" definovaná ako priamka, kolmá na os kométy a rozdeľujúca kométu na „hlavu" a „chvost". Navrhovaná metóda využíva virtuálnu hranicu, určenú výpočtom stredu „hlavy kométy“ a zrkadlením rozloženia intenzity žiary bodov prednej časti „hlavy kométy“. To výrazne zlepšuje presnosť výpočtu dĺžky chvosta kométy a percenta DNA v hlave a chvoste.

Je potrebné poznamenať, že všetky uvedené operácie sa vykonávajú automaticky súčasne na všetkých "kométach" na obrázku alebo sérii obrázkov.

NÁROK

Metóda na spracovanie a analýzu snímok komét podobných objektov získaných metódou „DNA-kométy“, ktorá spočíva v zavedení snímky s kométovými objektmi – „kométami“, ktoré sú súborom zlúčených a oddelených fluorescenčných bodov rôznych jas, vyhľadať tieto „kométy“ na obrázku, zvýrazniť ich obrys s vymedzením hranice „hlavy“ a „chvosta“, vykonať mikroskopickú morfometriu, ktorá sa vyznačuje tým, že pred hľadaním „komét“ na obrázku sa zisťuje jas obrázku úrovne sú optimalizované a nízkofrekvenčným filtrovaním sa spájajú jednotlivé body „komét“ do rozmazaných oblastí, následne sa segmentácia výsledného obrazu vykoná na základe prahu jasu, definovaného ako odsadenie od pozadia, nájdenie obrysov „komét“ pomocou tzv. vyplnenie ohraničenej oblasti „semenom“, kde semenom je ľubovoľný bod, patriaci do „kométy“, nájdenie stred hlavy každej „kométy“ určením ťažiska bodov s intenzitou žiary blízko maxima, určením virtuálnej hranice „hlavy“ a „chvosta“ zrkadlením rozloženia intenzít žiary bodov prednej časti hlavy kométy, potom sa vykoná mikroskopická morfometria „komét“ meraním dĺžky „kométy“, „chvostu“, priemeru „hlavy“ a výpočtom percent. DNA v celej "kométe", v "chvoste" a merania poškodenia DNA a vyššie uvedené operácie sa vykonávajú automaticky, súčasne na všetkých "kométach" v sérii obrázkov.

Článok do súťaže "bio/mol/text": Viete, že kométy skúmajú nielen astronómovia, ale aj molekulárni biológovia? Ich tvorba je spojená s priestorom len nepriamo. Pozerajú sa na kométy cez mikroskop. Slúži ako hviezdna obloha gélové sklíčko- mikroskopické sklíčko potiahnuté agarózou so študovanými bunkami. Umožnil to objav v roku 1984 metódy analýzy DNA nazývanej metóda DNA kométy.

O popularite v číslach

Obrázok 2. Príklady poškodenia DNA v dôsledku pôsobenia faktorov rôzneho charakteru

Ako vidíte, „lupiči“ môžu spáchať obrovské množstvo „zločinov“ a spôsobiť značné poškodenie integrity DNA. Bezpečnosť DNA však v bunke strážia reparačné systémy, „liečitelia“, ktorí korigujú poškodenie molekuly pomocou špeciálnych „liekov“ – enzýmov, ktoré dokážu „zalepiť rany“ spôsobené genotoxickými látkami. Existuje veľa opravných enzýmov. V súčasnosti je známe, že excízna oprava Poškodenie DNA, t.j. pri operáciách, keď sa miesto najskôr vyreže a potom znovu zloží, sa zúčastňuje 13 enzýmov!

Nie všetko je však také hladké, ako sa na prvý pohľad zdá. Operácie na „odbore reparácií“ nie vždy končia úspešne, t.j. obnovenie pôvodnej molekuly DNA. Výsledkom práce systémov obnovy môžu byť nové škody. Dôvodom je veľmi husté balenie reťazcov DNA v jadre.

Ale čo vedci? Vystupujú ako „policajti“, ktorí potrebujú identifikovať „zložky trestného činu“, t.j. nájsť „zločinca“ a jeho „spolupáchateľov“ (určiť genotoxické látky, ich dávky a koncentrácie) a určiť závažnosť „zločinu“ (určiť stupeň poškodenia DNA). Práve v takýchto situáciách pomáha metóda DNA kométy.

Pôvodom zo Švédska

Pokusy zamerané na štúdium jadrových štruktúr bunky a kvantitatívne stanovenie poškodenia reťazca DNA v jednotlivých bunkách organizmov sa uskutočnili už v 80. rokoch 20. storočia. XX storočia takými vedcami ako Cook a Brazell, Rydberg a Johanson. Avšak až v roku 1984 švédski výskumníci Ostling a Johanson vyvinuli novú metódu na zisťovanie poškodenia DNA. Práve oni si všimli, že obrázky fragmentov DNA migrujúcich v elektrickom poli pripomínajú astronomické kométy. Bola tam podobnosť. "Kométy", ktoré získali vedci zo Švédska, mali hlavné charakteristiky vesmírnych "bratov": mali "hlavu" a "chvost". Odtiaľ pochádza taký romantický názov – metóda DNA kométy.

Metóda má množstvo ďalších názvov - gélová elektroforéza jednotlivých (izolovaných) buniek a elektroforéza v mikrogéli . Krstné meno nesprávne odráža podstatu analýzy. Elektroforéza sa neuskutočňuje v jednotlivých bunkách, ale v agarózovom géli, kde sa DNA izolovaná z tých istých buniek pohybuje od jedného pólu k druhému. To druhé je správne, pretože elektroforéza sa uskutočňuje v agarózovom géli aplikovanom na sklíčka. Tento termín sa ale neujal. Tieto názvy nie sú veľmi populárne a na rozdiel od „metódy DNA komét“ sa používajú len zriedka.

Kúzlo na získanie „komét“

Obrázok 3. Štruktúra "kométy".

Laboratórne „kométy“ sú zaujímavé objekty. Ich vzhľad priamo závisí od faktorov vplyvu, ich sily a podmienok analýzy. Informácie o „kométach“ nie sú tajomstvom, sú zahalené tmou, takže o ich zložení, štruktúre a vzniku je známe takmer všetko.

V publikácii z roku 1984 Švédi Ostling a Johanson nazvali DNA, ktorá migrovala, „chvost“ a DNA zostávajúcu v dutine „stred“. Teraz sa prakticky nič nezmenilo: „kométa“ sa bežne rozlišuje podľa „hlavy“ a „chvosta“ (obr. 3).

Musí byť jasné, že „kométa“ nevzniká z bunky živého organizmu, ale z jeho DNA. uložené v agarózovej vrstve bunkovej suspenzie tvorí dutiny, ktoré v procese lýza zaberá DNA týchto buniek. Všetky ďalšie manipulácie v metóde DNA kométy sa vykonávajú s DNA.

"Kométy" sa tvoria v procese migrácie (pohybu) DNA v elektrickom poli (keď existuje prúd a napätie). Čo sa stane počas lýza a elektroforéza? Menšie biomolekuly, z ktorých sa bunka skladá, pri difúzii „unikajú“ do lyzačného roztoku, na rozdiel od DNA, ktorá vďaka extrémne veľká veľkosť nemôže pohybovať. Keď sa podložné sklíčka s DNA podrobia elektroforéze, neporušená DNA vytvorí „hlavu kométy“ a poškodené časti molekúl začnú „pobehovať“ smerom ku kladne nabitému zdroju prúdu – anóde (pretože DNA je nabitá záporne), čím sa vytvorí „chvost“. ". Aby bolo možné vidieť výsledné „kométy“, sú zafarbené fluorescenčnými farbivami (etídium bromid, akridínová oranž atď.) a následne vizualizované pomocou fluorescenčného mikroskopu pri veľkom zväčšení (obr. 4).

Ostling a Johanson píšu nasledovné: „Keď je bunka vložená do gélu, vytvorí v nej priehlbinu. Po lýze bunky jej DNA zaberá túto depresiu. Väčšina ostatných biomolekúl ľahko difunduje cez agarózový gél. Takmer všetky teda vychádzajú z dutiny, ktorú bunka zanechala, do lyzačného roztoku. Jedinou výnimkou je DNA, ktorá je vzhľadom na svoju veľkú molekulovej hmotnosti zostáva v géli. - Ed.

Obrázok 4. Postupnosť krokov metódy DNA kométy(začínajúc v smere hodinových ručičiek zhora). * - Krok je potrebný len v alkalickej verzii metódy (pH > 13,0) na neutralizáciu alkálie pomocou NaOH.

Čím silnejšie je poškodenie DNA (a stupeň poškodenia závisí od dávky mutagénu), tým výraznejší je „chvost kométy“. Ako ste už pochopili, dlhý „chvost“ nie je príliš dobrý.

Univerzálny vojak

Metóda DNA kométy je širokospektrálny nástroj. S jeho pomocou vedci „riešia zločiny“ súvisiace s pokusom o ľudské zdravie a bezpečnosť životného prostredia (samozrejme, to všetko prostredníctvom štúdia poškodenej DNA). Metóda si získala takú obľubu vďaka svojim atraktívnym vlastnostiam - jednoduchosti, rýchlosti, hospodárnosti a dostatočne vysokej citlivosti, ktorá umožňuje odhaliť poškodenie DNA spôsobené aj faktormi nízkej intenzity (napríklad nízke dávky žiarenia). Spomedzi mnohých metód hodnotenia poškodenia DNA je v tejto oblasti jednou z najvhodnejších metóda DNA kométa. Okrem vyššie uvedených výhod predčí napríklad aj známe cytogenetické metódy (ana-telofázický, metafázové analýzy, mikronukleový test) a z iných dobrých dôvodov.

Metóda DNA kométy umožňuje pracovať s akýmikoľvek bunkami obsahujúcimi DNA, na rozdiel od mikronukleárneho testu, ktorý najčastejšie zahŕňa bunky krvi alebo kostnej drene. Ak sú v zozname determinovaných obmedzené metódy ana-telofázy a metafázy chromozomálne aberácie, potom metóda DNA kométy poskytuje široké spektrum jej modifikácií, vďaka ktorým môže výskumník odhaliť rôzne poškodenia DNA: jednoduché, dvojité poškodenie, alkalicky labilné miesta, apoptóza a ďalšie. Práve tieto príležitosti z neho robia „univerzálneho vojaka“ a dláždia cestu metóde v rôznych oblastiach. vedecký výskum , :

• monitorovanie životného prostredia- hodnotenie stavu životného prostredia podľa stupňa poškodenia DNA organizmov žijúcich v skúmanom území (spravidla sa porovnávajú úrovne poškodenia DNA jedincov z kontaminovaných a kontrolných oblastí);
• biologické monitorovanie- štúdium vplyvu výživy a iných vonkajších faktorov prostredia na organizmus z hľadiska stupňa poškodenia DNA, akumulácie poškodenia a opravy;
• genotoxické štúdie farmakologické prípravky, nové a existujúce chemikálie (chemikálie pre domácnosť, pesticídy atď.);
• klinické výskumy zamerané na prenatálnu diagnostiku v štádiu vnútromaternicového vývoja, zisťovanie predispozície k chorobám;
• značka účinnosti liečba rakoviny a jej kontrola.

Zmena sa učí porovnávaním

Pozorovanie stavu životného prostredia, tzv. monitorovanie životného prostredia, pomáha výskumníkom včas identifikovať zmeny v životnom prostredí a biť na poplach (najmä v núdzových situáciách, napríklad v jadrovej elektrárni v Černobyle v roku 1986 alebo v jadrovej elektrárni Fukushima Daiichi v roku 2011). Pri znečistení životného prostredia prichádza vhod metóda DNA-kométa v kombinácii s indikátorovými organizmami. Zoznam organizmov charakteristických pre rôzne prostredia biotopy a najcitlivejšie na zmeny stavu životného prostredia, sú pomerne rozsiahle a zahŕňajú druhy od baktérií Escherichia coli a riasy rodu Chlamydomonas a končiac vyššími rastlinami ( Lemna minor, Pinus sylvestris), cicavce ( Microtus economus) a samozrejme osoba (obr. 5). V metóde DNA kométy sa spravidla nezúčastňujú celé organizmy, ale ich „komponenty“ - bunky, ktoré sú obzvlášť citlivé na zmeny faktorov prostredia, alebo tkanivá, z ktorých možno tieto bunky získať. Krvné bunky sa zvyčajne odoberajú zo zvierat: erytrocyty a lymfocyty, hemocyty(analógy erytrocytov u bezstavovcov), coelomocyty(bunky, ktoré vykonávajú imunitnú funkciu u dážďoviek); v rastlinách - bunky meristému, intenzívne sa deliace pletivo.

Poznámka: Pri analýze poškodenia DNA možno použiť aj celé jedince, ak sú reprezentované jednou bunkou, ako napr. Chlorella vulgaris.

Obrázok 5. Príklady indikátorových organizmov používaných na hodnotenie stavu životného prostredia pomocou metódy DNA kométy.

stránky scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, functionecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Ako v tomto prípade funguje metóda DNA kométy? Vedci porovnávajú stupeň poškodenia DNA indikátorových organizmov žijúcich na študovaných (kontaminovaných) a kontrolných (nekontaminovaných) územiach: vystavených kontaminovanej pôde, vode atď., a to isté, ale žijúce v normálnych kontrolných podmienkach, t.j. keď neexistuje žiadny vplyv skúmaného faktora alebo je nevýznamný. Hodnotenie stupňa poškodenia DNA sa vykonáva aj v laboratóriách za prísne kontrolovaných podmienok, keď je k dispozícii vzorka organizmov exponovaných skúmanému faktoru alebo skupine faktorov (žiarenie, kovy, pesticídy) a nevyhnutne kontrolná skupina ( nepociťujú tento efekt).

Príklad: V jadrovej elektrárni Fukušima Daiichi došlo 11. marca 2011 v dôsledku najsilnejšieho zemetrasenia v Japonsku a cunami, ktoré ho nasledovali, k vážnej radiačnej havárii. V roku 2014 vykonali japonskí vedci štúdiu. Ako kontroly vybrali dve lokality zasiahnuté haváriou, jednu s vysokou úrovňou radiácie (2,85 µSv/h) a jednu s nízkou úrovňou (0,28 µSv/h). U dážďoviek rodu Megascolecidae z týchto miest sa analyzoval stupeň poškodenia DNA. Ukázalo sa, že tento ukazovateľ je výrazne vyšší u jedincov vystavených vysokej úrovni žiarenia ako u jedincov v oblasti s nízkou úrovňou ožiarenia.

Scenáre sa môžu líšiť. Stupeň poškodenia DNA v bunkách sa môže zvýšiť, znížiť alebo zostať nezmenený. Zvýšený stupeň poškodenia DNA v organizmoch z kontaminovanej oblasti môže naznačovať vnútorné zmeny vo fungovaní buniek, ktoré vedú k početným „rozpadom“ DNA.

Príklady: Niektoré kovy, ktoré vstupujú do tela, indukujú reaktívne formy kyslíka (ROS), čo spôsobuje poškodenie DNA; ionizujúce žiarenie prispieva k tvorbe voľných radikálov, ktoré sú tiež „previnilcami“ DNA. Pôsobenie ultrafialových lúčov môže viesť k vzniku diméry v DNA, prerušenie väzby jeho dvoch reťazcov a tým zmena konformácie molekuly.

Znížené poškodenie DNA alebo žiadny rozdiel naznačuje, že organizmy sa s „útlakom“ vyrovnali genotoxické látky a prispôsobené životu v týchto nepriaznivé podmienky. Toto prispôsobenie sa nazýva adaptácia. Ale to je úplne iný príbeh.

Dedičnosť je strašná sila

Počuli ste o takých ochoreniach, ako je syndróm zlomenia chromozómov (syndróm poškodenia Nijmegen), xeroderma pigmentosa a trichotiodystrofia? Objavujú sa až vtedy, keď sú obaja rodičia nositeľmi defektného génu (obr. 6).

V literatúre sú údaje o možnosti využitia metódy DNA kométy v diagnostike týchto dedičných ochorení, čo je dôležité najmä v prenatálnom štádiu, t.j. počas tehotenstva.

Nijmegenský syndróm poranenia (Syndróm zlomu Nijmegen, NBS) je choroba spojená s trvalým narušením integrity DNA. Problém je v tom, že gen NBS1 dôjde k mutácii, ktorá sa „vypne“ nibrínu- proteín, ktorý riadi opravu párových zlomov DNA vyvolaných žiarením. Preto sú ľudia trpiaci týmto syndrómom mimoriadne rádiosenzitívni. Božena Novotná z pražského Ústavu experimentálnej medicíny vo svojej štúdii tvrdí, že metóda DNA kométy je vynikajúca na identifikáciu heterozygotných nosičov génu. NBS1 tým anomálne vysoký stupeň poškodenie reťazcov DNA v „kométach“ lymfocytov.

Nemenej nebezpečné sú xeroderma pigmentosa a trichotiodystrofia. Ide o závažné ľudské choroby, ktoré sa dedia. V prvom prípade pri krátkom pobyte na slnku u detí na otvorených miestach pokožky (ruky, krk, tvár) sa najskôr objavia červené fľaky, ktoré následne prechádzajú do výraznej pigmentácie až do tvorby nádorov. Druhá choroba je vyjadrená v krehkých vlasoch a nechtoch, mentálnej retardácii a anomáliách v štruktúre lebky.

Tieto choroby sú spojené porušením opravy nukleotidovej excízie. Na základe úspešnosti opravy nukleotidovej excízie vo fetálnych bunkách metódou DNA kométy je možné určiť, či bude dieťa trpieť týmito ochoreniami. Prípady takejto diagnózy sú opísané v literatúre.

Vedci stáli pred úlohou ešte pred narodením zistiť, či deti nebudú trpieť xeroderma pigmentosa a trichotiodystrofiou. Experimenty sa uskutočnili v rodinách, v ktorých rodičia sú nositeľmi génov xeroderma pigmentosum ( X rodina) a trichotiodystrofia ( Y rodina) a už majú deti s týmito chorobami .

Rodina X: tehotenstvo 15 týždňov, matka je nositeľkou génu xeroderma pigmentosa, má toto ochorenie 3-ročné dieťa.

Rodina Y: tehotenstvo 10 týždňov, otec a matka - nosiči trichotiodystrofického génu, dve deti s trichotiodystrofiou zomreli vo veku 22 mesiacov a 6 rokov, ešte jedno - následkom samovoľného potratu (potrat).

Všetky bunky boli vystavené ultrafialovému žiareniu počas 45 minút.

X Rodinná štúdia: Úroveň poškodenia DNA v bunkách plodu stanovená metódou DNA kométy bola blízka úrovni poškodenia DNA vo fibroblastoch matky-nositeľky, t.j. zodpovedalo úrovni poškodenia vlákna za normálnych podmienok opravy excízie DNA. Záver – plod je zdravý. Tento záver sa potvrdil po narodení normálneho dieťaťa.

Rodinná štúdia Y: v bunkách plodu v porovnaní s fibroblastmi otca a matky sa zistil defekt v práci excíznej opravy, ktorý bol potvrdený aj inou metódou, ktorá nie je založená na štúdiu opravy. Ukázalo sa, že plod je chorý. Po rozhovore s rodinou bolo rozhodnuté ísť na potrat.

Priemysel je nepriateľom ľudského zdravia

Zdravie ľudí pracujúcich v priemyselných zariadeniach alebo žijúcich v ekologicky nepriaznivých oblastiach je každý deň ohrozené. Nebezpečenstvo spočíva nielen v každodennom blízkom kontakte organizmu s genotoxickými látkami (ionizujúce žiarenie, ťažké kovy a iné chemikálie), ale aj v pravdepodobnosti havarijných situácií (pozri príklady vyššie), ktorých následky môžu byť pre organizmy katastrofálne. Zmeny v stave tela môžu byť veľmi odlišné, od miernych ochorení, ako sú bolesti hlavy až po rakovinu.

Ako sľubný nástroj možno použiť metódu DNA kométy počiatočné hodnotenie stav genómu ľudí pracujúcich alebo žijúcich v environmentálne nepriaznivých podmienkach. To znamená, že DNA kométy sa dajú využiť nielen v týchto oblastiach výskumu, ale v budúcnosti aj v iných, rozšíria možnosti využitia metódy v klinickom výskume, medicíne a mnoho ďalších.

Príklady: V Poľsku pri nehode v továrni na batérie boli pracovníci vystavení vysokým hladinám olova a kadmia, čo malo za následok malý, ale významný nárast poškodenia DNA v porovnaní so skupinou ľudí, ktorí takýto stres nezažili. Genotoxický účinok plynových zváracích aerosólov obsahujúcich ťažké kovy - mangán, chróm, nikel, kadmium, kobalt, olovo, molybdén, železo - na DNA leukocytov bol odhalený u ľudí, ktorých práca je už dlho spojená so zváraním.

Existujú určité ťažkosti

Aby ste metódu DNA kométy správne použili, musíte „z videnia poznať“ nielen jej možnosti a výhody oproti iným metódam, ale samozrejme aj nevýhody, obmedzenia a ťažkosti, na ktoré si treba dávať pozor. Metóda vyžaduje optimalizácia lýza, elektroforéza a ďalšie podmienky v závislosti od typu buniek, ktoré vedec používa, a cieľov štúdie.

Vysvetlenie: Rastlinné a živočíšne bunky vyžadujú odlišné podmienky na uvoľnenie DNA, t.j. lýza. Kvôli prítomnosti celulózovej bunkovej steny trvá lýza rastlinných buniek dlhšie ako živočíšnych.

Z prvej ťažkosti vyplýva druhá nepríjemnosť: prispôsobenie metódy problémom analýzy môže byť veľmi ťažké. namáhavý proces(aj keď samotná technika je jednoduchá a zrozumiteľná), najmä ak s objektom vašej štúdie nikto nepracoval metódou DNA kométy. Stáva sa, že „ladenie“ metodiky si v tomto prípade vyžaduje veľa času.

Niekedy existujú ťažkosti pri tlmočení výsledky získané podľa stupňa poškodenia DNA, keďže stupeň poškodenia nie je vždy možné korelovať s dávkou ovplyvňujúceho faktora.

Vysvetlenie: Takýto problém môže súvisieť s nedostatočnou optimalizáciou metódy, kedy sa niektoré druhy poškodenia miešajú s inými a tým skresľujú výsledky. Reparačné systémy, ktoré napravia niektoré časti vzniknutých porušení, môžu tiež „narušiť“ skutočný stupeň poškodenia DNA.

Jednou z najväčších ťažkostí môže byť porovnanie výsledkov získané pomocou metódy DNA kométy rôznymi vedcami v rôznych laboratóriách a výskumných ústavoch. Na posúdenie poškodenia DNA sa používajú metódy s modifikáciami a úplne odlišnými ukazovateľmi (napríklad percento DNA v „chvosta kométy“ alebo dĺžka „chvosta“).

Vysvetlenie: Dĺžka „chvosta kométy“ je vzdialenosť, ktorú DNA migrovala od „hlavy“ chvosta. Percento DNA v chvoste kométy je množstvo DNA, ktoré migrovalo do chvosta, vyjadrené v percentách. OD úplný zoznam Skóre poškodenia DNA sú dostupné na www.cometassayindia.org.

Vyvíjajú sa snahy o štandardizáciu používania metódy DNA komét, čo vedcom pomôže porovnávať výsledky. Napríklad pri genotoxických štúdiách boli vyvinuté protokoly a usmernenia.

Vysvetlenie: Pokyny Federálneho centra pre hygienu a epidemiológiu Rospotrebnadzor jasne definujú testovacie objekty (ľudské bunky) a podrobne popisujú všetky fázy analýzy. Podľa týchto odporúčaní je možné pomocou metódy DNA kométy testovať genotoxicitu chemikálií pre domácnosť a produktov vyrobených z polymérnych materiálov.

Záver

„Kto je ozbrojený, je chránený“ – to je motto práce s metódou DNA kométy. Znalosť výhod a nevýhod používania túto metódu posúdenie poškodenia DNA umožňuje majstrovsky manipulovať s priebehom práce, vyhnúť sa „nástrahám“ a získať správne výsledky.

Metóda DNA kométy hrá úlohu „čarovného prútika“ pri hodnotení celkového stavu tela spravidla na skoré štádia vplyv nepriaznivé faktoryživotné prostredie. Na počiatočná fáza práve poškodenie DNA je najrýchlejšou a teda jedinou merateľnou reakciou organizmu na nepriaznivé vplyvy dávno pred objavením sa zmien na fyziologickej úrovni.

Teraz už viete, ako biológovia získavajú „kométy“ v laboratóriách a prečo ich tak veľmi potrebujú.

Literatúra

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Kométový test: Citlivá metóda na detekciu poškodenia DNA v jednotlivých bunkách. metódy. 48 , 46–53;
2. Inge-Vechtomov S.G. Genetika so základmi výberu: učebnica pre vysokoškolákov vzdelávacie inštitúcie(3. vydanie, prepracované a doplnené). Petrohrad: N-L, 2015. - 720 s.;
3. Piperakis S.M. (2009). Kométový test: stručná história. Bunkový biol. Toxicol. 25 , 1–3;
4. Yarmonenko S.P. Rádiobiológia človeka a zvierat. M.: Vyššie. škola, 2004. - 549 s.;
5. Cook P.R. a Brazell I.A. (1976). Charakterizácia jadrových štruktúr obsahujúcich superhelikálnu DNA. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. a Johanson K.J. Odhad jednovláknových zlomov v jednotlivých bunkách cicavcov. In: Reparačné mechanizmy DNA / ed. od Hanawalt P.C., Friedberg E.C., Fox C.F. NY: Academic, 1978. s. 465–468;
7. Ostling O. a Johanson K.J. (1984). Mikroelektroforetická štúdia poškodení DNA v jednotlivých cicavčích bunkách vyvolaných žiarením. Biochem. Biophys. Res. komun. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. a Ferard J.F. (1999). Kométový test v genetickej ekotoxikológii: prehľad. Environ. Mol. Mutagén. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. a kol. (2000). Jednobunkový gél/kométový test: pokyny pre in vitro a in vivo genetické toxikologické testovanie. Environ. Mol. Mutagén. 35 , 206–221;
10. Filippov E.V. (2014). Využitie metódy "DNA comet" na detekciu a hodnotenie stupňa poškodenia DNA buniek rastlinných, živočíšnych a ľudských organizmov spôsobených environmentálnymi faktormi (recenzia) . Veda a vzdelanie. 2 , 72–78;
11. Collins A.R. (2004). Kométový test na poškodenie a opravu DNA: princípy, aplikácie a obmedzenia. Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Environmentálna rádioaktivita poškodzuje DNA dážďoviek v prefektúre Fukušima v Japonsku. Eur. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Vyvoláva expozícia uránu genotoxicitu v teleosteane? Danio Rerio? Prvé experimentálne výsledky. Rádioprotekcia. 40 , 175–181;
14. Kagan M.Yu., Shulakova N.S., Tumirova R.A., Zlodeeva E.A., Reznik N.V. (2012). Nijmegen syndróm (klinické pozorovanie). Pediatrická farmakológia. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Kométový test ako opravný test na prenatálnu diagnostiku Xeroderma pigmentosum a trichotiodystrofie. J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoxické účinky pracovnej expozície olovu a kadmiu. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Tomilin N.V., Petrov A.N., Filko O.A., Khrabrova A.V., Solovieva N.E., Ivanova T.M. a kol., (2015). Hodnotenie stupňa poškodenia jadrovej DNA v periférnych krvných bunkách ľudí odborne spojených s pôsobením ťažkých kovov. Zdravotná organizácia. 16 , 383–392;
18. Hodnotenie genotoxických vlastností metódou DNA kométy in vitro: Usmernenia . M.: federálne centrum hygiena a epidemiológia Rospotrebnadzor, 2010.- 16 s.