Генотоксичність, тобто шкідливий вплив того чи іншого з'єднання на геном, і канцерогенність - пов'язані явища. Метод ДНК-комет дозволяє оцінити ступінь пошкодження геномної ДНК як в експерименті, наукових цілях, і під час вирішення практичних завдань: оцінці впливу довкілляабо умов праці, контролю трансплантаційного матеріалу при розморожуванні, у тканинній інженерії. Пошкодження ДНК, виявлене тестом ДНК-комет, може свідчити і про схильність до онкології, і про зміни, пов'язані з нею. Збільшення ДНК-комет пошкоджень ДНК, що виявляються, характерно для пухлинних клітин. І, хоча за десятиліття з моменту розробки, метод набув поширення лише в спеціалізованих областях, він може знайти застосування в діагностиці та моніторингу лікування різних захворювань. Перевагами ДНК-комет є чутливість, невисокі вимоги до кількості матеріалу, швидкий у виконанні протокол роботи, відносна простота та невисока вартість.

Метод ДНК-комет застосовується для дослідження різних типівклітин, як у культурі, так і в зразках біологічних рідин та тканин. Головною вимогою для аналізу ДНК-комет є переведення клітин тканини суспензію, тому при розтині лабораторних тварин вилучені фрагменти органів повинні пройти відповідну обробку, а клітини, що містяться в крові або спермі можна досліджувати безпосередньо. 80% злоякісних новоутворень мають епітеліальне походження. Епітелії, що піддаються і зовнішньому впливу, та впливу з боку внутрішнього середовищаорганізми найбільше підходять для оцінки генотоксичності методом ДНК-комет. Неінвазивним способом одержання епітеліальних клітин людини є мазок епітелію ротової порожнини та відбір ексфоліативного матеріалу епітелію сльозового каналу. Клітини епітелію ротової порожнини живуть 10-14 днів, присутність у них ушкодженої ДНК свідчить про недавній вплив генотоксичної сполуки. Дослідження цілісності ДНК епітелію ротової порожнини можуть допомогти при моніторингу впливів речовин, пов'язаних з професійною діяльністюі харчових продуктів.

Клітини, поміщені в агарозу на склі, обробляються лізуючим розчином, і, якщо необхідно, ферментами, специфічними до певних порушень. Поділ проводиться у лужному буфері. ДНК виходить із клітини і рухається анод, утворюючи шлейф, який можна побачити, використовуючи флуоресцентний мікроскоп. Що більше розривів відбувається у ДНК, то більше виражено рух її фрагментів. Після процедури скла нейтралізуються і фарбуються інтеркалуючими барвниками для візуалізації ДНК. Оцінка електрофоретичної рухливості ДНК проводиться за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Коли практично вся ДНК клітини фрагментована, це, як правило, клітина, що загинула. Якщо поодинокі клітини мають такий ступінь ушкодження геному, вони виключаються з аналізу.

Найчастіше використовуваний лужний протокол ДНК-комет (поділ при pH > 13) дозволяє виявити одноланцюгові розриви, зшивки в ДНК і між ДНК та білками. Використання в ході пробопідготовки обробки лугом підвищує сприйнятливість методу, оскільки більшість генотоксичних агентів не вносять дволанцюжкового розриву в ланцюги ДНК, а формують одноланцюгові розриви або ділянки з підвищеною чутливістюдо лугів. Додатково застосовуються ферменти, що вносять розриви в ділянці ДНК зі специфічними ушкодженнями. Формамидопіримідин ДНК-глікозилаза розрізає ланцюга ДНК в області окислених нуклеотидів, формамідпіримідинів (аденіну та гуаніну з відкритим кільцем) та інших похідних гуаніну; OGG1 виявляє окислені пурини та формамидопіримідини, ендонуклеаза III виявляє окислені піримідини, T4 ендонуклеаза V розпізнає димери піримідинів, 3-метиладенін ДНК глікозилазу II (AlkA) специфічна до 3-метиладеніну; а урацил ДНК глікозилаза виявляє помилково вбудований у ДНК урацил. Такі протоколи обробки матеріалу можуть знадобитися для вирішення специфічних завдань, наприклад, у заморожених тканинах зростає вміст окислених піримідинів і сайтів T4 ендонуклеази V, а інших порушень не спостерігається. Метод ДНК-комет з обробкою відповідним ферментом може застосовуватися для оцінки стану трансплантату перед пересадкою.

Одна із сфер клінічної діагностики, в якій застосовується технологія ДНК-комет – діагностика чоловічої безплідності. В силу пристрою сперматозоїда ризик порушень структури ДНК у цих клітинах підвищений, а системи репарації повністю не компенсують порушення, що відбуваються. При чоловічому безплідді спостерігають підвищений ступінь ушкодження сперматозоїдів ДНК. Кількість розривів ДНК у сперматозоїдах в нормі досягає 10 6 - 10 7 на геном, як у людини, так і у лабораторних мишей, що набагато вище кількості розривів геному в лімфоцитах або клітинах червоного кісткового мозку. Запліднення сперматозоїдом, що містить ушкодження ДНК, активує в ооциті процеси репарації, що відновлюють ці ушкодження, але ризик мутацій та вроджених захворювань у дитини при цьому підвищується. Частота невиношування вагітності корелює зі ступенем ушкодження ДНК сперматозоїдів. З цим пов'язана підвищена частота вроджених захворювань та порушень розвитку у дітей при ІКСІ.

Метод ДНК-комет застосовується як оцінки стану ДНК, а й у дослідження процесів репарації у клітинах. При цьому досліджувані клітини руйнуються, а отриманим гомогенатом обробляється ДНК, в яку попередньо вносяться пошкодження певного типу, суміш додаються нуклеотиди і АТФ, необхідні для репарації. За здатністю гомогенату відновлювати ті чи інші ушкодження судять про активність систем репарації у клітинах. Тип ушкодження, який вноситься до ДНК, залежить від того, який механізм репарації досліджується. Наприклад, для оцінки ексцизійної репарації основ застосовують ушкоджену світлом ДНК, що містить 8-оксогуанін, а ексцизійної репарації нуклеотидів - опромінену ультрафіолетовим світлом ДНК, що містить димери піримідинів. Одноланцюгові розриви вносяться обробкою перекисом водню, опроміненням рентгенівськими або гамма променями, алкілування ДНК проводиться шляхом обробки метил-метансульфонатом. Для дослідження ексцизійної репарації нуклеотидів використовують оцінку накопичення розривів ДНК при блокуванні полімераз, що беруть участь у цьому процесі за допомогою афідоколіну, або цитозин арабінозиду у поєднанні з гідроксимочевиною.

Аналіз експресії генів, асоційованих з репарацією, не завжди може бути об'єктивним показником стану ДНК у клітинах, тому метод ДНК-комет дозволяє отримати цінну додаткову інформацію. Підвищена активність систем репарації свідчить як про те, що клітини стійкіші до ушкоджень геному, а й у тому, що вони піддаються впливу генотоксичного агента, у результаті синтез білків, що у репарації, активовано. Внесення до раціону Q10, вітаміну С у капсулах, що повільно розчиняються, підвищує активність ексцизійної репарації основ. Подібний ефект спостерігається, якщо замість препаратів використовувати багаті антиоксидантами фрукти та овочі. При цьому знижується активність системи ексцизійної репарації нуклеотидів, оскільки в ній відпадає потреба.

Тест мікронуклеусів є прямим показником канцерогенності, керівництво ICH рекомендує використовувати його у поєднанні з ДНК-комет. Метод ДНК-комет можна поєднувати з флуоресцентною гібридизацією FISH, щоб визначити, чи зачіпають зміни певні ділянки геному. Для аналізу великої кількості шлейфів ДНК отриманих в результаті процедури ДНК-комет. рекомендується застосовувати автоматизовані рішення. Це дозволить знизити суб'єктивність оцінки і більш точно оцінити розмір і форму шлейфів, що утворилися, що особливо важливо з урахуванням необхідності збору даних за великою кількістю шлейфів у кожному препараті. ДНК-комет може застосовуватися як метод для клінічної діагностики та в дослідних цілях - для оцінки генотоксичності тієї чи іншої сполуки.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Recent advances in vivo genotoxicity testing: prediction of carcinogenic potential using comet and micronucleus assay in animal models / J Cancer Prev. – 2013. V.18, N.4. – P. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epithelial cells як альтернативні людські biomatrices для комет assay / Front Genet. – 2014. V5. N. 386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O"Neill Gaivão I, Collins A. Comet assay to measure DNA repair: approach and applications / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. The source and significance of DNA damage in human spermatozoa; a commentary on diagnostic strategies і straw man fallacies / Mol Hum Reprod. – 2013. – V.19. N.8. – P. 475-85.

Оцінка впливу гамма-променів на ДНК-лімфоциту за допомогою методу ДНК-комет. Мікрофотографії (А) та оброблені зображення (В).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Damage Induced by Ionizing Radiation / Int. J. Mol. SCI. – 2013. – V.14. N.11. – P.22449-22461.

Вплив перекису водню на ДНК сперматозоїдів молюскуChoromytilus chorus

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Genomic Integrity avaluation in sperm of Choromytilus chorus (Molina, 1782) comet assay / Gayana. – 2008. – V.72. N.1. - P.36-44.

Метод гель-електрофорезу окремих клітин або метод ДНК-комет є високочутливим і забезпечує високу надійність одержуваних результатів, водночас відносно простий і швидко виконаємо, а також стандартизований на міжнародному рівні (OECD № 489). Даний метод є найперспективнішим для вирішення наступних завдань:

Біомоніторинг людини та навколишнього середовища, тобто виявлення наслідків індукованого мутагенезу при контакті людини з ксенобіотиками (лікарськими засобами, харчовими добавками, пестицидами, парфумерно-косметичними засобами, побутовою хімією, а також найбільш поширеними забруднювачами води, повітря та виробничі речовини);

Дослідження у галузі онкології;

Дослідження систем репарації ДНК;

Метод заснований на реєстрації різної рухливості у постійному електричному полі пошкодженої ДНК та/або фрагментів ДНК індивідуальних лізованих клітин, укладених у тонкий агарозний гель на стандартному предметному склі. При цьому ДНК клітини мігрує, формуючи електрофоретичний слід, що візуально нагадує "хвіст комети", параметри якого залежать від ступеня пошкодженості ДНК. Після завершення електрофорезу скла фарбують та аналізують, використовуючи флуоресцентну мікроскопію.

Отримання зображення та обробку даних здійснюють за допомогою програмно-апаратного комплексу, що включає високочутливу камеру, поєднану з мікроскопом, і спеціалізоване програмне забезпечення.

Універсальне інтелектуальне програмне забезпечення, що входить до цього комплексу, забезпечує:

Автоматизацію аналізу зображень ДНК-комет "одним натисканням клавіші", включає всі основні параметри вимірювання, в тому числі % ДНК у хвості комети;

- високу відтворюваність;

Аналіз параметрів ДНК-комет проводиться і в режимі «реального часу» та зі збережених цифрових зображень;

Програма здійснює обробку даних та виводить їх у вигляді протоколу відповідно до міжнародних вимог GLP;

Аналіз та порівняння даних;

Програма повністю валідована та відповідає міжнародним вимогам GLP. Має ієрархічний доступ та систему захисту даних.

У комплект входять:

1. Мікроскоп люмінесцентний медико-біологічний Nikon Eclipse Ni-E.

2. Епі-флюоресцентна освітлювальна система потужністю 50W, комплекти фільтр-дихроїчне дзеркало-фільтр для барвників DAPI, FITC, TRITC.

3. Монохромна CCD IEEE1394 FireWire відеокамера для люмінесценції. Basler Scout scA1300-32fm. Розмір піксела – 3.75 µm x 3.75 µm. Роздільна здатність - 1296 px x 966 px. Розмір сенсора 1/3 дюйми. Матриця – Sony. Передача даних через високошвидкісний порт – 1394 BUS. Швидкість відображення кадрів при максимальній роздільній здатності - 32кадра/сек. Забезпечує роботу з об'єктами в режимі реального часу

4. Comet Assay IV - програмний пакет для Windows з генератором електронних таблиць для Microsoft Excel, для роботи з монохромною CCD IEEE1394 FireWire відеокамерою в режимі реального часу (вимірювання та аналіз можливо як на відеопотоку так і на фотографіях), інструкція з експлуатації та компакт диск для інсталяції та валідації програми.

5. Ліцензія терміном один рік для чотирьох користувачів.

6. Дистанційне навчаннячерез мережу Internet чотирьох користувачів.

Додатково пропонується:

1. Оператор даних для використання Comet Assay IV у XML версіях баз даних для пошуку фільтрації та вилучення даних та аудиту через захищену базу даних Oracle із збереженням у форматі MS Excel для роботи в електронних таблицях. Включає можливість перегляду авто-збережених зображень, підписів, архівних даних та даних автоаудиту. Додатково включає можливість експорту в XML формат непідписаних і підписаних цифровим підписом даних. Включає Крипто-Ключ-Провідник для перегляду підписаних цифровими підписами даних у різних форматах.

2. Менеджер доступу до GLP. Access Manager це програма для контролю та управління доступом співробітників до баз даних. Уніфікована для ПІ генетичної токсикології система. Включає комплексний аудит системи. Зовнішній аудит. Адміністрація облікових записів користувачів та діяльності, пов'язаної програмами, доступу, паролів, ревізії і т.д. Використовує Oracle для надійного захисту користувачів та даних аудиту. Повна відповідність вимогам FDA 21 CFR Part 11 – остаточні правила для електронних записів та електронних підписів.

3. Навчання одного користувача на базі Perceptive instruments у Великій Британії

Спосіб полягає в тому, що в комп'ютер з біологічного препарату, встановленого на флуоресцентний мікроскоп з відеокамерою, вводять зображення з кометоподібними об'єктами - «кометами», що являють собою набір злитих і флуоресцентних точок різної яскравості. Потім виконують пошук цих комет на зображенні, виділяють їх контур з визначенням межі голови і хвоста і проводять мікроскопічну морфометрію. Перед пошуком комет на зображенні виконують оптимізацію рівнів яскравості зображення і низькочастотну фільтрацію з метою об'єднання окремих точок комет в розмиті області. Потім виконують сегментацію отриманого зображення на основі порога яскравості, що визначається як зсув від фону, знаходження контурів «комет» методом заповнення обмеженої області «із затравкою», де під затравкою розуміється довільна точка, що належить «кометі», знаходження центру голови кожної «комети», шляхом визначення центру тяжкості точок з інтенсивністю свічення, близькою до максимальної. Визначення віртуального кордону «голови» та «хвоста» проводять шляхом дзеркального відображеннярозподілу інтенсивностей світіння точок передньої частини голови комети, потім проводять мікроскопічну морфометрію «комет» шляхом вимірювання: довжини «комети», «хвоста», діаметра «голови». Потім обчислюють відсотковий вміст ДНК у всій «кометі», «хвості» та міри пошкодження ДНК. Перелічені операції здійснюють автоматично, одночасно над усіма кометами на серії зображень. Технічний результат полягає у підвищенні точності та швидкості обробки та аналізу зображень «комет».

Спосіб обробки та аналізу зображень кометоподібних об'єктів, отриманих методом «ДНК-комет» (comet assay або single cell gel electrophoresis - SCGE), в біологічних препаратах, відноситься до галузі обробки та аналізу зображень об'єктів - «комет», і призначений для комп'ютеризації (автоматизації) ) процесів морфометричних досліджень у галузі біомедицини, що проводяться для визначення ступеня пошкоджень молекул ДНК, викликаних різними агентами навколишнього середовища, для вивчення репарації молекул ДНК на рівні одиночних клітин, для оцінки інтегральної цілісності геному, для визначення індивідуальної радіочутливості онкологічних хворих, що проходять курс променевої терапії, для біоіндикації прибережних морських вод, тобто для моніторингу широкого спектру пошкоджень ДНК, викликаних мутагенними факторами навколишнього середовища.

Зображення «комет» являють собою набір злитих і флуоресцентних точок різної яскравості, отриманих методом гельелектрофорезалізованих одиничних клітин (метод «ДНК-комет»), тому обробляти і аналізувати їх способами, призначеними для зображень звичайних (суцільних) об'єктів, немає можливості.

В даний час зображення «ДНК-комет» аналізують шляхом візуального спостереження під флуоресцентним мікроскопом і диференціації їх за ступенем пошкодженості ДНК, або з використанням комп'ютерних засобів обробки зображень.

При візуальному аналізі (Struwe М, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. photo comet assay - A fast screening assay for determination of photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 6 1-2), p.44-57) «ДНК-комети» ранжують на п'ять умовних типів з відповідним числовим значенням від 0 до 4. Ступінь пошкодженості ДНК при цьому виражається як індекс «ДНК-комет» (І днк), що визначається за формулі

І днк =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

де n 0 -n 4 - число "ДНК-комет" кожного типу - сума підрахованих "ДНК-комет".

Даний спосіб обробки та аналізу дуже трудомісткий, суб'єктивний, має лише п'ять рівнів градації диференціації «ДНК-комет» і тому має невисоку точність, а звідси й низьку достовірність результатів.

Найбільш близьким до пропонованого технічного рішення є спосіб комп'ютерного аналізу зображень «ДНК-комет», реалізований програмне забезпечення SCGE-Pro (див. Chaubery R.С. Computerized Image analysis software for comet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106), прийнятий за прототип. Даний спосіб аналізу "комет" менш трудомісткий і особливо необхідний для об'єктивної оцінки їх параметрів (наприклад, довжини "комети", довжини "хвоста", діаметра "голови", процентного змістуДНК в «голові» або в «хвості» і т.д.), які використовуються як показники, що характеризують рівень пошкоджень ДНК в клітинах, що вивчаються. Спосіб дозволяє знаходити «комети» на зображенні та обчислювати їх параметри як у ручному, так і автоматичному режимі.

Недоліком відомого способу є спосіб визначення меж «комети» за допомогою прямокутної області, який знижує точність обчислення параметрів, необхідних для оцінки пошкоджень (особливо, якщо ушкодження слабо виражені) ДНК, тому що в цьому випадку до комети можуть бути віднесені перешкоди, що знаходяться поруч . Крім того, при даному способі аналізу межа «голови» і «хвоста» визначається як пряма, перпендикулярна до осі «комети» і розділяє комету на «голову» і «хвіст», що сильно знижує точність обчислення довжини «хвоста комети» та відсоткового вмісту ДНК у «голові» та в «хвості».

Технічним результатом винаходу є підвищення точності та швидкості обробки та аналізу зображень «комет», отриманих методом «ДНК-комет», включаючи фільтрацію, сегментацію «комет», виділення їх контуру з визначенням межі «голови» та «хвоста», що дозволяє підвищити достовірність результатів при мікроскопічній морфометрії, необхідної для комп'ютеризації процесів біометричних досліджень, які проводяться при моніторингу широкого спектра пошкоджень ДНК, спричинених різними мутагенними факторами довкілля.

Технічний результат досягається тим, що спосіб обробки та аналізу зображень кометоподібних об'єктів, отриманих методом «ДНК-комет», що полягає в тому, що комп'ютер з біологічного препарату, встановленого на флуоресцентний мікроскоп з відеокамерою, вводять зображення з кометоподібними об'єктами - «кометами», являють собою набір злитих і флуоресціюючих точок різної яскравості, що окремо стоять, виконують пошук цих «комет» на зображенні, виділяють їх контур з визначенням межі «голови» і «хвоста», проводять мікроскопічну морфометрію, при цьому перед пошуком «комет» на зображенні виконують оптимізацію рівнів яскравості зображення та низькочастотну фільтрацію з метою об'єднання окремих точок «комет» у розмиті області, потім виконують сегментацію отриманого зображення на основі порога яскравості, що визначається як зсув від фону, знаходження контурів «комет» методом заповнення обмеженої області «із затравкою», знаходження центру « голови» кожної «комети», шляхом опред еления центру тяжкості точок з інтенсивністю світіння, близької до максимальної, визначення віртуальної межі «голови» і «хвоста», шляхом дзеркального відображення розподілу інтенсивностей світіння точок передньої частини «голови комети», потім проводять мікроскопічну морфометрію «комет», шляхом вимірювання: довжини « комети», «хвоста», діаметра «голови» та обчислення відсоткового вмісту ДНК у всій «кометі», «в хвості», міри пошкодженості ДНК та багато інших параметрів, що характеризують ступінь пошкодженості ДНК в залежності від розв'язуваного завдання, причому перераховані операції здійснюються автоматично , одночасно над усіма кометами на зображенні або серії зображень.

Спосіб здійснюється шляхом виконання послідовності наступних процедур:

1. Введення в комп'ютер з біологічного препарату, встановленого на флуоресцентний мікроскоп з відеокамерою, зображення з кометоподібними об'єктами - «кометами», що являють собою набір злитих і флуоресцентних точок різної яскравості.

2. Оптимізація рівнів яскравості зображення. Нульова яскравість – фон, максимальна яскравість – центр голови «комети».

3. Низькочастотна фільтрація по Гаусу (розмиття) з великим радіусом, що дорівнює 1/10 радіусу середньої «комети», виконується з метою об'єднання окремих точок «комет» у розмиті області. Для запобігання злиттю «комет», розташованих близько один до одного, в інтерактивному режимі використовується коригування радіусу розмиття.

4. Сегментація одержаних розмитих областей виконується на основі порога яскравості. Поріг визначається автоматично як зміщення від фону (у зображенні немає сторонніх включень та інших об'єктів крім комет), але можлива корекція порога в інтерактивному режимі.

5. Знаходження контурів «комет» шляхом заповнення обмеженої області «із затравкою», де під затравкою розуміється довільна точка, що належить «комете».

Знаходження центру «голови комети». Для визначення можуть використовуватися два методи: максимум розподілу інтенсивності світіння точок «комети» вздовж горизонтальної осі або по центру тяжкості точок інтенсивністю світіння, що перевищує 80% від максимуму.

Визначення віртуального кордону «голови» і «хвоста» шляхом дзеркального відображення розподілу інтенсивностей світіння точок передньої частини «голови комети» (передня частина - це частина до передньої межі голови «комети»).

Виконання мікроскопічної морфометрії «комет» шляхом вимірювання: довжини «комети», довжини «хвоста», діаметра «голови» та обчислення відсоткового вмісту ДНК у всій «кометі», «в хвості», міри пошкодженості ДНК та багато інших параметрів, що характеризують ступінь пошкодження ДНК в залежності від розв'язуваного завдання.

9. Виведення значень отриманих параметрів кожної комети виконується в таблицю MS EXCEL для реалізації постановки завдання користувача, наприклад, для подальшого статистичного аналізучи класифікації «комет» за рівнем ушкодження структури ДНК.

Таким чином, у запропонованому способі кожна область комети визначається їх складним контуром, що підвищує точність обчислення параметрів, на відміну від відомого способу, де межі «комет» визначаються за допомогою прямокутної області, яка знижує точність обчислення параметрів, необхідних для оцінки пошкоджень (особливо, якщо ушкодження слабо виражені) «ДНК-комет», тому що в цьому випадку до «комети» можуть бути віднесені перешкоди, що знаходяться поруч. Крім того, у відомому способі межа «голови» і «хвоста» визначається як пряма, перпендикулярна до осі комети і розділяє комету на «голову» і «хвіст». У запропонованому способі застосовується віртуальна межа, що визначається шляхом обчислення центру «голови комети» та дзеркального відображення розподілу інтенсивності свічення точок передньої частини «голови комети». Це суттєво підвищує точність обчислення довжини хвоста комети та відсоткового вмісту ДНК у «голові та в хвості».

Слід зазначити, що всі ці операції виконуються автоматично одночасно над усіма «кометами» на зображенні або серії зображень.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

Спосіб обробки та аналізу зображень кометоподібних об'єктів, отриманих методом «ДНК-комет», полягає в тому, що в комп'ютер з біологічного препарату, встановленого на флуоресцентний мікроскоп з відеокамерою, вводять зображення з кометоподібними об'єктами - «кометами», що являють собою набір злитих та окремостоящих флуоресціюючих точок різної яскравості, виконують пошук цих «комет» на зображенні, виділяють їх контур з визначенням межі «голови» і «хвоста», проводять мікроскопічну морфометрію, що відрізняється тим, що перед пошуком «комет» на зображенні виконують оптимізацію рівнів яскравості зображення та низькочастотну фільтрацію з метою об'єднання окремих точок «комет» в розмиті області, потім виконують сегментацію отриманого зображення на основі порога яскравості, що визначається як зміщення від фону, знаходження контурів «комет» методом заповнення обмеженої області «із затравкою», де під затравкою розуміється довільна точка, що належить «кометі», знаходження центру голови кожної «комети» шляхом визначення центру тяжкості точок з інтенсивністю свічення, близької до максимальної, визначення віртуального кордону «голови» і «хвоста» шляхом дзеркального відображення розподілу інтенсивностей свічення точок передньої частини голови комети, потім проводять мікроскопічну морфометрію «комет» шляхом вимірювання довжини «комети», «хвоста», діаметра «голови» та обчислення відсоткового вмісту ДНК у всій «кометі», у «хвості» та міри пошкодження ДНК, причому перелічені операції здійснюють автоматично, одночасно над усіма «кометами» на серії зображень.

Стаття на конкурс «біо/мол/текст»: Ви знаєте, що вивченням комет займаються як астрономи, а й молекулярні біологи? Їхня робота пов'язана з космосом лише побічно. На комети вони дивляться у мікроскоп. Зоряним небом служить гель-слайд- мікроскопічне предметне скло, вкрите агарозою з клітинами, що досліджуються. Таке стало можливим завдяки відкриттю 1984 року способу аналізу ДНК, названого методом ДНК-комет.

Про популярність у цифрах

Рисунок 2. Приклади пошкоджень ДНК, що виникають внаслідок впливу факторів різної природи

Як бачите, «розбійники» можуть вчинити величезний спектр «злочинів» і завдати істотної шкоди цілісності ДНК. Однак у клітині на варті безпеки ДНК стоять системи репарації, «лікарі», які виправляють пошкодження молекули за допомогою спеціальних «медикаментів» - ферментів, здатних «залатати рани», нанесені генотоксикантами. Ферментів репарації безліч. На сьогоднішній момент відомо, що в ексцизійної репараціїушкоджень ДНК, тобто. в операціях, коли ділянка спочатку вирізується, а потім збирається знову, бере участь 13 ферментів!

Однак не все так гладко, як здається на перший погляд. Операції у «відділенні репарації» який завжди завершуються благополучно, тобто. відновленням вихідної молекули ДНК. Підсумком роботи відновлювальних систем можуть стати нові пошкодження. Причина тому - дуже щільна упаковка ниток ДНК в ядрі.

А що вчені? Вони у ролі «поліцейських», яким необхідно виявити «склад злочину», тобто. знайти «злочинця» та його «спільників» (визначити генотоксиканти, їх дози та концентрації) та встановити тяжкість «злочину» (виявити ступеня пошкоджень ДНК). Саме у таких ситуаціях допомагає метод ДНК-комет.

Родом із Швеції

Спроби, спрямовані на вивчення ядерних структур клітини та кількісне визначення ниткових ушкоджень ДНК у поодиноких клітинах організмів, було здійснено ще у 80-х роках. XX століття такими вченими, як Кук і Бразелл, Рідберг та Йохансон. Однак лише у 1984 р. шведські дослідники Остлінг та Йохансон розвинули новий метод визначення пошкоджень ДНК. Саме вони помітили, що зображення фрагментів ДНК, які мігрували в електричному полі, нагадували астрономічні комети. Подібність була в наявності. «Комети», отримані вченими зі Швеції, мали головні характеристики космічних «побратимів»: вони мали «голову» і «хвіст». Звідси й пішла така романтична назва – метод ДНК-комет.

У методу є ще низка найменувань - гель-електрофорез одиночних (ізольованих) клітин і електрофорез у мікрогелі . Перша назва некоректно відбиває суть аналізу. Електрофорез проводиться не в одиночних клітинах, а в агарозному гелі, де від одного полюса до іншого рухається ДНК, виділена з цих клітин. Друге - правильне, т.к. електрофорез здійснюється у агарозному гелі, нанесеному на слайди. Але цей термін не прижився. Зазначені назви не користуються великою популярністю та використовуються рідко, на відміну від «методу ДНК-комет».

Заклинання для отримання «комет»

Малюнок 3. Будова «комети».

Лабораторні «комети» – об'єкти цікаві. Їх вигляд безпосередньо залежить від факторів впливу, їх сили та умов проведення аналізу. Інформація про «комети» не таємниця, вкрита мороком, тому про їх склад, будову та освіту відомо практично все.

У публікації 1984 р. шведи Остлінг і Йохансон назвали ДНК, яка мігрувала, - "хвіст", а що залишилася в порожнині ДНК - "центр". Зараз практично нічого не змінилося: у «комети» умовно виділяють «голову» і «хвіст» (рис. 3).

Треба чітко уявляти, що «комета» утворюється не з клітин живого організму, а саме з її ДНК. Поміщена в агарозний шар суспензія клітинутворює порожнини, які у процесі лізисузаймає ДНК цих клітин. Усі подальші маніпуляції у методі ДНК-комет здійснюються саме з ДНК.

Комети утворюються в процесі міграції (переміщення) ДНК в електричному полі (коли є струм і напруга). Що ж відбувається під час лізисуі електрофорезу? Більш маленькі біомолекули, що входять до складу клітини, «втікають» у лізуючий розчин у процесі дифузії, на відміну від ДНК, яка через своє надзвичайно великого розміруне може зрушити з місця. Коли ж слайди з ДНК піддають електрофорезу, неушкоджена ДНК формує «голову комети», а пошкоджені частини молекул починають «пробіжки» до позитивно зарядженого джерела струму - анода (т.к. ДНК заряджена негативно), утворюючи «хвіст». Щоб побачити «комети», їх офарблюють флуоресцентними барвниками (бромистий етидій, акридиновий помаранчевий та ін), а потім візуалізують за допомогою флуоресцентного мікроскопа на великому збільшенні (рис. 4).

Остлінг і Йохансон пишуть таке: «Коли клітина вбудовується у гель, вона формує поглиблення у ньому. Після лізису клітини її ДНК займає це поглиблення. Більшість інших біомолекул легко дифундує по агарозному гелю. Таким чином, практично всі вони виходять з поглиблення, залишеного клітиною, в розчин, що лізує. Єдиний виняток становить ДНК, яка за рахунок своєї великої молекулярної масизалишається в гелі». - ред.

Малюнок 4. Послідовність етапів методу ДНК-комет(починаючи зверху за годинниковою стрілкою). * - Етап необхідний лише у лужній версії методу (рН > 13,0), щоб нейтралізувати луг NaOH.

Чим сильніше пошкодження ДНК (а ступінь пошкодження залежить від дози мутагену), тим більше виражений хвіст комети. Як ви вже зрозуміли, довгий хвіст - це не дуже добре.

Універсальний солдат

Метод ДНК-комет – інструмент широкого профілю. З його допомогою вчені «розкривають злочини», пов'язані із замахом на здоров'я людини та безпеку навколишнього середовища (звичайно ж, все це через дослідження пошкодженої ДНК). Метод набув такої популярності завдяки привабливим характеристикам - простоті, швидкості, економічності та досить високій чутливості, яка дозволяє виявляти пошкодження ДНК, викликані навіть факторами низької інтенсивності (наприклад, малими дозами радіації). Серед безлічі способів оцінки пошкоджень ДНК метод ДНК-комет є одним із найбільш підходящих у цій галузі. Крім зазначених вище переваг, він виграє, наприклад, у широко відомих цитогенетичних методів (ана-телофазний, метафазний аналізи, мікроядерний тест), ще й з інших вагомих причин.

Метод ДНК-комет дозволяє працювати з будь-якими клітинами, що містять ДНК, на відміну від мікроядерного тесту, в якому найчастіше залучають клітини крові або кісткового мозку. Якщо ж ана-телофазний та метафазний методи обмежені у переліку визначених хромосомних аберацій, то метод ДНК-комет надає широкий спектр своїх модифікацій, завдяки яким дослідник може виявити різні пошкодження ДНК: поодинокі, подвійні пошкодження, лужно-лабільні сайти, апоптозта інші. Саме такі можливості роблять його «універсальним солдатом» та прокладають методом дороги у різні області наукових досліджень , :

• екологічний моніторинг- оцінка стану навколишнього середовища за ступенем пошкодження ДНК організмів, що мешкають на досліджуваній території (як правило, порівнюють рівні пошкодження ДНК особин із забрудненою та контрольною територіями);
• біологічний моніторинг- Вивчення впливу харчування та інших зовнішніх факторів середовища на організм за ступенем пошкодження ДНК, накопичення пошкоджень та репарації;
• генотоксичні дослідженняфармакологічних препаратів, нових та вже наявних хімічних речовин (побутова хімія, пестициди та ін.);
• клінічні дослідження, Спрямовані на допологову діагностику на стадії внутрішньоутробного розвитку, виявлення схильності до захворювань;
• оцінка ефективностітерапій при онкологічних захворюваннях та її контроль.

Зміни пізнаються у порівнянні

Спостереження станом довкілля, т.зв. екологічний моніторинг, допомагає дослідникам виявляти зміни, що відбуваються в середовищі, і вчасно бити на сполох (особливо в аварійних ситуаціях, наприклад, на Чорнобильській АЕС у 1986 р. або на АЕС «Фукусіма Дайчі» у 2011 р.). При забрудненнях середовища метод ДНК-комет у поєднанні з організмами-індикаторами доводиться дуже доречним. Списки організмів, характерних для різних середовищпроживання і найбільш чутливих до змін стану середовища, досить великі і включають види, починаючи з бактерій Escherichia coliта водоростей роду Chlamydomonasі закінчуючи вищими рослинами ( Lemna minor, Pinus sylvestris), ссавцями ( Microtus oeconomus) і, звичайно ж, людиною (рис. 5). У методі ДНК-комет залучають, зазвичай, не організми цілком, які «складові частини» - клітини, особливо чутливі до змін чинників довкілля, чи тканини, у тому числі ці клітини можна одержати. У тварин зазвичай беруть клітини крові: еритроцитиі лімфоцити, гемоцити(аналоги еритроцитів у безхребетних), цілоцити(клітини, що виконують імунну функцію у дощових черв'яків); у рослин - клітини меристеми, тканини, що інтенсивно ділиться.

Примітка:В аналізі пошкоджень ДНК можна використовувати і цілих особин, якщо вони представлені однією клітиною, як, наприклад, Chlorella vulgaris.

Рисунок 5. Приклади організмів-індикаторів, що використовуються для оцінки стану довкілля за допомогою методу ДНК-комет.

сайти scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com , hdimagelib.com

Як метод ДНК-комет працює у цьому випадку? Вчені порівнюють ступеня ушкодження ДНК організмів-індикаторів, що мешкають на досліджуваній (забрудненій) і контрольній (незабрудненій) територіях: що піддаються впливу забрудненого ґрунту, води та ін, і таких, але живуть у звичайних контрольних умовах, тобто. коли відсутня вплив досліджуваного чинника чи він незначно. Оцінку ступеня пошкодження ДНК проводять і в лабораторіях, в строго контрольованих умовах, коли є вибірка організмів, піддана впливу досліджуваного фактора або групи факторів (радіації, металів, пестицидів), і обов'язково контрольна група (що не відчуває цього впливу).

Приклад: 11 березня 2011 р. внаслідок найсильнішого в Японії землетрусу і цунамі, що послідувало за ним, сталася серйозна радіаційна аварія на АЕС «Фукусіма Даїчі». У 2014 році японські вчені провели дослідження. Вони обрали дві ділянки, які постраждали внаслідок аварії: з високим рівнем радіації (2,85 мкЗв/год) та з низьким (0,28 мкЗв/год) як контроль. У дощових хробаків сімейства Megascolecidaeз цих ділянок проаналізували рівень пошкодження ДНК. Виявилося, що цей показник достовірно вищий у особин, підданих впливу високого рівня радіації, ніж у особин ділянці з низьким рівнем впливу .

Сценарії можуть бути різними. Ступінь пошкодження ДНК у клітинах може підвищуватися, знижуватися або залишатися незмінною. Підвищений ступінь ушкодження ДНК в організмів із забрудненої території може свідчити про внутрішні зміни у функціонуванні клітин, що призводять до численних «поломок» ДНК.

Приклади:Деякі метали, надходячи в організм, індукують активні форми кисню (АФК), що викликають ушкодження ДНК; іонізуюче випромінювання сприяє утворенню вільних радикалів, які також є «кривдниками» ДНК. Дія ультрафіолетових променів може призводити до утворення димерів у ДНК, що порушують зв'язок двох її ланцюжків і таким чином змінюють конформацію молекули.

Зниження ступеня ушкодження ДНК або відсутність відмінностей наштовхує на думку, що організми впоралися з «гнітою» генотоксикантіві пристосувалися до життя в цих несприятливі умови. Таке пристосування зветься адаптації. Але це зовсім інша історія.

Спадковість – страшна сила

Чули про такі захворювання, як синдром хромосомних поломок (синдром неймегенівського ушкодження), пігментна ксеродерма та трихотіодистрофія? Вони проявляються лише тоді, коли обидва батьки – носії дефектного гена (рис. 6).

У літературі є дані можливості застосування методу ДНК-комет в діагностиці цих спадкових захворювань, що особливо важливо на пренатальної стадії, тобто. при вагітності.

Синдром неймегенського ушкодження (Nijmegen breakage syndrome, NBS) – захворювання, пов'язане з постійними порушеннями цілісності ДНК. Проблема полягає в тому, що в гені NBS1відбувається мутація, яка "вимикає" нібрин- Білок, що контролює відновлення парних розривів ДНК, що індукуються радіацією. Саме тому люди, які страждають на цей синдром, є надзвичайно радіочутливими. Божена Новотна з празького Інституту експериментальної медицини у своєму дослідженні стверджує, що метод ДНК-комет чудово допомагає виявити гетерозиготних носіїв гена. NBS1аномально високого рівняушкоджень ниток ДНК у «кометах» лімфоцитів.

Не менш небезпечними є пігментна ксеродермаі трихотіодистрофія. Це серйозні захворювання людини, що передаються у спадок. У першому випадку при нетривалому знаходженні на сонці у дітей на відкритих ділянках шкіри (кистях рук, шиї, обличчі) спочатку з'являються червоні плями, які згодом переходять у виражену пігментацію до утворення пухлин. Друге захворювання виявляється у ламкості волосся та нігтів, затримці у розумовому розвитку та аномаліях у будові черепа.

Ці захворювання поєднує порушення у роботі ексцизійної репарації нуклеотидів. За успішністю ексцизійної репарації нуклеотидів у клітинах плода за допомогою методу ДНК-комет можна виявити, чи дитина страждатиме цими захворюваннями. У літературі описані випадки такої діагностики.

Перед дослідниками стояло завдання: до народження з'ясувати, чи діти хворітимуть на пігментну ксеродерму і трихотіодистрофію. Експерименти проводились у сім'ях, у яких батьки є носіями генів пігментної ксеродерми ( сім'я Х) та трихотіодистрофії ( сім'я Y) і вже мають дітей із цими захворюваннями .

Сім'я Х: вагітність 15 тижнів, мати - носій гена пігментної ксеродерми, є дитина 3-х років із цим захворюванням.

Сім'я Y: вагітність 10 тижнів, батько та мати - носії гена трихотіодистрофії, двоє дітей з трихотіодистрофією померли у віці 22 місяці та 6 років, ще один – внаслідок спонтанного аборту (викидня).

Усі клітини протягом 45 хвилин піддавали дії ультрафіолетового випромінювання.

Дослідження сім'ї Х: Рівень пошкоджень ДНК у клітинах плода, визначений за допомогою методу ДНК-комет, був близьким до рівня пошкоджень ДНК у фібробластах матері-носійки, тобто відповідав рівню ниткових пошкоджень за умов нормальної роботи ексцизійної репарації ДНК. Висновок – плід здоровий. Цей висновок підтвердився після народження нормальної дитини.

Дослідження сім'ї Y:у клітинах плода порівняно з фібробластами батька та матері виявлено дефект у роботі ексцизійної репарації, який був підтверджений й іншим методом, не заснованим на вивченні репарації. Виявлено, що плід хворий. Після розмови із сім'єю було вирішено робити аборт.

Промисловість – ворог здоров'я людини

Здоров'я людей, які працюють на промислових об'єктах або проживають в екологічно несприятливих районах, щодня наражається на ризик. Небезпека полягає не тільки в щоденному тісному контакті організму з генотоксикантами (іонізуючим випромінюванням, важкими металами та іншими хімікатами), а й у ймовірності аварійних ситуацій (приклади див. вище), наслідки яких можуть бути катастрофічними для організмів. Зміни стану організму можуть бути різними, починаючи з легких нездужань на кшталт головного болю і закінчуючи раковими захворюваннями.

Метод ДНК-комет можна застосовувати як перспективний інструмент первинної оцінкистану геному людей, які працюють або проживають в екологічно несприятливих умовах Це означає, що ДНК-комети можна використовувати у перелічених сферах досліджень, а й застосовувати у майбутньому інших областях, розширювати варіанти застосування методу у клінічних дослідженнях, медицині та багато іншого.

Приклади:У Польщі внаслідок аварії на заводі з виготовлення батарейок працівники зазнали сильного впливу свинцю та кадмію, що призвело до незначного, але достовірного підвищення рівня ушкоджень ДНК у порівнянні з групою людей, які не зазнали такого стресу. Генотоксична дія газозварювальних аерозолів, що містять важкі метали – марганець, хром, нікель, кадмій, кобальт, свинець, молібден, залізо, – на ДНК лейкоцитів виявлено для людей, чия робота протягом тривалого часу пов'язана зі зварюванням.

Є й деякі труднощі

Щоб правильно використовувати метод ДНК-комет, потрібно «знати в обличчя» не лише його можливості та переваги перед іншими методами, а й, звичайно ж, недоліки, обмеження та труднощі, з якими треба бути напоготові. Метод вимагає оптимізаціїлізису, електрофорезу та інших умов залежно від типу клітин, які використовує вчений, та цілей дослідження.

Пояснення:клітини рослин і тварин потребують різних умов вивільнення ДНК, тобто. лізису. Із-за наявності целюлозної клітинної стінки на лізис рослинних клітин витрачається більше часу, ніж у тварин.

З першої проблеми випливає друге незручність: адаптація методу до завдань аналізу можливо дуже трудомістким процесом(хоча сама методика проста і зрозуміла), якщо з об'єктом вашого дослідження ніхто не працював за методом ДНК-комет. Буває, «налаштування» методики у такому разі потребує дуже багато часу.

Іноді виникають складності в інтерпретаціїрезультатів, отриманих за ступенем ушкодження ДНК, оскільки ступінь ушкодження який завжди вдається співвіднести з дозою чинника впливу.

Пояснення:Така проблема може бути пов'язана з недостатньою оптимізацією методу, коли до одного типу ушкоджень домішуються інші і тим самим спотворюють результати. Вносити «смуту» в реальний ступінь пошкодження ДНК можуть і системи репарації, які виправляють якусь частину порушень, що виникають.

Однією з найголовніших труднощів можна назвати зіставлення результатів, отриманих за допомогою методу ДНК-комет різними вченими в різних лабораторіях та науково-дослідних інститутах Для оцінки пошкодження ДНК використовують методики з модифікаціями та абсолютно різні показники (наприклад, відсоток ДНК у «хвості комети» або довжину «хвоста»).

Пояснення:Довжина «хвоста комети» – відстань, на яку мігрувала ДНК від «голови» хвоста. Відсоток ДНК у «хвості комети» - це кількість ДНК, що мігрувала у «хвіст», виражену у відсотках. З повним спискомпоказників оцінки пошкодження ДНК можна ознайомитись на сайті www.cometassayindia.org.

Активно робляться спроби стандартизувати застосування методу ДНК-комет, що допоможе порівнювати отримані вченими результати. Наприклад, у генотоксичних дослідженнях розроблено протоколи та методичні рекомендації.

Пояснення:У методичних рекомендаціях Федерального центру гігієни та епідеміології Росспоживнагляду чітко визначено тест-об'єкти (клітини людини) та детально описано всі етапи аналізу. Згідно з цими рекомендаціями, за допомогою методу ДНК-комет перевіряти на генотоксичність можна товари побутової хімії та вироби з полімерних матеріалів.

Висновок

"Хто озброєний, той захищений" - такий девіз роботи з методом ДНК-комет. Знання переваг та труднощів застосування даного способуоцінки пошкодження ДНК дозволяє майстерно маніпулювати ходом роботи, уникати «підводного каміння» та отримувати коректні результати.

Метод ДНК-комет відіграє роль «палички-виручалочки» в оцінці загального стану організму, як правило, на ранніх етапахвпливу несприятливих факторівсередовища. на початковому етапісаме пошкодження ДНК є найшвидшим і тому єдино доступною для вимірювання відповіддю організму на несприятливий вплив ще задовго до появи змін на фізіологічному рівні.

Тепер ви знаєте, як біологи отримують «комети» в лабораторіях і навіщо вони так потрібні.

Література

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Comet assay: A sensitive method for detecting DNA damage in individual cells . Methods. 48 , 46–53;
2. Інге-Вечтом С.Г. Генетика з основами селекції: підручник для студентів вищих навчальних закладів(3-тє видання, перероб. і доп.). СПб.: Н-Л, 2015. – 720 с.;
3. Piperakis S.M. (2009). Comet assay: a brief history . Cell Biol. Toxicol. 25 , 1–3;
4. Ярмоненко С.П. Радіобіологія людини та тварин. М: Вища. шк., 2004. – 549 с.;
5. Cook P.R. і Brazell I.A. (1976). Characterization of nuclear structures містить superhelical DNA . J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. and Johanson K.J. Estimation of single strand breaks in single mammalian cells . In: DNA repair mechanisms / ed. by Hanawalt P.C., Friedberg E.C., Fox C.F. NY: Academic, 1978. P. 465-468;
7. Ostling O. and Johanson K.J. (1984). Microelectroforetic study of radiation-induced DNA damages в окремих mammalian cells . Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. та Ferard J.F. (1999). Comet assay in genetic ecotoxicology: a review . Environ. Mol. Mutagen. 34 , 246–255;
9. Tice RR, Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ. Mol. Mutagen. 35 , 206–221;
10. Філіппов Е.В. (2014). Використання методу «ДНК-комет» для детекції та оцінки ступеня пошкоджень ДНК клітин організмів рослин, тварин та людини, спричинених факторами довкілля (огляд). Наука та освіта. 2 , 72–78;
11. Collins A.R. (2004). Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations . Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Екологічна радіоактивність полегшує DNA earthworms of Fukushima Prefecture, Japan . Eur. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Does uranium exposure induce genotoxicity in the teleostean Danio rerio? First experimental results . Radioprotection. 40 , 175–181;
14. Каган М.Ю., Шулакова Н.С., Тумірова Р.А., Злодєєва Є.А., Резнік Н.В. (2012). Синдром Німеген (клінічне спостереження). Педіатрична фармакологія. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Кометує assay як repair test for prenatal diagnosis of Xeroderma pigmentosum and trichothiodystrophy. J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoxic effects of occupational exposure to lead and cadmium. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Томілін Н.В., Петров А.М., Філько О.А., Храброва А.В., Соловйова Н.Є., Іванова Т.М. та ін. (2015). Оцінка ступеня пошкодження ядерної ДНК у клітинах периферичної крові людей, які професійно пов'язані з дією важких металів. Організація охорони здоров'я. 16 , 383–392;
18. Оцінка генотоксичних властивостей методом ДНК-комет in vitro: Методичні рекомендації . М.: Федеральний центргігієни та епідеміології Росспоживнагляду, 2010.- 16 с.