Bakteriologická štúdia je štúdia určená na izoláciu a štúdium ich vlastností s cieľom stanoviť mikrobiologickú diagnózu.
Testovaný materiál by sa mal odobrať za aseptických podmienok do sterilných misiek a čo najskôr doručiť do laboratória. V prípade potreby by sa vzorky mali skladovať v chladničke. Technika odberu vzoriek závisí od objektu, povahy ochorenia a vlastností mikroorganizmu. Jednou z najbežnejších metód bakteriologického výskumu je bakterioskopia.
Na štúdium nefixovaných baktérií sa používajú dve metódy: rozdrvená (medzi sklíčkom a krycím sklíčkom) kvapka a. Malo by sa pamätať na to, že prípravky z nefixovaných baktérií sú nákazlivé.
Nátery sa používajú na bakterioskopiu fixovaných preparátov. Na ich prípravu sa kvapka testovacej kvapaliny rozotrie na povrch podložného skla a potom sa vysuší. Najbežnejšou metódou fixácie lieku je jeho prenášanie cez plameň plynového horáka. V niektorých prípadoch sa používajú fixačné zlúčeniny. Fixné prípravky sa zvyčajne farbia (pozri Farbenie mikroorganizmov). K číslu podstatné prvky bakteriologické štúdie zahŕňajú očkovanie a subkultúry produkované bakteriálnou slučkou alebo Pasteurovou pipetou. Slučka sa sterilizuje pražením plameňom, potom sa ochladí dotykom plochy neočkovaného agaru alebo opláchnutím v sterilnej tekutine. Pri použití Pasteurovej pipety sa jej hrot odlomí pinzetou, pipeta sa niekoľkokrát prenesie cez plameň kahana a nechá sa vychladnúť. Pri výseve sa používajú tekuté a tuhé živné pôdy. Pri výseve na šikmom agare sa kultúra baktérií potrie slučkou po povrchu agaru. Pri výseve do hrúbky agarového alebo želatínového stĺpca sa živné médium prepichne na dno skúmavky slučkou alebo špeciálnou ihlou. Pri výseve do tekutého média je potrebné zabezpečiť, aby tekutina nevytiekla a nezmáčala okraje skúmaviek a zátok. Očkovanie a subkultúry by sa mali vykonávať v blízkosti plameňa plynového horáka, skúmavky by nemali zostať dlho otvorené, slučka alebo Pasteurova pipeta s kultúrou by sa nemala ničoho dotýkať; pred zatvorením trubice by mali byť jej okraje spálené. Naočkované skúmavky musia byť ihneď označené.
Najdôležitejším krokom v bakteriologickom výskume je identifikácia – určenie druhu alebo typu baktérie získanej vo forme čistej kultúry. Pri identifikácii baktérií, ich fyziologických a biochemických vlastnostiach sa študuje tvorba toxínov. Sérologické metódy na identifikáciu baktérií sú široko používané (reakcie a). V mnohých prípadoch je účinná biologická metóda identifikácie mikroorganizmov založená na infekcii laboratórnych zvierat testovaným materiálom alebo výslednou bakteriálnou kultúrou a identifikácii charakteristických patologických zmien zvierat.
Na izoláciu čistých kultúr sa používajú mechanické a biologické metódy. Príklad mechanickej metódy: kvapka testovaného materiálu sa rozotrie tou istou sterilnou špachtľou alebo bakteriálnou slučkou na hustý povrch. rastové médium, postupne v prvom, druhom a treťom . Izolácia čistej kultúry sa robí z vyrastených jednotlivých kolónií a spočíva v ich štúdiu a skríningu na čerstvom živnom médiu. Biologické metódy izolácie čistých kultúr sú založené na zohľadnení jednej alebo druhej vlastnosti izolovaného mikróbu, ktorá ho odlišuje od iných mikróbov prítomných v skúmanom materiáli.
V biologickej metóde sa používa tento druh živných médií, v ktorých sa vytvárajú podmienky priaznivé pre vývoj určitého druhu mikróbov. K biologickým metódam patrí aj infekcia laboratórnych zvierat citlivých na izolovaný typ baktérie.
Bakteriologický výskum je súbor metód na detekciu patogénnych mikroorganizmov u pacienta, v nosiči alebo na objektoch životného prostredia. Bakteriologické štúdie Používajú sa aj na zisťovanie podmienene patogénnych a sanitárno-indikačných mikróbov, ktoré charakterizujú stupeň znečistenia vonkajšieho prostredia, na štúdium mikrobiálnej krajiny určitého prostredia (objektu). Bakteriologický výskum možno použiť na diagnostiku, prevenciu infekčných chorôb, na hygienické a hygienické vlastnosti prostredia obklopujúceho človeka, na vedecký výskum.
Materiál a metóda bakteriologického výskumu závisia od účelu analýzy, podmienok prostredia, patogenézy a priebehu ochorenia. V prítomnosti bakteriémie sa mikrób zisťuje hemokultúrou. V prípadoch výrazných lokálnych lézií je potrebné hľadať patogén vo výtoku alebo sekrétoch postihnutého orgánu (záškrt, úplavica, kvapavka atď.). Napokon, pri ochoreniach s komplexným priebehom, keď (ako napr. pri brušnom týfuse) je bakteriémia nahradená léziami tenkého čreva, sa v každom štádiu používa vhodná výskumná metóda: hemokultúry sa vykonávajú počas prvého týždňa choroba a sérologické vyšetrenie je najspoľahlivejšie v druhom, počnúc tretím týždňom sa pri výseve výkalov získa pozitívny výsledok; posledná uvedená metóda sa používa aj ako kontrolná štúdia na detekciu nosičov baktérií medzi rekonvalescentmi a na ich monitorovanie.
Vykonávanie ktorejkoľvek z týchto úloh sa vykonáva pomocou metód určených na izoláciu a identifikáciu mikroorganizmov. V závislosti od charakteristík mikróbov sa používa celý komplex metód alebo ich častí.
Bakterioskopia je najdostupnejšia technika založená na mikroskopickom vyšetrení materiálu. Pri mikroskopovaní čerstvých preparátov možno využiť niektoré mikrochemické reakcie (napríklad farbenie jodofilných baktérií Lugolovým roztokom) alebo selektívne farbenie rôznych štruktúrnych častí baktérií.
V zafarbenom prípravku možno jasnejšie identifikovať baktérie. Testovaný materiál sa nanesie na podložné sklíčko v tenkej a čo najrovnomernejšej vrstve. Prípravok sa nechá vysušiť na vzduchu a zafixuje sa jedným zo všeobecne uznávaných spôsobov, najčastejšie však plameňom, t. j. dvakrát až trikrát rýchle pridržanie prípravku nad plameňom horáka tak, aby bolo sklo teplé, ale nie horúce. Prípravok vychladený po fixácii sa farbí jednoduchým alebo diferenciálnym moridlom (pozri Farbenie mikroorganizmov). Vo fluorescenčnej mikroskopii sa používajú natívne aj suché prípravky. V tomto prípade ošetrenie určitými farbivami spôsobuje, že štruktúry mikrobiálneho tela alebo celého mikróbu žiaria ultrafialovými alebo krátkymi modrými lúčmi. V ďalšej modifikácii sú mikróby ošetrené špecifickými sérami označenými fluorescenčnými látkami (farbivami). Baktérie zodpovedajúce séru budú žiariť, keď sa na ne nanesie označené sérum. Heterologické baktérie nebudú svietiť.
Metóda bakterioskopie sa široko používa na bakteriologickú diagnostiku niektorých infekčných ochorení (kvapavka, tuberkulóza, recidivujúca horúčka), ako aj pri štúdiu celého komplexu mikroflóry orgánu (mandle, vagína), produktu alebo iného objektu.
Metóda výsevu, teda izolácia čistej kultúry požadovaného mikroorganizmu, je presnejšou a spoľahlivejšou metódou bakteriologickej diagnostiky ako bakterioskopia. Čerstvý materiál sa rozotrie po povrchu hustého živného média naliateho do Petriho misiek. Primárna inokulácia sa uskutočňuje na konvenčných médiách vhodných pre daný mikrób, na diferenciálnych alebo selektívnych médiách. Výber živného média (pozri), ako aj spôsob predbežnej úpravy čerstvého materiálu na siatie, závisí od stupňa jeho kontaminácie sprievodnou cudzou mikroflórou. Po 24-48 hodinách. obsah v termostate pri optimálnej teplote pre daný mikrób, misky sa preskúmajú a podozrivé kolónie sa subkultivujú na médiách, ktoré podporujú reprodukciu tohto patogénu. Takto sa získa kultúra homogénnych baktérií, ktoré je potrebné identifikovať.
Identifikácia mikróba začína štúdiom jeho morfológie v natretom prípravku a v drvenej kvapke (pozri) na definovanie formy mikróbov a ich pohyblivosti. Ďalším krokom je štúdium enzymatickej schopnosti baktérií rozkladať sacharidy, aminokyseliny a močovinu v kombináciách špecifických pre každý druh. Baktérie majú najviac preštudovaný cukor a proteolytické enzýmy.
Identifikácia mikróbov by mala byť doplnená štúdiom ďalších vlastností charakteristických pre každý rod a druh mikroorganizmov. Medzi tieto vlastnosti patrí schopnosť selektívne rozpúšťať erytrocyty rôznych zvierat (hemolýza), koagulovať krvnú plazmu (plazmatická koagulácia), rozpúšťať fibrínovú zrazeninu (fibrinolýza) atď. Všetky tieto vlastnosti baktérií možno využiť pri ich identifikácii ako diferenciálne znaky.
Konečná identifikácia mikróbov niektorých druhov, najmä patogénnych baktérií z čeľade čriev, zahŕňa sérologickú identifikáciu (pozri Identifikácia mikróbov). Zvyčajne je na to nastavená aglutinačná reakcia, to znamená, že akumulácia baktérií sa zistí pod vplyvom imunitného séra s rovnakým názvom. Aglutinácia mikróbov v sére proti konkrétnemu druhu naznačuje príslušnosť k tomuto druhu. Zvyčajne sa aglutinačná reakcia umiestňuje približne na sklo a na konečné stanovenie do skúmaviek so sérovými riedeniami.
Opísaným spôsobom nie je možné úplne určiť množstvo mikróbov. Potom musí byť identifikácia doplnená o infekciu laboratórnych zvierat, keďže niektoré baktérie sa vyznačujú patogenitou alebo toxikogenitou, ktorá sa prejaví pri infekcii zvierat. V niektorých prípadoch infekcia zvierat slúži aj ako spôsob akumulácie patogénnych mikróbov.
Iba porovnanie všetkých charakteristík kultúry, zhromaždených počas štúdia morfológie, biochemických, sérologických a v prípade potreby aj jej biologických vlastností, môže poskytnúť základ pre identifikáciu. Odpoveď s pozitívnym výsledkom štúdie nie je ťažká, ak je izolovaný mikrób typický. V tomto prípade sa uvádza rod, druh a ak je určený, aj typ baktérie. Pri izolácii mikróba, ktorý sa v niektorých vlastnostiach líši od typickej charakteristiky, sa poskytne odpoveď označujúca odlišnú vlastnosť. V tomto prípade je užitočné zopakovať štúdiu, ak to priebeh ochorenia alebo podmienky odberu materiálu dovoľujú. Je tiež užitočné podrobiť kultúru atypických mikróbov ďalšiemu štúdiu inými, zložitejšími metódami.
Negatívne výsledky bakteriologickej štúdie sú relatívne dôležité a ukazujú len to, že študovaná časť materiálu neobsahovala požadované mikróby alebo nebola životaschopná. Môžu sa však nachádzať v inej porcii. Preto sa napríklad pri vyšetrovaní bacilonosičov (týfus, dyzentéria, záškrt) vyžadujú opakované štúdie.
Na štúdium analýz prítomnosti určitých baktérií v nich sa používajú rôzne diagnostické metódy vrátane bakterioskopickej metódy. Vlastnosti tejto metódy, ako aj metóda bakteriologického výskumu, budú diskutované v tomto článku.
Podstata bakterioskopickej diagnostickej metódy
Bakterioskopická metóda skúmania vzorky je určená na identifikáciu mikroorganizmov v testovanej látke, ako aj na podrobné štúdium vlastností týchto mikroorganizmov, objasnenie ich počtu a správania v uvažovanom médiu. Výhodou tejto metódy štúdia analýz je jednoduchosť, rýchlosť a dostupnosť. Môže sa vykonávať takmer v akomkoľvek laboratóriu s použitím minimálneho počtu nástrojov a chemikálií. Medzi jeho nevýhody patrí nemožnosť získať úplný obraz o správaní mikróbov.
Materiály potrebné na výskum
Na štúdium analýz bakterioskopickou metódou sú potrebné tieto nástroje:
- Kovová slučka.
- Šmykľavka. Táto položka musí byť čistá, pretože akákoľvek kontaminácia môže ovplyvniť stav vzorky.
- Pinzeta.
- Filtračný papier.
Nové sklíčka sa čistia 1% roztokom sódy. Po varení v takomto roztoku sa sklo premyje destilovanou vodou, slabým roztokom kyseliny chlorovodíkovej a potom znova destilovanou vodou. Použité poháre sa čistia v niekoľkých fázach: najprv sa umiestnia do roztoku kyseliny sírovej na 60-120 minút, potom sa varia v roztoku sódy a potom sa sklo premyje vodou. Potom sa pohár ponorí do lekárskeho liehu.
Poháre s nástrojmi uchovávajte buď v alkohole alebo v tesne uzavretých nádobách. A v druhom prípade musí byť sklo suché.
Pre túto štúdiu budete potrebovať aj nasledujúce chemické činidlá:
- alkohol;
- Lugolov roztok;
- Farbivá.
Najčastejšie používané farbivá sú Ziehl purpurová, metylénová modrá a karbolická genciánová violeť. Posledným farbivom je roztok obyčajného fuchsínu v päťpercentnej karbolickej vode.
Pokrok vo výskume
Môžete preskúmať kultúru v jej pôvodnej aj maľovanej podobe. V druhom prípade budú kolónie mikroorganizmov aj jednotlivé baktérie mŕtve, čo umožňuje lepšie sa zoznámiť so štruktúrou týchto jednoduchých organizmov. Pri štúdiu lieku v jeho pôvodnej forme zase laboratórny asistent dostáva viac informácií o aktivite mikróbov. V oboch prípadoch sa liek skúma pomocou mikroskopu.
Farbenie média sa uskutočňuje v dvoch stupňoch, najprv sa pripraví prípravok na postup a až potom sa zafarbí. Príprava vzorky prebieha nasledovne:
- Vzorka určená na výskum je rovnomerne rozložená po skle prístroja v tvare kruhu alebo oválu. Ak sú v materiáli cudzie nečistoty (napríklad hnis), pred pridaním skúšobnej vzorky sa na sklo nanesú 1-2 kvapky vody.
- Potom by sa mal výsledný náter vysušiť.
- Hneď ako škvrna zaschne, musí sa fixovať plameňom z horáka.
Na upevnenie týmto spôsobom sa sklo prístroja drží trikrát nad plameňom. Ak je náter dostatočne pevne fixovaný, potom laboratórny asistent vykonávajúci experiment pocíti pálenie v prstoch.
Na konci tohto postupu sa vzorka zafarbí.
Metódy farbenia vzoriek
Farbenie môže byť jednoduché, s použitím jediného farbiva. A komplexný, v ktorom, aby sa presne rozlíšili bakteriálne bunky podľa jedného alebo druhého z nich vlastnosti na vzorku sa postupne aplikuje niekoľko rôznych farbiacich chemikálií. Príkladom komplexného farbenia je Gramova a Ziehl-Neelsenova metóda.
Gramova metóda
Gramova metóda vám umožňuje určiť chemické zloženie bunková membrána. Vďaka tejto metóde sa zaviedla klasifikácia baktérií podľa Grama: grampozitívne baktérie (ktoré zahŕňajú pôvodcov mnohých chorôb) po zafarbení získajú tmavofialovú farbu a gramnegatívne baktérie charakteristický červený odtieň. Gramova metóda pozostáva z nasledujúcich krokov:
- Najprv sa liek ošetrí Lugolovým roztokom počas jednej minúty.
- Po ošetrení Lugolom sa vzorka odfarbí alkoholom.
- Potom sa prípravok premyje destilovanou vodou a dodatočne zafarbí fuchsínom.
Metóda Ziehl-Neelsen
Metóda Ziehl-Nielsen sa používa na stanovenie baktérií citlivých na kyseliny, ktorých bunkové membrány obsahujú veľké množstvo lipidov, napríklad patogénov tuberkulózy. Práca na tejto metóde sa vykonáva v piatich etapách:
- Na podložné sklíčko sa položí filtračný papier, na ktorý sa potom nanesie malé množstvo Zielovho fuchsínu.
- Podložné sklíčko sa potom zahrieva, kým sa neobjaví charakteristická para. Po objavení sa pary sa sklo nechá vychladnúť. Tento postup sa opakuje ešte dvakrát, potom sa sklo nechá opäť vychladnúť.
- Potom sa fuchsín po odstránení papiera zmyje zo skla prístroja destilovanou vodou.
- Potom sa sklo umiestni do roztoku kyseliny chlorovodíkovej alebo sírovej, kým sa farba vzorky úplne nestratí.
- Nakoniec sa na odfarbený prípravok nanesie roztok metylénovej modrej, sklo sa premyje destilovanou vodou a nechá sa vysušiť na ďalšie skúmanie výsledného prípravku pod mikroskopom.
Lefflerova metóda
Medzi jednoduché metódy farbenia patrí Lefflerova metóda. S ním získavajú všetky baktérie Modrá farba. Táto metóda funguje v dvoch krokoch:
- Na náter sa položí filtračný papier, na ktorý sa nanesie roztok metylénovej modrej Leffler. V tomto stave sa liek nechá 3-5 minút.
- Po uplynutí tejto doby sa prípravok premyje vodou a vysuší, potom sa môže skúmať pod mikroskopom.
Pri bakterioskopickej metóde sa farbia aspoň dva preparáty a jeden z nich sa farbí jednoduchá metóda a jeden je zložitý.
Bakteriologická metóda
Pri skúmaní analýz je často potrebné určiť citlivosť patogénu na konkrétny liek. V tomto prípade sa vzorka vyšetrí bakteriologickou metódou. Táto metóda pozostáva z nasledujúcich krokov:
- Najprv musíte kultúru vyčistiť, aby ste identifikovali špecifické typy mikróbov. Na tento účel musí byť vzorka umiestnená do prostredia, v ktorom je najpravdepodobnejší vývoj baktérií, ktoré sa majú zistiť. Je tiež možné mechanicky oddeliť biomateriál počas jeho očkovania.
- Po získaní čistej kultúry sa z nej odobraté vzorky skúmajú bakterioskopickou metódou.
Nasledujú príklady médií používaných na detekciu mikroorganizmov:
- Elschnigovo médium pozostávajúce z jednej tretiny konského séra a dvoch tretín vývaru.
- Loefflerovo sérum, ktoré sa používa na detekciu patogénov záškrtu. Toto médium pozostáva z 3/4 konského alebo hovädzieho séra a 1/4 1 % glukózového bujónu.
- Krvný agar používaný na detekciu streptokokov a testovanie ich citlivosti na účinky antibakteriálnych liečiv. Toto médium pozostáva z 5-10% živočíšneho séra a agaru.
Typy bakterioskopických analýz
Bakterioskopia testov stolice
Na bakterioskopické vyšetrenie rozboru stolice je potrebná vzorka rozboru pacienta. Ak je potrebné analyzovať črevnú mikroflóru, ktorej porušenia naznačujú prítomnosť dysbakteriózy alebo infekčných ochorení tráviaceho systému, vzorka sa odoberie pomocou slučky, ktorá sa vloží do konečníka do hĺbky asi 10 centimetrov.
Pri skúmaní vzorky stolice možno zistiť nasledujúce nebezpečné mikroorganizmy:
- Stafylokoky.
- Klebsiella, ktorej prítomnosť naznačuje poškodenie hrubého čreva.
- Pseudomonas aeruginosa, ktorý uvoľňuje toxíny, ktoré sú pre človeka mimoriadne nebezpečné.
Prítomnosť Pseudomonas aeruginosa v ľudskom tele môže viesť k otrave krvi a meningitíde – ochoreniam, ktoré môžu byť smrteľné.
Bakterioskopia testov moču
Rozbor moču na bakterioskopické vyšetrenie sa podáva pri podozrení na zápal močového ústrojenstva a na prítomnosť ochorení ako pyelonefritída a cystitída, ktorých pôvodcami sú Escherichia coli, resp. niektoré patogény pohlavne prenosných chorôb. Na takúto štúdiu je potrebných 50 až 100 ml moču a moč sa musí uchovávať v sterilnej nádobe. Pred absolvovaním analýzy je potrebné dobre umyť, aby v moči bolo menej nečistôt tretích strán. Počas menštruácie sa neodporúča močiť.
Bakterioskopická analýza moču je nevyhnutná na detekciu ochorení močového systému u dojčiat. V tomto prípade sa moč odoberá cez katéter do sterilnej nádoby. Štúdium vzorky moču sa musí vykonať čo najskôr, inak bude detekcia patogénov ťažká.
Bakterioskopia spúta
Pri analýze spúta sa skúmajú dva nátery. Jeden z nich sa skúma na prítomnosť Kochových bacilov – pôvodcov tuberkulózy. Na základe výsledkov druhej štúdie sa vyvodzujú závery o prítomnosti iných mikróbov v spúte.
Na analýzu spúta na tuberkulózu sa vzorka farbí podľa Ziehl-Neelsenovej metódy.
Na analýzu prítomnosti iných mikróbov sa vzorka zafarbí pomocou Gramovej metódy. Pomocou bakterioskopickej metódy s použitím farbenia podľa Grama je možné identifikovať pneumokoka, baktériu spôsobujúcu zápal pľúc. Tiež pri práci so vzorkou podľa tejto schémy je možné zistiť prítomnosť streptokokov v spúte - pôvodcov angíny, ako aj zlatého stafylokoka. Posledne uvedený mikroorganizmus predstavuje osobitné nebezpečenstvo pre ľudské zdravie. Vyvoláva hnisavé procesy a tvorbu abscesov, vrátane na vnútorné orgány.
Zhrnutie
Bakterioskopická diagnostická metóda je jednou z hlavných výskumných metód v mikrobiológii. Napriek svojim nedostatkom je táto metóda široko používaná v moderná medicína na diagnostiku širokej škály chorôb, z ktorých niektoré, napríklad tuberkulóza, predstavujú pre ľudí osobitné nebezpečenstvo.
Bakteriologická výskumná metóda (BLMI)- metóda založená na izolácii čistých kultúr baktérií kultiváciou na živných pôdach a ich identifikácii k druhu na základe štúdia morfologických, kultúrnych, biochemických, genetických, sérologických, biologických, ekologických charakteristík mikroorganizmov.
Bakteriologická diagnostika infekcií sa vykonáva pomocou štandardných diagnostických schém schválených ministerstvom zdravotníctva.
Čistá kultúra - baktérie rovnakého druhu pestované na živnom médiu, ktorých vlastnosti sú v štádiu skúmania.
Kmeň- identifikovaná čistá kultúra mikroorganizmov rovnakého druhu izolovaná z konkrétneho zdroja v konkrétnom čase. Kmene toho istého druhu sa môžu nevýznamne líšiť v biochemických, genetických, sérologických, biologických a iných vlastnostiach, ako aj v mieste a čase izolácie.
Ciele BLMI:
1. Etiologická diagnóza: izolácia čistej kultúry mikroorganizmov a jej identifikácia.
2. Stanovenie ďalších vlastností, napríklad citlivosti mikroorganizmu na antibiotiká a bakteriofágy.
3. Stanovenie počtu mikroorganizmov (dôležité pri diagnostike infekcií spôsobených UPM).
4. Typizácia mikroorganizmov, teda stanovenie vnútrodruhových rozdielov na základe štúdie genetický a epidemiologické(fagovary a sérovary) značky. Používa sa na epidemiologické účely, pretože vám umožňuje zistiť zhodnosť mikroorganizmov izolovaných od rôznych pacientov a z rôznych objektov vonkajšieho prostredia, v rôznych nemocniciach, geografických oblastiach.
BLMI zahŕňa niekoľko fáz, rozdielne pre aeróby, fakultatívne anaeróby a obligátne anaeróby.
I. Etapy BLMI v izolácii čistej kultúry aeróbov a fakultatívnych anaeróbov.
Etapa.
A. Zber, preprava, skladovanie, predúprava materiálu. Niekedy sa pred výsevom uskutočňuje selektívne spracovanie materiálu, berúc do úvahy vlastnosti izolovaného mikroorganizmu. Napríklad pred vyšetrením spúta alebo iného materiálu na prítomnosť Mycobacterium tuberculosis odolných voči kyselinám sa materiál ošetrí roztokmi kyselín alebo zásad.
B. Naočkovanie do obohacovacieho média(ak je to potrebné).Vykonáva sa, ak testovaný materiál obsahuje malé množstvo baktérií, napríklad pri izolácii krvnej kultúry. Za týmto účelom sa krv odobratá vo výške horúčky vo veľkom objeme (8–10 ml u dospelých, 4–5 ml u detí) naočkuje do média v pomere 1:10 (na prekonanie účinku krvi baktericídnym faktory); výsev sa inkubuje pri teplote 37 0 C počas 18-24 hodín.
B. Mikroskopia testovaného materiálu. Z testovaného materiálu sa pripraví náter, zafarbí sa Gramovou alebo inou metódou a podrobí sa mikroskopii. Posúdiť prítomnú mikroflóru, jej množstvo. V priebehu ďalšieho výskumu by sa mali izolovať mikroorganizmy prítomné v primárnom nátere.
G. Výsev na živnom médiu s cieľom získať izolované kolónie. Materiál sa naočkuje slučkou alebo špachtľou mechanickou separáciou na platni s diferenciálnym diagnostickým alebo selektívnym médiom, aby sa získali izolované kolónie. Po vysiatí sa miska obráti hore dnom (aby sa zabránilo rozmazaniu kolónií kvapôčkami kondenzovanej kvapaliny), podpíše sa a umiestni sa do termostatu pri teplote 37 °C na 18-24 hodín.
Treba pamätať na to, že pri výseve a preosievaní mikrobiálnych kultúr treba upriamiť pozornosť pracovníka na dodržiavanie pravidiel asepsie, aby sa zabránilo kontaminácii živných médií a zabránilo sa infekcii iných a samoinfekcii!
V prípade infekcií spôsobených oportúnnymi mikroorganizmami, kde záleží na počte mikroorganizmov prítomných v patologickom materiáli, sa vykoná kvantitatívna inokulácia materiálu, pre ktorú sa pripraví séria 100-násobných riedení materiálu (zvyčajne 3 riedenia). v sterilnom izotonickom roztoku chloridu sodného v skúmavkách. Potom sa 50 μl každého riedenia vysije na živné médium v Petriho miskách.
Etapa.
A. Štúdium morfotypov kolónií na médiách, ich mikroskopia. Prezerajú si riad a všímajú si optimálne živné médium, rýchlosť rastu a povahu rastu mikroorganizmov. Vyberte si štúdium izolované kolónie umiestnené pozdĺž zdvihu, bližšie k stredu. Ak rastie niekoľko typov kolónií, každý sa skúma samostatne. Posúďte znaky kolónií (tabuľka 7). V prípade potreby sa misky s plodinami prezerajú cez lupu alebo pomocou mikroskopu s malým zväčšením a zúženou clonou. Študujú farbiace vlastnosti rôznych morfotypov kolónií; na tento účel sa pripravuje časť skúmanej kolónie mazať, zafarbené Gramom alebo inými metódami, mikroskopicky a určiť morfológiu čistoty kultúry. orientačná RA na skle s polyvalentnými sérami.
B. Akumulácia čistej kultúry. Na akumuláciu čistej kultúry sa izolované kolónie všetkých morfotypov subkultivujú do samostatných skúmaviek so šikmým agarom alebo iným živným médiom a inkubujú sa v termostate pri +37 0 C (táto teplota je optimálna pre väčšinu mikroorganizmov, ale môže sa líšiť, napríklad pre Campylobacterium spp.- +42 0 C, Candida spp. a Yersinia pestis- +25 °C).
Kliglerovo médium sa zvyčajne používa ako akumulačné médium pre enterobaktérie.
Zloženie Kliglerovho média: MPA, 0,1% glukóza, 1% laktóza, sírovodíkové činidlo (síran železitý + tiosíran sodný + siričitan sodný), indikátor fenolová červeň. Počiatočná farba média je malinovočervená, médium je v skúmavkách „šikmé“: má stĺpik (2/3) a skosený povrch (1/3).
Výsev do Kliglerovho média sa vykonáva zdvihom po povrchu a vstrekovaním do stĺpca.
Etapa.
A. Účtovanie rastu na akumulačnom médiu, hodnotenie čistoty kultúry v Gramovom nátere. rastové vzorce izolovaná čistá kultúra. Vizuálne čistá kultúra sa vyznačuje rovnomerným rastom. O mikroskopické vyšetrenie sfarbený náter pripravený z takejto kultúry, v rôznych zorných poliach sa v ňom nachádzajú morfologicky a tinctoriálne homogénne bunky. V prípade výrazného pleomorfizmu, ktorý je vlastný niektorým typom baktérií, sa však bunky s odlišnou morfológiou môžu vyskytovať súčasne v náteroch z čistej kultúry.
Ak bolo ako akumulačné médium použité Kliglerovo indikátorové médium, potom sa hodnotia jeho farebné zmeny v stĺpci a skosenej časti, podľa ktorých sa stanovujú biochemické vlastnosti: fermentácia glukózy, laktózy a tvorba sírovodíka. Pri rozklade laktózy šikmá časť média zožltne, pri rozklade glukózy stĺpec zožltne. Pri tvorbe CO 2 pri rozklade cukrov vznikajú plynové bubliny alebo prasklina v kolóne. V prípade výroby sírovodíka sa pozdĺž vstrekovania zaznamená sčernanie v dôsledku premeny síranu železnatého na sulfid železnatý.
Charakter zmeny farby Kliglerovho média (obr. 23) sa vysvetľuje nerovnakou intenzitou rozkladu dusíkatých látok mikroorganizmami a tvorbou alkalických produktov za aeróbneho (na šikmej ploche) a anaeróbneho (v a. stĺpec) podmienky.
Pri aeróbnych podmienkach dochádza k intenzívnejšej tvorbe alkálií na šikmej ploche ako v strednom stĺpci. Preto pri rozklade glukózy prítomnej v médiu v malom množstve sa kyselina vznikajúca na skosenej ploche rýchlo neutralizuje. Zároveň pri rozklade laktózy, ktorá je v médiu prítomná vo vysokej koncentrácii, alkalické produkty nie sú schopné kyselinu neutralizovať.
Za anaeróbnych podmienok v kolóne vznikajú alkalické produkty v nevýznamnom množstve, preto sa tu zisťuje fermentácia glukózy.
Ryža. 23. Kliglerovo indikačné médium:
1 - počiatočné,
2 - s rastom E. coli
3- s rastom S. paratyphi B,
4 - s rastom S. typhi
E. coli rozkladajú glukózu a laktózu za tvorby plynov, nevytvárajú sírovodík. Spôsobujú žltnutie stĺpika a skosenej časti s prerušením média.
S. paratyphi rozkladajú glukózu s tvorbou plynu, laktóza-neg. Spôsobujú žltnutie stĺpika s prestávkami, skosená časť nemení farbu a zostáva malinová. V čom S. paratyphi B produkovať sírovodík (pri injekcii sa objaví čierna farba), S. paratyphi A nevzniká sírovodík.
S. typhi rozkladajú glukózu bez tvorby plynov, laktóza-negatívna, produkujú sírovodík. Spôsobujú, že stĺpec bez prestávok zožltne, skosená časť nemení farbu a zostáva malinová, pri nástreku sa objaví čierna farba.
Shigella spp. glukózo-pozitívne, laktózovo-negatívne, neprodukujú sírovodík. Spôsobujú žltnutie stĺpca (s prestávkami alebo bez nich v závislosti od sérovaru), skosená časť nemení farbu a zostáva karmínová.
B. Konečná identifikácia čistej kultúry(určenie systematickej polohy izolovaného mikroorganizmu na úrovni druhu alebo variantu) a stanovenie spektra citlivosti izolovanej kultúry na antibiotiká.
Na identifikáciu čistej kultúry v tomto štádiu sa študujú biochemické, genetické, sérologické a biologické charakteristiky (tabuľka 8).
V bežnej laboratórnej praxi nie je potrebné pri identifikácii študovať všetky vlastnosti. Používajte informatívne, prístupné, jednoduché testy, dostatočné na určenie druhovej (variantnej) príslušnosti izolovaného mikroorganizmu.
9. Bakteriologická metóda diagnostiky infekčných chorôb
Hlavnou metódou mikrobiologickej diagnostiky a „zlatým štandardom“ mikrobiológie je bakteriologická metóda.
Účel bakteriologickej metódy spočíva v izolácii čistej kultúry patogénu z testovaného materiálu, akumulácii čistej kultúry a identifikácii tejto kultúry súborom vlastností: morfologické, tinktoriálne, kultúrne, biochemické, antigénne, prítomnosťou patogenity, faktorov toxigenity a určením jej citlivosti na antimikrobiálne lieky a bakteriofágy.
Metóda bakteriologického výskumu zahŕňa:
1. naočkovanie testovaného materiálu do živných médií
2. izolácia čistej kultúry
3. identifikácia mikroorganizmov (určenie príslušnosti k druhu).
Izolácia a identifikácia čistých kultúr aeróbnych a anaeróbnych baktérií zahŕňa nasledujúce štúdie:
I. fáza (práca s natívnym materiálom)
Účel: získanie izolovaných kolónií
1. Predbežná mikroskopia poskytuje približnú predstavu o mikroflóre
2. Príprava materiálu na výskum
3. Výsadba na husté živné médium na získanie izolovaných kolónií
4. Inkubácia pri optimálnej teplote, najčastejšie 37°C, 18-24 hodín
II etapa
Účel: získanie čistej kultúry
1. Makroskopické štúdium kolónií v prechádzajúcom a odrazenom svetle (charakteristika veľkosti, tvaru, farby, priehľadnosti, konzistencie, štruktúry, obrysu, povrchu kolónií).
2. Mikroskopické vyšetrenie izolovaných kolónií
3. Testovanie aerotolerancie (na potvrdenie prítomnosti striktných anaeróbov v testovanom materiáli).
4. Výsev kolónií charakteristických pre určitý druh na čisté kultivačné akumulačné médiá alebo elektívne médiá a inkubácia za optimálnych podmienok.
Stupeň III
Účel: Identifikácia izolovanej čistej kultúry
1. Na identifikáciu izolovanej kultúry podľa komplexu biologických vlastností sa študuje nasledovné:
morfológia a farbiace vlastnosti
kultúrne vlastnosti (povaha rastu na živných médiách)
biochemické vlastnosti (enzymatická aktivita mikroorganizmov)
sérologické vlastnosti (antigénne)
virulentné vlastnosti (schopnosť produkovať faktory patogenity: toxíny, enzýmy, obranné a agresívne faktory)
patogénnosť pre zvieratá
fágová lizabilita (citlivosť na diagnostické bakteriofágy)
citlivosť na antibiotiká
iné individuálne vlastnosti
Štádium IV (záver)
Podľa študovaných vlastností sa robí záver o izolovanej kultúre
Prvá etapa výskumu.Štúdium patologického materiálu začína mikroskopiou. Mikroskopia farbeného natívneho materiálu umožňuje približne stanoviť zloženie mikrobiálnej krajiny študovaného objektu, niektoré morfologické znaky mikroorganizmov. Výsledky mikroskopie natívneho materiálu do značnej miery určujú priebeh ďalšieho výskumu a následne sa porovnávajú s údajmi získanými pri očkovaní na živné pôdy.
Pri dostatočnom obsahu patogénnych mikroorganizmov vo vzorke sa očkovanie uskutočňuje na hustých živných médiách (na získanie izolovaných kolónií). Ak je v testovanom materiáli málo baktérií, potom sa očkovanie vykoná na tekuté živné obohacovacie médium. Živné pôdy sa vyberajú podľa požiadaviek mikroorganizmov.
Kultivácia mikroorganizmov je možná len pri vytváraní optimálnych podmienok pre ich životne dôležitú činnosť a dodržiavaní pravidiel vylučujúcich kontamináciu (náhodnú kontamináciu cudzími mikróbmi) testovaného materiálu. V skúmavke, banke alebo Petriho miske je možné vytvoriť umelé podmienky, ktoré by vylúčili kontamináciu kultúry inými druhmi. Všetky nádoby a živné pôdy musia byť sterilné a po naočkovaní mikrobiálnym materiálom chránené pred vonkajšou kontamináciou, čo sa dosiahne pomocou zátok alebo kovových uzáverov a viečok. Manipulácie s testovacím materiálom by sa mali vykonávať v zóne plameňa alkoholovej lampy, aby sa vylúčila kontaminácia materiálu z vonkajšieho prostredia, ako aj z dôvodu dodržania bezpečnostných predpisov.
Naočkovanie materiálu na živné pôdy by sa malo vykonať najneskôr do 2 hodín od okamihu ich odberu.
Druhá etapa výskumu.Štúdium kolónií a izolácia čistých kultúr. Po dni inkubácie rastú kolónie na platniach a pri prvom zdvihu je rast nepretržitý a pri ďalšom - izolované kolónie. Kolónia je súbor mikróbov rovnakého druhu, ktoré vyrástli z jednej bunky. Keďže materiál je najčastejšie zmes mikróbov, rastie niekoľko druhov kolónií. Rôzne kolónie sú označené ceruzkou, načrtnuté krúžkom zo strany dna a preštudované (tabuľka 11). Najprv študujte kolónie voľným okom: makroskopické znaky. Miska sa prezerá (bez jej otvorenia) zospodu v prechádzajúcom svetle, zaznamená sa priehľadnosť kolónií (priehľadná, ak nezachytáva svetlo; priesvitná, ak čiastočne zachytáva svetlo; nepriehľadná, ak svetlo neprechádza svetlom). kolónie), zmerajte (v mm) veľkosť kolónií. Potom sa kolónie skúmajú zo strany viečka, zaznamená sa tvar (pravidelný okrúhly, nepravidelný, plochý, konvexný), povaha povrchu (hladký, lesklý, matný, drsný, zvrásnený, mokrý, suchý, hlienovitý), farba (bezfarebná, farebná).
Tabuľka 11. Schéma štúdia kolónií
|
Možné charakteristiky kolónie |
||
|
Ploché, konvexné, kupolovité, prehĺbené, okrúhle, rozetovité, hviezdicovité |
||
|
Veľkosť, mm |
Veľký (4-5 mm), stredný (2-4 mm), malý (1-2 mm), trpaslík (< 1 мм) |
|
|
Povrchová povaha |
Hladký (tvar S), drsný (tvar R), slizký (tvar M), pruhovaný, hrboľatý, matný, lesklý |
|
|
Bezfarebné, farbené |
||
|
Transparentnosť |
Priehľadné, nepriehľadné, priesvitné |
|
|
Povaha okrajov |
Hladké, zúbkované, strapcové, vláknité, vrúbkované |
|
|
Vnútorná štruktúra |
Homogénne, zrnité, heterogénne |
|
|
Dôslednosť |
Viskózny, slizký, drobivý |
|
|
Emulgácia v kvapke vody |
Dobrý zlý |
Poznámka: 5-7 bodov sa študuje pri malom zväčšení mikroskopu.
Rozdiel medzi kolóniami ešte lepšie uvidíte, keď si ich priblížite. Za týmto účelom sa uzavretá miska položí hore nohami na stôl na predmety, kondenzor sa mierne zníži, použije sa malé zväčšenie objektívu (x8), pohybuje sa miskou, v kolóniách sa študujú mikroskopické znaky: povaha okraj (hladký, vlnitý, zúbkovaný, vrúbkovaný), štruktúra (homogénna, zrnitá, vláknitá, homogénna alebo odlišná v strede a po obvode).
Ďalej sa študuje morfológia mikrobiálnych buniek z kolónií. Na tento účel sa z časti každej z označených kolónií urobia nátery zafarbené podľa Grama. Pri odbere včelstiev dávajte pozor na konzistenciu (suché, ak sa včelstvo drobí a ťažko sa odoberá; mäkké, ak sa ľahko nasáva na slučku; slizké, ak včelstvo siaha po slučke; tvrdé, ak je súčasťou včelstva nie je zachytený slučkou, môže sa odstrániť iba celá kolónia).
Pri prezeraní náterov sa zistí, že kolónia je reprezentovaná jedným typom mikróbov, preto je možné izolovať čisté kultúry baktérií. Aby sa to dosiahlo, zo študovaných kolónií sa uskutoční opätovný výsev na šikmý agar. Pri opätovnom výseve z kolónií je potrebné dbať na to, aby ste vzali presne zamýšľané kolónie bez toho, aby ste sa dotkli slučky blízkych kolónií. Skúmavky sú označené a inkubované v termostate pri 37 °C počas 24 hodín.
Tretia etapa výskumu. Identifikácia izolovanej kultúry. Identifikácia mikróbov - určenie systematickej polohy kultúry izolovanej z materiálu k druhu a variantu. Prvou podmienkou spoľahlivosti identifikácie je bezpodmienečná čistota kultúry. Na identifikáciu mikróbov sa používa súbor znakov: morfologické (tvar, veľkosť, prítomnosť bičíkov, toboliek, spór, relatívna poloha v nátere), tinktoriálne (vzťah k farbeniu podľa Grama alebo iné metódy), chemické (pomer guanín + cytozín v molekula DNA), kultúrna (požiadavky na živiny, kultivačné podmienky, rýchlosť rastu a príroda na rôznych živných médiách), enzymatická (štiepenie rôzne látky s tvorbou medziproduktov a finálne produkty), sérologické (antigénna štruktúra, špecifickosť), biologické (virulencia pre zvieratá, toxigenita, alergénnosť, účinok antibiotík a pod.).
Pre biochemickú diferenciáciu schopnosť baktérií fermentovať sacharidy s tvorbou medziproduktov a konečné produkty, schopnosť degradovať proteíny a peptóny a študovať redoxné enzýmy.
Na štúdium sacharolytických enzýmov sa izolované kultúry naočkujú do skúmaviek s polotekutým médiom obsahujúcim laktózu, glukózu a iné sacharidy a viacsýtne alkoholy. Na polotekutých médiách sa očkovanie uskutočňuje injekciou do hĺbky média. Pri výseve injekciou sa skúmavka s médiom drží pod uhlom, zátka sa odstráni a okraj skúmavky sa spáli. Materiál sa odoberá sterilnou slučkou a prepichne sa ňou stĺpec živnej pôdy takmer až po dno.
Na stanovenie proteolytických enzýmov sa izolovaná kultúra naočkuje peptónovou vodou alebo MPB. Aby to urobili, zoberú skúmavku s očkovaním bližšie k sebe a skúmavku s médiom - ďalej od seba. Obidve skúmavky sa súčasne otvoria, malíčkom a okrajom dlane sa zachytia ich zátky, okraje skúmaviek sa spália, kalcinovanou ochladenou slučkou sa zachytí trochu kultúry a prenesie sa do druhej skúmavky , rozotreté v kvapalnom médiu na stene skúmavky a zmyté médiom.
Pri výseve a dosevu je potrebné dbať na dodržiavanie pravidiel sterility, aby nedošlo ku kontaminácii vašich plodín cudzou mikroflórou a tiež k kontaminácii životné prostredie. Skúmavky sa označia a umiestnia sa do termostatu na inkubáciu pri 37 °C počas jedného dňa.
Záver
Účtovanie výsledkov. Záver výskumu. Zohľadnia sa výsledky identifikácie a na základe súhrnu získaných údajov, na základe klasifikácie a charakteristík typových kmeňov opísaných v príručke (Bergyho príručka, 1994-1996) sa určí typ izolovaných kultúr.
Bakteriologická výskumná metóda. Izolácia čistej kultúry aeróbnych baktérií (1-2 stupne)
1. Podstata bakteriologickej metódy
3. Spôsoby získania izolovaných kolónií
4. Spôsoby získania čistej kultúry
1. Vykonajte primárny výsev Kochovou a Drygalského metódou
2. Izolujte čistú kultúru
Pracovný plán:
1. Bakteriologická výskumná metóda
2. Etapy bakteriologickej metódy
3. Koncept: čistá kultúra, kmeň, kolónia
4. Spôsoby získania izolovaných kolónií
5. Spôsoby získania čistej kultúry aeróbnych baktérií
Hlavnou metódou laboratórnej diagnostiky infekčných ochorení je bakteriologická metóda. Podstatou bakteriologickej metódy je izolácia patogénov zo skúmaného materiálu a jeho identifikácia (definícia rodu, druhu, odrôd).
Bakteriologická metóda vám umožňuje určiť:
1. Typ patogénu a stanovenie diagnózy ochorenia
2. Antibiotiká, ktoré zabíjajú patogén a predpisujú vhodnú liečbu
3. Fagovary a sérovary patogénu na identifikáciu zdroja infekcie
Prvým stupňom je primárna inokulácia testovaného materiálu na získanie izolovaných kolónií. Primárny výsev sa vykonáva na pamäťové médiá a DDS (pohárové médiá).
Druhou fázou je charakterizácia izolovaných kolónií a získanie čistej kultúry z nich presadením na šikmý stĺpec hlavného média.
Treťou etapou je identifikácia čistej kultúry – určenie rodu, druhu, odrôd patogénu, stanovenie citlivosti na antibiotiká, stanovenie fagovarov.
Kultúra mikroorganizmov sú baktérie pestované na živných médiách. Čistá kultúra je jeden druh baktérií pestovaných na živných médiách. V rámci druhu existujú odrody, ktoré sa líšia v jednom znaku:
1. Morfovary – líšia sa morfológiou
2. Chemovary – líšia sa biochemickými vlastnosťami
3. Sérovary – líšia sa antigénnymi vlastnosťami
4. Fagovary – líšia sa citlivosťou na fágy
Čistá kultúra je potrebná na identifikáciu, stanovenie sérovarov, fagovarov, citlivosti na antibiotiká. Kmeň je jeden druh baktérie izolovaný zo špecifického zdroja (rieka Volga, chorý Ivanov atď.). Kolónia - viditeľná akumulácia baktérií rovnakého druhu, vytvorená počas reprodukcie jednej bakteriálnej bunky na hustom živnom médiu.
Prvým stupňom štúdie je primárna inokulácia testovaného materiálu na získanie izolovaných kolónií. Pred počiatočnou inokuláciou sa vykoná mikroskopia testovaného materiálu. Testovaný materiál zvyčajne obsahuje zmes rôznych baktérií vrátane patogénov. Na izoláciu patogénu je potrebné získať izolované kolónie (baktérie rovnakého druhu) výberom živného média a použitím špeciálnych metód výsevu.
Existujú dva spôsoby získania izolovaných kolónií:
1. Drygalského metóda
