मछली (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति) कैंसर के निदान में एक अनिवार्य विधि है। विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच की मदद से, यह विधि जीनोमिक पुनर्व्यवस्था की उपस्थिति की पहचान करना संभव बनाती है, अर्थात निदान को स्पष्ट करना, रोग का निदान स्पष्ट करना और विशिष्ट मामले के आधार पर उपयुक्त चिकित्सा का चयन करना। सबसे पहले, इस दृष्टिकोण का उपयोग ऑन्कोमेटोलॉजिकल रोगों में किया जाता है। पहले, इन उद्देश्यों के लिए पारंपरिक कैरियोटाइपिंग का उपयोग किया जाता था, लेकिन यदि रोगी की कोशिकाएं संस्कृति में स्पष्ट वृद्धि नहीं दिखाती हैं, तो यह इस पद्धति द्वारा निदान को गंभीरता से जटिल करता है। इन मामलों में, मछली का उपयोग प्रयोगशाला निदान की संभावनाओं का काफी विस्तार करता है। इसके अलावा, जटिल क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था मछली का उपयोग करके व्याख्या करना आसान है।

प्रयोगशाला सेंट्रोमियर, गुणसूत्रों के विशिष्ट क्षेत्रों और जीन के लिए जांच का उपयोग करती है। ट्रांसलोकेशन की खोज के लिए दो-रंग की जांच का चयन इस तरह से किया जाता है कि यदि दो जीन के टुकड़े जो आमतौर पर जीनोम के विभिन्न हिस्सों में स्थित होते हैं, तो दो सिग्नल पास होते हैं विभिन्न रंग- प्रत्येक जांच से एक, एक में विलीन हो जाता है जो मूल से प्रकाश में भिन्न होता है। इसलिए, उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार के ल्यूकेमिया के बीच आम बीसीआर-एबीएल ट्रांसलोकेशन का पता लगाया जाता है। MLL, TEL और RARα जैसे जीन विभिन्न अनुक्रमों के साथ काइमेरिक जीन बनाने के लिए पुनर्व्यवस्थित कर सकते हैं। इस मामले में, जीन के विभिन्न सिरों पर दो जांच की जाती है। यदि जीन बरकरार है, तो तैयारी पर प्रत्येक नाभिक में एक बिंदु होगा, यदि यह टूट गया है, तो अलग-अलग रंगों के दो बिंदु होंगे। इसके कारण, पीसीआर की तुलना में फिश क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन का पता लगाने के लिए अधिक लचीली तकनीक है। पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के विपरीत, किसी भी विशिष्ट क्षेत्र के भीतर किसी अन्य गुणसूत्र के एक टुकड़े का टूटना और लगाव इस पर ध्यान दिए बिना जांच गुणसूत्र पर बैठेगी, जो विशिष्ट, यद्यपि सामान्य, पुनर्व्यवस्था को पहचानती है।

मछली द्वारा पता लगाए गए मार्करों का पैनल क्रोनिक लिम्फोइड ल्यूकेमिया में रोग का आकलन करने की अनुमति देता है। 11q और 17p विलोपन एक खराब रोग का निदान के साथ जुड़े हुए हैं, जबकि एक सामान्य कैरियोटाइप की तरह एक 13q विलोपन, एक अनुकूल रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। गुणसूत्र 12 पर ट्राइसॉमी के साथ, मामले को एक मध्यवर्ती जोखिम समूह के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

मायलोमा जोखिम श्रेणी भी विलोपन और ट्रांसलोकेशन के संयोजन से जुड़ी है, टी (4; 14), टी (14; 16) ट्रांसलोकेशन और 17 पी विलोपन खराब रोग का निदान से जुड़े हैं। इस तरह के नैदानिक ​​अध्ययन संवर्धन के बाद लाल अस्थि मज्जा बायोप्सी पर किए जाते हैं। काइमेरिक EML4-ALK जीन के निर्माण के साथ थोड़ा सा उलटा, गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर की विशेषता है। काइमेरिक जीन का उत्पाद लक्षित चिकित्सा का लक्ष्य है। इस तरह की पुनर्व्यवस्था का पता फिश विधि से भी लगाया जा सकता है। HER2 प्रवर्धन का अक्सर एक अप्रत्यक्ष संकेत द्वारा मूल्यांकन किया जाता है - इसके लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की विधि का उपयोग करके अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि, हालांकि, कुछ देशों में इस उद्देश्य के लिए FISH का उपयोग करने या पुष्टि के लिए कम से कम इस पद्धति का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

संक्षिप्त जवाब: स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति की विधि (मछली - स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति) में रोगी से प्राप्त सामग्री में वांछित डीएनए अनुक्रमों की खोज के लिए एक जांच के रूप में अद्वितीय डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का उपयोग शामिल है। विधि मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों या इंटरफ़ेज़ कोशिकाओं के डीएनए के लिए डीएनए जांच के पूरक बंधन पर आधारित है। डीएनए जांच और परीक्षण डीएनए को एकल-फंसे डीएनए बनाने के लिए विकृत किया जाता है। डीएनए जांच को क्रोमोसोम की तैयारी में जोड़ा जाता है और एक निश्चित समय के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। संकरण के बाद डीएनए में फ्लोरोक्रोम-लेबल जांच की उपस्थिति या अनुपस्थिति फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गुणसूत्रों की जांच करके निर्धारित की जाती है।

विस्तृत प्रतिक्रिया: फ्लोरोसेंट संकरण विधि बगल मेंआपको एक फ्लोरोसेंट लेबल और क्रोमोसोम पर वांछित साइट के साथ संयुग्मित डीएनए जांच की पूरक बातचीत के आधार पर मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों या इंटरफ़ेज़ नाभिक की तैयारी पर अलग-अलग गुणसूत्रों या उनके व्यक्तिगत वर्गों की पहचान करने की अनुमति देता है। गुणसूत्र पर पेप्टाइड-न्यूक्लिक यौगिकों की कल्पना करने के लिए, प्रोटीन उत्पाद पर आधारित पीएनए जांच का उपयोग किया जाता है।
विधि मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों या इंटरफ़ेज़ कोशिकाओं के डीएनए के लिए डीएनए जांच के पूरक बंधन पर आधारित है और इसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं:
1. विकृतीकरणडबल-फंसे जांच डीएनए और उच्च तापमान या रासायनिक एजेंटों के प्रभाव में एकल-फंसे हुए डीएनए को लक्षित करें।
2. संकरणडबल-स्ट्रैंडेड हाइब्रिड अणु के गठन के साथ पूरकता के सिद्धांत के अनुसार डीएनए लक्ष्य के साथ डीएनए जांच
3. संकरण के बाद धोनाअनहाइब्रिडाइज्ड डीएनए जांच को हटाने के लिए
4. विश्लेषणएक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ संकरण संकेत

लाभमछली आणविक आनुवंशिक निदान विधियों में तेजी से विश्लेषण शामिल है एक बड़ी संख्या मेंकोशिकाओं, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता, गैर-कृषि योग्य और गैर-विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता।
कमियांविधि के बारे में जानकारी प्राप्त करने में असमर्थता हैं शारीरिक हालतअध्ययन के तहत डीएनए या गुणसूत्र क्षेत्र।
मछली का उपयोग प्रसवपूर्व आणविक आनुवंशिक निदान और ट्यूमर के लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है; बाल चिकित्सा अभ्यास में, इसका उपयोग, एक नियम के रूप में, विशिष्ट विकृतियों से जुड़े सूक्ष्मदर्शी विलोपन की पहचान करने के लिए किया जाता है। माइक्रोएलेटमेंट पर आधारित सिंड्रोम को पहले अज्ञात एटियलजि के रोग माना जाता था, क्योंकि क्रोमोसोमल विलोपन और पुनर्व्यवस्था जो इन रोगों के विकास का कारण बनती हैं, आमतौर पर इसकी कल्पना नहीं की जाती है। पारंपरिक तरीकेगुणसूत्र विश्लेषण। गुणसूत्रों के विशिष्ट क्षेत्रों में इस तरह के छोटे विलोपन का पता मछली द्वारा बड़ी सटीकता के साथ लगाया जा सकता है। सबमाइक्रोस्कोपिक विलोपन के कारण होने वाले रोगों में शामिल हैं: प्रेडर-विली, एंजेलमैन, विलियम्स, मिलर-डायकर, स्मिथ-मैजेनिस सिंड्रोम और वेलोकार्डियोफेशियल सिंड्रोम. मछली असामान्य मामलों में इन सिंड्रोमों के निदान की सुविधा प्रदान करती है, विशेष रूप से शैशवावस्था में, जब रोग के कई नैदानिक ​​रूप से महत्वपूर्ण लक्षण अभी भी अनुपस्थित हैं। आणविक आनुवंशिक निदान की इस पद्धति का उपयोग किशोरावस्था और वयस्कता में भी उचित है, जब रोग के विशिष्ट नैदानिक ​​लक्षण, बचपन की विशेषता, परिवर्तन से गुजरते हैं।

121. डीएनए जांच। वंशानुगत रोगों के निर्धारण में उनका उपयोग।

संक्षिप्त समीक्षा

डीएनए जांच हैडीएनए का एक छोटा टुकड़ा फ़्लोरेसिन, एक एंजाइम, या एक रेडियोधर्मी आइसोटोप से संयुग्मित होता है, जिसका उपयोग लक्ष्य डीएनए अणु के पूरक क्षेत्र में संकरण करने के लिए किया जाता है।

मुख्य हिस्सा

डीएनए डायग्नोस्टिक सिस्टम

किसी जीव के सभी प्रकार के गुणों की जानकारी उसके आनुवंशिक पदार्थ में निहित होती है। इस प्रकार, बैक्टीरिया की रोगजनकता एक विशिष्ट जीन या उनमें जीन के सेट की उपस्थिति से निर्धारित होती है, और एक वंशानुगत आनुवंशिक रोग एक विशिष्ट जीन को नुकसान के परिणामस्वरूप होता है। इस जैविक विशेषता को निर्धारित करने वाले डीएनए खंड में एक कड़ाई से परिभाषित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होता है और यह एक नैदानिक ​​मार्कर के रूप में काम कर सकता है।

कई तेज़ और विश्वसनीय निदान विधियां संकरण पर आधारित हैं न्यूक्लिक एसिड- विभिन्न डीएनए अणुओं के दो पूरक खंडों की जोड़ी। सामान्य शब्दों में प्रक्रिया इस प्रकार है।

1. एक झिल्ली फिल्टर पर एकल-फंसे डीएनए लक्ष्य का निर्धारण।

2. एक लेबल एकल-फंसे डीएनए जांच का अनुप्रयोग, जो कुछ शर्तों (तापमान और आयनिक शक्ति) के तहत, लक्ष्य डीएनए के साथ जोड़े।

3. अतिरिक्त अनबाउंड लेबल डीएनए जांच को हटाने के लिए फिल्टर को धोना।

4. जांच/लक्षित संकर अणुओं का पता लगाना।

न्यूक्लिक एसिड संकरण पर आधारित नैदानिक ​​परीक्षणों में, तीन घटक प्रमुख हैं: एक डीएनए जांच, एक डीएनए लक्ष्य, और एक संकरण संकेत पहचान विधि। डिटेक्शन सिस्टम में होना चाहिए उच्चतम डिग्रीविशिष्ट और अत्यधिक संवेदनशील।

* फ्लोरेसिन (डाइऑक्सिफ्लोरान, यूरेनिन ए) - कार्बनिक मिश्रण, प्रतिदीप्त रंग करना। विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में, फ़्लोरेसिन का उपयोग ल्यूमिनसेंट एसिड-बेस संकेतक के रूप में किया जाता है। जैव रसायन में और आणविक जीव विज्ञानएंटीजन और एंटीबॉडी के निर्धारण के लिए जैविक रंगों के रूप में फ्लोरेसिन के आइसोथियोसाइनेट डेरिवेटिव।

* पता लगाना किसी चीज का पता लगाना, पहचानना, खोजना है।

*संयुग्मन = संयुग्मन

*यदि डीएनए का मिश्रण, उदाहरण के लिए, मानव और माउस, एक "टेस्ट ट्यूब" में पिघलाया जाता है और एनील किया जाता है, तो माउस डीएनए श्रृंखला के कुछ खंड मानव डीएनए श्रृंखला के पूरक वर्गों के साथ हाइब्रिड बनाने के लिए पुनर्संयोजन करेंगे। ऐसी साइटों की संख्या प्रजातियों की संबंधितता की डिग्री पर निर्भर करती है। प्रजातियां एक-दूसरे के जितने करीब होती हैं, डीएनए स्ट्रैंड्स की संपूरकता के उतने ही अधिक क्षेत्र होते हैं। इस घटना को कहा जाता है डीएनए-डीएनए संकरण।

122. प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक्स के उपयोग के लिए तरीके और शर्तें।

संक्षिप्त समीक्षा:

प्रत्यक्ष विधियों का उपयोग करते हुए, डीएनए के प्राथमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (म्यूटेशन और उनके प्रकार) में गड़बड़ी का पता लगाया जाता है। प्रत्यक्ष विधियों को सटीकता की विशेषता लगभग 100% तक पहुंच जाती है।

प्रत्यक्ष निदान का उद्देश्य उत्परिवर्ती एलील (प्राथमिक डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में असामान्यताएं, उत्परिवर्तन और उनके प्रकार) की पहचान करना है।

प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक्स का नुकसान जीन के सटीक स्थान और इसके उत्परिवर्तन के स्पेक्ट्रम को जानने की आवश्यकता है। फेनिलकेटोनुरिया (उत्परिवर्तन R408W), सिस्टिक फाइब्रोसिस - (सबसे आम उत्परिवर्तन delF508), हंटिंगटन कोरिया (ट्रिन्यूक्लियोटाइड दोहराव का विस्तार-सीटीजी दोहराव), आदि जैसे रोगों के लिए प्रत्यक्ष डीएनए निदान के तरीकों का संकेत दिया जाता है।

पूरा जवाब:

प्रत्यक्ष विधियों का उपयोग करते हुए, डीएनए के प्राथमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (म्यूटेशन और उनके प्रकार) में गड़बड़ी का पता लगाया जाता है। प्रत्यक्ष विधियों को सटीकता की विशेषता लगभग 100% तक पहुंच जाती है। हालाँकि, व्यवहार में, इन विधियों को कुछ शर्तों के तहत लागू किया जा सकता है:

1) वंशानुगत बीमारी के विकास के लिए जिम्मेदार जीन का ज्ञात साइटोजेनेटिक स्थानीयकरण,

2) रोग जीन को क्लोन किया जाना चाहिए और इसके न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम ज्ञात होना चाहिए।

प्रत्यक्ष निदान का उद्देश्य उत्परिवर्ती एलील (प्राथमिक डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में असामान्यताएं, उत्परिवर्तन और उनके प्रकार) की पहचान करना है। ज्यादातर मामलों में प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक पद्धति की उच्च सटीकता के लिए परिवार के सभी सदस्यों के डीएनए विश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि संबंधित जीन में एक उत्परिवर्तन का पता लगाने से लगभग 100% सटीकता के साथ निदान की पुष्टि करना और जीनोटाइप का निर्धारण करना संभव हो जाता है। एक बीमार बच्चे के परिवार के सभी सदस्य, विषमयुग्मजी वाहक सहित।

प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक्स का नुकसान जीन के सटीक स्थान और इसके उत्परिवर्तन के स्पेक्ट्रम को जानने की आवश्यकता है।

फेनिलकेटोनुरिया (उत्परिवर्तन R408W), सिस्टिक फाइब्रोसिस - (सबसे आम उत्परिवर्तन delF508), हंटिंगटन कोरिया (ट्रिन्यूक्लियोटाइड दोहराव का विस्तार-सीटीजी दोहराव), आदि जैसे रोगों के लिए प्रत्यक्ष डीएनए निदान के तरीकों का संकेत दिया जाता है।

हालांकि, आज तक, कई बीमारियों के जीन का मानचित्रण नहीं किया गया है, उनका एक्सॉन-इंट्रॉन संगठन अज्ञात है, और कई वंशानुगत बीमारियों को स्पष्ट आनुवंशिक विविधता की विशेषता है, जो प्रत्यक्ष डीएनए निदान विधियों के पूर्ण उपयोग की अनुमति नहीं देता है। इसलिए, प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक्स की विधि की सूचना सामग्री व्यापक रूप से भिन्न होती है। तो, हंटिंगटन के कोरिया, एन्डोंड्रोप्लासिया के निदान में, यह 100% है, फेनिलकेटोनुरिया, सिस्टिक एसिडोसिस, एड्रेनोजेनिटल सिंड्रोम के साथ - 70 से 80% तक, और विल्सन-कोनोवलोव रोग और डचेन / बेकर मायोपैथी के साथ - 45-60%। इस संबंध में, वंशानुगत रोगों के आणविक आनुवंशिक निदान के अप्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग किया जाता है।

मानक सूक्ष्मदर्शी आणविक स्तर पर कोशिकाओं की जांच करना संभव नहीं बनाते हैं। यहां केवल एक शक्तिशाली वृद्धि पर्याप्त नहीं है। डिजिटल इमेजिंग, अतिरिक्त अभिकर्मकों और अन्य सामग्रियों और उपकरणों की आवश्यकता होती है। डीएनए और आरएनए के विश्लेषण के लिए वर्तमान में एक विधि का उपयोग किया जाता है, जिसे स्वस्थानी संकरण कहा जाता है। क्योंकि इसमें धुंधला नमूने शामिल होते हैं जिसके बाद विकिरण विश्लेषण होता है, इसे प्रतिदीप्ति संकरण या मछली भी कहा जाता है।

स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट का व्यापक रूप से आनुवंशिक अनुसंधान, कैंसर निदान, गर्भावस्था प्रबंधन और विज्ञान के कई अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। विधि, जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, डीएनए और आरएनए अणुओं की संपत्ति पर आधारित है जो जांच के साथ स्थिर बंधन बनाते हैं, यानी हाइब्रिड अणु बनाते हैं। "इन सीटू" शब्द का अर्थ है कि सभी अवलोकन "इन सीटू" किए जाते हैं, यानी सीधे अतिरिक्त माध्यम के उपयोग के बिना।

डीएनए जांच (जांच) परीक्षण नमूने में अणुओं के पूरक हैं। उनमें न्यूक्लियोसाइड शामिल हैं, जिन्हें फ्लोरोफोरस (पदार्थ जो अणु को प्रतिदीप्ति की संपत्ति देते हैं) के साथ लेबल किया जाता है। इस विधि को प्रत्यक्ष लेबलिंग कहा जाता है; यदि हाइब्रिड संयुग्म अणुओं को मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है, तो अप्रत्यक्ष लेबलिंग प्राप्त की जाती है। प्रत्यक्ष लेबलिंग के साथ, इसके पूरा होने के तुरंत बाद एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत संकरण देखा जा सकता है। अप्रत्यक्ष लेबलिंग के लिए, एक और धुंधला प्रक्रिया की जाती है। यह रंग द्वारा संयुग्मित अणुओं को अध्ययन किए गए नमूनों से अलग करता है।

अप्रत्यक्ष लेबलिंग के साथ संकरण विधि में अधिक समय और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, लेकिन यह आपको अधिक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देता है। इस मामले में सिग्नल का स्तर अधिक होगा, और इसके अलावा, इसका चरणबद्ध प्रवर्धन भी संभव है। क्लोन किए गए डीएनए अनुक्रम (पीसीआर उत्पाद, जीनोमिक डीएनए, लेबल किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और अन्य) का उपयोग लेबलिंग जांच के रूप में किया जाता है। जांच लेबलिंग कई तरीकों से की जाती है। लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड के साथ सामान्य तरीके निक ट्रांसलेशन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हैं।

प्रक्रिया का क्रम

स्वस्थानी विधि से शुरू होती है प्रारंभिक चरण- डिजाइनिंग जांच। जांच प्रक्रिया में हस्तक्षेप करने के लिए जांच के आयाम काफी बड़े नहीं होने चाहिए। जांच जो बहुत छोटी हैं वे भी अवांछनीय हैं, क्योंकि वे विश्वसनीय परिणाम की गारंटी नहीं देते हैं। इसलिए शोध के लिए 1 हजार बीपी आकार तक की जांच की जाती है। यदि जांच डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए है, तो एसिड को संकरण से पहले विकृत किया जाता है। जब वांछित परिणाम प्राप्त होता है (गुणसूत्रों के कुछ क्षेत्र या सभी गुणसूत्र दागदार होते हैं), तो दोहराए जाने वाले अनुक्रमों के साथ डीएनए जांच का आगे संकरण अवरुद्ध हो जाता है। ऐसा करने के लिए, बिना लेबल वाले डीएनए दोहराने वाले अणुओं को संकरण मिश्रण में जोड़ा जाता है।

अनुसंधान का अगला चरण इंटरफेज़ नाभिक या मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों की तैयारी की तैयारी है। कोशिकाओं को कांच पर सब्सट्रेट में तय किया जाता है, जिसके बाद डीएनए को विकृत किया जाता है। विकृतीकरण के तापमान को कम करने और नाभिक और गुणसूत्रों के आकारिकी को संरक्षित करने के लिए, फॉर्मैडाइड के अतिरिक्त के साथ विकृतीकरण किया जाता है। उसके बाद, सामग्री में जांच जोड़ दी जाती है और कई घंटों के लिए संकरण किया जाता है। इसके पूरा होने पर, उन जांचों को हटाने के लिए एक बहु-चरण धुलाई की जाती है जो नमूना अणुओं से नहीं जुड़े हैं।

संकरण विधि बगल में* (स्थान पर, अव्यक्त।) डीएनए या आरएनए की क्षमता पर आधारित है जो डीएनए / आरएनए जांच के साथ स्थिर संकर अणु बनाने के लिए सीधे निश्चित गुणसूत्रों और इंटरफेज़ नाभिक की तैयारी पर आधारित है। इस पद्धति का उपयोग करके, आप लगभग किसी भी डीएनए या आरएनए अनुक्रम का सटीक स्थान सीधे सेल, सेल न्यूक्लियस या क्रोमोसोम में निर्धारित कर सकते हैं।

संकरण के लिए। बगल मेंमानक तरीकों के अनुसार तैयार किसी भी ऊतक या अंगों की कोशिकाओं की उपयुक्त साइटोलॉजिकल या हिस्टोलॉजिकल तैयारी। एक नैदानिक ​​साइटोजेनेटिक प्रयोगशाला में, सुसंस्कृत परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स, कोरियोनिक एपिथेलियल साइटोट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं, एम्नियोटिक द्रव की संवर्धित और असिंचित कोशिकाओं, गर्भपात सामग्री से विभिन्न ऊतकों, साथ ही बुक्कल एपिथेलियम और रक्त कोशिकाओं के स्मीयर की तैयारी का उपयोग किया जाता है।

संकरण विधि बगल में गैर-रेडियोधर्मी संशोधित न्यूक्लियोटाइड के साथ लेबल किए गए जांच के उपयोग के आधार पर एक गैर-समस्थानिक संस्करण के विकास के कारण व्यावहारिक साइटोजेनेटिक्स के लिए विशेष महत्व है। तैयारी (विशेष रूप से फ्लोरोसेंट वाले) पर संकरण के गैर-समस्थानिक रूपों में समस्थानिक वाले की तुलना में कई फायदे हैं: उच्च संकल्प, जो एक माइक्रोस्कोप (0.1 - 0.2 माइक्रोन) के संकल्प के बराबर है, परिणामों के सांख्यिकीय प्रसंस्करण की कोई आवश्यकता नहीं है, स्वास्थ्य शोधकर्ताओं के लिए गति और सुरक्षा

इसके अलावा, विभिन्न संशोधित नमूनों के संयोजन का उपयोग करके पता लगाया गया विभिन्न प्रणालियाँडिटेक्शन, आपको एक सेल में या एक मेटाफ़ेज़ प्लेट पर दो या दो से अधिक डीएनए अनुक्रमों के स्थान को एक साथ निर्धारित करने की अनुमति देता है। और डीएनए जांच के रूप में फ्लोरोक्रोमेस के साथ लेबल किए गए दोहराव वाले अनुक्रमों का उपयोग प्रक्रिया के समय को 7-9 घंटे तक कम कर देता है (क्लासिक गैर-आइसोटोप संकरण में दो दिन लगते हैं, आइसोटोप वेरिएंट एक सप्ताह से एक महीने तक), जो प्रसवपूर्व निदान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। प्रयोग मछली विधिसाइटोजेनेटिक डायग्नोस्टिक्स में, यह संरचनात्मक क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था की पहचान करने, मार्कर क्रोमोसोम की प्रकृति को स्थापित करने, क्रोमोसोम सेट के संख्यात्मक उल्लंघन का विश्लेषण करने के लिए, मेटाफ़ेज़ क्रोमोसोम और इंटरफ़ेज़ नाभिक दोनों में अनुमति देता है।

मछली विधि का सिद्धांत

महत्वपूर्ण या मुख्य स्थान पर मछली विधिकृत्रिम रूप से निर्मित डीएनए जांच और परमाणु डीएनए के पूरक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के बीच संकरण प्रतिक्रिया निहित है। डीएनए अणु में दो पेचदार न्यूक्लियोटाइड श्रृंखलाएं होती हैं, और संकरण तभी संभव है जब श्रृंखला अलग हो। डीएनए न्यूक्लियोटाइड श्रृंखलाओं को डिस्कनेक्ट करने के लिए, विकृतीकरण का उपयोग किया जाता है (बाद के संकरण के लिए, अध्ययन के तहत नमूने के नाभिक में डीएनए और डीएनए जांच को ही विकृत किया जाना चाहिए)। विकृतीकरण के बाद, डीएनए जांच इसके पूरक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में संकरणित हो जाती है और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसका पता लगाया जा सकता है।

इस तरह, सामान्य फ़ॉर्मसेटिंग के लिए प्रोटोकॉल मछलीनिम्नलिखित रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है:

1. हिस्टोलॉजिकल या साइटोलॉजिकल तैयारी की तैयारी।
एक हिस्टोलॉजिकल तैयारी की तैयारी मानक योजना के अनुसार की जाती है: कटिंग, मार्किंग, वायरिंग, डालना, माइक्रोटॉमी, कट को एक ग्लास स्लाइड पर रखना और डीपराफिनाइजेशन। एक साइटोलॉजिकल तैयारी तैयार करते समय, विशेष अवक्षेपण समाधान और सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया जाता है, जिससे एक केंद्रित सेल निलंबन प्राप्त करना संभव हो जाता है।

2. पूर्व उपचार (यदि आवश्यक हो)।
संकरण में बाधा डालने वाले प्रोटीन की उपस्थिति को समाप्त करने के लिए तैयारी को प्रोटीज द्वारा संसाधित किया जाता है।

3. तैयारी और बाद में विकृतीकरण के लिए डीएनए जांच लागू करना।
जांच और नमूना डीएनए को अस्वीकार करने के लिए, उन्हें फॉर्मामाइड के साथ इलाज किया जाता है और लगभग 85-90 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गरम किया जाता है।

4. संकरण।
विकृतीकरण के बाद, दवा को एक निश्चित तापमान (नैदानिक ​​​​अध्ययन के मामले में 37 डिग्री सेल्सियस) तक ठंडा किया जाता है और कई घंटों के लिए एक आर्द्र कक्ष में ऊष्मायन किया जाता है (ऊष्मायन की अवधि प्रत्येक विशिष्ट प्रोटोकॉल में इंगित की जाती है)। वर्तमान में, स्वचालित संकरण का उपयोग विकृतीकरण और संकरण के लिए किया जाता है।

5. धुलाई।
एक बार संकरण पूरा हो जाने के बाद, अनबाउंड जांच को धोना चाहिए, जो अन्यथा एक ऐसी पृष्ठभूमि तैयार करेगा जिससे मछली के परिणामों का मूल्यांकन करना मुश्किल हो जाता है। फ्लशिंग के लिए, आमतौर पर साइट्रेट और सोडियम क्लोराइड (एसएससी) युक्त घोल का उपयोग किया जाता है।

6. काउंटर-धुंधला।
फ्लोरोसेंट रंजक (डीएपीआई - 4,6-डायमिडिन-2-फेनिलइंडोल; प्रोपीडियम आयोडाइड) की मदद से, सभी परमाणु डीएनए दागदार होते हैं।

7. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण। नियमित संचालन (डीवैक्सिंग, प्रीट्रीटमेंट, धुलाई) को स्वचालित किया जा सकता है।

* - सामग्री खुले स्रोतों से मिली जानकारी के आधार पर तैयार की गई थी।

निर्धारण की विधि स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट।

अध्ययन के तहत सामग्री विवरण में देखें

होम विजिट उपलब्ध

अध्ययन का उपयोग स्तन कैंसर या गैस्ट्रिक कैंसर के लिए व्यक्तिगत सहायक रसायन चिकित्सा का चयन करने के लिए किया जाता है।

स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं में ऑन्कोलॉजिकल रोगों में पहले स्थान पर है। स्तन कैंसर की कोशिकाओं में हो सकता है अलग - अलग प्रकाररिसेप्टर्स जो कुछ पदार्थों (हार्मोन या अन्य जैविक रूप से सक्रिय अणुओं) के प्रति संवेदनशील होते हैं। ट्यूमर कोशिकाओं में हार्मोन रिसेप्टर्स (एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन) या मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर टाइप 2 (ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2, एचईआर 2) की उपस्थिति के आधार पर, हार्मोन-रिसेप्टर-पॉजिटिव, एचईआर 2-पॉजिटिव और ट्रिपल नेगेटिव स्तन कैंसर को अलग किया जाता है। . चिकित्सा के व्यक्तिगत चयन और उपचार की सफलता की भविष्यवाणी करने के लिए इसे ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है।

HER2 एक रिसेप्टर है जो ऊतकों में मौजूद होता है और सामान्य रूप से कोशिका विभाजन और भेदभाव के नियमन में भाग लेता है। ट्यूमर कोशिकाओं (हाइपरएक्सप्रेशन) की सतह पर इसकी अधिकता ट्यूमर के तेजी से अनियंत्रित विकास, मेटास्टेसिस के उच्च जोखिम और कुछ प्रकार के उपचार की कम प्रभावशीलता को पूर्व निर्धारित करती है। स्तन कैंसर के कुछ उपप्रकारों में HER2 के हाइपरएक्प्रेशन से प्रसार और एंजियोजेनेसिस में वृद्धि होती है, साथ ही एपोप्टोसिस (कोशिकाओं का आनुवंशिक रूप से क्रमादेशित आत्म-विनाश) का अपचयन होता है। वर्तमान में, ऐसी दवाएं हैं जो HER2 रिसेप्टर को लक्षित करती हैं। यह, विशेष रूप से, हर्सेप्टिन (ट्रैस्टुज़ुमैब) है, जो HER2 / neu रिसेप्टर्स के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है।

HER2 (ErbB-2) ऑन्कोजीन का प्रवर्धन और ओवरएक्प्रेशन, स्तन कार्सिनोमा के लिए अपेक्षाकृत विशिष्ट घटनाएँ हैं और व्यावहारिक रूप से अन्य स्थानीयकरण के ट्यूमर में नहीं होती हैं। गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कुछ अपवादों में से एक है: एचईआर 2 सक्रियण इस अंग के घातक नियोप्लाज्म के लगभग 10-15% मामलों में नोट किया जाता है और रोग के आक्रामक पाठ्यक्रम से संबंधित होता है। HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर में, ट्यूमर कोशिकाओं की सतह पर HER2 रिसेप्टर्स की अधिकता मौजूद हो सकती है (जिसे HER2 पॉजिटिव या हर्सेप्ट पॉजिटिव कहा जाता है)। यह घटना स्तन कैंसर से पीड़ित 15-20% महिलाओं में देखी जाती है। उपचार की रणनीति निर्धारित करने के लिए HER2 स्थिति का आकलन महत्वपूर्ण है।

HER2 / neu overexpression और / या HER2 / neu जीन के प्रवर्धन का पता लगाने के लिए मुख्य मानकीकृत तरीके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (IHC) विधि और स्वस्थानी संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति हैं। दोनों अध्ययन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (IHC), फ्लोरोसेंट जांच (FISH) और विभिन्न इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल तैयारी (पैराफिन में एम्बेडेड ट्यूमर सामग्री के अनुभाग) पर किए जाते हैं।

IHC प्रतिक्रिया के परिणामों का मूल्यांकन करते समय, अभिव्यक्ति को केवल ट्यूमर के आक्रामक घटक में ध्यान में रखा जाता है। प्रतिक्रिया परिणामों का मूल्यांकन स्कोरिंग स्केल का उपयोग करके किया जाता है: 0, 1+, 2+, 3+, परीक्षण निर्माता द्वारा विकसित और विशेषज्ञों द्वारा अनुमोदित। 0 और 1+ के रूप में रेट की गई हेरसेप्ट स्थिति को नकारात्मक माना जाना चाहिए - प्रोटीन की कोई अधिकता नहीं है, जो इसके जीन के प्रवर्धन की अनुपस्थिति से संबंधित है। हेरसेप्ट स्थिति, रेटेड 3+, सकारात्मक है, यानी, प्रोटीन ओवरएक्प्रेशन मौजूद है, जो जीन प्रवर्धन की उपस्थिति के अनुरूप है। हेरसेप्ट स्थिति 2+ को अनिश्चित माना जाता है, अर्थात, एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया के आधार पर निर्धारित प्रोटीन अभिव्यक्ति को जीन प्रवर्धन पर आत्मविश्वास से नहीं आंका जा सकता है, इसलिए, एक अध्ययन की आवश्यकता है जो सीधे प्रवर्धन की उपस्थिति या अनुपस्थिति को प्रकट करता है। FISH विधि का उपयोग उसी नमूने (ब्लॉक) के वर्गों पर किया जाता है, जिस पर इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन किया गया था। मछली संकरण में, HER2 जीन प्रवर्धन की उपस्थिति का आकलन लाल फ्लोरोसेंट (लेबल HER2 जीन के अनुरूप) और हरे रंग के फ्लोरोसेंट संकेतों के अनुपात की गणना करके किया जाता है जो 17 वें गुणसूत्र के सेंट्रोमेरिक क्षेत्र को लेबल करते हैं। 2 से अधिक का अनुपात HER2 प्रवर्धन की उपस्थिति को इंगित करता है। मछली विधि IHC विधि की तुलना में अधिक संवेदनशील है, क्योंकि यह आपको प्रवर्धन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का सीधे आकलन करने की अनुमति देती है।

अनुसंधान के लिए सामग्री: ट्यूमर बायोप्सी के साथ पैराफिन ब्लॉक।

ध्यान! आवश्यक रूप से:

• HER2/neu . के प्रतिरक्षी के साथ IHC-धुंधला के साथ ग्लास स्लाइड
• एक डॉक्टर से एक रेफरल या एक हिस्टोलॉजिकल और आईएचसी अध्ययन के परिणामों के साथ एक उद्धरण Her-2 / neu . के एंटीबॉडी के साथ

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