Farbenie náterov podľa Gramovej metódy Najbežnejšia metóda farbenia baktérií, ktorá umožňuje klasifikovať bunky podľa typu sfarbenia steny na gracilicutes (gram-negatívne) alebo firmicutes (gram-pozitívne).

Na fixovaný náter sa položí kúsok filtračného papiera, na ktorý sa naleje karbolický roztok genciánovej violeti po dobu 30-50 sekúnd. Farbivo sa vypustí, papier sa odstráni, na 60 sekúnd sa aplikuje Lugolov roztok. Lugolov roztok zlikvidujte. Opláchnite liek v 95 ° etanole po dobu 30-50 sekúnd, kým farbivo neprestane odchádzať, čo závisí od hrúbky náteru. Prípravok sa premyje vodou, farbí sa 30-60 sekúnd Pfeiffer fuchsínom, premyje sa vodou, suší sa a mikroskopuje. Mikroskopický obraz: grampozitívne baktérie - fialové, gramnegatívne - červené.

Prax ukazuje, že čistejšie prípravky bez ujmy na rozlišovaní sa získajú, ak sa náter po zafarbení genciánovou violeťou mierne opláchne vodou, ktorej zvyšky sa vytrasú a až potom sa aplikuje Lugolov roztok.

Modifikácia podľa A.P. Sineva. Prúžok papiera s farbivom sa umiestni na pevný náter, nalejú sa 2-3 kvapky vody a farbia sa 2 minúty. Potom postupujte podľa popisu vyššie.

Kerryho modifikácia. Náter sa farbí 1-2 minúty alkoholovým roztokom genciánovej violeti, spracováva sa roztokom jódu počas 1-2 minút, potom etanolom počas 30-40 sekúnd. Umyté. Opakovane ošetrené 1 minútu roztokom jódu, umyté, farbené 1-2 minúty fuchsínom alebo zmesou safranínu s brilantnou zeleňou.

Burkeho modifikácia. Roztok A: 1% roztok kryštálovej violeti v destilovanej vode.

Moridlo: kryštalický jód - 1 g, jodid draselný - 2 g, destilovaná voda - 100 ml.

Rozpúšťadlo na odfarbenie: etyléter - 1 objem, acetón - 3 objemy.

Prídavné farbivo: 2% roztok safranínu v destilovanej vode.

Metodológia. Náter fixovaný zahrievaním sa ponorí do roztoku A. Náter sa opláchne v jódovom moridle a zaleje sa čerstvým moridlom na 2 minúty. Opláchnite vodou a potom bieliacim rozpúšťadlom, až kým nebude odpadová voda bez farby. Po vysušení farbiť ďalším farbivom na 5-10 sekúnd, opláchnuť vodou a pod mikroskopom.

Hooker úprava

Roztok A: kryštálová violeť - 2 g, 95% etanol - 20 ml.

Roztok B: šťavelan amónny - 0,8 g, destilovaná voda - 80 ml.

Roztoky A a B v pripravených objemoch sa zmiešajú v tmavej fľaštičke a nechajú sa 24 hodín pri teplote miestnosti.

Roztok B: 2,5% roztok safranínu (v 96% etanole) - 10 ml, destilovaná voda - 100 ml.

Metodológia. Náter fixovaný zahrievaním sa ponorí do zmesi roztokov A a B na 1 minútu, potom sa prípravok premyje vodou a na 1 minútu sa spracuje Lugolovým roztokom, potom sa znova premyje vodou a vysuší; Na 30 s sa aplikuje 96% etanol, prípravok sa dôkladne premyje vodou, vysuší, umiestni na 10 sekúnd do roztoku B, mierne premyje vodou, vysuší a podrobí mikroskopii.

Test hydroxidu draselného na sledovanie výsledkov bakteriálneho Gramovho farbenia. Ak Gramova škvrna nie je jasná, táto metóda vám umožňuje spresniť výsledok.

Nastavenie testu. Na podložné sklíčko sa nanesú 1-2 kvapky 3% roztoku KOH. Agarová kultúra sa zavedie do KOH pomocou bakteriologickej slučky, premieša sa a potom sa slučka zdvihne. Ak kultúra vo forme "nitky" siaha po slučke - gramnegatívnej, pri absencii tohto javu - grampozitívnej baktérii.

Metódy farbenia acidorezistentných baktérií

Farbenie Ziehl-Nielsen. Farbivo Carbol fuchsin sa pripraví: zásaditý fuchsín - 0,3 g, 95% etanol - 10 ml, fenol (kryštály sa roztopia pri zahrievaní) - 5 ml, destilovaná voda - 95 ml.

Zásaditý fuchsín sa rozpustí v etanole, pridá sa fenol rozpustený vo vode, premieša sa, udržiava sa 5 až 7 dní pri teplote miestnosti; pred použitím prefiltrujte cez filtračný papier.

Rozpúšťadlo na odfarbenie (chlorovodíkový alkohol): etanol 95% - 97 ml, koncentrovaná kyselina chlorovodíková - 3 ml. Ďalšie farbivo: metylénová modrá - 0,3 g, destilovaná voda - 100 ml.

Metodológia. Karbol-fuchsínové farbivo sa naleje na náter zafixovaný zahrievaním, zahrieva sa, kým neuniknú výpary (ale nevrieť!). Po 5 minútach sa premyje vodou. Potom sa náter na 30 až 50 sekúnd ošetrí bieliacim rozpúšťadlom, premyje sa vodou a potom sa bakteriálny film na nátere zmení na svetloružový.

Náter sa farbí počas 3 až 5 minút ďalším farbivom (metylénová modrá atď.), premyje sa vodou a vysuší.

Kyslostále mikroorganizmy v nátere sú červené, ostatné sú modré.

Auramínová škvrna. Roztok A: auramín - 1,5 g, rodamín B - 0,75 g, glycerín - 75 ml, roztavený fenol - 10 ml, destilovaná voda - 50 ml.

Farbivá: fenol a glycerín sa rozpustí v 25-30 ml vody, pridá sa zvyšný objem vody a prefiltruje sa cez sklenú vatu.

Roztok B: 70 % etanol - 99,5 ml, koncentrovaná kyselina chlorovodíková - 0,5 ml.

Roztok B: manganistan draselný - 0,5 g, destilovaná voda - 99,5 ml.

Metodológia. Náter fixovaný nad plameňom horáka sa farbí 15 minút roztokom A pri izbovej teplote alebo pri 37-38 °C. Premýva sa pod tečúcou vodou až do odfarbenia. Roztok B sa naleje na náter na 3-5 minút, premyje a farbí ďalšie 2-4 minúty roztokom C. Premytý, vysušený, mikroskopicky vo fluorescenčnom mikroskope pod ponorením (filtrom excitujúceho svetla BG-12, blokujúcim OG-1) .

Kyslo-stále baktérie žlto-oranžové na tmavom pozadí.

Farbenie mušiek. Droga vydrží 24 hodín v roztoku metyl violeti (10 ml nasýteného alkoholového roztoku metyl violeti, 100 ml 2% vodného roztoku kyseliny karbolovej). Lugolov roztok sa aplikuje 1-2 minúty, potom sa na 1 minútu aplikuje 5% roztok kyselina dusičná a 10 sekúnd 3% roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Potom sa na prípravok nanesie zmes etanolu a acetónu (1:1), až kým farba neprestane vypadávať, premyje sa vodou, vysuší sa a mikroskopuje.

Metódy farbenia spór

Aujeszkyho metóda. Náter vysušený na vzduchu bez fixácie sa ošetrí 2-3 minúty (pri zahrievaní) s 0,5% kyselinou sírovou, premyje sa a fixuje sa nad plameňom. Farbí sa 7-8 minút Zielovým karbolfuchsínom pri zahriatí, farba sa scedí. Na náter sa pôsobí 5 až 7 sekúnd 5 % roztokom kyseliny sírovej, premyje sa a farbí sa metylénovou modrou počas 4 až 5 minút. Pod mikroskopom je vegetatívna časť bunky modrá, spóra červená.

Mellerova metóda. Náter fixovaný nad plameňom sa leptá 2-3 minúty 5% kyselinou chrómovou, premyje sa a zafarbí sa Zielovým karbolickým fuchsínom. Bielenie a farbenie rovnakým spôsobom ako pri Aujeszkeho metóde.

Peshkovova metóda. Fixovaný náter sa zafarbí metylénovou modrou zahriatou do varu. Farba sa zmyje a farbí 1% vodným roztokom neutrality počas 10 sekúnd. Umyté, vysušené. Spóry sú modré, vegetatívne bunky sú červené.

Schaeffer-Fultonova metóda. 0,5 % vodný roztok malachitovej zelene sa naleje na náter fixovaný zahrievaním, prekrytý filtračným papierom. Náter sa umiestni na 5 minút nad vriacou vodou. Premyté a kontrastné farbenie počas 30 sekúnd s 2% vodným roztokom safranínu. Umyté, vysušené. Spóry sú jasne zelené, vegetatívne bunky sú červenohnedé.

Trujillova metóda. Náter sa fixuje nad plameňom horáka, zaleje sa nasýteným vodným roztokom malachitovej zelene, zahrieva sa, kým sa neobjaví para, a zafarbí sa 3 minúty. Farba sa zmyje vodou a škvrna sa farbí 0,25 % vodným roztokom zásaditého fuchsínu počas 1 minúty. Umyté, vysušené. Spóry sú zelené, vegetatívne bunky sú červené.

Dornerova metóda. Náter fixovaný na plameni horáka sa pri zahrievaní farbí na 5 až 10 minút karbolfuchsínom, odfarbí sa na 1 minútu alkoholom kyseliny chlorovodíkovej (3 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej a 97 ml 96 % etanolu). Droga sa premyje, suší filtračným papierom a naleje sa na náter s tenkou vrstvou 10% roztoku nigrozínu v 0,5% roztoku formalínu. Bez umývania sa náter suší na vzduchu a mikroskopuje. Spóry sú červené, vegetatívne bunky sú na čiernom podklade bezfarebné.

Waldmanova metóda. Na fixovaný prípravok sa nanesie lefleur blue (zásaditá) a zohreje sa do varu, potom sa ochladí a premyje vodou. Farbte 1% neutrálnym roztokom po dobu 30 sekúnd. Mikroskopický obraz: spóry - modré, vegetatívne bunky - červené.

Ozheshka metóda. 0,5% roztok HC1 sa naleje na nefixovaný náter a zahrieva sa 1-2 minúty. Kyselina sa scedí, prípravok sa premyje vodou, vysuší, zafixuje na plameni a zafarbí podľa Ziehl-Neelsenovej metódy. Mikroskopický obraz: spóry - červené, vegetatívne bunky - modré.

Spôsoby farbenia kapsúl

Romanovského-Giemsova metóda. Náter fixovaný v etanole alebo Nikiforovovej kvapaline sa umiestni do farby Romanovsky-Giemsa (15-20 kvapiek farby na 10 ml destilovanej vody) na 15-20 minút. Umyté, vysušené. Telo baktérií je sfarbené na tmavomodro, kapsuly sú ružové.

Oltova metóda. Zafixované šmuhy nad plameňom horáka sa farbia 1-3 minúty 2% vodným roztokom safranínu (safranín sa rozpustí v horúca voda prefiltrujte, naneste čerstvo pripravený roztok). Telo baktérie je sfarbené do hneda, kapsula je svetložltá.

Rebigerova metóda. Nefixovaný náter sa farbí 15-20 sekúnd roztokom genciánovej violeti vo formalíne (15-20 g genciánovej violeti sa rozpustí v 100 ml 40% formalínu, usadí, prefiltruje), premyje vodou. Telo baktérie je tmavofialové, kapsula je červenofialová.

Antonova cesta. Náter sa farbí 2 minúty 1 % vodným roztokom kryštálovej violeti. Farba sa zmyje 20 % vodným roztokom síranu meďnatého (CuS04.5H20), prebytočný roztok sa vytrasie a náter sa vysuší filtračným papierom bez oplachovania vodou. Mikróby - tmavo fialová, kapsula - svetlo modrá.

Ginsova metóda. Kvapka čierneho atramentu zriedeného v pomere 1:3 destilovanou vodou sa nanesie na podložné sklíčko a odstreďuje sa pri 3000 otáčkach za minútu počas 15 minút. V kvapke jatočného tela sa kultúra suspenduje pomocou slučky a urobí sa náter (podobne ako krvný náter). Vysušte, zafixujte nad plameňom kahana, nafarbite Zielovým karbolfuchsínom, zriedeným 1:3. Bakteriálne telá sú červené. Kapsula na tmavom pozadí je viditeľná ako svetlý halo okolo baktérií.

Mikhinova metóda. Náter sa farbí 3-5 minút Leffleurovou modrou (vhodná je len farba, ktorá bola skladovaná aspoň 20-30 dní, pretože počas skladovania sa v nej vytvára azúr, ktorý dáva metachromatickosť). Telá baktérií sú modré, kapsula je ružová.

Gissova metóda. Na podložné sklíčko sa nanesie kvapka normálneho krvného séra hovädzieho dobytka alebo koní (alebo kvapka odstredeného mlieka), do neho sa slučkou zavedie kultúra, suspenduje sa a pripraví sa náter. Film bakteriálnej suspenzie sa suší na vzduchu, fixuje sa nad plameňom horáka a farbí sa 0,1 % vodnou kryštálovou violeťou počas 1 minúty. Náter sa premyje 20% vodným roztokom síranu meďnatého a vysuší filtračným papierom. Kapsuly v nátere sú bledomodré, telá baktérií sú tmavofialové.

Dugidova metóda. Kvapka čierneho atramentu sa umiestni na podložné sklíčko a kultúra sa v ňom suspenduje. Kvapka sa prekryje krycím sklom, prebytočný atrament sa odstráni filtračným papierom. Na hnedo-čiernom pozadí sú viditeľné baktérie lámajúce svetlo, obklopené kapsulou vo forme priehľadnej zóny.

Jonovým spôsobom. Na jeden koniec povrchu podložného skla sa nanesie kvapka atramentu zriedeného v pomere 1:2-1:4 destilovanou vodou. Baktérie sa suspendujú v kvapke a pripraví sa náter (ako krvný náter). Prípravok sa suší na vzduchu, fixuje sa nad plameňom horáka a farbí sa 2 minúty 2 % vodným roztokom genciánovej violeti alebo 1 % roztokom fuchsínu. Premyté vodou, ošetrené 2% roztokom kyseliny octovej počas 8-10 sekúnd a znovu premyté. V nátere je okolo intenzívne zafarbených baktérií viditeľná nezafarbená kapsula.

metóda farbenia bičíkov

Prítomnosť bičíkov v baktériách sa posudzuje podľa nepriamych znakov, napríklad podľa mobility buniek v prípravkoch „rozdrvená kvapka“, „visiaca kvapka“, ako aj podľa povahy rastu testovanej kultúry v polotekutom agar (0,15-0,3 %). V druhom prípade sa testovaná kultúra naočkuje vpichom do pankreasu a inkubuje sa 18 až 24 hodín. V procese rastu pohyblivé baktérie migrujú zo vstrekovacieho potrubia, čo spôsobuje zakalenie média, zatiaľ čo nepohyblivé baktérie rastú iba pozdĺž vstrekovania.

V niektorých prípadoch sa použijú metódy farbenia, ktoré umožňujú priame pozorovanie bičíkov

Pre všetky metódy farbenia by mali byť sklíčka pripravené z mladých agarových kultúr (14-20 hodín rastu). 0,5% vodný roztok peptónu sa pridá do skúmaviek s kultúrou na šikmom agare počas 30-40 minút. Kvapalina je usadená, kvôli sedimentácii mikróbov, ktoré do nej prešli, sa odstredí. Sediment sa naleje do fyziologického roztoku a znova sa odstredí. Aby sa zabránilo strate bičíkov, premytá zrazenina sa resuspenduje v 10% roztoku formalínu, aby sa získala mierne zakalená suspenzia.

Bičíky zafarbené kyselinou osmikovou. Na čistom odtučnenom predmete alebo hodinovom sklíčku sa kvapka suspenzie baktérií zmieša s kvapkou 2% roztoku kyseliny osmikovej. Výsledná kvapka zmesi sa nanesie tenkou kapilárou Pasteurovej pipety na čisté podložné sklíčko bez tuku. Vysušte na vzduchu a pripevnite na plameň (zabráňte prehriatiu!).

Moridlo pripravené za niekoľko dní sa naleje na fixovaný prípravok (1 ml nasýteného alkoholového roztoku fuchsínu, 10 ml 20% vodného roztoku tanínu a 5,5 ml nasýteného vodného roztoku síranu železnatého a amoniaku). Po 15 minútach sa moridlo zmyje vodou, farbí sa fuchsínom počas 4 minút, premyje sa a mikroskopicky.

Farbenie bičíkov striebrom. Zo suspenzie sa pripraví tenký náter, vysuší sa a fixuje sa 2 až 3 minúty 2 % roztokom kyseliny osmiovej. Droga sa premyje ponorením na 2 – 3 s v 0,5 % vodnom roztoku dusičnanu strieborného a bez premývania sa na 2 – 3 s ponorí do nálevu (pyrogalol alebo kyselina galová - 2,0 g, tanín - 1,2 g, octan sodný - 4,0 g, destilovaná voda - 150 ml). Vyberie sa z moridla a opäť sa ponorí do roztoku dusičnanu strieborného, ​​kým prípravok nezčernie. Po umytí sa vykoná mikroskopia.

Sfarbenie bičíkov podľa Plimmera. Pripraví sa farba: tanín - 5,0 g, chlorid zinočnatý - 5,0 g, chlorid hlinitý - 10,0 g, fuchsínový prášok - 0,75 g vzorky uvedených zložiek sa rozomelie v mažiari, postupne sa pridáva 40 ml 60% etanolu až do úplného rozpustenia . Pred použitím sa farba zriedi vodou (1: 5).

Prúžok filtračného papiera sa položí na zaschnutý tenký náter a naplní sa pripravenou farbou. Po 2 minútach sa farba zmyje vodou a dodatočne sa zafarbí karbolfuchsínom Ziehl. Baktérie a bičíky sú červené.

Sfarbenie bičíkov podľa Benichettiho. Vopred sú pripravené 3 roztoky. Roztok 1: síran zinočnatý - 0,5 g, tanín - 8,0 g, destilovaná voda - 50 ml. Roztok 2: nasýtený roztok kamenca draselného. Riešenie 3: Nasýtený roztok genciánovej violeti alebo kryštálovej violeti. Pred použitím sa roztoky zmiešajú (5:5:3). Zmes roztokov sa naleje na vysušený náter a zahrieva sa, kým sa neobjaví para. Po 3 minútach umyte a pod mikroskopom. Fialovo-čierne bičíky.

Farbenie podľa Valentiho. Náter sa ošetrí 3 minúty 20% roztokom tanínu pri zahriatí, premyje sa, pri zahrievaní sa farbí 10 minút karbolickým fuchsínom. Umyté, mikroskopické. Baktérie a bičíky sú červené.

Šedé sfarbenie. Roztok A: tanín 20% vodná kyselina - 2 ml, nasýtený vodný roztok kamenca draselného - 5 ml, chlorid ortuťnatý, nasýtený vodný roztok - 2 ml, zásaditý fuchsín 3% v 96% etanole - 0,4 ml. Farbivo (purpurová) sa pridá k zvyšku zložiek bezprostredne pred použitím a po jeho rozpustení sa výsledný roztok prefiltruje cez filtračný papier. Roztok B: Zielov karbolický fuchsín (základný fuchsín 3% v 95% etanole - 10 ml, fenol - 5 ml, destilovaná voda - 95 ml).

Metodológia. Na pohár sa nanesie kvapka baktérií (suspenzia) vo formalíne a nechá sa odtiecť. Suché na vzduchu. Vložte prúžok filtračného papiera a nalejte 4-6 minút roztokom A. Premyte vodou a farbite roztokom B 3 minúty cez filtračný papier.Umyte, vysušte, pod mikroskopom. Bičíky a baktérie sú červené.

Farbenie podľa Lifesona. Pripravte 3 roztoky. Roztok 1: 1,5 % roztok chloridu sodného v destilovanej vode. Roztok 2: 3% roztok kyseliny trieslovej v destilovanej vode. Roztok 3: kyselina octová rosanilín - 0,9 g, kyselina chlorovodíková prozanilín - 0,3 g, 96% etanol - 100 ml. Roztoky 1 a 2 sa rovnomerne zmiešajú a potom sa 2 objemy tejto zmesi nalejú do 1 objemu roztoku 3. Zmes sa uchováva v chladničke až 3 mesiace.

Metodológia. Kvapka kaše sa nanesie na dobre odmastené sklo a nechá sa odtiecť. Po vysušení sa okraje bakteriálneho filmu načrtnú ceruzkou na sklo, oblasť sa naplní farbivom na 7-15 minút. Vydržte, kým povrch farbiva nezíska zlatú farbu a film baktérií nie je pokrytý sedimentom. Umyté, vysušené. Baktérie a bičíky sú červené.

Metódy farbenia bunkovej steny

Farbenie bunkovej steny má diagnostickú hodnotu pri odlíšení mykoplazmy od baktérií.

Gutsteinova metóda. Droga sa fixuje 1-2 hodiny v Bouinovej kvapaline, 2-3 minúty sa uchováva v 5-10% vodnom roztoku tanínu, premyje sa vodou a mikroskopuje sa v kvapke 0,01% vodného roztoku kryštálovej violeti.

Peshkovova metóda. Liečivo sa fixuje 15 minút v kvapaline s nasledujúcim zložením: etanol 90% - 60 ml, chloroform - 30 ml, octová esencia - 10 ml. Potom sa prípravok nechá 2 až 5 minút v 10 % vodnom roztoku tanínu, premyje sa vodou, farbí sa 30 až 60 sekúnd Pfeiffer magenta a bez miešania sa suší a mikroskopuje.

Metóda) Robinow. Študovaný mikroorganizmus sa pestuje na agarovom médiu v Petriho miske, vyreže sa blok agaru, ktorý sa povrchom umiestni na krycie sklíčko, vloží sa cez noc do Bouinovej tekutiny. Nasledujúci deň sa agar odstráni, sklo sa položí lícom nadol na povrch 5-10% vodného roztoku kyseliny trieslovej na 20-30 minút. Potom sa prípravok premyje vodou, na povrch 0,02% vodného roztoku kryštálovej violeti sa na 5-10 sekúnd umiestni krycie sklo s bunkami baktérií nadol. Výsledkom je, že bunkové membrány a priečky sú zafarbené tmavomodrou alebo čiernou farbou a cytoplazma zostáva nezafarbená.

Spôsoby farbenia cytoplazmatických inklúzií

Pri identifikácii mikroorganizmov sú mimoriadne dôležité údaje o prítomnosti inklúzií v bunkách odrážajúcich typ a smer konštruktívneho metabolizmu. Cytoplazmatické inklúzie zahŕňajú kyselinu poly-β-hydroxymaslovú, zrnká metachromatínu (volutín) a polysacharidy.

Kyselina poly-β-hydroxymaslová je polyester kyseliny beta-hydroxymaslovej, ktorý sa akumuluje v cytoplazme buniek vo forme okrúhlych alebo oválnych granúl s veľkosťou 200-800 nm. Metachromatín sú polyfosfáty a polysacharidy sú glukány pozostávajúce z D-glukózy s veľkosťou do 200 nm. Uvedené inklúzie pôsobia ako akési zásoby bunkových látok a dajú sa zistiť špeciálnymi metódami farbenia.

Detekcia kyseliny poly-beta-hydroxymaslovej

Náter fixovaný nad plameňom horáka sa farbí 5 až 15 minút 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v etylénglykole. Farba sa scedí a po vysušení na vzduchu bez umytia vodou sa opláchne v xyléne. Po zaschnutí náteru sa na 5 až 10 sekúnd ponorí do 0,5 % vodného roztoku safranínu. Premyté vodou, vysušené a mikroskopované. Inklúzie kyseliny poly-β-hydroxymaslovej sú viditeľné na ružovom pozadí cytoplazmy ako čierno-modré útvary.

Detekcia metachromatínu (volutín)

Neisserova metóda. Pripravte 4 roztoky. Roztok A: metylénová modrá - 0,1 g, 95% etanol - 2 ml, ľadová kyselina octová - 6 ml, destilovaná voda - 100 ml. Roztok B: kryštálová violeť - 1 g, etanol 95% - 100 ml, destilovaná voda - 300 ml. Roztok B kryštalický jód - 1 g, jodid draselný - 2,0 g, destilovaná voda - 300 ml. Roztok D: chrysoidin - 1 g, destilovaná voda - 300 ml (chrysoidin sa rozpustí v horúcej vode). Zmes roztoku A a B v pomere 2:1 sa naleje na maznicu upevnenú nad plameňom horáka na 1 min (zmes sa pripraví pred lakovaním). Farba sa nechá odkvapkať, pôsobí sa na ňu 1 minútu roztokom B (Lugolov roztok) a premyje sa vodou, vysuší sa mikroskopicky. Bakteriálne bunky sú svetložlté, volutínové zrná sú tmavomodré.

Ruskinova metóda. Pripravte farbu s nasledujúcim zložením: Tsilya karbolický fuchsín - 4 ml, nasýtený alkoholový roztok metylénová modrá- 4 ml, ľadová kyselina octová - 5 ml, etanol 96% - 95 ml, destilovaná voda - 92 ml. Farbivo sa naleje na náter upevnený nad plameňom horáka, zahrieva sa nad horákom až do vypálenia alkoholu, premyje sa vodou, suší sa a mikroskopuje. Bakteriálne bunky sú sfarbené svetločerveno, volutínové zrná sú zafarbené čiernou a modrou farbou.

Detekcia polysacharidov

Zafarbené Schiffovým činidlom. Pripravte 4 roztoky. Roztok A (roztok jodistanu): 4 % roztok kyseliny jodovej 20 ml, 0,2 M vodný roztok octanu sodného 10 ml, 96 % etanol 70 ml. Roztok je citlivý na svetlo, preto ho treba skladovať v tmavej fľaši v tme.

Rozlišujte medzi jednoduchými a zložitými metódami farbenia.

Jednoduché metódy farbenia nazývané predfarbenie

paraty akékoľvek jedno farbivo. Niektoré mikroorganizmy (spirochéty), ktoré sa ťažko detegujú pomocou pozitívnych škvŕn, sa dajú ľahko zistiť, keď sú zafarbené negatívnymi škvrnami.

Technika varenia liek je nasledujúci. Fixovaný prípravok sa umiestni na paralelné sklenené lamely (most), ktoré ležia nad kyvetou. 1% vodný roztok fuchsínu alebo metylénovej modrej sa aplikuje na náter pomocou kvapkadla počas 1-2 minút. Dbajte na to, aby roztok farbiva počas farbenia nevyschol. Po dokončení farbenia sa farbivo vypustí. Droga sa premýva vodou, kým sa tečúca voda neodfarbí. Potom sa droga suší. Na tento účel sa spodná strana prípravku osuší filtračným papierom a horná strana sa opatrne osuší zo strán bez toho, aby sa dotkla rozmazania. Droga sa nakoniec suší na vzduchu alebo vysoko nad plameňom liehovej lampy. Na získanie čistejších prípravkov sa farbivo nanáša na náter pokrytý filtračným papierom. Metóda farbenia v modifikácii Sineva umožňuje použitie vopred impregnovaného filtračného papiera namiesto roztoku farbiva. V správne zafarbenom a dobre umytom preparáte je zorné pole svetlé a čisté, zafarbené sú len bunky. Mikroskopické preparáty s imerzným systémom.

O komplexné (diferenciačné) metódy farbenie na tom istom prípravku je ovplyvnené niekoľkými farbiacimi látkami, z ktorých jedna sa nazýva hlavná, ostatné sú dodatočné. Okrem farbív sa používajú rôzne bielidlá: alkoholy, kyseliny, acetón atď. Pomocou komplexných metód farbenia sa odhalia cytologické znaky buniek mikroorganizmov (bunkové štruktúry, inklúzie atď.).

Gramovo farbenie je najuniverzálnejšia z komplexných metód farbenia. Farbenie je základom bakteriálnej diferenciácie a odráža schopnosť buniek vnímať a uchovávať farbiaci komplex genciánovej violeti a jódu vo vnútri bunky, alebo ho po ošetrení alkoholom stratiť. V súlade s tým grampozitívne ( bacil, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, atď.) a gram negatívny (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, atď.) formulárov.

Na získanie spoľahlivých výsledkov sa musia pripraviť nátery na farbenie podľa Grama z mladých, aktívne rastúcich (zvyčajne jeden deň starých) kultúr, pretože bunky zo starých kultúr niekedy spôsobujú nestabilnú reakciu podľa Grama. Gram-negatívne baktérie sa môžu javiť ako gram-pozitívne, ak je bakteriálny film (náter) príliš hrubý a zafarbenie alkoholom nie je úplné. Gram-pozitívne baktérie môžu vyzerať ako gramnegatívne, ak je náter zafarbený alkoholom.

Method Essence . Na povrchu bunkovej cytoplazmy sa u grampozitívnych mikroorganizmov nachádza komplex proteínu a ribonukleátu horečnatého, ktorý u gramnegatívnych baktérií chýba. Gramovo farbenie na povrchu grampozitívnych buniek vytvára silný komplex bielkovín, magnézium ribonukleátu, genciánovej violeti a jódu, ktorý sa alkoholom nezničí. Takéto baktérie zostávajú sfarbené do modra. Fialová. Gramnegatívne baktérie nemajú schopnosť udržať farbu a pri ošetrení alkoholom sa odfarbia. Na ich identifikáciu sa prípravok zafarbí fuchsínom. Gramnegatívne baktérie sa farbia na červeno.

Štádiá diferencovaného Gramovho farbenia:

Fixovaný náter sa prekryje kúskom filtračného papiera (1,5 x 1,5 cm) a nanáša sa naň karbolický roztok genciánovej violeti alebo kryštálovej violeti až do úplného navlhčenia (častejšie sa používa Sinevova modifikácia). Farbenie sa vykonáva 1-2 minúty.

Papier sa odstráni, farbivo sa scedí a bez premývania prípravku vodou sa na prípravok aplikuje Lugolov roztok na 1-2 minúty, kým škvrna nesčernie.

Lugolov roztok sa vypustí, zafarbená škvrna sa odfarbí 96º etylalkoholom. Na tento účel sa droga umiestni 2–3 krát do pohára s alkoholom, kým neprestanú vytekať fialové pramienky (čas odfarbenia nie je dlhší ako 30 s), alebo sa na škvrnu nalejú 2–4 kvapky alkoholu na 30– 45 s.

Liečivo sa rýchlo premyje vodou (ako je opísané vyššie).

Náter sa dodatočne farbí na 1-2 minúty vodným roztokom fuchsínu (Pfeifferov fuchsín).

Farbivo sa scedí, prípravok sa premyje vodou, vysuší filtračným papierom.

mikroskopované s imerzným systémom.

Gram-pozitívne baktérie sa farbia na fialovo, Gram-negatívne baktérie sa farbia na ružovo.

Nukleoid. Je ťažké detegovať nukleoid v bakteriálnej bunke pomocou svetelného mikroskopu. Na selektívne farbenie nukleoidov sa fixované bunky vopred ošetria ribonukleázou alebo zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, aby sa degradovala ribozomálna RNA. Následné zafarbenie hlavným farbivom umožňuje odhaliť nukleoid vo forme hustých teliesok s nepravidelnými obrysmi umiestnenými v strede alebo na póloch bunky.

Ziehl-Neelsenovo farbenie acidorezistentných baktérií odráža vlastnosti mykobaktérií a nokardií.

Princíp metódy. Odolnosť týchto baktérií voči kyselinám je spojená s vysoký obsah lipidov v bunkovej stene. Baktérie odolné voči kyselinám sú pri zahriatí prípravku na červeno zafarbené karbolickým fuchsínom Ziehl a túto farbu si zachovajú aj po bielení kyselinou sírovou. Nekyselinostále baktérie sa odfarbia kyselinou a následne sa farbia na modro metylénovou modrou.

Pre detekcia kapsúl pomocou rôznych metód, vrátane Burriho metóda a Burri Guinsa . Metóda je založená na negatívnom kontraste. Keďže kapsula alebo telo mikrobiálnej bunky nevníma farbivá, iba pozadie mikroprípravku je zafarbené atramentom. Kapsula je viditeľná ako nezafarbená oblasť na tmavom pozadí atramentového rozmazania. Podľa metódy Burri-Gins sa telá mikrobiálnych buniek dodatočne farbia na červeno fuchsínom.

Pre farbenie bičíkov Bolo navrhnutých niekoľko metód, ktorých spoločným krokom je leptanie prípravku (zvyčajne roztokmi tanínu, KAl(SO 4) 2, HgCl 2) a následné farbenie (často karbolickým roztokom fuchsínu). V dôsledku toho sa farbivo ukladá na bičíky, čím sa súčasne dosiahne zvýšenie ich hrúbky a zníženie priehľadnosti. Jednou z navrhovaných metód na farbenie bičíkov je Leifsonova metóda. Prípravok sa mikroskopuje ponorným systémom. Bakteriálne bunky sa sfarbia do červena, bičíky majú formu hrubých vlákien vyčnievajúcich z bunky.

Otázky na sebaovládanie

1 Uveďte hlavné morfologické bunkové typy mikroorganizmov.

2 Popíšte schematickú štruktúru bakteriálnej bunky.

3 Uveďte štádiá prípravy fixných preparátov mikroorganizmov, popíšte ich.

5 Klasifikujte farbivá používané v mikrobiológii, charakterizujte ich.

Cvičenie 4

Cieľ: oboznámenie sa so spôsobmi prípravy fixných prípravkov, jednoduchými a zložitými metódami farbenia; oboznámenie sa s morfológiou a cytológiou rôznych mikroorganizmov.

Materiály a vybavenie: biologické mikroskopy, mikroskopické sklíčka a krycie sklíčka, liehové lampy, bakteriálne slučky, imerzný olej, sterilné pipety, pinzety, filtračný papier, zápalky, hygienické vatové tampóny, značkovače, sterilné Petriho misky, po skupine - v 50 ml banke sterilná voda z vodovodu, destilovaná voda na oplachy, ostrekovače, kyvety, mostíky, súprava hotových roztokov farieb v stojane, lieh 96 0, pipety, nálevy z prírodných materiálov: mäso, hrach a pod.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="(!LANG:> TECHNIKA PRÍPRAVY ŤAHU. METÓDY LAKOVANIA.">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="(!LANG:> Bezpečnosť v mikrobiologickej miestnosti (laboratóriu) Pravidlá"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="(!LANG:> Pravidlá pre prácu so živou kultúrou. 1. Hlavná vec, keď siatie živej kultúry - to je"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="(!LANG:> Pravidlá pre prípravu a skladovanie pohárov (predmet, obaly) Predmet a krycie sklíčka"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="(!LANG:> uložiť"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в !} alkalický roztok poháre sa opláchnu tečúcou vodou z vodovodu, ponoria sa na 10-15 minút do 5-10% roztoku kyseliny chlorovodíkovej a potom sa umyjú tečúcou vodou. Použité sklíčka a krycie sklíčka znečistené farbou a imerzným olejom sa upravia takto: ponoria sa na 2 hodiny do koncentrovaného kyselina sírová alebo zmes chrómu, potom dôkladne umyte tečúcou vodou z vodovodu; nalejte 5% roztok hydrogénuhličitanu sodného alebo alkálie (lúh draselný alebo lúh sodný), dajte na mierny oheň a varte 30-40

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="(!LANG:> KROKY PRÍPRAVY. 1. Príprava náteru 2. Sušenie 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="(!LANG:> Recepty na výrobu farbív Carbolic"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="(!LANG:>"> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В !} ľavá ruka vezmite skúmavku so sterilným fyzikálnym roztokom (destilovaná voda) a vložte ju medzi prsty 1 a 2 tak, aby dlaň bola pod skúmavkou a hrdlo skúmavky smerovalo do zóny alkoholovej lampy. bakteriálna slučka vpravo, ako ceruzka, slučka je flambovaná do červena, najprv horizontálne, potom vertikálne, uvoľňovacie slučky, malíček pravá ruka stlačte korok fyzický. roztok do dlane a opatrne ho vyberte zo skúmavky. Pohyby by mali byť hladké Hrdlo skúmavky sa spáli plameňom a vloží sa slučka Odoberajú sa fyzickou výstupnou slučkou. roztoku a kvapnite pár kvapiek na sklo v rámci hraníc náteru Uzavrite korok po tom, čo ste predtým prešli korkom a hrdlom skúmavky plameňom liehovej lampy a umiestnite skúmavku na statív

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="(!LANG:> Vezmite skúmavku s kultúrou do ľavej ruky a umiestnite ju ako trubica"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="(!LANG:>"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt="(!LANG:>Schéma prípravy náteru">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="(!LANG:> Typy fixácie q Fyzikálne - v plameni alkoholovej lampy q Chemikálie"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="(!LANG:> Metódy farbenia: Jednoduchý komplex (Gram, Ziehl-Nielsen, OrzeshkoNielsen Buri-giny).">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="(!JAZYK:> JEDNODUCHÉ METÓDY FARBOVANIA ROZMAZOV (základné anilínové farbivá"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt="(!LANG:> Jednoduchou metódou farbenia pár kvapiek akéhokoľvek liehu resp. voda"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt="(!LANG:>Jednoduchým sfarbením vnímajú mikrobiálne telá farbu nanesenej farby tak intenzívne ako rád"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из !} čistá kultúra) sú namaľované rovnakou farbou, ale o niečo bledšie. Purpurová a genciánová violeť sú intenzívnejšie sfarbujúce farby; metylénová modrá sa farbí oveľa bledšie. Vnímanie farieb závisí nielen od vlastností farieb, ale aj od vlastností farbených mikróbov. Väčšina mikróbov sa ľahko a rýchlo zafarbí vodou alebo alkoholovo-vodnými roztokmi farieb. Na zvýšenie farbiacej schopnosti je farba vystavená vysokej teplote (zohrievaniu), kým sa neobjavia výpary (až do varu). Zmenou stupňa ohrevu je možné získať rôzne stupne intenzity farby. Predĺženie doby pôsobenia farbiaceho roztoku na predmet môže tiež do určitej miery zvýšiť stupeň zafarbenia.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="(!LANG:> KOMPLEXNÉ metódy farbenia založené na vlastnostiach fyzikálno-chemickej štruktúry mikrobiálna bunka.Podstata týchto metód"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="(!LANG:> METÓDA GRAM v Naneste genciánovú violeť na fixovaný tampón"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt="(!LANG:>Pomer baktérií k farbeniu podľa Grama je určený ich schopnosťou udržať formované v"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="(!LANG:> GRAM-NEGATÍVNE A GRAM-POZITÍVNE"> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt="(!LANG:>Streptokoky Gr+ koky zoradené do reťazcov faukoky Streptoccus Enterococcus+"> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="(!LANG:> Vibrio Gr- Vibrio cholerae"> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="(!LANG:> DIAGNOSTIKA TUBERKULÓZY PĽÚC POMOCOU BAKTERIÓZIE"> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt="(!LANG:>FARBA a) Prikryte škvrnu filtračným papierom a naneste na celý povrch papierového karbolického fuchsínu"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="(!LANG:> METÓDA ZIEHL-NIELSEN (NÁVOD 1999)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="(!LANG:> METÓDA ZIEHL-NIELSENA"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="(!LANG:> DETEKCIA KAPSULÍ V BAKTÉRIÁCH Niektoré mikróby"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="(!LANG:>"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt="(!LANG:>BURRI A BURRI-GINS škvrna kapsula pri zápale pľúc Klebsiella">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="(!LANG:>"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="(!LANG:> ŠKVRNA OZZHZKO Na zaschnutom nátere (neopravené!) + niekoľko"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="(!LANG:> Štúdium motility mikroorganizmov."> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="(!LANG:> METÓDA DRVENEJ KVAPKY Kvapka sa nanesie na podložné sklíčko pomocou pipeta alebo slučka"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="(!LANG:> Bičíky majú rôzne dĺžky. Ich priemer je taký malý, že sú neviditeľné v"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt="(!LANG:>Stanovenie motility baktérií metódou "visiacej kvapky". Young kvapka (18 -20 hodín) vývar"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="(!LANG:> METÓDA ZAVÁSENIA"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля!}

Žijeme vo svete baktérií. Sú okolo nás a vo vnútri nášho tela. Niet divu, že o nich chceme vedieť čo najviac. Ale ako zvážiť a ešte viac študovať niečo také malé? Zdá sa, že mikroskop by mal tento problém vyriešiť. Ale nie všetko je také jednoduché - v prirodzenom stave sú mikroorganizmy priehľadné ako sklo. Rôzne metódy farbenia baktérií pomáhajú „ukázať“ obraz a pomáhajú preskúmať vonkajšiu a vnútornú štruktúru mikróbov.

Na konci devätnásteho storočia navrhol riešenie tohto problému dánsky biológ Christian Gram. Ak je niečo neviditeľné, treba to natrieť a uvidíte, čo sa stane. Metóda farbenia baktérií, ktorú navrhol Gram, bola taká presvedčivá, že dodnes sa mikroorganizmy delia na grampozitívne (zachovávajú farbu) a gramnegatívne (odfarbujú po ošetrení alkoholom).

Ako sa ukázalo, bunky sú pokryté membránou podobnou prepleteným vláknam. A hoci živiny potrebné pre bunku voľne prechádzajú do medzier medzi závitmi, škrupina spoľahlivo chráni „vnútorný svet“ pred vonkajšími agresívnymi faktormi. U rôznych typov baktérií má vonkajšia stena bunky rôznu hrúbku, hustotu a chemické zloženie. Práve na tejto vlastnosti bunkových membrán je založená metóda Gramovho farbenia.

Na základe práce Christiana Grama biológovia vyvinuli nové metódy, ktoré umožňujú nielen určiť tvar a veľkosť buniek, ale aj zvážiť niektoré detaily ich štruktúry. Niekedy mikroorganizmy, ktoré majú úplne identický vzhľad, reagujú na farbivá odlišne. Získané informácie umožňujú rýchlo a presne určiť typ baktérie.

Starý neznamená zlý

Snáď najpraktickejšou a najpoužívanejšou metódou na farbenie mikroorganizmov je Gramova metóda. Náter fixovaný ohňom sa prekryje metylfialovým farbivom, zafixuje sa jódom, vysuší sa a premyje sa alkoholom. V tomto štádiu, v závislosti od vlastností bunkovej membrány, sa baktérie stávajú:

• jasne modrá (gram-pozitívna);
• bezfarebný (gram negatívny).

Hrúbka plášťa buniek, ktoré zostávajú bezfarebné, neumožňuje farbivu preniknúť dovnútra a ľahko sa zmýva z povrchu baktérií. Posledným krokom pri farbení podľa Grama je použitie červeného farbiva, ktoré zostáva na povrchu bunkovej membrány a dodáva jej ružový alebo červený odtieň.

Gram-pozitívne baktérie sú vo všeobecnosti pre človeka nebezpečné. Do tejto kategórie patria streptokoky, stafylokoky, bacily, klostrídie atď. Gramnegatívne nie sú až také nebezpečné. Môžu tiež spôsobiť ochorenie a zápal, ale len za určitých podmienok. Jednoduchou prípravou farebného prípravku je možné získať predstavu o stupni nebezpečenstva študovaných mikroorganizmov.

Vitálne metódy farbenia

Podľa stavu študovaných organizmov v mikrobiológii existujú:

• životne dôležitá metóda, to znamená práca so živými baktériami (nebezpečná, vyžaduje prísne dodržiavanie bezpečnostných opatrení);
• postvitálna metóda – práca s fixovanými (usmrtenými) bunkami;
• negatívny, môže byť vitálny a postvitálny, vhodný na prácu s kapsulami.

Životne dôležitá metóda je zďaleka najnebezpečnejšia, keďže výskumníci sa musia vysporiadať so živými bunkami, niekedy smrteľnými. Práve táto metóda však umožňuje skúmať nielen štruktúru bunky, ale aj celý jej životný cyklus a interakciu s prostredím.

Pre mnohé mikrobiologické štúdie je dôležité udržať baktérie nažive. To znamená, že je potrebné použiť špeciálne netoxické alebo málo toxické farbivá, ktoré navyše ľahko prenikajú do bunkovej štruktúry cez vonkajší obal. Sú to takzvané vitálne farbivá, môžu byť určené viditeľné svetlo alebo fluorescenčné. Podľa chemického zloženia sa farbivá delia na:

• zásadité (akridínová oranž, metylénová modrá);
• kyslé alebo kyslé (indigokarmín, kyslý fuchsín);
• neutrálne (rodamín B).

Práca s fixnými liekmi

Podľa zložitosti práce sa metódy farbenia fixných (neživých) buniek delia na:

1. Jednoduché metódy. V tomto prípade sa používa iba jedna farba, zvyčajne červená (purpurová) alebo modrá (metylénová modrá). Rozdiel medzi týmito farbivami je rýchlosť expozície. Fuchsin dáva výsledok po 1-2 minútach, zatiaľ čo na výsledok modrej farby je potrebné počkať 3-5 minút. Vhodné je použiť aj roztok fuchsínu v kyseline karbolovej (tzv. Zielov fuchsín), pretože pripravený prípravok nestráca svoje farbiace vlastnosti po dobu niekoľkých mesiacov. Metylénovú modrú je možné pripraviť aj vopred v silnom alkoholovom roztoku.
2. Komplexné (diferenciálne) metódy. To bude vyžadovať niekoľko farbív (najmenej dve), ktoré majú iná farba. To umožní nielen vidieť baktérie, ale aj podrobnejšie študovať ich vnútornú štruktúru, pretože rôzne časti bunky môžu vnímať farbivá odlišne. Medzi komplexné patria Gramova, Ziehl-Nielsenova metóda (pre acidorezistentné baktérie), Benignetti (farbenie bakteriálnych bičíkov), Gins (identifikácia kapsúl), diferenciačná metóda Romanovského-Giemsa (farbenie spór) a niektoré ďalšie.

Komplexné metódy sú dôležité najmä pre diagnostiku infekčných ochorení, napríklad metóda Neisserovho farbenia pomáha rozlíšiť bacil záškrtu od falošného záškrtu.

Diferenciačná metóda Romanovského - Giemsa je založená na použití špeciálneho hotového prášku, na základe ktorého laboratóriá pripravujú roztok farbiva požadovanej koncentrácie. Výhodou tejto metódy je, že cytoplazma a jadro bunky dostanú inú farbu, čo uľahčuje identifikáciu a štúdium mikroorganizmov.

Neisserova metóda sa používa v medicíne na detekciu volutínových zŕn (granule so zásobou potravy pre mnohé prokaryotické bunky) v patogénoch záškrtu. V dôsledku farbenia baktéria získava žltá a volutinové granule sú modré.

Biela na čiernom

Ďalší typ farbenia baktériami je založený na vlastnostiach negatívu, t.j. bezfarebné baktérie sú jasne viditeľné na tmavom pozadí prípravku, inými slovami, farbí sa prostredie a nie samotný organizmus.

Niekedy baktérie, ktoré sa dostanú do určitých podmienok, tvoria kapsuly. Sú to slizničné útvary, ktoré pokrývajú bunku, trochu podobné gélu. Kapsuly sú priehľadné, ich chemické zloženie sa môže u rôznych druhov baktérií veľmi líšiť, t.j. len maľovať a hodnotiť výsledok podľa výslednej farby nebude fungovať.

Kapsuly sú navyše mäkké a krehké, pri natieraní môžu stratiť svoj tvar. Farbivá neinteragujú dobre s rôsolovitou štruktúrou kapsúl a ľahko sa vymývajú počas spracovania. Na detekciu, ale nie poškodenie kapsúl, je užitočná metóda negatívneho farbenia.

Jednou z metód detekcie kapsúl je metóda farbenia Guins. Kvapka čierneho atramentu sa nanesie na okraj podložného sklíčka, pridá sa k nej testovaný materiál, premieša sa a rozloží sa po celej ploche. Náter sa vysuší na vzduchu, zafixuje a zafarbí purpurovou farbou Ziehl. Po 2-3 minútach opláchnite vodou a osušte. Výsledkom je, že ružové bunky obklopené priehľadnými kapsulami sú jasne viditeľné pod mikroskopom na celkovom tmavom pozadí.

Sfarbenie spórotvorných baktérií

Ak hovoríme o bunkových membránach, nemôžeme si nespomenúť na baktérie tvoriace spóry. Spóry sa tvoria za nepriaznivých podmienok pre bunku a v agresívnom prostredí môžu existovať pomerne dlho. Čo je dobré na zachovanie bunky, je zlé na jej štúdium. Výtrusy sú veľmi husté a takmer nepriepustné pre tekutiny, navyše sú odolné voči kyselinám. Preto jednoduché farbenie alebo Gramova metóda zanechá spóry bezfarebné.

Pred farbením je potrebné povrch spór chemicky ošetriť, aby mierne zmenil svoju štruktúru a umožnil farbivám preniknúť dovnútra. V tomto prípade je tiež zafarbená celá cytoplazma bunky. Na odfarbenie cytoplazmy sa prípravok premyje a vysuší. Farbivo v spórach sa vďaka ich hustejšej štruktúre udrží lepšie ako v cytoplazme.

Metódy farbenia spór môžu byť rôzne, napríklad Orzeshko alebo Ziehl-Nielsen, ale všetky prichádzajú do rovnakej schémy:

• uvoľnenie povrchu spór chemikálie(kyseliny, amoniak, lúh sodný);
• farbenie bunky spórou (zvyčajne pri zahrievaní);
• zmena farby cytoplazmy.

V dôsledku toho získame dokonale viditeľnú pestrofarebnú spóru a bledú, takmer priehľadnú cytoplazmu.

Ako vyšetriť bakteriálne bičíky

Ďalšou ťažkou úlohou je farbenie baktérií bičíkmi. Sú to špirálovito stočené veľmi tenké vlákna, ktoré mikroorganizmy využívajú na pohyb. Bičíky sú nezvyčajne tenké, keď sa zafarbia, ľahko sa oddelia od bunky. Preto sa pred farbením bičíky leptajú, čím sa umelo zväčšuje objem.

Pri príprave mikroorganizmov na štúdiu sa bakteriálna kultúra niekoľkokrát subkultivuje na čerstvom živnom médiu počas niekoľkých dní. Potom sa baktérie s bičíkmi prenesú do skúmavky so sterilnou vodou (t 37⁰С). Robte to veľmi opatrne, bez miešania kvapaliny, aby ste nepoškodili bičíky.

Obsah skúmavky sa nechá asi hodinu pôsobiť, aby sa baktérie rovnomerne rozložili v celom objeme. Pred začatím štúdie sa skontroluje pohyblivosť buniek v visiacej kvapke. Ak nedôjde k žiadnemu pohybu, trubica sa nechá ešte nejaký čas.

Keď sa roztok nanesie na podložné sklíčko, bunky môžu ľahko stratiť bičíky. Preto musí byť povrch skla dokonale čistý a zbavený mastnoty. Pred nanesením kvapiek roztoku sa nad horúcu časť plameňa horáka pridrží podložné sklíčko, aby sa kvapôčky, ktoré dopadli na povrch, rýchlo rozšírili a vysušili.

Po zaschnutí sa náter vyleptá, po 15 minútach sa chemikália zmyje. Ďalšia fáza - farbenie fuchsínom - sa vykonáva ponorením skla do roztoku farbiva, aby sa pri nanášaní farby nepoškodil bičík.

Po dodržaní správneho času sa náter premyje vodou a vysuší. Teraz môžete pristúpiť k štúdiu výsledného výsledku.

Technika farbenia

Na získanie farebného prípravku nemožno jednoducho vziať štetec, farby a chytiť baktériu. Existuje určitá schéma pre prácu s mikroorganizmami:

1. Príprava náteru. Kvapka vody sa nanesie na sklíčko (sterilné), do ktorého sa potom pomocou bakteriologickej slučky zavedie laboratórny materiál a rozdelí sa po povrchu.
2. Sušenie. Prebytočná tekutina sa buď vysuší prirodzeným spôsobom pri izbovej teplote, alebo sa náter mierne zahreje vysoko nad plameňom horáka.
3. Fixácia. Nestačí len odstrániť vodu, musíte baktérie zafixovať na podložnom sklíčku. Na tento účel môžete použiť oheň (niekoľko prechodov nad najhorúcejšou časťou plameňa) alebo kvapalinu (alkohol, acetón). Po takomto spracovaní mikroorganizmy absorbujú farbu rýchlejšie.
4. Priame farbenie. Farba by mala úplne pokryť celý povrch náteru. Po vydržaní správneho času (pre každé vlastné farbivo) sa farba odstráni a prípravok sa premyje vodou.

Po vysušení (zvyčajne prirodzene) môže byť výsledok použitý na určený účel.

Farbenie mikroorganizmov je celý systém metód, techník, schém zameraných na detekciu a rozpoznávanie buniek pomocou mikroskopu. Žiadny lekársky výskum resp vedecká práca v mikrobiológii sa nezaobídu bez predbežnej prípravy a farbenia študovaného materiálu.

Farbenie mikroorganizmov (farbenie mikróbov) je súbor metód a techník na štúdium vonkajších a vnútorná štruktúra mikroorganizmy, metóda mikrobiologickej technológie, ktorá umožňuje rozlišovať medzi typmi mikroorganizmov. Metóda je široko používaná v aplikovanej bakteriológii na určenie tvaru, veľkosti, štruktúry, lokalizácie, relatívnej polohy mikróbov a štruktúry ich organel. Bez zafarbenia sú mikróby, okrem niektorých húb, vo svetelnom mikroskope prakticky neviditeľné, kvôli ich nízkemu kontrastu. Po ošetrení získajú membrány a/alebo organely mikróbov farbu, ktorá kontrastuje s pozadím.

// Všeobecné informácie o metóde

Mikrobiálne prípravky sú vystavené chemickým činidlám, zvyčajne farbivám alebo oxidu osmičelému. V dôsledku fyzikálno-chemického procesu interakcie farbiva s chemické zlúčeniny predmetov, aby sa im umelo dala určitá farba, je možné určiť typ mikroorganizmu alebo aspoň typ jeho membrány (pozri Gramovo farbenie).

Spôsoby farbenia sa delia na vitálne, postvitálne a negatívne, posledné môžu byť vitálne a postvitálne.

Vitálna metóda farbenia

Na vitálne (vitálne) farbenie sa používajú 0,2-0,001% vodné roztoky metylénovej a toluoidínovej modrej, neutrálnej a konžskej červenej, ktoré sa pridávajú do vylisovanej alebo visiacej kvapky kultúry. Táto metóda odhaľuje spirochéty, prvoky, určuje pohyblivosť baktérií, imunitný opuch kapsuly, ale jej použitie vyžaduje prísne dodržiavanie pravidiel, ktoré vylučujú laboratórnu infekciu.

Postvitálne metódy farbenia

Metódy farbenia fixných prípravkov (postvitálne) sú rozdelené na jednoduché a zložité. Jednoduchými metódami sa na fixovaný prípravok nanesú farbiace roztoky Pfeiffer fuchsin (expozícia 1-2 minúty), alkalická metylénová modrá (3-5 minút) tak, aby úplne prekryla náter, farbivo sa scedí, prípravok sa premyje prúd vody, pretrepaný, vysušený a mikroskopovaný .
Jednoduché spôsoby umožňujú posúdiť veľkosť, tvar, lokalizáciu, vzájomné usporiadanie jednotlivých buniek, ale s ich pomocou nie je možné stanoviť štruktúru mikróbov a často aj ich diferencovaný vzťah k farbivám.
Z komplexných metód farbenia baktérií diferencovaná Gramova metóda, zisťovanie rezistencie voči kyselinám podľa Ziehla-Nelsona, stanovenie zŕn volutín podľa Lefflera alebo Neissera, diferenciačná metóda Romanovského-Giemsa, negatívno-pozitívna metóda na stanovenie kapsulu podľa Gins-Burriho, detekciu spór podľa Peshkova alebo Ziel - Nelsona a ďalších.
Na farbenie prvokov sa používa metóda Romanovského-Giemsa a farbenie hematoxylín-eozín.
Huby sa skúmajú nefarbené alebo metódami Grama, Ziel - Nelson, Leffler, Romanovsky - Giemsa, ako aj Lugolov roztok, laktofuchsín atď.

Gramova metóda je metóda farbenia mikroorganizmov pre výskum, ktorá umožňuje diferencovať baktérie podľa biochemických vlastností ich bunkovej steny. Navrhol ho v roku 1884 dánsky lekár G. K. Gram.

Podľa Grama sa baktérie farbia hlavnými farbivami – genciánovou alebo metylovou violeťou atď., Potom sa farbivo fixuje roztokom jódu. Po následnom umytí zafarbeného prípravku alkoholom sa tie druhy baktérií, ktoré sa ukážu ako silne zafarbené, nazývajú grampozitívne baktérie – na rozdiel od gramnegatívnych (Gram (-)), ktoré sa pri umývaní odfarbia.

// Použitie v diagnostike

Gramova škvrna má veľký význam v taxonómii baktérií, ako aj na mikrobiologickú diagnostiku infekčných chorôb.

Gram-pozitívne kokálne a spóronosné formy baktérií, ako aj kvasiniek, sú natreté modro-čiernou (tmavomodrou) farbou.

Mnohé baktérie, ktoré nenesú spóry, sú gramnegatívne, farbia sa do červena, bunkové jadrá sú jasne červené, cytoplazma je ružová alebo karmínová.

Technika farbenia

Gramovo farbenie označuje komplexný spôsob farbenia, keď je náter vystavený dvom farbivám, z ktorých jedno je hlavné a druhé je doplnkové. Okrem farbív sa na komplexné metódy farbenia používajú bielidlá: alkohol, kyseliny atď.

Na farbenie podľa Grama sa najčastejšie používajú farbivá trifenylmetánovej skupiny: gencián, metyl violeť alebo kryštálová violeť. Gram-pozitívne gram (+) mikroorganizmy poskytujú silné spojenie s uvedenými farbivami a jódom. Pri pôsobení alkoholu sa zároveň neodfarbujú, v dôsledku čoho pri dodatočnom farbení fuchsínom Gram (+) mikroorganizmy nemenia pôvodne prevzatú fialovú farbu.

Gram-negatívne gram(-) mikroorganizmy tvoria zlúčeninu ľahko zničiteľnú alkoholom so zásaditými farbivami a jódom. V dôsledku toho sa mikróby odfarbia a potom sa zafarbia purpurovou farbou, ktorá sa zmení na červenú.

Príprava materiálu na maľovanie

Testovaný materiál sa rozotrie v tenkej vrstve na povrch dobre odtučneného podložného sklíčka. Pripravený náter sa suší na vzduchu a po úplnom vysušení sa fixuje. Histologické rezy sa pripravia podľa rutinnej techniky fixovaním kúskov tkaniva vo formalíne a zaliatím do parafínu.

Fixácia

Pri fixácii je náter fixovaný na povrchu podložného sklíčka, a preto pri následnom farbení preparátu nedochádza k zmývaniu mikrobiálnych buniek. Usmrtené mikrobiálne bunky sa navyše farbia lepšie ako živé.

Rozlišuje sa fyzikálna metóda fixácie, ktorá je založená na vplyve vysokej teploty na mikrobiálnu bunku, a chemické metódy, pri ktorých sa používajú chemikálie spôsobujúce koaguláciu cytoplazmatických proteínov.

Fyzický spôsob upevnenia

Podložné sklíčko s prípravkom sa odoberá pinzetou alebo I a II prstami pravej ruky za rebrá ťahom nahor a plynulým pohybom 2-3 krát cez hornú časť plameňa horáka. Celý proces fixácie by nemal trvať dlhšie ako 2 s.

Spoľahlivosť fixácie sa kontroluje nasledujúcim spôsobom: povrch podložného sklíčka zbavený rozmazania sa nanesie na zadnú plochu ľavej ruky. Pri správnej fixácii náteru by malo byť sklo horúce, ale nemalo by spôsobiť pocit pálenia.

Chemická metóda zaväzuje

Na fixáciu šmúh sa používa metylalkohol, acetón, zmes Nikiforov (zmes etylalkoholu 96% a anestetického éteru v pomere 1: 1), Carnoyova kvapalina (etylalkohol 96% - 60%, chloroform 30%, ľadový kyselina octová 10%), alkohol-formol (40% formalín 5 ml, etylalkohol 96 ° - 95 ml). Podložné sklíčko so zaschnutým náterom sa ponorí do fľaše s fixačným prostriedkom na 10-15 minút a potom sa vysuší na vzduchu. Používa sa aj niekoľkosekundová fixácia v 40% formalíne.

Proces farbenia

Jedno z hlavných farbív sa naleje na pevný náter po dobu 2-3 minút. Aby ste predišli zrážaniu, zafarbite cez filtračný papier.

Vypustite farbu, opatrne odstráňte filtračný papier. Náter sa naplní Lugolovým roztokom alebo Gramovým roztokom jodidu (vodný roztok jodidu draselného a kryštalického jódu v pomere 2: 1) počas 1-2 minút, kým prípravok nesčernie.

Roztok sa scedí, náter sa prepláchne 96° etylalkoholom alebo acetónom, naleje sa a nechá sa odkvapkať, kým náter nezmení farbu a vytekajúca tekutina nie je číra (približne 20-40-60 sekúnd).

Podložné sklíčka dôkladne opláchnite v tečúcej alebo destilovanej vode po dobu 1-2 minút.

Na identifikáciu gramnegatívnej skupiny baktérií sa prípravky dodatočne farbia fuchsínom alebo safranínom (2-5 min).

Opláchnite pod tečúcou vodou a vysušte filtračným papierom.

Technika farbenia baktérií v histologických rezoch podľa Gram-Weigerta

Rezy zbavené parafínu sa privedú do vody.

Farbené 20 minút v 1% roztoku pararosanilínu alebo zásaditého fuchsínu v 1% octová kyselina(roztok farbiva sa zahreje do varu, ochladí a prefiltruje).

Umyté v 3 výmenách destilovanej vody.

Farbte 5 minút v 1% kryštálovej violeti v destilovanej vode.

Rýchlo opláchnite v 1% roztoku chloridu sodného.

Ošetrené po dobu 30 sekúnd v zmesi: 1 diel jódu + 2 diely jodidu draselného + 100 dielov destilovanej vody.

Navlhčite filtračným papierom.

Odlíšte sa nanesením zmesi na rez rovnaké objemy anilín a xylén (1 - 2 ml); roztoky sa vypúšťajú, kým sa oblaky farbiva neprestanú vzďaľovať od rezu.

Prešli cez 3 xylénové posuny

Uzavreté v balzame alebo akejkoľvek živici rozpustenej v xyléne.

Výsledok: Gram-pozitívne baktérie sú modro-čierne, fibrín je fialový, jadrá sú červené.

Peshkovova metóda sa používa na farbenie bakteriálnych endospór.

Technika farbenia

Vysušený prípravok z kultúry grampozitívnych baktérií sa 15 minút fixuje v Carnoyovej tekutine, potom sa premyje vodou, zaleje sa metylénovou modrou podľa Lefflera a zahrieva sa, kým sa neobjavia výpary, varí sa 15-20 minút, po ochladení sa prípravok umyté a zafarbené 0,5% vodným roztokom neutrálnej červenej alebo purpurovej podľa Pfeifera 30-60 sekúnd. Vysušte filtračným papierom a mikroskopom.

Výsledok farbenia

Výsledkom je, že zrelé endospóry sú sfarbené na modro, mladé endospóry na tmavomodro, cytoplazma je červená a chromatínové zrná sú sfarbené do fialova.

Metóda farbenia Ziehl-Nelsen je metóda farbenia mikroorganizmov na detekciu mykobaktérií odolných voči kyselinám (pôvodcovia tuberkulózy, mykobakteriózy, lepry), aktinomycét a iných mikroorganizmov odolných voči kyselinám. Odolnosť mikroorganizmov voči kyselinám je spôsobená prítomnosťou lipidov, vosku a hydroxykyselín v ich bunkách. Takéto mikroorganizmy sa zle farbia zriedenými roztokmi farbív. Na uľahčenie prenikania farbiva do buniek mikroorganizmov sa fenolický fuchsín Tsilya aplikovaný na prípravok zahrieva nad plameňom horáka. Farebné mikroorganizmy neodfarbia slabé roztoky minerálnych kyselín a alkoholu.

Metóda je pomenovaná po nemeckých lekároch – mikrobiológovi Franzovi Zielovi (1857-1926) a patológovi Friedrichovi Nelsenovi (1854-1898), ktorí ju vyvinuli v rokoch 1882-1883.

Kroky farbenia

1. Fixovaný náter sa prekryje plochým filtračným papierom a naleje sa naň Ziehlov fenolfuchsín. Náter sa zahrieva nad plameňom horáka, kým sa neobjavia výpary, potom sa odoberie na ochladenie a pridá sa nová časť farbiva. Zahrievanie sa opakuje 2-3 krát. Po vychladnutí odstráňte filtračný papier a prípravok umyte vodou.

2. Droga sa odfarbí ponorením alebo nanesením 5 % roztoku kyseliny sírovej alebo 3 % chlorovodíkového liehu a niekoľkokrát sa premyje vodou.

3. Prípravky farbiť vodno-alkoholovým roztokom metylénovej modrej po dobu 3-5 minút, opláchnuť vodou a vysušiť.

Pri farbení metódou Ziehl-Nelsen sa baktérie odolné voči kyselinám intenzívne sčervenajú, zvyšok mikroflóry sa zafarbí na svetlomodro.

Farbenie podľa Romanovského-Giemsu je cytologická metóda na farbenie prvokov, baktérií, bunkových štruktúr a tkanív rôznych typov (vrátane krvi) pomocou svetelnej mikroskopie. Farbí acidofilné útvary v rôznych odtieňoch červenej, bazofilné útvary vo farbách od fialovej po modrú.

// Príprava farbiva

Pred farbením náterov sa hotové tekuté farbivo zriedi rýchlosťou 1-2 kvapiek farbiva na 1 ml destilovanej vody. Nátery sa farbia 20 - 25 minút pri 37 °C vo vlhkej komore (uzavretá Petriho miska s navlhčeným filtrom na dne). Po zafarbení sa nátery premyjú v tečúcej vode, vysušia sa na vzduchu a preskúmajú sa olejovou imerziou.

Farbivá zmes Romanovsky-Giemsa, ktorá je založená na farbe Romanovského Wrighta, vo forme prášku (komerčné farbivo) sa rozpustí v zmesi rovnakých objemov metylalkoholu a glycerínu (800 mg farbiva na 100 ml solventný). Farbivo sa zle rozpúšťa, preto je lepšie ho rozdrviť rozpúšťadlom v množstve 300 mg na 100 ml a potom za miešania pridávať farbivo, kým sa nedosiahne požadovaná koncentrácia. Príprava farbiva často trvá niekoľko dní. Ako rozpúšťadlá je dôležité používať chemicky čistý metylalkohol a glycerín, pretože nečistoty zhoršujú vlastnosti farbiva. Namiesto metylalkoholu je možné použiť 100% etylalkohol. Pripravená farbiaca zmes sa skladuje na chladnom a suchom mieste v tesne uzavretej nádobe.

technika farbenia

Nátery fixované v metylalkohole sa farbia roztokom (1 ml hotovej tekutej farby + 2 ml základného tlmivého roztoku + 47 ml destilovanej vody) počas 40-120 minút (doba farbenia sa volí empiricky). Používajú fosfátový tlmivý roztok, ale pH tlmivého roztoku závisí od typu náteru: pre náter z kostnej drene - 5,8 - 6,0, pre krvný náter - 6,4 - 6,5, pre detekciu prvokov - 6,8, malarické plazmodium - 7 0 - 7,2.

Opláchnite v destilovanej vode, vysušte a skontrolujte ponorením.

Farebný výsledok

Baktérie sa farbia fialovo-červeno, bunková cytoplazma modro, jadrá červeno. Pri farbení prvokov sa ich cytoplazma zmení na modrú a jadrá na červenofialové.