जीनोटॉक्सिसिटी, यानी जीनोम पर एक विशेष यौगिक का हानिकारक प्रभाव, और कैंसरजन्यता संबंधित घटनाएं हैं। डीएनए धूमकेतु विधि प्रयोग और दोनों में जीनोमिक डीएनए को नुकसान की डिग्री का आकलन करना संभव बनाती है वैज्ञानिक उद्देश्य, और व्यावहारिक समस्याओं को हल करने में: प्रभाव का आकलन वातावरणया काम करने की स्थिति, ऊतक इंजीनियरिंग में, विगलन के दौरान प्रत्यारोपण सामग्री का नियंत्रण। डीएनए धूमकेतु परीक्षण द्वारा पता लगाया गया डीएनए क्षति ऑन्कोलॉजी और इससे जुड़े परिवर्तनों के लिए एक पूर्वसूचना दोनों का संकेत दे सकता है। डीएनए धूमकेतु द्वारा पता चला डीएनए क्षति में वृद्धि ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषता है। और, हालांकि इसके विकास के दशकों में, यह विधि केवल विशेष क्षेत्रों में व्यापक हो गई है, यह विभिन्न रोगों के उपचार के निदान और निगरानी में आवेदन पा सकती है। डीएनए धूमकेतु के फायदे संवेदनशीलता, सामग्री की मात्रा के लिए कम आवश्यकताएं, तेजी से काम करने वाले प्रोटोकॉल, सापेक्ष सादगी और कम लागत हैं।

डीएनए धूमकेतु विधि का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है विभिन्न प्रकार केकोशिकाओं, दोनों संस्कृति में और जैविक तरल पदार्थ और ऊतकों के नमूनों में। डीएनए धूमकेतु के विश्लेषण के लिए मुख्य आवश्यकता ऊतक कोशिकाओं को निलंबन में स्थानांतरित करना है, इसलिए, प्रयोगशाला जानवरों को विदारक करते समय, हटाए गए अंग के टुकड़ों को उचित प्रसंस्करण से गुजरना होगा, और रक्त या शुक्राणु में निहित कोशिकाओं की सीधे जांच की जा सकती है। 80% घातक नवोप्लाज्म उपकला मूल के हैं। उपकला बाहरी और बाहरी दोनों प्रभावों के संपर्क में है आंतरिक पर्यावरणडीएनए धूमकेतु विधि द्वारा जीनोटॉक्सिसिटी के आकलन के लिए जीव सबसे उपयुक्त हैं। मानव उपकला कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक गैर-आक्रामक विधि मौखिक गुहा के उपकला का एक धब्बा है और लैक्रिमल नहर के उपकला से एक्सफ़ोलीएटिव सामग्री का चयन है। मौखिक उपकला कोशिकाएं 10-14 दिनों तक जीवित रहती हैं, और उनमें क्षतिग्रस्त डीएनए की उपस्थिति एक जीनोटॉक्सिक यौगिक के हाल के संपर्क को इंगित करती है। मौखिक उपकला के डीएनए अखंडता अध्ययन से जुड़े पदार्थों के प्रभावों की निगरानी में मदद मिल सकती है व्यावसायिक गतिविधितथा खाद्य उत्पाद.

कांच पर agarose में रखी कोशिकाओं को एक लाइसिंग समाधान के साथ इलाज किया जाता है और यदि आवश्यक हो, तो कुछ विकारों के लिए विशिष्ट एंजाइम। पृथक्करण क्षारीय बफर में किया जाता है। डीएनए कोशिका से बाहर निकलता है और एनोड की यात्रा करता है, जिससे एक प्लम बनता है जिसे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा जा सकता है। डीएनए में जितने अधिक विराम होते हैं, उसके टुकड़ों की गति उतनी ही अधिक स्पष्ट होती है। प्रक्रिया के बाद, स्लाइड्स को बेअसर कर दिया जाता है और डीएनए विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इंटरकैलेटिंग रंगों के साथ दाग दिया जाता है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डीएनए इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता का आकलन किया जाता है। जब लगभग सभी कोशिका का डीएनए खंडित हो जाता है, तो यह आमतौर पर एक मृत कोशिका होती है। यदि एकल कोशिकाओं में जीनोम क्षति की यह डिग्री है, तो उन्हें विश्लेषण से बाहर रखा गया है।

सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला क्षारीय डीएनए धूमकेतु प्रोटोकॉल (पीएच> 13 पर पृथक्करण) डीएनए में और डीएनए और प्रोटीन के बीच सिंगल-स्ट्रैंड ब्रेक, क्रॉस-लिंक का पता लगाने की अनुमति देता है। नमूना तैयार करने के दौरान क्षारीय उपचार के उपयोग से विधि की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, क्योंकि अधिकांश जीनोटॉक्सिक एजेंट डीएनए श्रृंखला में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक का परिचय नहीं देते हैं, लेकिन सिंगल-स्ट्रैंड ब्रेक या क्षेत्रों के साथ बनाते हैं। अतिसंवेदनशीलताक्षार को। इसके अतिरिक्त, एंजाइमों का उपयोग किया जाता है जो विशिष्ट क्षति के साथ डीएनए क्षेत्रों में विराम का परिचय देते हैं। फॉर्मैमिडोपाइरीमिडीन डीएनए ग्लाइकोसिलेज ऑक्सीकृत न्यूक्लियोटाइड्स, फॉर्मामाइड पाइरीमिडाइन्स (ओपन रिंग एडेनिन और गुआनाइन), और अन्य ग्वानिन डेरिवेटिव के क्षेत्र में डीएनए श्रृंखलाओं को काटता है; OGG1 ऑक्सीकृत प्यूरीन और फॉर्मैमिडोपाइरीमिडीन का पता लगाता है, एंडोन्यूक्लिज़ III ऑक्सीकृत पाइरीमिडाइन का पता लगाता है, T4 एंडोन्यूक्लिज़ V पाइरीमिडीन डिमर को पहचानता है, 3-मिथाइलडेनिन डीएनए ग्लाइकोसिलेज़ II (AlkA) 3-मिथाइलडेनिन के लिए विशिष्ट है; और यूरैसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज डीएनए में गलत तरीके से डाले गए यूरैसिल का पता लगाता है। विशिष्ट समस्याओं को हल करने के लिए इस तरह के सामग्री प्रसंस्करण प्रोटोकॉल की आवश्यकता हो सकती है, उदाहरण के लिए, जमे हुए ऊतकों में ऑक्सीकृत पाइरीमिडाइन और एंडोन्यूक्लाइज वी की टी 4 साइटों की सामग्री बढ़ जाती है, जबकि अन्य गड़बड़ी नहीं देखी जाती है। प्रत्यारोपण से पहले ग्राफ्ट की स्थिति का आकलन करने के लिए उपयुक्त एंजाइम उपचार के साथ डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग किया जा सकता है।

नैदानिक ​​​​निदान के क्षेत्रों में से एक जिसमें डीएनए धूमकेतु प्रौद्योगिकी का उपयोग किया जाता है वह पुरुष बांझपन का निदान है। शुक्राणु की संरचना के कारण, इन कोशिकाओं में डीएनए संरचना को नुकसान का खतरा बढ़ जाता है, और मरम्मत प्रणाली होने वाले उल्लंघनों के लिए पूरी तरह से क्षतिपूर्ति नहीं करती है। पुरुष बांझपन में, शुक्राणु के डीएनए को नुकसान की एक बढ़ी हुई डिग्री देखी जाती है। शुक्राणु में डीएनए टूटने की संख्या सामान्य रूप से मनुष्यों और प्रयोगशाला चूहों दोनों में 10 6 - 10 7 प्रति जीनोम तक पहुंच जाती है, जो लिम्फोसाइटों या लाल अस्थि मज्जा कोशिकाओं में जीनोम के टूटने की संख्या से बहुत अधिक है। डीएनए क्षति वाले शुक्राणुजन के साथ निषेचन ओओसीट में मरम्मत प्रक्रियाओं को सक्रिय करता है जो इन नुकसानों को बहाल करता है, लेकिन बच्चे में उत्परिवर्तन और जन्मजात बीमारियों का खतरा बढ़ जाता है। गर्भपात की आवृत्ति शुक्राणु डीएनए को नुकसान की डिग्री से संबंधित है। यह आईसीएसआई वाले बच्चों में जन्मजात बीमारियों और विकास संबंधी विकारों की बढ़ती घटनाओं से जुड़ा है।

डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग न केवल डीएनए की स्थिति का आकलन करने के लिए किया जाता है, बल्कि कोशिकाओं में मरम्मत की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। इस मामले में, अध्ययन के तहत कोशिकाओं को नष्ट कर दिया जाता है, और परिणामी होमोजेनेट को डीएनए द्वारा संसाधित किया जाता है, जिसमें एक निश्चित प्रकार की क्षति को प्रारंभिक रूप से पेश किया जाता है, मरम्मत के लिए आवश्यक न्यूक्लियोटाइड और एटीपी को मिश्रण में जोड़ा जाता है। कुछ क्षति को बहाल करने के लिए समरूप की क्षमता का उपयोग कोशिकाओं में मरम्मत प्रणालियों की गतिविधि का न्याय करने के लिए किया जाता है। डीएनए में किस प्रकार की क्षति का परिचय दिया जाता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि किस मरम्मत तंत्र का अध्ययन किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, 8-ऑक्सोगुआनिन युक्त प्रकाश-क्षतिग्रस्त डीएनए का उपयोग बेस एक्सिशन रिपेयर का आकलन करने के लिए किया जाता है, और यूवी-विकिरणित डीएनए जिसमें पाइरीमिडीन डिमर होता है, का उपयोग न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर के लिए किया जाता है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड, एक्स-रे या गामा विकिरण के साथ उपचार द्वारा सिंगल-स्ट्रैंड ब्रेक पेश किए जाते हैं, मिथाइल मीथेनसल्फोनेट के साथ उपचार द्वारा डीएनए क्षारीकरण किया जाता है। न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत का अध्ययन करने के लिए, हाइड्रॉक्सीयूरिया के साथ संयोजन में एफिडोकोलिन, या अरेबिनोसाइड साइटोसिन का उपयोग करके इस प्रक्रिया में शामिल पोलीमरेज़ को अवरुद्ध करते समय डीएनए ब्रेक के संचय का आकलन किया जाता है।

मरम्मत से जुड़े जीनों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण हमेशा कोशिकाओं में डीएनए की स्थिति का एक उद्देश्य संकेतक नहीं हो सकता है; इसलिए, डीएनए धूमकेतु विधि एक मूल्यवान प्राप्त करने की अनुमति देती है अतिरिक्त जानकारी. मरम्मत प्रणालियों की बढ़ी हुई गतिविधि न केवल यह दर्शाती है कि कोशिकाएं जीनोम क्षति के प्रति अधिक प्रतिरोधी हैं, बल्कि यह भी कि वे एक जीनोटॉक्सिक एजेंट के संपर्क में हैं, जिसके परिणामस्वरूप मरम्मत में शामिल प्रोटीन का संश्लेषण सक्रिय होता है। Q10 के साथ आहार अनुपूरक, धीमी गति से घुलने वाले कैप्सूल में विटामिन सी, बेस एक्सिशन रिपेयर गतिविधि को बढ़ाता है। एक समान प्रभाव देखा जाता है यदि दवाओं के बजाय एंटीऑक्सिडेंट से भरपूर फलों और सब्जियों का उपयोग किया जाता है। यह न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर सिस्टम की गतिविधि को कम करता है, क्योंकि अब इसकी आवश्यकता नहीं है।

माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण कैंसरजन्यता का प्रत्यक्ष संकेतक है, आईसीएच दिशानिर्देश धूमकेतु डीएनए के संयोजन में इसके उपयोग की सलाह देते हैं। डीएनए धूमकेतु विधि को किसके साथ जोड़ा जा सकता है फ्लोरोसेंट संकरणमछली यह निर्धारित करने के लिए कि क्या परिवर्तन जीनोम के कुछ क्षेत्रों को प्रभावित करते हैं। डीएनए धूमकेतु प्रक्रिया के परिणामस्वरूप प्राप्त बड़ी संख्या में डीएनए प्लम के विश्लेषण के लिए। स्वचालित समाधान की सिफारिश की जाती है। यह मूल्यांकन की व्यक्तिपरकता को कम करेगा और परिणामी प्लम के आकार और आकार का अधिक सटीक रूप से आकलन करेगा, जो कि प्रत्येक तैयारी में बड़ी संख्या में प्लम पर डेटा एकत्र करने की आवश्यकता को देखते हुए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। धूमकेतु डीएनए का उपयोग नैदानिक ​​निदान और अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक विधि के रूप में किया जा सकता है - किसी विशेष यौगिक की जीनोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए।

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सिंगल सेल जेल वैद्युतकणसंचलन विधि या डीएनए धूमकेतु विधि अत्यधिक संवेदनशील है और प्राप्त परिणामों की उच्च विश्वसनीयता प्रदान करती है, साथ ही यह अपेक्षाकृत सरल और प्रदर्शन करने में तेज़ है, और अंतरराष्ट्रीय स्तर पर मानकीकृत (ओईसीडी संख्या 489) भी है। निम्नलिखित समस्याओं को हल करने के लिए यह विधि सबसे आशाजनक है:

मनुष्यों और पर्यावरण की बायोमॉनिटरिंग, यानी प्रेरित उत्परिवर्तजन के परिणामों की पहचान करना जब कोई व्यक्ति ज़ेनोबायोटिक्स (दवाओं, खाद्य योजक, कीटनाशक, इत्र और सौंदर्य प्रसाधन, घरेलू रसायन, साथ ही सबसे आम पानी, वायु और औद्योगिक) के संपर्क में आता है। खतरे, नैनोमटेरियल्स);

ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में अनुसंधान;

डीएनए मरम्मत प्रणालियों का अध्ययन;

विधि क्षतिग्रस्त डीएनए और/या अलग-अलग लाइस कोशिकाओं के डीएनए टुकड़े के निरंतर विद्युत क्षेत्र में विभिन्न गतिशीलता के पंजीकरण पर आधारित है, जो एक मानक ग्लास स्लाइड पर एक पतली agarose जेल में संलग्न है। उसी समय, सेल डीएनए माइग्रेट करता है, एक "धूमकेतु पूंछ" जैसा दिखने वाला एक इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रेस बनाता है, जिसके पैरामीटर डीएनए क्षति की डिग्री पर निर्भर करते हैं। वैद्युतकणसंचलन के पूरा होने के बाद, स्लाइड्स को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दाग और विश्लेषण किया जाता है।

छवि अधिग्रहण और डेटा प्रोसेसिंग एक हार्डवेयर-सॉफ़्टवेयर कॉम्प्लेक्स का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें एक माइक्रोस्कोप के साथ संयुक्त अत्यधिक संवेदनशील कैमरा और विशेष सॉफ़्टवेयर शामिल होता है।

इस परिसर में शामिल सार्वभौमिक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर प्रदान करता है:

डीएनए धूमकेतु "एक कीस्ट्रोक" का स्वचालित छवि विश्लेषण, जिसमें सभी बुनियादी माप पैरामीटर शामिल हैं: धूमकेतु की पूंछ में% डीएनए;

- उच्च प्रजनन क्षमता;

डीएनए धूमकेतु के मापदंडों का विश्लेषण "वास्तविक समय" मोड और संग्रहीत डिजिटल छवियों दोनों से किया जाता है;

कार्यक्रम डेटा को संसाधित करता है और उन्हें GLP की अंतर्राष्ट्रीय आवश्यकताओं के अनुसार एक प्रोटोकॉल के रूप में प्रदर्शित करता है;

डेटा विश्लेषण और तुलना;

कार्यक्रम पूरी तरह से मान्य है और अंतरराष्ट्रीय जीएलपी आवश्यकताओं का अनुपालन करता है। पदानुक्रमित पहुंच और डेटा सुरक्षा प्रणाली है।

किट में शामिल हैं:

1. ल्यूमिनसेंट बायोमेडिकल माइक्रोस्कोप निकॉन एक्लिप्स नी-ई।

2. 50W एपि-फ्लोरोसेंट लाइटिंग सिस्टम, डीएपीआई, एफआईटीसी, टीआरआईटीसी रंगों के लिए फिल्टर-डाइक्रोइक मिरर-फिल्टर किट।

3. ल्यूमिनेसेंस के लिए मोनोक्रोम सीसीडी IEEE1394 फायरवायर कैमरा। बेसलर स्काउट scA1300-32fm। पिक्सेल आकार - 3.75 µm x 3.75 µm. संकल्प - 1296 पिक्सल x 966 पिक्सल। सेंसर का आकार 1/3 इंच। मैट्रिक्स - सोनी। हाई-स्पीड पोर्ट के माध्यम से डेटा ट्रांसफर - 1394 बस। अधिकतम रिज़ॉल्यूशन पर फ़्रेम दर - 32 फ़्रेम/सेकंड। वास्तविक समय में वस्तुओं के साथ काम प्रदान करता है

4. धूमकेतु परख IV - माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के लिए एक स्प्रेडशीट जनरेटर के साथ विंडोज के लिए एक सॉफ्टवेयर पैकेज, वास्तविक समय में एक मोनोक्रोम सीसीडी IEEE1394 फायरवायर वीडियो कैमरा के साथ काम करने के लिए (एक वीडियो स्ट्रीम और तस्वीरों पर माप और विश्लेषण दोनों संभव हैं), एक निर्देश कार्यक्रम को स्थापित और मान्य करने के लिए मैनुअल और एक सीडी।

5. चार उपयोगकर्ताओं के लिए एक साल का लाइसेंस।

6. दूर - शिक्षणचार उपयोगकर्ताओं के इंटरनेट नेटवर्क के माध्यम से।

इसके अतिरिक्त की पेशकश की:

1. डेटा ऑपरेटर को स्प्रैडशीट कार्य के लिए एमएस एक्सेल प्रारूप में संग्रहीत एक सुरक्षित ओरेकल डेटाबेस के माध्यम से डेटा खोजने, फ़िल्टर करने और निकालने और ऑडिटिंग के लिए डेटाबेस के एक्सएमएल संस्करणों में धूमकेतु परख IV का उपयोग करने के लिए। ऑटो-सहेजे गए चित्र, हस्ताक्षर, संग्रहीत डेटा और ऑटो-ऑडिट डेटा देखने की क्षमता शामिल है। इसके अतिरिक्त अहस्ताक्षरित और डिजिटल रूप से हस्ताक्षरित डेटा को एक्सएमएल प्रारूप में निर्यात करने की क्षमता भी शामिल है। विभिन्न स्वरूपों में डिजिटल रूप से हस्ताक्षरित डेटा देखने के लिए अकेले क्रिप्टो-की-प्रोव शामिल है।

2. जीएलपी सिस्टम तक प्रबंधक की पहुंच। एक्सेस मैनेजर डेटाबेस तक कर्मचारी पहुंच को नियंत्रित और प्रबंधित करने का एक प्रोग्राम है। पीआई आनुवंशिक विष विज्ञान के लिए एकीकृत प्रणाली। एक व्यापक सिस्टम ऑडिट शामिल है। बाह्य अंकेक्षण। प्रोग्राम, एक्सेस, पासवर्ड, संशोधन आदि से संबंधित उपयोगकर्ता खातों और उपयोगकर्ता गतिविधियों का प्रशासन। उपयोगकर्ताओं और ऑडिट डेटा को सुरक्षित रूप से सुरक्षित रखने के लिए Oracle का उपयोग करता है। इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्ड और इलेक्ट्रॉनिक हस्ताक्षर के लिए FDA 21 CFR भाग 11 के अंतिम नियमों का पूर्ण अनुपालन।

3. यूके में अवधारणात्मक उपकरणों पर आधारित एकल उपयोगकर्ता प्रशिक्षण

विधि में यह शामिल है कि धूमकेतु जैसी वस्तुओं के साथ एक छवि - "धूमकेतु", जो अलग-अलग चमक के मर्ज किए गए और अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स का एक सेट है, एक वीडियो कैमरा के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार जैविक तैयारी से कंप्यूटर में दर्ज किया जाता है। फिर, इन "धूमकेतु" को छवि में खोजा जाता है, उनके समोच्च को "सिर" और "पूंछ" सीमाओं की परिभाषा के साथ प्रतिष्ठित किया जाता है, और सूक्ष्म आकारिकी का प्रदर्शन किया जाता है। छवि में "धूमकेतु" की खोज करने से पहले, छवि चमक स्तरों को अनुकूलित किया जाता है और "धूमकेतु" के अलग-अलग बिंदुओं को धुंधले क्षेत्रों में संयोजित करने के लिए कम-पास फ़िल्टरिंग की जाती है। फिर परिणामी छवि का विभाजन ब्राइटनेस थ्रेशोल्ड के आधार पर किया जाता है, जिसे पृष्ठभूमि से ऑफसेट के रूप में परिभाषित किया जाता है, एक सीमित क्षेत्र "बीज के साथ" भरकर "धूमकेतु" की आकृति का पता लगाया जाता है, जहां बीज से संबंधित एक मनमाना बिंदु होता है "धूमकेतु", प्रत्येक "धूमकेतु" के सिर के केंद्र को खोजने के लिए, अधिकतम के करीब चमक तीव्रता वाले बिंदुओं के गुरुत्वाकर्षण के केंद्र का निर्धारण करके। "सिर" और "पूंछ" की आभासी सीमा की परिभाषा किसके द्वारा की जाती है परावर्तक प्रतिबिंबधूमकेतु के सिर के सामने के भाग के बिंदुओं की चमक की तीव्रता का वितरण, फिर "धूमकेतु" की सूक्ष्म आकृति विज्ञान को मापने के द्वारा किया जाता है: "धूमकेतु", "पूंछ", व्यास की लंबाई सिर"। फिर पूरे "धूमकेतु" में डीएनए का प्रतिशत, "पूंछ" में और डीएनए क्षति के उपायों की गणना की जाती है। ये ऑपरेशन छवियों की एक श्रृंखला में सभी "धूमकेतु" पर एक साथ स्वचालित रूप से किए जाते हैं। तकनीकी परिणाम "धूमकेतु" की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण की सटीकता और गति को बढ़ाना है।

जैविक तैयारी में "डीएनए-धूमकेतु" विधि (धूमकेतु परख या एकल कोशिका जेल वैद्युतकणसंचलन - एससीजीई) द्वारा प्राप्त धूमकेतु जैसी वस्तुओं की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण की विधि, वस्तुओं की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के क्षेत्र को संदर्भित करती है - "धूमकेतु", और बायोमेडिसिन के क्षेत्र में मॉर्फोमेट्रिक अध्ययनों की कम्प्यूटरीकरण (स्वचालन) प्रक्रियाओं के लिए अभिप्रेत है, जो विभिन्न पर्यावरणीय एजेंटों के कारण डीएनए अणुओं को नुकसान की डिग्री निर्धारित करने के लिए किया जाता है, ताकि डीएनए अणुओं की मरम्मत के स्तर पर अध्ययन किया जा सके। एकल कोशिकाओं, जीनोम की अभिन्न अखंडता का आकलन करने के लिए, विकिरण चिकित्सा से गुजरने वाले कैंसर रोगियों की व्यक्तिगत रेडियोसक्रियता का निर्धारण करने के लिए, तटीय समुद्री जल के जैव संकेत के लिए, दूसरे शब्दों में, उत्परिवर्तजन पर्यावरणीय कारकों के कारण डीएनए क्षति की एक विस्तृत श्रृंखला की निगरानी के लिए।

"धूमकेतु" की छवियां अलग-अलग चमक के फ्यूज़्ड और अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स का एक सेट हैं, जो लाइसेड सिंगल सेल ("डीएनए-धूमकेतु" विधि) के जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्राप्त किया जाता है, इसलिए, इच्छित तरीकों का उपयोग करके उन्हें संसाधित करना और उनका विश्लेषण करना संभव नहीं है। साधारण (ठोस) वस्तुओं की छवियां।

वर्तमान में, "डीएनए धूमकेतु" की छवियों का विश्लेषण या तो एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य अवलोकन द्वारा किया जाता है और डीएनए क्षति की डिग्री के अनुसार उनके भेदभाव, या कंप्यूटर इमेज प्रोसेसिंग टूल का उपयोग करके किया जाता है।

दृश्य विश्लेषण में (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. फोटो धूमकेतु परख - इन विट्रो में फोटोजेनोटॉक्सिसिटी के निर्धारण के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग परख। // उत्परिवर्तन अनुसंधान / आनुवंशिक विष विज्ञान और पर्यावरण उत्परिवर्तन। 2007, 632 ( 1-2), पी.44-57) "डीएनए धूमकेतु" को 0 से 4 के संगत संख्यात्मक मान के साथ पांच सशर्त प्रकारों में स्थान दिया गया है। डीएनए क्षति की डिग्री को "डीएनए धूमकेतु" (I dna) सूचकांक के रूप में व्यक्त किया जाता है, सूत्र द्वारा निर्धारित

और dna =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

जहाँ n 0 -n 4 प्रत्येक प्रकार के "डीएनए धूमकेतु" की संख्या है, गिने गए "डीएनए धूमकेतु" का योग है।

प्रसंस्करण और विश्लेषण की यह विधि बहुत समय लेने वाली, व्यक्तिपरक है, इसमें "डीएनए-धूमकेतु" भेदभाव के केवल पांच स्तर हैं और इसलिए इसकी सटीकता कम है, और इसलिए परिणामों की कम विश्वसनीयता है।

प्रस्तावित तकनीकी समाधान के सबसे करीब "डीएनए धूमकेतु" छवियों के कंप्यूटर विश्लेषण की विधि है, जिसे में लागू किया गया है सॉफ़्टवेयरएससीजीई-प्रो (धूमकेतु परख के लिए चौबेरी आरसी कम्प्यूटरीकृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर देखें। आणविक जीवविज्ञान में तरीके 2005; 291: 97-106) प्रोटोटाइप के रूप में लिया गया। "धूमकेतु" का विश्लेषण करने की यह विधि कम श्रमसाध्य है और विशेष रूप से उनके मापदंडों के उद्देश्य मूल्यांकन के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, "धूमकेतु की लंबाई", "पूंछ की लंबाई", "सिर" का व्यास, प्रतिशत"सिर" या "पूंछ", आदि में डीएनए), जो अध्ययन की गई कोशिकाओं में डीएनए क्षति के स्तर को दर्शाने वाले संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है। विधि छवि में "धूमकेतु" को ढूंढना और मैन्युअल रूप से और स्वचालित रूप से उनके मापदंडों की गणना करना संभव बनाती है।

ज्ञात विधि का नुकसान एक आयताकार क्षेत्र का उपयोग करके "धूमकेतु" की सीमाओं को निर्धारित करने की विधि है, जो डीएनए की क्षति (विशेषकर यदि क्षति हल्की है) का आकलन करने के लिए आवश्यक मापदंडों की गणना की सटीकता को कम करती है, क्योंकि इसमें मामले में, पास में मौजूद हस्तक्षेप को धूमकेतु के लिए भी जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, विश्लेषण की इस पद्धति के साथ, "सिर" और "पूंछ" की सीमा को एक सीधी रेखा के रूप में परिभाषित किया गया है, जो "धूमकेतु" की धुरी के लंबवत है और धूमकेतु को "सिर" और "पूंछ" में विभाजित करती है। जो "धूमकेतु पूंछ" की लंबाई और "सिर" और "पूंछ" में डीएनए के प्रतिशत की गणना की सटीकता को बहुत कम कर देता है।

आविष्कार का तकनीकी परिणाम "धूमकेतु" विधि द्वारा प्राप्त "धूमकेतु" की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण की सटीकता और गति को बढ़ाना है, जिसमें फ़िल्टरिंग, "धूमकेतु" का विभाजन, परिभाषा के साथ उनके समोच्च को उजागर करना शामिल है। "सिर" और "पूंछ" की सीमा, जो विभिन्न उत्परिवर्तजन पर्यावरणीय कारकों के कारण डीएनए क्षति की एक विस्तृत श्रृंखला की निगरानी में किए गए बायोमेट्रिक अनुसंधान प्रक्रियाओं के कम्प्यूटरीकरण के लिए आवश्यक सूक्ष्म आकारिकी के विश्वसनीयता परिणामों को बढ़ाने की अनुमति देता है।

तकनीकी परिणाम इस तथ्य से प्राप्त होता है कि "डीएनए-धूमकेतु" विधि द्वारा प्राप्त धूमकेतु जैसी वस्तुओं की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण की विधि, जिसमें यह तथ्य शामिल है कि धूमकेतु जैसी वस्तुओं के साथ एक छवि - "धूमकेतु" दर्ज की जाती है एक वीडियो कैमरा के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर स्थापित एक जैविक तैयारी से एक कंप्यूटर में, विभिन्न चमक के मर्ज किए गए और अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स के एक सेट का प्रतिनिधित्व करते हुए, वे छवि में इन "धूमकेतु" की खोज करते हैं, सीमा की परिभाषा के साथ उनके समोच्च का चयन करते हैं "सिर" और "पूंछ" के, सूक्ष्म आकारिकी का प्रदर्शन करते हैं, जबकि छवि में "धूमकेतु" की खोज करने से पहले, धुंधले क्षेत्रों में "धूमकेतु" के अलग-अलग बिंदुओं को संयोजित करने के लिए स्तरों का अनुकूलन छवि चमक और कम-पास फ़िल्टरिंग किया जाता है। , फिर परिणामी छवि का विभाजन चमक थ्रेशोल्ड के आधार पर किया जाता है, जिसे पृष्ठभूमि से एक ऑफसेट के रूप में परिभाषित किया जाता है, एक सीमित क्षेत्र को "बीज के साथ" भरकर "धूमकेतु" की आकृति का पता लगाया जाता है, प्रत्येक के केंद्र "सिर" की खोज की जाती है। धूमकेतु", परिभाषित करके "सिर" और "पूंछ" की आभासी सीमा का निर्धारण, "सिर" और "पूंछ" की आभासी सीमा का निर्धारण, "के सामने के भाग के बिंदुओं की चमक तीव्रता के वितरण को प्रतिबिंबित करके" के करीब चमक तीव्रता वाले बिंदुओं के गुरुत्वाकर्षण के केंद्र का विभाजन धूमकेतु का सिर", फिर "धूमकेतु" की सूक्ष्म आकृति विज्ञान को मापने के द्वारा किया जाता है: धूमकेतु", "पूंछ", "सिर" का व्यास और पूरे "धूमकेतु" में डीएनए के प्रतिशत की गणना, "पूंछ में" ", डीएनए क्षति के उपाय और कई अन्य पैरामीटर जो समस्या को हल करने के आधार पर डीएनए क्षति की डिग्री की विशेषता रखते हैं, और सूचीबद्ध संचालन स्वचालित रूप से छवि या छवियों की श्रृंखला में सभी "धूमकेतु" पर एक साथ किए जाते हैं।

निम्नलिखित प्रक्रियाओं के अनुक्रम को निष्पादित करके विधि को पूरा किया जाता है:

1. एक वीडियो कैमरा के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर लगे जैविक नमूने से कंप्यूटर में प्रवेश करना, धूमकेतु जैसी वस्तुओं के साथ चित्र - "धूमकेतु", जो विभिन्न चमक के विलय और अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स का एक सेट है।

2. छवि चमक स्तरों का अनुकूलन। शून्य चमक पृष्ठभूमि है, अधिकतम चमक "धूमकेतु" सिर का केंद्र है।

3. औसत "धूमकेतु" के त्रिज्या के 1/10 के बराबर बड़े त्रिज्या के साथ गॉसियन लो-पास फ़िल्टरिंग (धुंधला) "धूमकेतु" के अलग-अलग बिंदुओं को धुंधले क्षेत्रों में संयोजित करने के लिए किया जाता है। एक दूसरे के करीब "धूमकेतु" के विलय को रोकने के लिए, धुंधला त्रिज्या समायोजन अंतःक्रियात्मक रूप से उपयोग किया जाता है।

4. परिणामी धुंधले क्षेत्रों का विभाजन चमक सीमा के आधार पर किया जाता है। दहलीज स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि से ऑफसेट के रूप में निर्धारित की जाती है ("धूमकेतु" को छोड़कर छवि में कोई बाहरी समावेशन और अन्य वस्तुएं नहीं हैं), लेकिन दहलीज को अंतःक्रियात्मक रूप से ठीक किया जा सकता है।

5. एक सीमित क्षेत्र "बीज" भरकर "धूमकेतु" की आकृति का पता लगाना, जहां बीज "धूमकेतु" से संबंधित एक मनमाना बिंदु है।

धूमकेतु के सिर के केंद्र का पता लगाना। निर्धारित करने के लिए दो विधियों का उपयोग किया जा सकता है: क्षैतिज अक्ष के साथ "धूमकेतु" बिंदुओं की चमक तीव्रता के अधिकतम वितरण द्वारा या अधिकतम 80% से अधिक चमक तीव्रता वाले बिंदुओं के गुरुत्वाकर्षण के केंद्र द्वारा।

"धूमकेतु सिर" के सामने के हिस्से के बिंदुओं की चमक तीव्रता के वितरण को प्रतिबिंबित करके "सिर" और "पूंछ" की आभासी सीमा का निर्धारण (सामने का हिस्सा सामने की सीमा तक का हिस्सा है "धूमकेतु सिर")।

मापने के द्वारा "धूमकेतु" की सूक्ष्म रूपमिति का प्रदर्शन: "धूमकेतु" की लंबाई, "पूंछ की लंबाई", "सिर" का व्यास और पूरे "धूमकेतु" में डीएनए के प्रतिशत की गणना, "पूंछ में" ", डीएनए क्षति के उपाय और कई अन्य पैरामीटर जो हल किए जा रहे कार्य के आधार पर डिग्री डीएनए क्षति की विशेषता रखते हैं।

9. प्रत्येक धूमकेतु के प्राप्त मापदंडों के मूल्यों का आउटपुट उपयोगकर्ता के कार्य विवरण को लागू करने के लिए MS EXCEL तालिका में किया जाता है, उदाहरण के लिए, आगे के लिए सांख्यिकीय विश्लेषणया डीएनए संरचना को नुकसान की डिग्री के अनुसार "धूमकेतु" का वर्गीकरण।

इस प्रकार, प्रस्तावित विधि में, धूमकेतु के प्रत्येक क्षेत्र को उनके जटिल समोच्च द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो ज्ञात विधि के विपरीत, गणना मापदंडों की सटीकता को बढ़ाता है, जहां "धूमकेतु" की सीमाएं एक आयताकार क्षेत्र का उपयोग करके निर्धारित की जाती हैं, जो क्षति का आकलन करने के लिए आवश्यक मापदंडों की गणना की सटीकता को कम करता है (विशेषकर यदि क्षति कमजोर रूप से व्यक्त की जाती है) "डीएनए-धूमकेतु", क्योंकि इस मामले में, पास में होने वाले हस्तक्षेप को "धूमकेतु" के लिए भी जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, ज्ञात विधि में, "सिर" और "पूंछ" की सीमा को एक सीधी रेखा के रूप में परिभाषित किया गया है, जो धूमकेतु की धुरी के लंबवत है और धूमकेतु को "सिर" और "पूंछ" में अलग करती है। प्रस्तावित विधि "धूमकेतु सिर" के केंद्र की गणना करके और "धूमकेतु सिर" के सामने के हिस्से के बिंदुओं की चमक तीव्रता के वितरण को प्रतिबिंबित करके निर्धारित एक आभासी सीमा का उपयोग करती है। यह धूमकेतु की पूंछ की लंबाई और सिर और पूंछ में डीएनए के प्रतिशत की गणना की सटीकता में काफी सुधार करता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी सूचीबद्ध संचालन एक छवि या छवियों की एक श्रृंखला पर सभी "धूमकेतु" पर स्वचालित रूप से एक साथ किए जाते हैं।

दावा

"डीएनए-धूमकेतु" विधि द्वारा प्राप्त धूमकेतु जैसी वस्तुओं की छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए एक विधि, जिसमें धूमकेतु जैसी वस्तुओं के साथ एक छवि पेश करना शामिल है - "धूमकेतु", जो अलग-अलग के विलय और अलग फ्लोरोसेंट बिंदुओं का एक सेट है चमक, छवि में इन "धूमकेतु" की खोज करें, "सिर" और "पूंछ" की सीमा की परिभाषा के साथ उनके समोच्च को हाइलाइट करें, माइक्रोस्कोपिक मॉर्फोमेट्री करें, जिसमें छवि में "धूमकेतु" की खोज करने से पहले, छवि चमक स्तरों को अनुकूलित किया जाता है और "धूमकेतु" के अलग-अलग बिंदुओं को धुंधले क्षेत्रों में संयोजित करने के लिए निम्न-आवृत्ति फ़िल्टरिंग, फिर परिणामी छवि का विभाजन चमक थ्रेशोल्ड के आधार पर किया जाता है, जिसे पृष्ठभूमि से ऑफसेट के रूप में परिभाषित किया जाता है, "धूमकेतु" की आकृति को ढूंढता है एक सीमित क्षेत्र "बीज के साथ" भरना, जहां बीज "धूमकेतु" से संबंधित एक मनमाना बिंदु है, खोज प्रत्येक "धूमकेतु" के सिर का केंद्र अधिकतम के करीब एक चमक तीव्रता वाले बिंदुओं के गुरुत्वाकर्षण के केंद्र का निर्धारण करके, "सिर" और "पूंछ" की आभासी सीमा का निर्धारण करके चमक की तीव्रता के वितरण को प्रतिबिंबित करता है धूमकेतु के सिर के सामने के हिस्से के बिंदु, फिर "धूमकेतु" की सूक्ष्म आकृति विज्ञान "धूमकेतु", "पूंछ", "सिर" के व्यास और प्रतिशत की गणना की लंबाई को मापकर किया जाता है। पूरे "धूमकेतु" में डीएनए का, "पूंछ" में और डीएनए क्षति के उपायों में, और उपरोक्त संचालन छवियों की एक श्रृंखला में सभी "धूमकेतु" पर एक साथ स्वचालित रूप से किया जाता है।

प्रतियोगिता के लिए लेख "जैव/मोल/पाठ": क्या आप जानते हैं कि धूमकेतुओं का अध्ययन न केवल खगोलविद करते हैं, बल्कि आणविक जीवविज्ञानी भी करते हैं? इनका कार्य अंतरिक्ष से परोक्ष रूप से ही जुड़ा है। वे सूक्ष्मदर्शी से धूमकेतुओं को देखते हैं। तारों वाले आकाश के रूप में कार्य करता है जेल स्लाइड- अध्ययन के तहत कोशिकाओं के साथ agarose के साथ लेपित सूक्ष्म कांच की स्लाइड। यह 1984 में डीएनए धूमकेतु विधि नामक डीएनए विश्लेषण पद्धति की खोज से संभव हुआ था।

संख्या में लोकप्रियता के बारे में

चित्रा 2. विभिन्न प्रकृति के कारकों की कार्रवाई के परिणामस्वरूप डीएनए क्षति के उदाहरण

जैसा कि आप देख सकते हैं, "लुटेरे" "अपराधों" की एक विशाल श्रृंखला को अंजाम दे सकते हैं और डीएनए की अखंडता को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचा सकते हैं। हालांकि, सेल में, डीएनए सुरक्षा को मरम्मत प्रणाली, "हीलर" द्वारा संरक्षित किया जाता है, जो विशेष "दवाओं" की मदद से अणु को नुकसान पहुंचाते हैं - एंजाइम जो जीनोटॉक्सिकेंट्स के कारण "घावों को पैच" कर सकते हैं। कई मरम्मत एंजाइम हैं। वर्तमान में, यह ज्ञात है कि छांटना मरम्मतडीएनए क्षति, यानी। संचालन में, जब साइट को पहले काट दिया जाता है और फिर से जोड़ा जाता है, तो 13 एंजाइम भाग लेते हैं!

हालांकि, सब कुछ उतना सहज नहीं है जितना पहली नज़र में लगता है। "मरम्मत विभाग" में संचालन हमेशा सफलतापूर्वक समाप्त नहीं होता है, अर्थात। मूल डीएनए अणु की बहाली। रिकवरी सिस्टम के काम का नतीजा नया नुकसान हो सकता है। इसका कारण नाभिक में डीएनए स्ट्रैंड्स की बहुत घनी पैकिंग है।

लेकिन वैज्ञानिकों का क्या? वे "पुलिस" के रूप में कार्य करते हैं जिन्हें "अपराध के घटकों" की पहचान करने की आवश्यकता होती है, अर्थात। "अपराधी" और उसके "सहयोगियों" (जीनोटॉक्सिकेंट्स, उनकी खुराक और सांद्रता निर्धारित करें) का पता लगाएं और "अपराध" की गंभीरता को स्थापित करें (डीएनए क्षति की डिग्री की पहचान करें)। ऐसी स्थितियों में डीएनए धूमकेतु विधि मदद करती है।

मूल रूप से स्वीडन से

कोशिका की परमाणु संरचनाओं का अध्ययन करने और जीवों की एकल कोशिकाओं में डीएनए स्ट्रैंड क्षति के मात्रात्मक निर्धारण के उद्देश्य से प्रयास 1980 के दशक की शुरुआत में किए गए थे। कुक और ब्रेज़ेल, रिडबर्ग और जोहानसन जैसे वैज्ञानिकों द्वारा XX सदी। हालांकि, 1984 तक स्वीडिश शोधकर्ता ओस्टलिंग और जोहानसन ने डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक नई विधि विकसित नहीं की थी। यह वे थे जिन्होंने देखा कि एक विद्युत क्षेत्र में पलायन करने वाले डीएनए टुकड़ों की छवियां खगोलीय धूमकेतु से मिलती जुलती थीं। सादृश्य था। स्वीडन के वैज्ञानिकों द्वारा प्राप्त "धूमकेतु" में अंतरिक्ष "भाइयों" की मुख्य विशेषताएं थीं: उनके पास "सिर" और "पूंछ" थी। यहीं से ऐसा रोमांटिक नाम आया - डीएनए धूमकेतु विधि।

इस विधि के और भी कई नाम हैं - एकल (पृथक) कोशिकाओं के जेल वैद्युतकणसंचलन तथा माइक्रोगेल में वैद्युतकणसंचलन . पहला नाम गलत तरीके से विश्लेषण के सार को दर्शाता है। वैद्युतकणसंचलन एकल कोशिकाओं में नहीं, बल्कि एक agarose जेल में किया जाता है, जहां इन्हीं कोशिकाओं से पृथक डीएनए एक ध्रुव से दूसरे ध्रुव तक जाता है। दूसरा सही है, क्योंकि स्लाइड्स पर लागू agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन किया जाता है। लेकिन यह शब्द नहीं चल पाया। "डीएनए धूमकेतु विधि" के विपरीत, ये नाम बहुत लोकप्रिय नहीं हैं और शायद ही कभी उपयोग किए जाते हैं।

"धूमकेतु" पाने के लिए जादू

चित्रा 3. "धूमकेतु" की संरचना।

प्रयोगशाला "धूमकेतु" दिलचस्प वस्तुएं हैं। उनकी उपस्थिति सीधे प्रभाव के कारकों, उनकी ताकत और विश्लेषण की स्थितियों पर निर्भर करती है। "धूमकेतु" के बारे में जानकारी एक रहस्य नहीं है, अंधेरे में डूबा हुआ है, इसलिए उनकी रचना, संरचना और गठन के बारे में लगभग सब कुछ जाना जाता है।

1984 के एक प्रकाशन में, स्वीडन ओस्टलिंग और जोहानसन ने डीएनए को "पूंछ" और गुहा "केंद्र" में शेष डीएनए को स्थानांतरित कर दिया। अब, व्यावहारिक रूप से कुछ भी नहीं बदला है: "धूमकेतु" पारंपरिक रूप से "सिर" और "पूंछ" (चित्र 3) द्वारा प्रतिष्ठित है।

यह स्पष्ट रूप से समझा जाना चाहिए कि "धूमकेतु" किसी जीवित जीव की कोशिका से नहीं, बल्कि उसके डीएनए से बनता है। एक agarose परत में एम्बेडेड सेल निलंबनगुहा बनाता है, जो प्रक्रिया में लसीकाइन कोशिकाओं के डीएनए पर कब्जा कर लेता है। डीएनए धूमकेतु विधि में आगे सभी जोड़तोड़ डीएनए के साथ किए जाते हैं।

"धूमकेतु" एक विद्युत क्षेत्र (जब करंट और वोल्टेज होता है) में डीएनए के प्रवास (आंदोलन) की प्रक्रिया में बनते हैं। के दौरान क्या होता है लसीकातथा वैद्युतकणसंचलन? डीएनए के विपरीत, प्रसार के दौरान कोशिका को बनाने वाले छोटे बायोमोलेक्यूल्स लसीका समाधान में "बच" जाते हैं, जो कि इसके अत्यंत होने के कारण बड़े आकारहिल नही सकता। जब डीएनए के साथ स्लाइड्स को वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया जाता है, तो अक्षुण्ण डीएनए एक "धूमकेतु सिर" बनाता है, और अणुओं के क्षतिग्रस्त हिस्से सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए वर्तमान स्रोत की ओर "जॉग" करना शुरू कर देते हैं - एनोड (क्योंकि डीएनए नकारात्मक रूप से चार्ज होता है), एक "पूंछ" बनाता है ". परिणामी "धूमकेतु" को देखने के लिए, उन्हें फ्लोरोसेंट रंगों (एथिडियम ब्रोमाइड, एक्रिडीन नारंगी, आदि) के साथ दाग दिया जाता है, और फिर उच्च आवर्धन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है (चित्र 4)।

ओस्टलिंग और जोहानसन निम्नलिखित लिखते हैं: “जब एक कोशिका एक जेल में अंतर्निहित होती है, तो यह उसमें एक अवसाद बनाती है। कोशिका विश्लेषण के बाद, इसका डीएनए इस अवसाद पर कब्जा कर लेता है। अधिकांश अन्य बायोमोलेक्यूल्स आसानी से agarose जेल के माध्यम से फैल जाते हैं। इस प्रकार, उनमें से लगभग सभी कोशिका द्वारा छोड़े गए गुहा से लाइसिंग समाधान में आते हैं। एकमात्र अपवाद डीएनए है, जो अपने बड़े होने के कारण आणविक वजनजेल में रहता है। - ईडी।

चित्रा 4. डीएनए धूमकेतु विधि के चरणों का क्रम(ऊपर से दक्षिणावर्त शुरू)। * - NaOH के साथ क्षार को बेअसर करने के लिए केवल विधि के क्षारीय संस्करण (pH> 13.0) में चरण की आवश्यकता होती है।

डीएनए की क्षति जितनी मजबूत होगी (और क्षति की डिग्री उत्परिवर्तजन की खुराक पर निर्भर करती है), उतनी ही अधिक स्पष्ट "धूमकेतु पूंछ"। जैसा कि आप पहले ही समझ चुके हैं, एक लंबी "पूंछ" बहुत अच्छी नहीं है।

यूनिवर्सल सैनिक

डीएनए धूमकेतु विधि एक विस्तृत श्रेणी का उपकरण है। इसकी मदद से, वैज्ञानिक मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण सुरक्षा के प्रयास से संबंधित "अपराधों को सुलझाते हैं" (बेशक, यह सब क्षतिग्रस्त डीएनए के अध्ययन के माध्यम से)। विधि ने अपनी आकर्षक विशेषताओं - सादगी, गति, अर्थव्यवस्था और पर्याप्त रूप से उच्च संवेदनशीलता के कारण इतनी लोकप्रियता हासिल की है, जो कम-तीव्रता वाले कारकों (उदाहरण के लिए, विकिरण की कम खुराक) के कारण भी डीएनए क्षति का पता लगाना संभव बनाता है। डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए कई तरीकों में से, डीएनए धूमकेतु विधि इस क्षेत्र में सबसे उपयुक्त है। उपरोक्त लाभों के अलावा, यह बेहतर प्रदर्शन करता है, उदाहरण के लिए, प्रसिद्ध साइटोजेनेटिक तरीके (एना-टेलोफैसिक, मेटाफ़ेज़ विश्लेषण, माइक्रोन्यूक्लियस टेस्ट), और अन्य अच्छे कारणों के लिए।

डीएनए धूमकेतु विधि आपको माइक्रोन्यूक्लियस परीक्षण के विपरीत, डीएनए युक्त किसी भी कोशिका के साथ काम करने की अनुमति देती है, जिसमें अक्सर रक्त या अस्थि मज्जा कोशिकाएं शामिल होती हैं। यदि एना-टेलोफ़ेज़ और मेटाफ़ेज़ विधियाँ निर्धारित की सूची में सीमित हैं गुणसूत्र विपथन, तो डीएनए धूमकेतु विधि अपने संशोधनों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करती है, धन्यवाद जिससे शोधकर्ता विभिन्न प्रकार के डीएनए क्षति का पता लगा सकता है: एकल, दोहरी क्षति, क्षारीय-लेबल साइट, apoptosisऔर दूसरे। यही अवसर उसे "सार्वभौमिक सैनिक" बनाते हैं और विभिन्न क्षेत्रों में इस पद्धति का मार्ग प्रशस्त करते हैं। वैज्ञानिक अनुसंधान , :

• पर्यावरणीय निगरानी- अध्ययन क्षेत्र में रहने वाले जीवों के डीएनए को नुकसान की डिग्री से पर्यावरण की स्थिति का आकलन (एक नियम के रूप में, दूषित और नियंत्रण क्षेत्रों से व्यक्तियों के डीएनए क्षति के स्तर की तुलना की जाती है);
• जैविक निगरानी- डीएनए क्षति की डिग्री, क्षति के संचय और मरम्मत के संदर्भ में शरीर पर पोषण और अन्य बाहरी पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का अध्ययन;
• जीनोटॉक्सिक अध्ययनऔषधीय तैयारी, नए और मौजूदा रसायन (घरेलू रसायन, कीटनाशक, आदि);
• नैदानिक ​​अनुसंधानअंतर्गर्भाशयी विकास के चरण में प्रसव पूर्व निदान के उद्देश्य से, रोगों की प्रवृत्ति की पहचान करना;
• दक्षता चिह्नकैंसर चिकित्सा और उसका नियंत्रण।

तुलना करके सीखा जाता है बदलाव

पर्यावरण की स्थिति का अवलोकन, तथाकथित। पर्यावरणीय निगरानी, शोधकर्ताओं को पर्यावरण में परिवर्तन की पहचान करने और समय पर अलार्म बजने में मदद करता है (विशेषकर आपातकालीन स्थितियों में, उदाहरण के लिए, 1986 में चेरनोबिल परमाणु ऊर्जा संयंत्र में या 2011 में फुकुशिमा दाइची परमाणु ऊर्जा संयंत्र में)। जब पर्यावरण प्रदूषित होता है, तो संकेतक जीवों के संयोजन में डीएनए-धूमकेतु विधि काम आती है। जीवों की सूची की विशेषता अलग वातावरणआवास और पर्यावरण की स्थिति में परिवर्तन के प्रति सबसे संवेदनशील, काफी व्यापक हैं और इसमें बैक्टीरिया से लेकर प्रजातियां शामिल हैं इशरीकिया कोलीऔर जीनस के शैवाल क्लैमाइडोमोनासऔर उच्च पौधों के साथ समाप्त ( लेम्ना माइनर, पिनस सिल्वेस्ट्रिस), स्तनधारी ( माइक्रोटस एकोनोमस) और, ज़ाहिर है, एक व्यक्ति (चित्र 5)। डीएनए धूमकेतु विधि में, एक नियम के रूप में, पूरे जीव शामिल नहीं होते हैं, लेकिन उनके "घटक भाग" - कोशिकाएं जो पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील होती हैं, या ऊतक जिनसे ये कोशिकाएं प्राप्त की जा सकती हैं। रक्त कोशिकाएं आमतौर पर जानवरों से ली जाती हैं: एरिथ्रोसाइट्सतथा लिम्फोसाइट्स, हीमोसाइट्स(अपरिवर्तक में एरिथ्रोसाइट्स के अनुरूप), कोएलोमोसाइट्स(कोशिकाएं जो केंचुओं में प्रतिरक्षा कार्य करती हैं); पौधों में - विभज्योतक की कोशिकाएं, गहन रूप से विभाजित ऊतक।

टिप्पणी:डीएनए क्षति के विश्लेषण में, पूरे व्यक्तियों का भी उपयोग किया जा सकता है यदि उन्हें एक एकल कोशिका द्वारा दर्शाया जाता है, उदाहरण के लिए, क्लोरेला वल्गरिस.

चित्रा 5. डीएनए धूमकेतु पद्धति का उपयोग करके पर्यावरण की स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले संकेतक जीवों के उदाहरण।

साइटें scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, Functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, Animalfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

इस मामले में डीएनए धूमकेतु विधि कैसे काम करती है? वैज्ञानिक अध्ययन (दूषित) और नियंत्रण (गैर-दूषित) क्षेत्रों में रहने वाले संकेतक जीवों के डीएनए को नुकसान की डिग्री की तुलना करते हैं: दूषित मिट्टी, पानी आदि के संपर्क में, और वही, लेकिन सामान्य नियंत्रण स्थितियों में रहना, यानी। जब अध्ययन किए गए कारक का कोई प्रभाव नहीं होता है या यह महत्वहीन होता है। डीएनए क्षति की डिग्री का आकलन प्रयोगशालाओं में भी कड़ाई से नियंत्रित परिस्थितियों में किया जाता है, जब अध्ययन किए गए कारक या कारकों के समूह (विकिरण, धातु, कीटनाशक) के संपर्क में आने वाले जीवों का एक नमूना होता है, और आवश्यक रूप से एक नियंत्रण समूह ( इस प्रभाव का अनुभव नहीं कर रहा है)।

उदाहरण: 11 मार्च, 2011 को, जापान में सबसे तेज भूकंप और उसके बाद आई सुनामी के परिणामस्वरूप, फुकुशिमा दाइची परमाणु ऊर्जा संयंत्र में एक गंभीर विकिरण दुर्घटना हुई। 2014 में, जापानी वैज्ञानिकों ने एक अध्ययन किया। उन्होंने दुर्घटना से प्रभावित दो साइटों को चुना, एक उच्च स्तर के विकिरण (2.85 μSv / h) के साथ और एक निम्न स्तर (0.28 μSv / h) के साथ, नियंत्रण के रूप में। परिवार के केंचुओं में मेगास्कोलेसिडेइन साइटों से, डीएनए क्षति की डिग्री का विश्लेषण किया गया था। यह पता चला है कि कम स्तर के जोखिम वाले क्षेत्र में व्यक्तियों की तुलना में विकिरण के उच्च स्तर के संपर्क में आने वाले व्यक्तियों में यह सूचक काफी अधिक है।

परिदृश्य भिन्न हो सकते हैं। कोशिकाओं में डीएनए क्षति की डिग्री बढ़ सकती है, घट सकती है या अपरिवर्तित रह सकती है। दूषित क्षेत्र से जीवों में डीएनए क्षति की एक बढ़ी हुई डिग्री कोशिकाओं के कामकाज में आंतरिक परिवर्तन का संकेत दे सकती है, जिससे डीएनए के कई "ब्रेकडाउन" हो सकते हैं।

उदाहरण:कुछ धातुएं, शरीर में प्रवेश करती हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को प्रेरित करती हैं, जिससे डीएनए क्षति होती है; आयनकारी विकिरण मुक्त कणों के निर्माण में योगदान देता है, जो डीएनए के "अपराधी" भी हैं। पराबैंगनी किरणों की क्रिया से गठन हो सकता है डीएनए में डिमर, इसकी दो श्रृंखलाओं के बंधन को तोड़ना और इस प्रकार अणु की संरचना को बदलना।

कम डीएनए क्षति या कोई अंतर नहीं बताता है कि जीवों ने "उत्पीड़न" का मुकाबला किया है जीनोटॉक्सिकेंट्सऔर इनमें जीवन के लिए अनुकूलित प्रतिकूल परिस्थितियां. इस अनुकूलन को अनुकूलन कहा जाता है। लेकिन यह पूरी तरह से अलग कहानी है।

आनुवंशिकता एक भयानक शक्ति है

क्या आपने क्रोमोसोम ब्रेकेज सिंड्रोम (निजमेजेन डैमेज सिंड्रोम), ज़ेरोडर्मा पिगमेंटोसा और ट्राइकोथियोडिस्ट्रॉफी जैसी बीमारियों के बारे में सुना है? वे तभी प्रकट होते हैं जब माता-पिता दोनों ही दोषपूर्ण जीन के वाहक होते हैं (चित्र 6)।

इन वंशानुगत रोगों के निदान में डीएनए धूमकेतु पद्धति का उपयोग करने की संभावना पर साहित्य में डेटा है, जो कि जन्म के पूर्व चरण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, अर्थात। गर्भावस्था के दौरान।

निजमेजेन इंजरी सिंड्रोम (निजमेजेन ब्रेकेज सिंड्रोम, एनबीएस) डीएनए की अखंडता के स्थायी उल्लंघन से जुड़ी एक बीमारी है। समस्या यह है कि जीन एनबीएस1एक उत्परिवर्तन होता है जो "बंद हो जाता है" निब्रिन- एक प्रोटीन जो विकिरण से प्रेरित युग्मित डीएनए ब्रेक की मरम्मत को नियंत्रित करता है। इसलिए इस सिंड्रोम से पीड़ित लोग बेहद रेडियोसेंसिटिव होते हैं। अपने अध्ययन में प्राग इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन से बोजेना नोवोत्ना का तर्क है कि डीएनए धूमकेतु विधि जीन के विषमयुग्मजी वाहक की पहचान करने में उत्कृष्ट है एनबीएस1असामान्य रूप से उच्च स्तरलिम्फोसाइटों के "धूमकेतु" में डीएनए किस्में को नुकसान।

कोई कम खतरनाक नहीं ज़ेरोडर्मा पिगमेंटोसमतथा ट्राइकोथियोडिस्ट्रोफी. ये गंभीर मानव रोग हैं जो विरासत में मिले हैं। पहले मामले में, त्वचा के खुले क्षेत्रों (हाथ, गर्दन, चेहरे) पर बच्चों में सूरज के कम संपर्क के साथ, पहले लाल धब्बे दिखाई देते हैं, जो बाद में ट्यूमर के गठन तक स्पष्ट रंजकता में बदल जाते हैं। दूसरी बीमारी भंगुर बाल और नाखून, मानसिक मंदता और खोपड़ी की संरचना में विसंगतियों में व्यक्त की जाती है।

न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर के काम में उल्लंघन से ये रोग एकजुट होते हैं। डीएनए धूमकेतु पद्धति का उपयोग करके भ्रूण कोशिकाओं में न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत की सफलता के आधार पर, यह निर्धारित करना संभव है कि बच्चा इन बीमारियों से पीड़ित होगा या नहीं। साहित्य में इस तरह के निदान के मामलों का वर्णन किया गया है।

शोधकर्ताओं को जन्म से पहले यह पता लगाने के कार्य का सामना करना पड़ा कि क्या बच्चे ज़ेरोडर्मा पिगमेंटोसा और ट्राइकोथियोडिस्ट्रॉफी से पीड़ित होंगे। प्रयोग उन परिवारों में किए गए जिनमें माता-पिता ज़ेरोडर्मा पिगमेंटोसम जीन के वाहक हैं ( एक्स परिवार) और ट्राइकोथियोडिस्ट्रॉफी ( वाई परिवार) और पहले से ही इन बीमारियों से ग्रस्त बच्चे हैं।

परिवार X: गर्भावस्था 15 सप्ताह, माँ ज़ेरोडर्मा पिगमेंटोसा जीन की वाहक होती है, इस रोग के साथ एक 3 वर्षीय बच्चा है।

परिवार Y: गर्भावस्था 10 सप्ताह, पिता और माता - ट्राइकोथियोडिस्ट्रॉफी जीन के वाहक, ट्राइकोथियोडिस्ट्रॉफी वाले दो बच्चों की 22 महीने और 6 साल की उम्र में मृत्यु हो गई, एक और - सहज गर्भपात (गर्भपात) के परिणामस्वरूप।

सभी कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में लाया गया।

एक्स फैमिली स्टडी: डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग करके निर्धारित भ्रूण की कोशिकाओं में डीएनए क्षति का स्तर वाहक मां के फाइब्रोब्लास्ट में डीएनए क्षति के स्तर के करीब था, अर्थात। सामान्य डीएनए छांटने की मरम्मत की स्थिति के तहत स्ट्रैंड क्षति के स्तर के अनुरूप। निष्कर्ष - भ्रूण स्वस्थ है। इस निष्कर्ष की पुष्टि एक सामान्य बच्चे के जन्म के बाद हुई थी।

परिवार वाई अध्ययन:भ्रूण की कोशिकाओं में, पिता और माता के फाइब्रोब्लास्ट की तुलना में, एक्सिसनल मरम्मत के कार्य में एक दोष का पता चला था, जिसकी पुष्टि एक अन्य विधि द्वारा भी की गई थी जो मरम्मत के अध्ययन पर आधारित नहीं थी। यह पता चला है कि भ्रूण बीमार है। परिजनों से बात करने के बाद अबॉर्शन कराने का निर्णय लिया गया।

उद्योग मानव स्वास्थ्य का दुश्मन है

औद्योगिक सुविधाओं में काम करने वाले या पर्यावरण के अनुकूल क्षेत्रों में रहने वाले लोगों का स्वास्थ्य हर दिन खतरे में है। खतरा न केवल जीनोटॉक्सिकेंट्स (आयनीकरण विकिरण, भारी धातुओं और अन्य रसायनों) के साथ शरीर के दैनिक निकट संपर्क में है, बल्कि आपातकालीन स्थितियों की संभावना में भी है (ऊपर उदाहरण देखें), जिसके परिणाम जीवों के लिए विनाशकारी हो सकते हैं। सिर दर्द जैसी हल्की बीमारियों से लेकर कैंसर तक, शरीर की स्थिति में परिवर्तन बहुत भिन्न हो सकते हैं।

डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग एक आशाजनक उपकरण के रूप में किया जा सकता है प्रारंभिक मूल्यांकनपर्यावरणीय रूप से प्रतिकूल परिस्थितियों में काम करने वाले या रहने वाले लोगों के जीनोम की स्थिति। इसका मतलब है कि डीएनए धूमकेतु का उपयोग न केवल अनुसंधान के इन क्षेत्रों में किया जा सकता है, बल्कि भविष्य में अन्य क्षेत्रों में भी किया जा सकता है, नैदानिक ​​अनुसंधान, चिकित्सा, और बहुत कुछ में विधि का उपयोग करने के विकल्पों का विस्तार करें।

उदाहरण:पोलैंड में, एक बैटरी कारखाने में एक दुर्घटना ने श्रमिकों को उच्च स्तर के सीसा और कैडमियम के संपर्क में ला दिया, जिसके परिणामस्वरूप उन लोगों के समूह की तुलना में डीएनए क्षति में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि हुई, जिन्होंने इस तरह के तनाव का अनुभव नहीं किया था। ल्यूकोसाइट डीएनए पर भारी धातुओं - मैंगनीज, क्रोमियम, निकल, कैडमियम, कोबाल्ट, लेड, मोलिब्डेनम, आयरन - युक्त गैस वेल्डिंग एरोसोल के जीनोटॉक्सिक प्रभाव का पता उन लोगों पर पड़ा, जिनका काम लंबे समय से वेल्डिंग से जुड़ा हुआ है।

कुछ मुश्किलें हैं

डीएनए धूमकेतु विधि का सही ढंग से उपयोग करने के लिए, आपको न केवल इसकी क्षमताओं और अन्य तरीकों पर फायदे को "दृष्टि से जानने" की आवश्यकता है, बल्कि निश्चित रूप से, नुकसान, सीमाएं और कठिनाइयां भी हैं, जिनकी आपको तलाश करने की आवश्यकता है। विधि की आवश्यकता है अनुकूलनवैज्ञानिक द्वारा उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के प्रकार और अध्ययन के लक्ष्यों के आधार पर विश्लेषण, वैद्युतकणसंचलन और अन्य स्थितियां।

व्याख्या:डीएनए रिलीज के लिए पौधे और पशु कोशिकाओं को अलग-अलग स्थितियों की आवश्यकता होती है, अर्थात। विश्लेषण सेल्यूलोज कोशिका भित्ति की उपस्थिति के कारण, पादप कोशिकाएँ जंतु कोशिकाओं की तुलना में अधिक समय लेती हैं।

पहली कठिनाई से दूसरी असुविधा होती है: विश्लेषण की समस्याओं के लिए विधि का अनुकूलन बहुत मुश्किल हो सकता है। श्रमसाध्य प्रक्रिया(हालांकि तकनीक अपने आप में सरल और समझने योग्य है), खासकर अगर किसी ने डीएनए धूमकेतु पद्धति का उपयोग करके आपके अध्ययन के उद्देश्य के साथ काम नहीं किया है। ऐसा होता है कि इस मामले में कार्यप्रणाली के "ट्यूनिंग" में बहुत समय लगता है।

कभी-कभी होते हैं व्याख्या करने में कठिनाईडीएनए क्षति की डिग्री से प्राप्त परिणाम, क्योंकि क्षति की डिग्री को हमेशा प्रभावित करने वाले कारक की खुराक के साथ सहसंबद्ध नहीं किया जा सकता है।

व्याख्या:ऐसी समस्या विधि के अपर्याप्त अनुकूलन से जुड़ी हो सकती है, जब कुछ प्रकार के नुकसान दूसरों के साथ मिश्रित होते हैं और परिणाम विकृत करते हैं। मरम्मत प्रणाली, जो परिणामी उल्लंघनों के कुछ हिस्से को ठीक करती है, डीएनए क्षति की वास्तविक डिग्री को "परेशान" भी कर सकती है।

सबसे बड़ी कठिनाइयों में से एक हो सकती है परिणामों की तुलनाविभिन्न प्रयोगशालाओं और अनुसंधान संस्थानों में विभिन्न वैज्ञानिकों द्वारा डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग करके प्राप्त किया गया। डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए, संशोधनों और पूरी तरह से अलग संकेतकों के तरीकों का उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, "धूमकेतु पूंछ" में डीएनए का प्रतिशत या "पूंछ" की लंबाई)।

व्याख्या:"धूमकेतु पूंछ" की लंबाई वह दूरी है जो डीएनए पूंछ के "सिर" से चली गई है। धूमकेतु की पूंछ में डीएनए का प्रतिशत डीएनए की मात्रा है जो पूंछ में माइग्रेट होता है, जिसे प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। से पूरी लिस्टडीएनए क्षति स्कोर www.comtassayindia.org पर उपलब्ध हैं।

डीएनए धूमकेतु पद्धति के उपयोग को मानकीकृत करने का प्रयास किया जा रहा है, जिससे वैज्ञानिकों को परिणामों की तुलना करने में मदद मिलेगी। उदाहरण के लिए, जीनोटॉक्सिक अध्ययनों में प्रोटोकॉल और दिशानिर्देश विकसित किए गए हैं।

व्याख्या: Rospotrebnadzor के संघीय स्वच्छता और महामारी विज्ञान केंद्र के दिशानिर्देश स्पष्ट रूप से परीक्षण वस्तुओं (मानव कोशिकाओं) को परिभाषित करते हैं और विश्लेषण के सभी चरणों का विस्तार से वर्णन करते हैं। इन सिफारिशों के अनुसार, डीएनए धूमकेतु विधि का उपयोग करके, घरेलू रसायनों और बहुलक सामग्री से बने उत्पादों को जीनोटॉक्सिसिटी के लिए परीक्षण किया जा सकता है।

निष्कर्ष

"जो सशस्त्र है वह सुरक्षित है" - यह डीएनए धूमकेतु विधि के साथ काम करने का आदर्श वाक्य है। उपयोग करने के फायदे और नुकसान का ज्ञान यह विधिडीएनए क्षति का आकलन करने से आप काम के दौरान कुशलता से हेरफेर कर सकते हैं, "नुकसान" से बच सकते हैं और सही परिणाम प्राप्त कर सकते हैं।

डीएनए धूमकेतु विधि, एक नियम के रूप में, शरीर की सामान्य स्थिति का आकलन करने में "जादू की छड़ी" की भूमिका निभाती है। प्रारंभिक चरणप्रभाव प्रतिकूल कारकवातावरण। पर आरंभिक चरणयह डीएनए क्षति है जो शारीरिक स्तर पर परिवर्तन की उपस्थिति से बहुत पहले प्रतिकूल प्रभावों के लिए शरीर की सबसे तेज और इसलिए एकमात्र मापनीय प्रतिक्रिया है।

अब आप जानते हैं कि जीवविज्ञानी प्रयोगशालाओं में "धूमकेतु" कैसे प्राप्त करते हैं और उन्हें उनकी इतनी आवश्यकता क्यों है।

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