Genotoksičnost, odnosno štetno dejstvo određenog jedinjenja na genom, i karcinogenost su povezane pojave. Metoda DNK kometa omogućava procjenu stepena oštećenja genomske DNK kako u eksperimentu tako i u naučne svrhe, te u rješavanju praktičnih problema: procjena uticaja okruženje ili radne uslove, kontrolu transplantacionog materijala tokom odmrzavanja, u tkivnom inženjerstvu. Oštećenje DNK otkriveno testom DNK kometa može ukazivati ​​i na predispoziciju za onkologiju i na promjene povezane s njom. Povećanje oštećenja DNK koje detektuju DNK komete karakteristično je za tumorske ćelije. I, iako je u decenijama od svog razvoja, metoda postala rasprostranjena samo u specijalizovanim oblastima, može naći primenu u dijagnostici i praćenju lečenja različitih bolesti. Prednosti DNK kometa su osjetljivost, niski zahtjevi za količinom materijala, brz protokol rada, relativna jednostavnost i niska cijena.

Za proučavanje se koristi metoda DNK komete razne vrstećelije, kako u kulturi tako iu uzorcima bioloških tečnosti i tkiva. Glavni zahtjev za analizu DNK kometa je prijenos ćelija tkiva u suspenziju, stoga, prilikom seciranja laboratorijskih životinja, uklonjeni fragmenti organa moraju proći odgovarajuću obradu, a stanice sadržane u krvi ili spermi mogu se direktno pregledati. 80% malignih neoplazmi je epitelnog porijekla. Epitel izložen vanjskim i vanjskim utjecajima unutrašnje okruženje organizmi su najpogodniji za procjenu genotoksičnosti metodom DNK kometa. Neinvazivna metoda za dobijanje ljudskih epitelnih ćelija je bris epitela usne šupljine i odabir eksfolijativnog materijala iz epitela suznog kanala. Ćelije oralnog epitela žive 10-14 dana, a prisustvo oštećene DNK u njima ukazuje na nedavno izlaganje genotoksičnom spoju. Studije integriteta DNK oralnog epitela mogu pomoći u praćenju efekata supstanci povezanih sa profesionalna aktivnost i prehrambeni proizvodi.

Ćelije smještene u agarozu na staklu tretiraju se otopinom za lizu i, ako je potrebno, enzimima specifičnim za određene poremećaje. Odvajanje se vrši u alkalnom puferu. DNK izlazi iz ćelije i putuje do anode, formirajući oblak koji se može videti pomoću fluorescentnog mikroskopa. Što se više prekida u DNK, to je izraženije kretanje njenih fragmenata. Nakon postupka, stakalca se neutraliziraju i boje interkalirajućim bojama za vizualizaciju DNK. Elektroforetska pokretljivost DNK se procjenjuje pomoću fluorescentnog mikroskopa. Kada je gotovo sva ćelijska DNK fragmentirana, to je obično mrtva stanica. Ako pojedinačne ćelije imaju ovaj stepen oštećenja genoma, one se isključuju iz analize.

Najčešće korišćeni alkalni DNK komet protokol (razdvajanje pri pH > 13) omogućava detekciju jednolančanih prekida, unakrsnih veza u DNK i između DNK i proteina. Upotreba alkalnog tretmana tokom pripreme uzorka povećava osjetljivost metode, budući da većina genotoksičnih agenasa ne uvodi dvolančani prekid u lancu DNK, već formira jednolančane prekide ili regije sa preosjetljivost na alkalije. Osim toga, koriste se enzimi koji uvode prekide u DNK regionima sa specifičnim oštećenjima. Formamidopirimidin DNK glikozilaza seče lance DNK u regionu oksidisanih nukleotida, formamidnih pirimidina (adenin i gvanin sa otvorenim prstenom) i drugih derivata gvanina; OGG1 detektuje oksidirane purine i formamidopirimidine, endonukleaza III detektira oksidirane pirimidine, T4 endonukleaza V prepoznaje pirimidinske dimere, 3-metiladenin DNK glikozilaza II (AlkA) je specifična za 3-metiladenin; a uracil DNK glikozilaza otkriva uracil koji je pogrešno umetnut u DNK. Takvi protokoli obrade materijala mogu biti potrebni za rješavanje specifičnih problema, na primjer, povećanje sadržaja oksidiranih pirimidina i T4 mjesta endonukleaze V u smrznutim tkivima, dok se drugi poremećaji ne primjećuju. Metoda DNK komet sa odgovarajućim enzimskim tretmanom može se koristiti za procjenu stanja grafta prije transplantacije.

Jedna od oblasti kliničke dijagnostike u kojoj se koristi tehnologija DNK kometa je dijagnostika muške neplodnosti. Zbog strukture spermatozoida povećan je rizik od oštećenja strukture DNK u ovim ćelijama, a sistemi popravke ne nadoknađuju u potpunosti nastale povrede. Kod muške neplodnosti primećuje se povećan stepen oštećenja DNK spermatozoida. Broj prekida DNK u spermatozoidima obično dostiže ∼10 6 - 10 7 po genomu, kako kod ljudi tako i kod laboratorijskih miševa, što je mnogo više od broja prekida genoma u limfocitima ili stanicama crvene koštane srži. Oplodnja spermatozoidom koji sadrži oštećenje DNK aktivira procese popravke u oociti koji obnavljaju ta oštećenja, ali se povećava rizik od mutacija i urođenih bolesti kod djeteta. Učestalost pobačaja korelira sa stepenom oštećenja DNK spermatozoida. To je povezano s povećanom incidencom urođenih bolesti i razvojnih poremećaja kod djece s ICSI.

Metoda DNK kometa koristi se ne samo za procjenu stanja DNK, već i za proučavanje procesa popravke u stanicama. U tom slučaju se proučavane stanice uništavaju, a dobiveni homogenat se obrađuje DNK, u koju se prethodno unosi oštećenje određenog tipa, u smjesu se dodaju nukleotidi i ATP potrebni za popravak. Sposobnost homogenata da obnovi određena oštećenja koristi se za procjenu aktivnosti popravnih sistema u ćelijama. Vrsta oštećenja koja se unosi u DNK ovisi o tome koji se mehanizam popravke proučava. Na primjer, svjetlom oštećena DNK koja sadrži 8-oksoguanin se koristi za procjenu ekscizijske popravke baze, a UV zračena DNK koja sadrži pirimidinske dimere koristi se za popravak ekscizijom nukleotida. Jednolančani prekidi se uvode tretmanom vodonik peroksidom, rendgenskim ili gama zračenjem, alkilacija DNK se vrši tretmanom sa metil metansulfonatom. Za proučavanje popravke ekscizijom nukleotida koristi se procjena akumulacije prekida DNK kada se blokiraju polimeraze uključene u ovaj proces korištenjem afidokolina ili arabinozida citozina u kombinaciji s hidroksiureom.

Analiza ekspresije gena povezanih s popravkom ne mora uvijek biti objektivan pokazatelj stanja DNK u stanicama; stoga metoda DNK kometa omogućava da se dobije vrijedan Dodatne informacije. Povećana aktivnost reparaturnih sistema ukazuje ne samo na to da su ćelije otpornije na oštećenja genoma, već i na to da su izložene genotoksičnom agensu, usled čega se aktivira sinteza proteina uključenih u popravku. Dodatak prehrani s Q10, vitaminom C u kapsulama koje se sporo otapaju, povećava aktivnost popravke bazne ekscizije. Sličan efekat se primećuje ako se umesto lekova koristi voće i povrće bogato antioksidansima. Ovo smanjuje aktivnost sistema popravke ekscizije nukleotida, jer više nije potrebno.

Mikronukleusni test je direktan pokazatelj kancerogenosti, ICH smjernice preporučuju njegovu upotrebu u kombinaciji sa kometnom DNK. Metoda DNK kometa može se kombinovati sa fluorescentna hibridizacija FISH kako bi se utvrdilo da li promjene utječu na određene regije genoma. Za analizu velikog broja DNK perja dobijenih kao rezultat postupka DNK kometa. preporučuju se automatska rješenja. To će smanjiti subjektivnost procjene i preciznije procijeniti veličinu i oblik nastalih perja, što je posebno važno s obzirom na potrebu prikupljanja podataka o velikom broju perja u svakom preparatu. DNK kometa može se koristiti kao metoda za kliničku dijagnostiku i u istraživačke svrhe - za procjenu genotoksičnosti određenog spoja.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Nedavni napredak u testiranju genotoksičnosti in vivo: predviđanje kancerogenog potencijala korištenjem kometnog i mikronukleusnog testa na životinjskim modelima / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - P. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epitelne ćelije kao alternativne ljudske biomatrice za ispitivanje kometa / Front Genet. - 2014. V5. br. 386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O "Neill Gaivão I, Collins A. Test kometa za mjerenje popravke DNK: pristup i primjene / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Izvor i značaj oštećenja DNK u ljudskim spermatozoidima; Komentar dijagnostičkih strategija i slamnatih zabluda / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. N.8. - P. 475-85.

Procjena uticaja gama zraka na DNK limfocita metodom DNK kometa. Mikrofotografije (A) i obrađene slike (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Evaluacija kometnog testa za procjenu odnosa doze i odgovora DNK Oštećenja izazvana jonizujućim zračenjem / Int. J. Mol. sci. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.

Utjecaj vodikovog peroksida na DNK sperme školjkiChoromytilus chorus

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Procjena genomskog integriteta u spermi Choromytilus chorus (Molina, 1782) ispitivanjem kometa / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - P.36-44.

Metoda jednoćelijske gel elektroforeze ili metoda DNK kometa je visoko osjetljiva i pruža visoku pouzdanost dobijenih rezultata, istovremeno je relativno jednostavna i brza za izvođenje, a također je međunarodno standardizirana (OECD br. 489). Ova metoda je najperspektivnija za rješavanje sljedećih problema:

Biomonitoring čovjeka i okoline, odnosno identifikacija posljedica izazvane mutageneze kada osoba dođe u kontakt sa ksenobioticima (lijekovi, aditivi u hrani, pesticidi, parfemi i kozmetika, kućna hemikalija, kao i najčešće vode, zraka i industrijske opasnosti, nanomaterijali);

Istraživanje u području onkologije;

Studije sistema popravke DNK;

Metoda se zasniva na registraciji različite pokretljivosti u stalnom električnom polju oštećenih DNK i/ili DNK fragmenata pojedinačnih liziranih ćelija, zatvorenih u tankom agaroznom gelu na standardnom staklenom predmetu. Istovremeno, ćelijska DNK migrira, formirajući elektroforetski trag koji vizualno podsjeća na "rep komete", čiji parametri ovise o stupnju oštećenja DNK. Nakon završetka elektroforeze, stakalca se boje i analiziraju pomoću fluorescentne mikroskopije.

Snimanje slike i obrada podataka vrši se pomoću hardversko-softverskog kompleksa, koji uključuje visokoosjetljivu kameru u kombinaciji sa mikroskopom i specijalizovani softver.

Univerzalni inteligentni softver uključen u ovaj kompleks pruža:

Automatska analiza slike DNK kometa "jedan pritisak na tipku", uključuje sve osnovne mjerne parametre uključujući % DNK u repu komete;

- visoka reproduktivnost;

Analiza parametara DNK kometa se vrši kako u režimu "real time" tako i iz pohranjenih digitalnih slika;

Program obrađuje podatke i prikazuje ih u obliku protokola u skladu sa međunarodnim zahtjevima GLP-a;

Analiza i poređenje podataka;

Program je u potpunosti validiran i usklađen je sa međunarodnim GLP zahtjevima. Ima hijerarhijski pristup i sistem zaštite podataka.

Komplet uključuje:

1. Luminescentni biomedicinski mikroskop Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50W epi-fluorescentni sistem rasvjete, filter-dihroični ogledalo-filter kompleti za DAPI, FITC, TRITC boje.

3. Monohromna CCD IEEE1394 FireWire kamera za luminescenciju. Basler Scout scA1300-32fm. Veličina piksela - 3,75 µm x 3,75 µm. Rezolucija - 1296 px x 966 px. Veličina senzora 1/3 inča. Matrix - Sony. Prijenos podataka preko porta velike brzine - 1394 BUS. Brzina kadrova pri maksimalnoj rezoluciji - 32 kadra u sekundi. Omogućava rad sa objektima u realnom vremenu

4. Comet Assay IV - softverski paket za Windows sa generatorom proračunskih tablica za Microsoft Excel, za rad sa monohromatskom CCD IEEE1394 FireWire video kamerom u realnom vremenu (mjerenja i analize su moguća i na video streamu i na fotografijama), uputstvo priručnik i CD za instalaciju i validaciju programa.

5. Jednogodišnja licenca za četiri korisnika.

6. Učenje na daljinu putem internet mreže od četiri korisnika.

Dodatno u ponudi:

1. Operater podataka da koristi Comet Assay IV u XML verzijama baza podataka za pretraživanje, filtriranje i izdvajanje podataka i reviziju kroz sigurnu Oracle bazu podataka sačuvanu u MS Excel formatu tabele. Uključuje mogućnost pregleda automatski sačuvanih slika, potpisa, arhiviranih podataka i podataka automatske revizije. Dodatno uključuje mogućnost izvoza nepotpisanih i digitalno potpisanih podataka u XML format. Uključuje samo Crypto-Key-Prove za pregled digitalno potpisanih podataka u različitim formatima.

2. Menadžerski pristup GLP sistemu. Access Manager je program za kontrolu i upravljanje pristupom zaposlenika bazama podataka. Sistem ujedinjen za PI genetsku toksikologiju. Uključuje sveobuhvatnu reviziju sistema. Eksterna revizija. Administracija korisničkih naloga i korisničkih aktivnosti vezanih za programe, pristup, lozinke, revizije itd. Koristi Oracle za sigurnu zaštitu korisnika i podataka revizije. Potpuna usklađenost sa FDA 21 CFR, dio 11 konačnih pravila za elektronske zapise i elektronske potpise.

3. Obuka za jednog korisnika zasnovana na perceptivnim instrumentima u UK

Metoda se sastoji u tome da se slika sa objektima sličnim kometima - "kometama", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih tačaka različitog sjaja, unese u kompjuter iz biološkog preparata postavljenog na fluorescentni mikroskop sa video kamerom. Zatim se te "komete" traže na slici, izdvaja se njihova kontura uz definisanje granica "glave" i "repa" i vrši se mikroskopska morfometrija. Prije traženja "kometa" na slici, nivoi svjetline slike se optimizuju i vrši se niskopropusno filtriranje kako bi se kombinovale pojedinačne tačke "kometa" u zamućena područja. Zatim se vrši segmentacija rezultirajuće slike na osnovu praga svjetline, definiranog kao pomak od pozadine, pronalaženje kontura "kometa" popunjavanjem ograničenog područja "semenom", gdje je sjeme proizvoljna tačka koja pripada "komete", pronalazeći centar glave svake "komete", određivanjem težišta tačaka sa intenzitetom sjaja blizu maksimalnog. Definicija virtualne granice "glave" i "repa" vrši se pomoću spekularni odraz raspodjela intenziteta sjaja tačaka prednjeg dijela glave komete, zatim se vrši mikroskopska morfometrija "kometa" mjerenjem: dužine "komete", "repa", prečnika "glava". Zatim se izračunava procenat DNK u celoj "kometi", u "repu" i mere oštećenja DNK. Ove operacije se izvode automatski, istovremeno na svim "kometama" u nizu slika. Tehnički rezultat je povećanje tačnosti i brzine obrade i analize slika "kometa".

Metoda za obradu i analizu slika kometi sličnih objekata dobijenih metodom "DNK-komete" (comet assay ili single cell gel electrophoresis - SCGE), u biološkim preparatima, odnosi se na oblast obrade i analize slika objekata - "komete", a namijenjen je za kompjuterizaciju (automatizaciju) procesa morfometrijskih studija iz oblasti biomedicine, koji se sprovode radi utvrđivanja stepena oštećenja molekula DNK uzrokovanih raznim agensima okoline, za proučavanje popravke molekula DNK na nivou pojedinačnih ćelija, za procjenu integralnog integriteta genoma, za određivanje individualne radioosjetljivosti pacijenata oboljelih od raka koji su podvrgnuti terapiji zračenjem, za bioindikaciju obalnih morskih voda, drugim riječima, za praćenje širokog spektra oštećenja DNK uzrokovanih mutagenim faktorima okoline.

Slike “kometa” su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih tačaka različitog sjaja, dobijenih gel elektroforezom liziranih pojedinačnih ćelija (metoda “DNK-kometa”), stoga ih nije moguće obraditi i analizirati metodama namijenjenim za slike običnih (čvrstih) objekata.

Trenutno se slike "DNK kometa" analiziraju ili vizuelnim posmatranjem pod fluorescentnim mikroskopom i njihovom diferencijacijom prema stepenu oštećenja DNK, ili korišćenjem kompjuterskih alata za obradu slika.

U vizuelnoj analizi (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for determination photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), str.44-57) „DNK komete“ su rangirane u pet uslovnih tipova sa odgovarajućom numeričkom vrednošću od 0 do 4. Stepen oštećenja DNK se izražava indeksom „DNK komete“ (I dna), određena formulom

I dna =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

gdje je n 0 -n 4 broj "DNK kometa" svakog tipa, je zbir prebrojanih "DNK kometa".

Ova metoda obrade i analize je veoma dugotrajna, subjektivna, ima samo pet nivoa diferencijacije gradacije "DNK-komete" i samim tim ima nisku tačnost, a samim tim i nisku pouzdanost rezultata.

Najbliži predloženom tehničkom rješenju je metoda kompjuterske analize slika "DNK komete", implementirana u softver SCGE-Pro (vidi Chaubery R.C. Kompjuterizovan softver za analizu slike za analizu kometa. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106) uzet kao prototip. Ova metoda analize "kometa" je manje naporna i posebno je neophodna za objektivnu procjenu njihovih parametara (na primjer, dužina "komete", dužina "repa", prečnik "glave", postotak DNK u „glavi“ ili „repu“ itd.), koji se koriste kao indikatori koji karakterišu nivo oštećenja DNK u proučavanim ćelijama. Metoda omogućava pronalaženje "kometa" na slici i izračunavanje njihovih parametara i ručno i automatski.

Nedostatak poznate metode je metoda određivanja granica "komete" pomoću pravougaone površine, što umanjuje tačnost izračunavanja parametara neophodnih za procjenu oštećenja (posebno ako je oštećenje blago) DNK, budući da u ovom U slučaju, smetnje koje su u blizini se takođe mogu pripisati kometi. Osim toga, ovom metodom analize, granica “glave” i “repa” je definirana kao prava linija, okomita na osu “komete” i koja dijeli kometu na “glavu” i “rep”, što uvelike smanjuje tačnost izračunavanja dužine “repa komete” i procenta DNK u “glavi” i u “repu”.

Tehnički rezultat pronalaska je povećanje tačnosti i brzine obrade i analize slika "kometa" dobijenih metodom "DNK-kometa", uključujući filtriranje, segmentaciju "kometa", isticanje njihove konture sa definicijom granice "glave" i "repa", što omogućava povećanje pouzdanosti rezultata mikroskopske morfometrije neophodne za kompjuterizaciju biometrijskih istraživačkih procesa koji se sprovode u praćenju širokog spektra oštećenja DNK uzrokovanih različitim mutagenim faktorima okoline.

Tehnički rezultat postiže se činjenicom da je u metodu obrade i analize slika objekata sličnih kometi dobijenih metodom "DNK-komete", koja se sastoji u tome da se unese slika sa objektima nalik kometi - "kometama". u kompjuter iz biološkog preparata instaliranog na fluorescentnom mikroskopu sa video kamerom, koji predstavlja skup spojenih i odvojenih fluorescentnih tačaka različitog sjaja, traže ove „komete“ na slici, biraju njihovu konturu sa definicijom granice “glave” i “repa”, obavljaju mikroskopsku morfometriju, dok se prije traženja “kometa” na slici vrši optimizacija nivoa svjetline slike i niskopropusno filtriranje kako bi se pojedinačne točke “kometa” kombinirale u zamućena područja , zatim se segmentacija rezultirajuće slike izvodi na osnovu praga svjetline, definiranog kao pomak od pozadine, pronalaženje kontura "kometa" popunjavanjem ograničenog područja "semenom", pronalaženje središnje "glave" svake " kometa", definisanjem podjela težišta tačaka sa intenzitetom sjaja blizu maksimalnog, određivanje virtualne granice “glave” i “repa”, preslikavanjem distribucije intenziteta sjaja tačaka prednjeg dijela “ glava komete“, zatim se vrši mikroskopska morfometrija „kometa“, merenjem: komete“, „repa“, prečnika „glave“ i izračunavanja procenta DNK u celoj „kometi“, „u repu“. “, mjere oštećenja DNK i mnogi drugi parametri koji karakteriziraju stepen oštećenja DNK u zavisnosti od problema koji se rješava, a navedene operacije se izvode automatski, istovremeno nad svim “kometama” na slici ili nizu slika.

Metoda se provodi izvođenjem niza sljedećih postupaka:

1. Unošenje u kompjuter iz biološkog uzorka postavljenog na fluorescentni mikroskop sa video kamerom, slike sa objektima nalik kometi - "kometama", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih tačaka različite jačine.

2. Optimizacija nivoa svjetline slike. Nulta svjetlina je pozadina, maksimalna svjetlina je centar glave "komete".

3. Gaussovo niskopropusno filtriranje (zamućenje) sa velikim radijusom jednakim 1/10 poluprečnika prosječne "komete" izvodi se u cilju kombinovanja pojedinačnih tačaka "kometa" u zamućena područja. Kako bi se spriječilo spajanje "kometa" koje su blizu jedna drugoj, interaktivno se koristi podešavanje radijusa zamućenja.

4. Segmentacija rezultirajućih zamućenih područja vrši se na osnovu praga svjetline. Prag se određuje automatski kao pomak od pozadine (nema stranih inkluzija i drugih objekata na slici osim „kometa“), ali se prag može korigovati interaktivno.

5. Pronalaženje kontura "kometa" popunjavanjem ograničenog područja "semenom", gdje je sjeme proizvoljna tačka koja pripada "kometi".

Pronalaženje centra glave komete. Za određivanje se mogu koristiti dvije metode: maksimalnom distribucijom intenziteta sjaja tačaka “komete” duž horizontalne ose ili težištem tačaka čiji intenzitet sjaja prelazi 80% od maksimuma.

Određivanje virtuelne granice "glave" i "repa", preslikavanjem distribucije intenziteta sjaja tačaka prednjeg dela "glave komete" (prednji deo je deo do prednje granice "glava komete").

Izvođenje mikroskopske morfometrije "kometa" mjerenjem: dužine "komete", dužine "repa", prečnika "glave" i izračunavanja procenta DNK u cijeloj "kometi", "u repu" “, mjere oštećenja DNK i mnogi drugi parametri koji karakterišu stepen oštećenja DNK, u zavisnosti od zadatka koji se rešava.

9. Izlaz vrijednosti dobijenih parametara svake komete izvodi se u tablici MS EXCEL za implementaciju korisničkog naredbe zadatka, na primjer, za daljnje Statistička analiza ili klasifikacija "kometa" prema stepenu oštećenja strukture DNK.

Dakle, u predloženoj metodi, svako područje komete je određeno njihovom složenom konturom, što povećava tačnost izračunavanja parametara, za razliku od poznate metode, gdje se granice "kometa" određuju pomoću pravokutnog područja, što umanjuje tačnost proračuna parametara potrebnih za procjenu štete (naročito ako je oštećenje slabo izraženo) "DNK-kometa", budući da se u ovom slučaju i interferencija koja je u blizini može pripisati "kometi". Osim toga, u poznatoj metodi, granica "glave" i "repa" je definirana kao prava linija, okomita na osu komete i koja dijeli kometu na "glavu" i "rep". Predložena metoda koristi virtuelnu granicu, koja se određuje izračunavanjem centra "glave komete" i preslikavanjem distribucije intenziteta sjaja tačaka prednjeg dela "glave komete". Ovo značajno poboljšava tačnost izračunavanja dužine repa komete i procenta DNK u glavi i repu.

Treba napomenuti da se sve navedene operacije izvode automatski istovremeno na svim "kometama" na slici ili nizu slika.

TVRDITI

Metoda za obradu i analizu slika kometi sličnih objekata dobijenih metodom "DNK-komete", koja se sastoji u uvođenju slike sa objektima sličnim kometi - "kometama", koji su skup spojenih i odvojenih fluorescentnih tačaka različitih svjetlina, potražite ove "komete" na slici, istaknite njihovu konturu sa definicijom granice "glave" i "repa", izvršite mikroskopsku morfometriju, karakteriziranu time da prije traženja "kometa" na slici, osvijetljenost slike optimizirani su nivoi i niskofrekventno filtriranje radi kombinovanja pojedinačnih tačaka "kometa" u zamućena područja, zatim se segmentacija rezultirajuće slike vrši na osnovu praga svjetline, definiranog kao pomak od pozadine, pronalaženje kontura "kometa" pomoću popunjavanje ograničenog područja "semenom", gdje je sjeme proizvoljna tačka, koja pripada "kometi", pronalaženje centar glave svake "komete" određivanjem težišta tačaka sa intenzitetom sjaja blizu maksimalnog, određivanjem virtuelne granice "glave" i "repa" preslikavanjem distribucije intenziteta sjaja tačke prednjeg dela glave komete, zatim se vrši mikroskopska morfometrija "kometa" merenjem dužine "komete", "repa", prečnika "glave" i izračunavanjem procenta DNK u cijeloj "kometi", u "repu" i mjere oštećenja DNK, a navedene operacije se izvode automatski, istovremeno na svim "kometama" u nizu slika.

Članak za konkurs "bio/mol/tekst": Znate li da komete ne proučavaju samo astronomi, već i molekularni biolozi? Njihov rad je povezan sa prostorom samo posredno. Oni posmatraju komete kroz mikroskop. Služi kao zvjezdano nebo gel slajd- mikroskopsko staklo obloženo agarozom sa ćelijama koje se proučavaju. Ovo je omogućeno otkrićem 1984. metode analize DNK nazvane metoda DNK kometa.

O popularnosti u brojkama

Slika 2. Primjeri oštećenja DNK nastalih djelovanjem faktora različite prirode

Kao što vidite, "razbojnici" mogu počiniti veliki broj "zločina" i uzrokovati značajnu štetu integritetu DNK. Međutim, u ćeliji sigurnost DNK čuvaju sistemi za popravku, “iscjelitelji” koji ispravljaju oštećenje molekule uz pomoć posebnih “lijekova” – enzima koji mogu “zakrpiti rane” uzrokovane genotoksikantima. Postoji mnogo enzima za popravku. Trenutno je poznato da popravak ekscizije Oštećenje DNK, tj. u operacijama, kada se lokacija prvo iseče, a zatim ponovo sastavi, učestvuje 13 enzima!

Međutim, nije sve tako glatko kao što se čini na prvi pogled. Operacije u "odjelu reparacija" ne završavaju se uvijek uspješno, tj. obnavljanje originalne molekule DNK. Rezultat rada sistema za oporavak mogu biti nova oštećenja. Razlog za to je veoma gusto pakovanje DNK lanaca u jezgru.

Ali šta je sa naučnicima? Oni se ponašaju kao "panduri" koji treba da identifikuju "komponente zločina", tj. pronaći "zločinaca" i njegove "saučesnike" (odrediti genotoksikante, njihove doze i koncentracije) i utvrditi težinu "zločina" (utvrditi stepen oštećenja DNK). U takvim situacijama pomaže metoda DNK kometa.

Porijeklom iz Švedske

Pokušaji proučavanja nuklearnih struktura ćelije i kvantitativnog određivanja oštećenja lanaca DNK u pojedinačnim ćelijama organizama učinjeni su još 1980-ih godina. XX vijeka od strane naučnika kao što su Cook i Brazell, Rydberg i Johanson. Međutim, tek 1984. švedski istraživači Ostling i Johanson razvili su novu metodu za otkrivanje oštećenja DNK. Upravo su oni primijetili da slike fragmenata DNK koji migriraju u električnom polju podsjećaju na astronomske komete. Postojala je sličnost. "Komete" koje su dobili naučnici iz Švedske imale su glavne karakteristike svemirske "braće": imale su "glavu" i "rep". Otuda je došlo tako romantično ime - metoda DNK komete.

Metoda ima niz drugih naziva - gel elektroforeza pojedinačnih (izolovanih) ćelija i elektroforeza u mikrogelu . Prvo ime netačno odražava suštinu analize. Elektroforeza se ne provodi u pojedinačnim ćelijama, već u agaroznom gelu, gdje se DNK izolirana iz tih istih stanica kreće s jednog pola na drugi. Drugo je tačno, jer elektroforeza se provodi u agaroznom gelu nanesenom na stakalca. Ali ovaj termin se nije uhvatio. Ova imena nisu baš popularna i rijetko se koriste, za razliku od "metode DNK komete".

Spelujte da dobijete "komete"

Slika 3. Struktura "komete".

Laboratorijske "komete" su zanimljivi objekti. Njihov izgled direktno zavisi od faktora uticaja, njihove snage i uslova analize. Podaci o "kometama" nisu tajna, obavijeni mrakom, pa se o njihovom sastavu, strukturi i formiranju zna gotovo sve.

U jednoj publikaciji iz 1984. Šveđani Ostling i Johanson nazvali su DNK koja je migrirala "repom", a DNK koja je ostala u šupljini "centrom". Sada se praktično ništa nije promijenilo: „kometa“ se konvencionalno razlikuje po „glavi“ i „repu“ (slika 3).

Mora se jasno shvatiti da se "kometa" ne formira od ćelije živog organizma, već od njegovog DNK. ugrađen u sloj agaroze suspenzija ćelija formira šupljine, koje u tom procesu liza zauzima DNK ovih ćelija. Sve dalje manipulacije u metodi DNK kometa provode se sa DNK.

"Komete" nastaju u procesu migracije (kretanja) DNK u električnom polju (kada postoji struja i napon). Šta se dešava tokom liza i elektroforeza? Manje biomolekule koje čine ćeliju "pobjegnu" u otopinu za lizu tokom difuzije, za razliku od DNK, koja zbog svoje izuzetno velika veličina ne može da se kreće. Kada se slajdovi s DNK podvrgnu elektroforezi, netaknuta DNK formira "glavu komete", a oštećeni dijelovi molekula počinju "trčati" prema pozitivno nabijenom izvoru struje - anodi (jer je DNK negativno nabijena), formirajući "rep". ". Da bi se videle nastale „komete“, one se boje fluorescentnim bojama (etidijev bromid, akridin narandžasta, itd.), a zatim se vizualizuju pomoću fluorescentnog mikroskopa pri velikom povećanju (slika 4).

Ostling i Johanson pišu sljedeće: „Kada je ćelija ugrađena u gel, ona u njemu formira udubljenje. Nakon lize ćelije, njena DNK zauzima ovu depresiju. Većina drugih biomolekula lako difundira kroz agarozni gel. Tako skoro svi izlaze iz šupljine koju je ostavila ćelija u rastvor za lizu. Jedini izuzetak je DNK, koja zbog svoje velike molekularna težina ostaje u gelu. - Ed.

Slika 4. Redoslijed koraka metode DNK komete(počevši od vrha u smjeru kazaljke na satu). * - Korak je potreban samo u alkalnoj verziji metode (pH > 13,0) za neutralizaciju lužine pomoću NaOH.

Što je oštećenje DNK jače (a stepen oštećenja zavisi od doze mutagena), to je „rep komete“ izraženiji. Kao što ste već shvatili, dugačak "rep" nije baš dobar.

Univerzalni vojnik

Metoda DNK kometa je alat širokog dometa. Uz njegovu pomoć naučnici "riješe zločine" vezane za pokušaj ugrožavanja zdravlja ljudi i sigurnosti okoliša (naravno, sve to kroz proučavanje oštećene DNK). Metoda je stekla takvu popularnost zbog svojih atraktivnih karakteristika - jednostavnosti, brzine, ekonomičnosti i dovoljno visoke osjetljivosti, što omogućava otkrivanje oštećenja DNK uzrokovanih čak i faktorima niskog intenziteta (na primjer, niske doze zračenja). Među mnogim metodama za procjenu oštećenja DNK, metoda DNK komete je jedna od najpogodnijih u ovoj oblasti. Pored gore navedenih prednosti, nadmašuje, na primjer, dobro poznate citogenetske metode (ana-telofazni, metafazne analize, mikronukleus test), i iz drugih dobrih razloga.

Metoda DNK kometa omogućava vam da radite sa svim stanicama koje sadrže DNK, za razliku od mikronukleusnog testa, koji najčešće uključuje ćelije krvi ili koštane srži. Ako su metode ana-telofaze i metafaze ograničene na listi utvrđenih hromozomske aberacije, tada metoda DNK kometa pruža širok spektar njegovih modifikacija, zahvaljujući kojima istraživač može otkriti različita oštećenja DNK: jednostruka, dvostruka oštećenja, alkalno labilna mjesta, apoptoza i drugi. Upravo te prilike ga čine "univerzalnim vojnikom" i otvaraju put ovoj metodi u različitim oblastima. naučno istraživanje , :

• monitoring životne sredine- procjena stanja životne sredine prema stepenu oštećenja DNK organizama koji žive na istraživanom području (po pravilu se porede nivoi oštećenja DNK jedinki iz kontaminiranih i kontrolnih područja);
• biološki monitoring- proučavanje uticaja ishrane i drugih spoljašnjih faktora sredine na organizam u smislu stepena oštećenja DNK, akumulacije oštećenja i popravke;
• genotoksične studije farmakološki preparati, nove i postojeće hemikalije (kućne hemikalije, pesticidi, itd.);
• klinička istraživanja usmjerena na prenatalnu dijagnostiku u fazi intrauterinog razvoja, utvrđivanje predispozicije za bolesti;
• oznaka efikasnosti terapija raka i njena kontrola.

Promjena se uči poređenjem

Posmatranje stanja životne sredine, tzv. monitoring životne sredine, pomaže istraživačima da identificiraju promjene u okolišu i na vrijeme aktiviraju alarm (posebno u vanrednim situacijama, na primjer, u nuklearnoj elektrani Černobil 1986. ili u nuklearnoj elektrani Fukushima Daiichi 2011.). Kada je okolina zagađena, metoda DNK-kometa u kombinaciji sa indikatorskim organizmima dobro dođe. Liste karakterističnih organizama za različitim okruženjima staništa i najosjetljivija na promjene stanja okoliša, prilično su opsežna i uključuju vrste u rasponu od bakterija Escherichia coli i alge iz roda Chlamydomonas i završavajući sa višim biljkama ( Lemna minor, Pinus sylvestris), sisari ( Microtus oeconomus) i, naravno, osobu (slika 5). U metodi DNK komete, po pravilu, nisu uključeni cijeli organizmi, već njihovi “komponentni dijelovi” – ćelije koje su posebno osjetljive na promjene faktora okoline, odnosno tkiva iz kojih se te ćelije mogu dobiti. Krvne ćelije se obično uzimaju od životinja: eritrociti i limfociti, hemociti(analozi eritrocita kod beskičmenjaka), celimociti(ćelije koje obavljaju imunološku funkciju kod glista); u biljkama - ćelije meristema, koje se intenzivno dijele tkiva.

Bilješka: U analizi oštećenja DNK mogu se koristiti i cijele osobe ako ih predstavlja jedna ćelija, kao npr. Chlorella vulgaris.

Slika 5. Primjeri indikatorskih organizama koji se koriste za procjenu stanja okoliša metodom DNK komete.

stranice scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, funkcionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Kako u ovom slučaju radi metoda DNK komete? Naučnici upoređuju stepen oštećenja DNK indikatorskih organizama koji žive na proučavanim (kontaminiranim) i kontrolnim (nekontaminiranim) teritorijama: izloženim kontaminiranom zemljištu, vodi i sl., i istim, ali koji žive u normalnim kontrolnim uslovima, tj. kada nema uticaja proučavanog faktora ili je on neznatan. Procjena stepena oštećenja DNK vrši se iu laboratorijama, pod strogo kontrolisanim uslovima, kada postoji uzorak organizama izloženih ispitivanom faktoru ili grupi faktora (zračenje, metali, pesticidi), a obavezno i ​​kontrolna grupa ( ne doživljava ovaj efekat).

primjer: 11. marta 2011. godine, kao posljedica najjačeg zemljotresa u Japanu i cunamija koji ga je pratio, dogodila se ozbiljna radijacija u nuklearnoj elektrani Fukushima Daiichi. Japanski naučnici su 2014. godine sproveli istraživanje. Odabrali su dvije lokacije pogođene nesrećom, jednu sa visokim nivoom zračenja (2,85 µSv/h) i jednu sa niskim (0,28 µSv/h), kao kontrolu. U glistama porodice Megascolecidae sa ovih mesta analiziran je stepen oštećenja DNK. Pokazalo se da je ovaj pokazatelj značajno veći kod osoba izloženih visokim nivoima zračenja nego kod osoba na području sa niskim nivoom izloženosti.

Scenariji se mogu razlikovati. Stupanj oštećenja DNK u stanicama može se povećati, smanjiti ili ostati nepromijenjen. Povećan stepen oštećenja DNK u organizmima iz kontaminiranog područja može ukazivati ​​na unutrašnje promjene u funkcionisanju ćelija, koje dovode do brojnih „kvarova“ DNK.

primjeri: Neki metali, ulazeći u tijelo, induciraju reaktivne vrste kisika (ROS), uzrokujući oštećenje DNK; Jonizujuće zračenje doprinosi stvaranju slobodnih radikala, koji su također "prekršitelji" DNK. Djelovanje ultraljubičastih zraka može dovesti do stvaranja dimera u DNK, prekidajući vezu svoja dva lanca i tako mijenjajući konformaciju molekula.

Smanjeno oštećenje DNK ili nikakva razlika ukazuje na to da su se organizmi izborili sa "ugnjetavanjem" genotoksikanata i prilagođeni životu u njima nepovoljni uslovi. Ova adaptacija se zove adaptacija. Ali to je sasvim druga priča.

Naslijeđe je strašna sila

Jeste li čuli za bolesti kao što su sindrom lomljenja hromozoma (Nijmegenov sindrom oštećenja), pigmentna kseroderma i trihotiodistrofija? Pojavljuju se samo kada su oba roditelja nosioci defektnog gena (slika 6).

U literaturi postoje podaci o mogućnosti primjene metode DNK komete u dijagnostici ovih nasljednih bolesti, što je posebno važno u prenatalnoj fazi, tj. tokom trudnoće.

Nijmegenov sindrom ozljede (Nijmegenov sindrom loma, NBS) je bolest povezana sa trajnim narušavanjem integriteta DNK. Problem je što gen NBS1 javlja se mutacija koja se "isključuje" nibrin- protein koji kontroliše popravku parnih prekida DNK izazvanih zračenjem. Zbog toga su osobe koje pate od ovog sindroma izuzetno osjetljive na radioaktivnost. Božena Novotna sa Instituta za eksperimentalnu medicinu u Pragu u svojoj studiji tvrdi da je metoda DNK kometa odlična u identifikaciji heterozigotnih nosilaca gena NBS1 by anomally visoki nivo oštećenje lanaca DNK u "kometama" limfocita.

Ništa manje opasni nisu xeroderma pigmentosa i trihotiodistrofija. To su ozbiljne ljudske bolesti koje su naslijeđene. U prvom slučaju, pri kratkotrajnom izlaganju suncu kod djece na otvorenim područjima kože (ruke, vrat, lice) prvo se pojavljuju crvene mrlje, koje kasnije prelaze u izraženu pigmentaciju do stvaranja tumora. Druga bolest se izražava u lomljivosti kose i noktiju, mentalnoj retardaciji i anomalijama u građi lobanje.

Ove bolesti objedinjuje kršenje u radu popravke ekscizije nukleotida. Na osnovu uspešnosti popravke nukleotida ekscizijom u fetalnim ćelijama metodom DNK komete, moguće je utvrditi da li će dete bolovati od ovih bolesti. Slučajevi takve dijagnoze opisani su u literaturi.

Istraživači su se suočili sa zadatkom da prije rođenja otkriju da li će djeca oboljeti od pigmentne kseroderme i trihotiodistrofije. Eksperimenti su rađeni u porodicama u kojima su roditelji nosioci gena xeroderma pigmentosum ( X porodica) i trihotiodistrofija ( Y porodica) i već imaju djecu sa ovim bolestima.

Porodica X: trudnoća 15 nedelja, majka je nosilac gena za xeroderma pigmentosa, ima dete od 3 godine sa ovom bolešću.

Porodica Y: trudnoća 10 sedmica, otac i majka - nosioci gena za trihotiodistrofiju, dvoje djece sa trihotiodistrofijom umrlo je u dobi od 22 mjeseca i 6 godina, još jedno - od posljedica spontanog pobačaja (pobačaja).

Sve ćelije su bile izložene ultraljubičastom zračenju 45 minuta.

X porodična studija: Nivo oštećenja DNK u ćelijama fetusa, određen metodom DNK komete, bio je blizu nivoa oštećenja DNK u fibroblastima majke nosioca, tj. odgovara nivou oštećenja lanca u normalnim uslovima popravke ekscizije DNK. Zaključak - fetus je zdrav. Ovaj zaključak je potvrđen nakon rođenja normalnog djeteta.

Studija porodice Y: u ćelijama fetusa, u poređenju sa fibroblastima oca i majke, otkriven je defekt u radu ekscizione popravke, što je potvrđeno i drugom metodom koja nije zasnovana na proučavanju popravke. Otkriveno je da je fetus bolestan. Nakon razgovora sa porodicom, odlučeno je da se abortira.

Industrija je neprijatelj ljudskog zdravlja

Zdravlje ljudi koji rade u industrijskim objektima ili žive u ekološki nepovoljnim područjima svakodnevno je u opasnosti. Opasnost nije samo u svakodnevnom bliskom kontaktu tijela sa genotoksičnim tvarima (jonizujuće zračenje, teški metali i druge kemikalije), već i u vjerojatnosti nastanka vanrednih situacija (vidi primjere iznad), čije posljedice mogu biti katastrofalne za organizme. Promjene u stanju tijela mogu biti vrlo različite, od blagih tegoba poput glavobolje do raka.

Metoda DNK kometa može se koristiti kao obećavajući alat početna evaluacija stanje genoma ljudi koji rade ili žive u ekološki nepovoljnim uslovima. To znači da se DNK komete mogu koristiti ne samo u ovim područjima istraživanja, već iu drugim područjima u budućnosti, proširiti mogućnosti korištenja metode u kliničkim istraživanjima, medicini i još mnogo toga.

primjeri: U Poljskoj je nesreća u fabrici baterija izložila radnike visokim nivoima olova i kadmijuma, što je rezultiralo malim, ali značajnim povećanjem oštećenja DNK u poređenju sa grupom ljudi koji nisu iskusili takav stres. Genotoksični učinak aerosola za plinsko zavarivanje koji sadrže teške metale - mangan, krom, nikl, kadmijum, kobalt, olovo, molibden, željezo - na DNK leukocita otkriven je kod ljudi čiji je rad već duže vrijeme vezan za zavarivanje.

Postoje neke poteškoće

Da biste pravilno koristili metodu DNK komete, morate "znati iz vida" ne samo njene mogućnosti i prednosti u odnosu na druge metode, već i, naravno, nedostatke, ograničenja i poteškoće na koje morate biti u potrazi. Metoda zahtijeva optimizacija liza, elektroforeza i druga stanja u zavisnosti od vrste ćelija koje naučnik koristi i ciljeva istraživanja.

Objašnjenje: Biljne i životinjske ćelije zahtevaju različite uslove za oslobađanje DNK, tj. liza. Zbog prisustva celuloznog ćelijskog zida, biljnim ćelijama je potrebno duže da se lize nego životinjskim ćelijama.

Iz prve teškoće slijedi druga neugodnost: prilagođavanje metode problemima analize može biti vrlo teško. naporan proces(iako je sama tehnika jednostavna i razumljiva), pogotovo ako niko nije radio sa objektom vašeg proučavanja metodom DNK komete. Dešava se da "podešavanje" metodologije u ovom slučaju zahtijeva puno vremena.

Ponekad postoje poteškoća u tumačenju rezultati dobijeni stepenom oštećenja DNK, budući da stepen oštećenja ne može uvek biti u korelaciji sa dozom faktora koji utiče.

Objašnjenje: Takav problem može biti povezan s nedovoljnom optimizacijom metode, kada se neke vrste oštećenja miješaju s drugima i time iskrivljuju rezultate. Sistemi popravke koji ispravljaju neki dio nastalih kršenja također mogu "poremetiti" stvarni stepen oštećenja DNK.

Jedna od najvećih poteškoća može biti poređenje rezultata dobijeni metodom DNK komete od strane različitih naučnika u različitim laboratorijama i istraživačkim institutima. Za procjenu oštećenja DNK koriste se metode s modifikacijama i potpuno drugačijim pokazateljima (na primjer, postotak DNK u "repu komete" ili dužina "repa").

Objašnjenje: Dužina "repa komete" je udaljenost na kojoj je DNK migrirao od "glave" repa. Procenat DNK u repu komete je količina DNK koja je migrirala u rep, izražena u procentima. OD kompletna lista Rezultati oštećenja DNK dostupni su na www.cometassayindia.org.

Ulažu se napori da se standardizira korištenje metode DNK komete, što će pomoći naučnicima da uporede rezultate. Na primjer, u genotoksičnim studijama razvijeni su protokoli i smjernice.

Objašnjenje: Smjernice Federalnog centra za higijenu i epidemiologiju Rospotrebnadzora jasno definiraju objekte za ispitivanje (ljudske ćelije) i detaljno opisuju sve faze analize. Prema ovim preporukama, metodom DNK komete, hemikalije za domaćinstvo i proizvodi od polimernih materijala mogu se testirati na genotoksičnost.

Zaključak

"Ko je naoružan, zaštićen je" - ovo je moto rada sa metodom DNK komete. Poznavanje prednosti i mana upotrebe ovu metodu Procjena oštećenja DNK omogućava vam da majstorski manipulišete tokom rada, izbjegnete "zamke" i dobijete ispravne rezultate.

Metoda DNK kometa igra ulogu "čarobnog štapića" u procjeni općeg stanja tijela, po pravilu, na ranim fazama uticaj nepovoljni faktori okruženje. Na početna faza upravo oštećenje DNK je najbrži i samim tim jedini mjerljivi odgovor organizma na štetne efekte mnogo prije pojave promjena na fiziološkom nivou.

Sada znate kako biolozi dobijaju "komete" u laboratorijama i zašto su im toliko potrebne.

Književnost

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Test kometa: Osetljiva metoda za otkrivanje oštećenja DNK u pojedinačnim ćelijama. metode. 48 , 46–53;
2. Inge-Vechtomov S.G. Genetika sa osnovama selekcije: udžbenik za studente obrazovne institucije(3. izdanje, revidirano i dopunjeno). Sankt Peterburg: N-L, 2015. - 720 str.;
3. Piperakis S.M. (2009). Test kometa: kratka istorija. Cell biol. Toxicol. 25 , 1–3;
4. Yarmonenko S.P. Radiobiologija čovjeka i životinja. M.: Više. škola, 2004. - 549 str.;
5. Cook P.R. i Brazell I.A. (1976). Karakterizacija nuklearnih struktura koje sadrže superheličnu DNK. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. i Johanson K.J. Procjena jednolančanih prekida u pojedinačnim stanicama sisara. U: Mehanizmi popravke DNK / ur. od Hanawalt P.C, Friedberg E.C, Fox C.F. NY: Academic, 1978. str. 465–468;
7. Ostling O. i Johanson K.J. (1984). Mikroelektroforetska studija oštećenja DNK izazvanih zračenjem u pojedinačnim ćelijama sisara. Biochem. Biophys. Res. komun. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. i Ferard J.F. (1999). Test kometa u genetskoj ekotoksikologiji: pregled. Environ. Mol. Mutagen. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Jednoćelijski gel/kometni test: smjernice za in vitro i in vivo genetsko toksikološko testiranje. Environ. Mol. Mutagen. 35 , 206–221;
10. Filippov E.V. (2014). Upotreba metode "DNK kometa" za detekciju i procjenu stepena oštećenja DNK ćelija biljnih, životinjskih i ljudskih organizama uzrokovanih faktorima okoline (prikaz) . Nauka i obrazovanje. 2 , 72–78;
11. Collins A.R. (2004). Test kometa za oštećenje i popravak DNK: principi, primjene i ograničenja. Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Radioaktivnost okoline oštećuje DNK glista u prefekturi Fukushima, Japan. EUR. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Da li izloženost uranijumu izaziva genotoksičnost kod teleosta Danio rerio? Prvi eksperimentalni rezultati. Radioprotection. 40 , 175–181;
14. Kagan M.Yu., Shulakova N.S., Tumirova R.A., Zlodeeva E.A., Reznik N.V. (2012). Nijmegen sindrom (klinička opservacija). Pedijatrijska farmakologija. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Test kometa kao popravni test za prenatalnu dijagnozu Xeroderma pigmentosum i trihotiodistrofije. J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoksični efekti profesionalne izloženosti olovu i kadmijumu. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Tomilin N.V., Petrov A.N., Filko O.A., Khrabrova A.V., Solovjeva N.E., Ivanova T.M. i drugi (2015). Procjena stepena oštećenja nuklearne DNK u stanicama periferne krvi osoba profesionalno povezanih s djelovanjem teških metala. Zdravstvena organizacija. 16 , 383–392;
18. Procjena genotoksičnih svojstava metodom DNK kometa in vitro: Smjernice. M.: federalni centar higijena i epidemiologija Rospotrebnadzora, 2010.- 16 str.