Genotoksiškumas, tai yra, žalingas konkretaus junginio poveikis genomui, ir kancerogeniškumas yra susiję reiškiniai. DNR kometos metodas leidžia įvertinti genominės DNR pažeidimo laipsnį tiek eksperimento metu, tiek jo metu moksliniais tikslais, o sprendžiant praktines problemas: įvertinant poveikį aplinką arba darbo sąlygos, transplantacinės medžiagos kontrolė atšildymo metu, audinių inžinerijoje. DNR kometos testu nustatytas DNR pažeidimas gali rodyti ir polinkį sirgti onkologinėmis ligomis, ir su ja susijusius pokyčius. DNR kometų aptiktas DNR pažeidimo padidėjimas būdingas navikinėms ląstelėms. Ir nors per dešimtmečius nuo jo sukūrimo metodas paplito tik specializuotose srityse, jis gali rasti pritaikymą įvairių ligų diagnostikoje ir gydymo stebėsenoje. DNR kometų privalumai – jautrumas, maži reikalavimai medžiagos kiekiui, greitas darbo protokolas, santykinis paprastumas ir maža kaina.

Tyrimui naudojamas DNR kometos metodas įvairių tipų ląstelėse tiek kultūroje, tiek biologinių skysčių bei audinių mėginiuose. Pagrindinis reikalavimas atliekant DNR kometų analizę yra audinių ląstelių perkėlimas į suspensiją, todėl skrodžiant laboratorinius gyvūnus, pašalinti organų fragmentai turi būti atitinkamai apdoroti, o kraujyje ar spermoje esančios ląstelės gali būti tiriamos tiesiogiai. 80% piktybinių navikų yra epitelio kilmės. Epitelis veikiamas tiek išorinio, tiek išorinio poveikio vidinė aplinka organizmai tinkamiausi genotoksiškumui įvertinti DNR kometos metodu. Neinvazinis žmogaus epitelio ląstelių gavimo būdas – burnos ertmės epitelio tepinėlis ir eksfoliacinės medžiagos parinkimas iš ašarų kanalo epitelio. Burnos epitelio ląstelės gyvena 10-14 dienų, o pažeistos DNR buvimas jose rodo, kad neseniai buvo paveiktas genotoksinis junginys. Burnos epitelio DNR vientisumo tyrimai gali padėti stebėti medžiagų, susijusių su profesinę veiklą ir maisto produktai.

Ląstelės, patalpintos į agarozę ant stiklo, apdorojamos lizuojančiu tirpalu ir, jei reikia, tam tikriems sutrikimams būdingais fermentais. Atskyrimas atliekamas šarminiame buferyje. DNR išeina iš ląstelės ir nukeliauja į anodą, sudarydama plunksną, kurį galima pamatyti naudojant fluorescencinį mikroskopą. Kuo daugiau lūžių atsiranda DNR, tuo ryškesnis jos fragmentų judėjimas. Po procedūros stikleliai neutralizuojami ir nudažomi interkaluojančiais dažais DNR vizualizavimui. DNR elektroforezinis mobilumas vertinamas naudojant fluorescencinį mikroskopą. Kai beveik visa ląstelės DNR yra suskaidyta, dažniausiai tai yra negyva ląstelė. Jei atskiros ląstelės turi tokį genomo pažeidimo laipsnį, jos neįtraukiamos į analizę.

Dažniausiai naudojamas šarminės DNR kometos protokolas (atskyrimas esant pH > 13) leidžia aptikti vienos grandinės lūžius, kryžminius ryšius DNR ir tarp DNR bei baltymų. Šarminio apdorojimo naudojimas ruošiant mėginį padidina metodo jautrumą, nes dauguma genotoksinių medžiagų nesukelia dvigubos grandinės pertraukos DNR grandinėje, bet sudaro vienos grandinės pertraukas arba sritis su padidėjęs jautrumas prie šarmų. Be to, naudojami fermentai, kurie įveda pertraukas DNR regionuose su specifiniais pažeidimais. Formamidopirimidino DNR glikozilazė pertraukia DNR grandines oksiduotų nukleotidų, formamido pirimidinų (adenino ir guanino su atviru žiedu) ir kitų guanino darinių srityje; OGG1 aptinka oksiduotus purinus ir formamidopirimidinus, endonukleazė III aptinka oksiduotus pirimidinus, T4 endonukleazė V atpažįsta pirimidino dimerus, 3-metiladenino DNR glikozilazė II (AlkA) yra specifinė 3-metiladeninui; o uracilo DNR glikozilazė aptinka klaidingai į DNR įterptą uracilą. Tokių medžiagų apdorojimo protokolų gali prireikti sprendžiant specifines problemas, pavyzdžiui, sušalusiuose audiniuose padidėja oksiduotų pirimidinų ir endonukleazės V T4 vietų kiekis, o kitų sutrikimų nepastebima. Transplantato būklei prieš transplantaciją įvertinti galima naudoti DNR kometos metodą su atitinkamu fermentiniu apdorojimu.

Viena iš klinikinės diagnostikos sričių, kurioje naudojama DNR kometų technologija, yra vyrų nevaisingumo diagnostika. Dėl spermatozoidų sandaros padidėja šių ląstelių DNR struktūros pažeidimo rizika, o taisymo sistemos nevisiškai kompensuoja atsiradusius pažeidimus. Vyrų nevaisingumo atveju pastebimas padidėjęs spermatozoidų DNR pažeidimo laipsnis. Tiek žmonių, tiek laboratorinių pelių DNR lūžių skaičius spermatozoiduose paprastai siekia ~10 6 - 10 7 genome, o tai yra daug didesnis nei genomo lūžių skaičius limfocituose arba raudonųjų kaulų čiulpų ląstelėse. Tręšimas spermatozoidu, turinčiu DNR pažeidimo, suaktyvina kiaušialąstės atstatymo procesus, kurie atkuria šiuos pažeidimus, tačiau padidėja vaiko mutacijų ir įgimtų ligų rizika. Persileidimo dažnis koreliuoja su spermos DNR pažeidimo laipsniu. Tai siejama su padidėjusiu ICSI sergančių vaikų įgimtų ligų ir raidos sutrikimų dažniu.

DNR kometos metodas naudojamas ne tik DNR būklei įvertinti, bet ir ląstelių atstatymo procesams tirti. Šiuo atveju tiriamos ląstelės sunaikinamos, o gautą homogenatą apdoroja DNR, į kurią prieš tai įvedamas tam tikro tipo pažeidimas, į mišinį pridedami taisymui būtini nukleotidai ir ATP. Sprendžiant apie ląstelių taisymo sistemų aktyvumą, naudojamas homogenato gebėjimas atkurti tam tikrą žalą. Į DNR įvestos žalos tipas priklauso nuo to, kuris taisymo mechanizmas yra tiriamas. Pavyzdžiui, šviesos pažeista DNR, kurioje yra 8-oksoguanino, naudojama bazinio ekscizijos taisymui įvertinti, o UV spinduliuote apšvitinta DNR, kurioje yra pirimidino dimerų, naudojama nukleotidų ekscizijos taisymui. Vienos grandinės pertraukos įvedamos apdorojant vandenilio peroksidu, rentgeno arba gama spinduliais, DNR alkilinama apdorojant metilmetansulfonatu. Nukleotidų ekscizijos taisymui tirti naudojamas DNR lūžių kaupimosi įvertinimas, kai blokuojamos šiame procese dalyvaujančios polimerazės naudojant afidokoliną arba arabinozido citoziną kartu su hidroksikarbamidu.

Su remontu susijusių genų ekspresijos analizė ne visada gali būti objektyvus DNR būklės ląstelėse rodiklis, todėl DNR kometos metodas leidžia gauti vertingą Papildoma informacija. Padidėjęs remonto sistemų aktyvumas rodo ne tik tai, kad ląstelės yra atsparesnės genomo pažeidimams, bet ir tai, kad jos yra veikiamos genotoksinio agento, ko pasekoje suaktyvėja atstatyme dalyvaujančių baltymų sintezė. Maisto papildai su Q10, vitaminu C lėtai tirpstančiose kapsulėse padidina bazinio ekscizijos atstatymo aktyvumą. Panašus poveikis pastebimas, jei vietoj vaistų vartojami vaisiai ir daržovės, kuriuose gausu antioksidantų. Tai sumažina nukleotidų ekscizijos taisymo sistemos aktyvumą, nes tai nebėra būtina.

Mikrobranduolių testas yra tiesioginis kancerogeniškumo rodiklis, ICH rekomendacijos rekomenduoja jį naudoti kartu su kometos DNR. DNR kometos metodas gali būti derinamas su fluorescencinė hibridizacija FISH, kad nustatytų, ar pokyčiai turi įtakos tam tikriems genomo regionams. Daugelio DNR plunksnų, gautų atliekant DNR kometos procedūrą, analizei. rekomenduojami automatizuoti sprendimai. Tai sumažins vertinimo subjektyvumą ir tiksliau įvertins susidariusių plunksnų dydį ir formą, o tai ypač svarbu, atsižvelgiant į būtinybę rinkti duomenis apie didelį kiekvieno preparato plunksnų skaičių. Kometos DNR gali būti naudojama kaip klinikinės diagnostikos metodas ir tyrimų tikslais – konkretaus junginio genotoksiškumui įvertinti.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Naujausi genotoksiškumo tyrimų in vivo pažanga: kancerogeninio potencialo numatymas naudojant kometų ir mikrobranduolių tyrimą gyvūnų modeliuose / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - P. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epithelial cells as alternative human biomatrices for Comet assay / Front Genet. - 2014. V5. Nr.386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O "Neill Gaivão I, Collins A. Kometos tyrimas DNR taisymui matuoti: požiūris ir taikymas / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Žmogaus spermatozoidų DNR pažeidimo šaltinis ir reikšmė; komentaras apie diagnostikos strategijas ir šiaudų klaidas / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. N.8. - P. 475-85.

Gama spindulių poveikio limfocitų DNR įvertinimas DNR kometos metodu. Mikrofotografijos (A) ir apdoroti vaizdai (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Kometos tyrimo įvertinimas DNR dozės ir atsako santykiui įvertinti Jonizuojančiosios spinduliuotės sukelta žala / Tarpt. J. Mol. sci. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.

Vandenilio peroksido poveikis vėžiagyvių spermos DNRChoromytilus choras

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Genominio vientisumo įvertinimas Choromytilus chorus spermoje (Molina, 1782), naudojant kometų tyrimą / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - P.36-44.

Vienos ląstelės gelio elektroforezės metodas arba DNR kometos metodas yra labai jautrus ir užtikrina aukštą gautų rezultatų patikimumą, tuo pačiu yra gana paprastas ir greitas, be to, yra standartizuotas tarptautiniu mastu (OECD Nr. 489). Šis metodas yra perspektyviausias sprendžiant šias problemas:

Žmonių ir aplinkos biomonitoringas, tai yra sukeltos mutagenezės pasekmių nustatymas žmogui kontaktuojant su ksenobiotikais (vaistais, maisto priedais, pesticidais, kvepalais ir kosmetika, buitine chemija, taip pat dažniausiai vandens, oro ir pramoninėmis medžiagomis). pavojai, nanomedžiagos);

Tyrimai onkologijos srityje;

DNR taisymo sistemų tyrimai;

Metodas pagrįstas skirtingo judrumo registravimu pastoviame pažeistos DNR ir (arba) atskirų lizuotų ląstelių DNR fragmentų elektriniame lauke, uždengtų ploname agarozės gelyje ant standartinio stiklelio. Tuo pačiu metu ląstelės DNR migruoja, suformuodama elektroforezinį pėdsaką, vizualiai primenantį „kometos uodegą“, kurio parametrai priklauso nuo DNR pažeidimo laipsnio. Baigus elektroforezę, stikleliai nudažomi ir analizuojami naudojant fluorescencinę mikroskopiją.

Vaizdo gavimas ir duomenų apdorojimas atliekamas naudojant techninės-programinės įrangos kompleksą, kurį sudaro itin jautri kamera kartu su mikroskopu ir specializuota programinė įranga.

Į šį kompleksą įtraukta universali intelektuali programinė įranga suteikia:

Automatinė DNR kometų vaizdo analizė „vienu klavišo paspaudimu“ apima visus pagrindinius matavimo parametrus, įskaitant % DNR kometos uodegoje;

- didelis atkuriamumas;

DNR kometų parametrų analizė atliekama tiek „realaus laiko“ režimu, tiek iš saugomų skaitmeninių vaizdų;

Programa apdoroja duomenis ir atvaizduoja juos protokolo forma pagal tarptautinius GLP reikalavimus;

Duomenų analizė ir palyginimas;

Programa yra visiškai patvirtinta ir atitinka tarptautinius GLP reikalavimus. Turi hierarchinę prieigą ir duomenų apsaugos sistemą.

Į komplektą įeina:

1. Liuminescencinis biomedicininis mikroskopas Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50W epi-fluorescencinio apšvietimo sistema, filtras-dichroic veidrodis-filtras rinkiniai DAPI, FITC, TRITC dažams.

3. Vienspalvė CCD IEEE1394 FireWire kamera liuminescencijai. Basler Scout scA1300-32fm. Pikselio dydis – 3,75 µm x 3,75 µm. Rezoliucija – 1296 px x 966 px. Jutiklio dydis 1/3 colio. Matrica – Sony. Duomenų perdavimas per didelės spartos prievadą - 1394 BUS. Kadrų dažnis esant maksimaliai raiškai – 32 kadrai/sek. Suteikia darbą su objektais realiu laiku

4. Comet Assay IV - programinės įrangos paketas, skirtas Windows su Microsoft Excel skirtu skaičiuoklių generatoriumi, darbui su monochromine CCD IEEE1394 FireWire vaizdo kamera realiuoju laiku (matavimai ir analizė galimi tiek vaizdo sraute, tiek nuotraukose), instrukcija vadovas ir kompaktinis diskas programai įdiegti ir patvirtinti.

5. Vienerių metų licencija keturiems vartotojams.

6. Nuotolinio mokymosi per keturių vartotojų interneto tinklą.

Papildomai siūloma:

1. Duomenų operatorius naudos Comet Assay IV duomenų bazių XML versijose duomenų paieškai, filtravimui ir ištraukimui bei auditui per saugią Oracle duomenų bazę, išsaugotą MS Excel skaičiuoklės formatu. Apima galimybę peržiūrėti automatiškai išsaugotus vaizdus, ​​parašus, archyvuotus duomenis ir automatinio audito duomenis. Be to, yra galimybė eksportuoti nepasirašytus ir skaitmeniniu būdu pasirašytus duomenis į XML formatą. Apima tik Crypto-Key-Prove, kad galėtumėte peržiūrėti skaitmeniniu būdu pasirašytus įvairių formatų duomenis.

2. Vadovo prieiga prie GLP sistemos. Access Manager yra programa, skirta kontroliuoti ir valdyti darbuotojų prieigą prie duomenų bazių. Sistema suvienodinta PI genetinei toksikologijai. Apima išsamų sistemos auditą. Išorinis auditas. Vartotojų paskyrų administravimas ir vartotojo veikla, susijusi su programomis, prieiga, slaptažodžiais, taisymais ir kt. Naudoja „Oracle“, kad saugiai apsaugotų vartotojus ir audito duomenis. Visiškai atitinka FDA 21 CFR 11 dalies galutines elektroninių įrašų ir elektroninių parašų taisykles.

3. Vieno vartotojo mokymas, pagrįstas Perceptive instrumentais JK

Metodas susideda iš to, kad vaizdas su į kometą panašiais objektais - "kometomis", kurios yra sujungtų ir atskirų skirtingo ryškumo fluorescencinių taškų rinkinys, įvedamas į kompiuterį iš biologinio preparato, sumontuoto ant fluorescencinio mikroskopo su vaizdo kamera. Tada vaizde ieškoma šių „kometų“, išskiriamas jų kontūras nustačius „galvos“ ir „uodegos“ ribas, atliekama mikroskopinė morfometrija. Prieš ieškant „kometų“ vaizde, optimizuojami vaizdo ryškumo lygiai ir atliekamas žemųjų dažnių filtravimas, siekiant sujungti atskirus „kometų“ taškus į neryškias sritis. Tada gauto vaizdo segmentavimas atliekamas pagal šviesumo slenkstį, apibrėžtą kaip poslinkį nuo fono, surandant „kometų“ kontūrus, užpildant ribotą sritį „sėkla“, kur sėkla yra savavališkas taškas, priklausantis „kometą“, surandant kiekvienos „kometos“ galvos centrą, nustatant taškų, kurių švytėjimo intensyvumas artimas maksimumui, svorio centrą. Virtualios „galvos“ ir „uodegos“ ribos apibrėžimą atlieka veidrodinis atspindys kometos galvos priekinės dalies taškų švytėjimo intensyvumo pasiskirstymas, tada atliekama mikroskopinė „kometų“ morfometrija išmatuojant: „kometos“, „uodegos“ ilgį, kometos skersmenį. vadovas". Tada apskaičiuojamas DNR procentas visoje „kometoje“, „uodegoje“ ir DNR pažeidimo matai. Šios operacijos atliekamos automatiškai, vienu metu visoms „kometoms“ vaizdų serijoje. Techninis rezultatas – padidinti „kometų“ vaizdų apdorojimo ir analizės tikslumą bei greitį.

Į kometą panašių objektų vaizdų, gautų „DNR-kometų“ metodu (kometos tyrimas arba vienos ląstelės gelio elektroforezė – SCGE), apdorojimo ir analizės metodas biologiniuose preparatuose yra susijęs su objektų vaizdų apdorojimo ir analizės sritimi. „kometos“ ir yra skirtas biomedicinos srities morfometrinių tyrimų kompiuterizavimo (automatizavimo) procesams, atliekamiems, siekiant nustatyti įvairių aplinkos veiksnių sukeltos DNR molekulių pažeidimo laipsnį, tirti DNR molekulių atstatymą. pavienėms ląstelėms, genomo vientisumui įvertinti, vėžiu sergančių pacientų, kuriems taikoma spindulinė terapija, individualiam radiojautrumui nustatyti, pakrančių jūrų vandenų bioindikacijai, kitaip tariant, įvairiems mutageninių aplinkos veiksnių sukeliamiems DNR pažeidimams stebėti.

„Kometų“ atvaizdai – tai susiliejusių ir atskirų skirtingo ryškumo fluorescencinių taškų rinkinys, gautas lizuotų pavienių ląstelių gelio elektroforezės būdu („DNR-kometų“ metodas), todėl jų apdoroti ir analizuoti taikant metodus, skirtus įprastų (kietųjų) objektų vaizdai.

Šiuo metu „DNR kometų“ vaizdai analizuojami arba vizualiai stebint fluorescenciniu mikroskopu ir diferencijuojant juos pagal DNR pažeidimo laipsnį, arba naudojant kompiuterines vaizdo apdorojimo priemones.

Atliekant vizualinę analizę (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo Comet assay – A fast screening assay for the determination of photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 () 1-2), p.44-57) „DNR kometos“ suskirstytos į penkis sąlyginius tipus, kurių atitinkama skaitinė reikšmė nuo 0 iki 4. DNR pažeidimo laipsnis išreiškiamas indeksu „DNR kometos“ (I dna), nustatoma pagal formulę

Ir DNR =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

kur n 0 -n 4 yra kiekvieno tipo "DNR kometų" skaičius, yra suskaičiuotų "DNR kometų" suma.

Šis apdorojimo ir analizės metodas yra labai daug laiko reikalaujantis, subjektyvus, turi tik penkis „DNR kometų“ diferenciacijos gradacijos lygius, todėl turi mažą tikslumą, taigi ir žemą rezultatų patikimumą.

Arčiausiai siūlomo techninio sprendimo yra kompiuterinės vaizdų analizės metodas „DNR kometos“, įgyvendintas m programinė įranga SCGE-Pro (žr. Chaubery R.C. Kompiuterizuota vaizdo analizės programinė įranga, skirta kometų tyrimui. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106), paimta kaip prototipas. Šis „kometų“ analizės metodas yra mažiau sudėtingas ir ypač reikalingas objektyviai įvertinti jų parametrus (pavyzdžiui, „kometos“ ilgį, „uodegos“ ilgį, „galvos“ skersmenį), procentais DNR „galvoje“ arba „uodegoje“ ir kt.), kurie naudojami kaip rodikliai, apibūdinantys DNR pažeidimo lygį tiriamose ląstelėse. Metodas leidžia vaizde rasti „kometas“ ir apskaičiuoti jų parametrus tiek rankiniu, tiek automatiniu būdu.

Žinomo metodo trūkumas yra „kometos“ ribų nustatymo metodas naudojant stačiakampį plotą, kuris sumažina parametrų, būtinų įvertinti DNR pažeidimą (ypač jei pažeidimas lengvas), skaičiavimo tikslumą, nes Netoliese esantys trukdžiai taip pat gali būti priskirti kometai. Be to, naudojant šį analizės metodą, „galvos“ ir „uodegos“ riba apibrėžiama kaip tiesi linija, statmena „kometos“ ašiai ir padalijanti kometą į „galvą“ ir „uodegą“, o tai labai sumažina „kometos uodegos“ ilgio ir DNR procentinės dalies „galvoje“ ir „uodegoje“ skaičiavimo tikslumą.

Techninis išradimo rezultatas – padidinti „kometų“ vaizdų, gautų „DNR-kometų“ metodu, apdorojimo ir analizės tikslumą ir greitį, įskaitant filtravimą, „kometų“ segmentavimą, paryškinant jų kontūrą su apibrėžimu. „galvos“ ir „uodegos“ riba, leidžianti padidinti mikroskopinės morfometrijos rezultatų patikimumą, reikalingą biometrinių tyrimų procesų, atliekamų stebint įvairius DNR pažeidimus, kuriuos sukelia įvairūs mutageniniai aplinkos veiksniai, kompiuterizavimui.

Techninis rezultatas pasiekiamas naudojant „DNR-kometų“ metodu gautų į kometą panašių objektų vaizdų apdorojimo ir analizės metodą, kuris susideda iš to, kad įvedamas vaizdas su į kometą panašiais objektais – „kometomis“. į kompiuterį iš biologinio preparato, sumontuoto fluorescenciniame mikroskope su vaizdo kamera, vaizduojančiu sujungtų ir atskirų skirtingo ryškumo fluorescencinių taškų rinkinį, jie ieško vaizde šių „kometų“, pasirenka jų kontūrą su ribos apibrėžimu. „galvos“ ir „uodegos“, atlieka mikroskopinę morfometriją, o prieš ieškant „kometų“ vaizde, lygių optimizavimas atliekamas vaizdo ryškumas ir žemųjų dažnių filtravimas, siekiant sujungti atskirus „kometų“ taškus į neryškias sritis. , tada atliekamas gauto vaizdo segmentavimas pagal ryškumo slenkstį, apibrėžiamą kaip poslinkį nuo fono, surandant „kometų“ kontūrus, užpildant ribotą plotą „sėkla“, surandant kiekvieno iš jų centrinę „galvą“ kometa“, apibrėžiant taškų, kurių švytėjimo intensyvumas artimas maksimumui, svorio centro padalijimas, virtualios „galvos“ ir „uodegos“ ribos nustatymas, atspindint priekinės „skilties“ dalies taškų švytėjimo intensyvumo pasiskirstymą. kometos galva“, tada atliekama „kometų“ mikroskopinė morfometrija, išmatuojant: kometą, „uodegą“, „galvos“ skersmenį ir apskaičiuojant DNR procentinę dalį visoje „kometoje“, „uodegoje“. “, DNR pažeidimo matavimai ir daugelis kitų parametrų, apibūdinančių DNR pažeidimo laipsnį, priklausomai nuo sprendžiamos problemos, o išvardytos operacijos atliekamos automatiškai, vienu metu visose vaizdo ar vaizdų serijos „kometose“.

Metodas atliekamas atliekant šias procedūras:

1. Į kompiuterį iš biologinio pavyzdžio, sumontuoto ant fluorescencinio mikroskopo su vaizdo kamera, vaizdai su į kometą panašiais objektais – „kometomis“, kurios yra susijungusių ir atskirų skirtingo ryškumo fluorescencinių taškų rinkinys.

2. Vaizdo ryškumo lygių optimizavimas. Nulinis ryškumas yra fonas, maksimalus ryškumas yra „kometos“ galvos centras.

3. Gauso žemųjų dažnių filtravimas (suliejimas), kurio didelis spindulys lygus 1/10 vidutinio "kometos" spindulio, atliekamas siekiant sujungti atskirus "kometų" taškus į neryškias sritis. Siekiant išvengti arti viena kitos esančių „kometų“ susijungimo, interaktyviai naudojamas suliejimo spindulio reguliavimas.

4. Pagal šviesumo slenkstį atliekamas susidariusių neryškių sričių segmentavimas. Slenkstis nustatomas automatiškai kaip poslinkis nuo fono (vaizde nėra pašalinių inkliuzų ir kitų objektų, išskyrus „kometas“), tačiau slenkstį galima koreguoti interaktyviai.

5. „Kometų“ kontūrų radimas užpildant ribotą plotą „sėkla“, kur sėkla yra savavališkas taškas, priklausantis „kometai“.

Kometos galvos centro radimas. Nustatant galima naudoti du metodus: pagal maksimalų „kometos“ taškų švytėjimo intensyvumo pasiskirstymą išilgai horizontalios ašies arba pagal svorio centrą tų taškų, kurių švytėjimo intensyvumas viršija 80 % maksimumo.

Virtualios „galvos“ ir „uodegos“ ribos nustatymas, atspindint „kometos galvos“ priekinės dalies taškų švytėjimo intensyvumo pasiskirstymą (priekinė dalis yra dalis iki priekinės kometos ribos). „kometos galva“).

Mikroskopinės „kometų“ morfometrijos atlikimas išmatuojant: „kometos“ ilgį, „uodegos“ ilgį, „galvos“ skersmenį ir apskaičiuojant DNR procentinę dalį visoje „kometoje“, „uodegoje“. “, DNR pažeidimo matai ir daugelis kitų parametrų, apibūdinančių DNR pažeidimo laipsnį, priklausomai nuo sprendžiamos užduoties.

9. Kiekvienos kometos gautų parametrų reikšmių išvedimas atliekamas MS EXCEL lentelėje, kad būtų galima įgyvendinti vartotojo užduoties teiginį, pvz. Statistinė analizė arba „kometų“ klasifikacija pagal DNR struktūros pažeidimo laipsnį.

Taigi siūlomu metodu kiekviena kometos sritis nustatoma pagal jų sudėtingą kontūrą, o tai padidina parametrų skaičiavimo tikslumą, priešingai nei žinomas metodas, kai "kometų" ribos nustatomos naudojant stačiakampį plotą, o tai sumažina žalos įvertinimui reikalingų parametrų (ypač jei žala silpnai išreikšta) skaičiavimo tikslumą „DNR kometos“, nes tokiu atveju „kometai“ galima priskirti ir šalia esančius trukdžius. Be to, pagal žinomą metodą „galvos“ ir „uodegos“ riba apibrėžiama kaip tiesi linija, statmena kometos ašiai ir skirianti kometą į „galvą“ ir „uodegą“. Siūlomas metodas naudoja virtualią sieną, kuri nustatoma apskaičiuojant „kometos galvos“ centrą ir atspindint „kometos galvos“ priekinės dalies taškų švytėjimo intensyvumo pasiskirstymą. Tai žymiai pagerina kometos uodegos ilgio ir DNR procentinės dalies galvoje ir uodegoje skaičiavimo tikslumą.

Pažymėtina, kad visos išvardintos operacijos automatiškai vienu metu atliekamos visoms vaizdo ar vaizdų serijos „kometoms“.

REIKALAVIMAS

Metodas, skirtas apdoroti ir analizuoti į kometą panašių objektų, gautų taikant „DNR-kometų“ metodą, vaizdų, kurį sudaro vaizdas su į kometą panašiais objektais – „kometomis“, kurios yra sujungtų ir atskirų skirtingų skirtingų fluorescencinių taškų rinkinys. ryškumą, ieškoti vaizde šių „kometų“, paryškinti jų kontūrą „galvos“ ir „uodegos“ ribos apibrėžimu, atlikti mikroskopinę morfometriją, pasižyminčią tuo, kad prieš ieškant „kometų“ vaizde, vaizdo ryškumas. lygiai optimizuojami ir žemo dažnio filtravimas, kad atskiri "kometų" taškai būtų sujungti į neryškias sritis, tada atliekamas gauto vaizdo segmentavimas pagal šviesumo slenkstį, apibrėžtą kaip nuokrypį nuo fono, surandant "kometų" kontūrus riboto ploto užpildymas "sėkla", kur sėkla yra savavališkas taškas, priklausantis "kometai", radimas kiekvienos „kometos“ galvos centras, nustatant taškų, kurių švytėjimo intensyvumas artimas didžiausiam, svorio centrą, virtualią „galvos“ ir „uodegos“ ribą atspindint švytėjimo intensyvumo pasiskirstymą. kometos galvos priekinės dalies taškais, tada atliekama mikroskopinė „kometų“ morfometrija, matuojant „kometos“, „uodegos“ ilgį, „galvos“ skersmenį ir procentinį dydį. DNR visoje „kometoje“, „uodegoje“ ir DNR pažeidimo matuose, o aukščiau nurodytos operacijos atliekamos automatiškai, vienu metu visoms „kometoms“ vaizdų serijoje.

Straipsnis konkursui "bio/mol/text": Ar žinote, kad kometas tiria ne tik astronomai, bet ir molekuliniai biologai? Jų kūryba su erdve susijusi tik netiesiogiai. Jie į kometas žiūri pro mikroskopą. Tarnauja kaip žvaigždėtas dangus gelio skaidrė- mikroskopinis stiklinis stiklelis, padengtas agaroze su tiriamomis ląstelėmis. Tai tapo įmanoma 1984 m. atradus DNR analizės metodą, vadinamą DNR kometų metodu.

Apie populiarumą skaičiais

2 pav. DNR pažeidimo, atsirandančio dėl skirtingo pobūdžio veiksnių veikimo, pavyzdžiai

Kaip matote, „plėšikai“ gali įvykdyti daugybę „nusikaltimų“ ir padaryti didelę žalą DNR vientisumui. Tačiau ląstelėje DNR saugumą saugo taisymo sistemos, „gydytojai“, kurie molekulės pažeidimus koreguoja pasitelkdami specialius „vaistus“ – fermentus, galinčius „užlopyti genotoksinių medžiagų padarytas žaizdas“. Yra daug remonto fermentų. Šiuo metu žinoma, kad ekscizinis remontas DNR pažeidimas, t.y. operacijose, kai vieta pirmą kartą išpjaunama, o po to vėl surenkama, dalyvauja 13 fermentų!

Tačiau ne viskas taip sklandu, kaip atrodo iš pirmo žvilgsnio. Operacijos „remonto skyriuje“ ne visada baigiasi sėkmingai, t.y. pradinės DNR molekulės atkūrimas. Atkūrimo sistemų darbo rezultatas gali būti nauja žala. To priežastis – labai tankus DNR gijų susikaupimas branduolyje.

Bet kaip su mokslininkais? Jie veikia kaip „mentai“, kuriems reikia nustatyti „nusikaltimo sudedamąsias dalis“, t.y. surasti „nusikaltėlį“ ir jo „bendrininkus“ (nustatyti genotoksines medžiagas, jų dozes ir koncentracijas) ir nustatyti „nusikaltimo“ sunkumą (nustatyti DNR pažeidimo laipsnį). Būtent tokiose situacijose padeda DNR kometos metodas.

Kilęs iš Švedijos

Bandymai ištirti ląstelės branduolines struktūras ir kiekybiškai nustatyti DNR grandinės pažeidimus atskirose organizmų ląstelėse buvo atlikti dar devintajame dešimtmetyje. XX amžiuje tokių mokslininkų kaip Cook ir Brazell, Rydberg ir Johanson. Tačiau tik 1984 m. švedų mokslininkai Ostlingas ir Johansonas sukūrė naują DNR pažeidimo nustatymo metodą. Būtent jie pastebėjo, kad elektriniame lauke migruojančių DNR fragmentų vaizdai primena astronomines kometas. Buvo panašumas. Mokslininkų iš Švedijos gautos „kometos“ turėjo pagrindines kosminių „brolių“ savybes: turėjo „galvą“ ir „uodegą“. Iš čia kilo toks romantiškas pavadinimas – DNR kometos metodas.

Metodas turi daugybę kitų pavadinimų - pavienių (izoliuotų) ląstelių gelio elektroforezė ir elektroforezė mikrogele . Vardas neteisingai atspindi analizės esmę. Elektroforezė atliekama ne atskirose ląstelėse, o agarozės gelyje, kur iš tų pačių ląstelių išskirta DNR juda iš vieno poliaus į kitą. Antrasis yra teisingas, nes elektroforezė atliekama agarozės gelyje, užtepamame ant stiklelių. Tačiau šis terminas neprigijo. Šie pavadinimai nėra labai populiarūs ir retai naudojami, priešingai nei „DNR kometos metodas“.

Rašyba, kad gautumėte "kometas"

3 pav. „Kometos“ struktūra.

Laboratorinės „kometos“ – įdomūs objektai. Jų išvaizda tiesiogiai priklauso nuo įtakos veiksnių, jų stiprumo ir analizės sąlygų. Informacija apie „kometas“ – ne paslaptis, apgaubta tamsos, todėl apie jų sudėtį, sandarą ir susidarymą žinoma beveik viskas.

1984 m. publikacijoje švedai Ostlingas ir Johansonas migravusią DNR pavadino „uodega“, o ertmėje likusią DNR – „centru“. Dabar praktiškai niekas nepasikeitė: „kometą“ sutartinai skiria „galva“ ir „uodega“ (3 pav.).

Reikia aiškiai suprasti, kad „kometa“ susidaro ne iš gyvo organizmo ląstelės, o iš jos DNR. įterptas į agarozės sluoksnį ląstelių suspensija formuoja ertmes, kurios proceso metu lizės užima šių ląstelių DNR. Visos tolesnės manipuliacijos DNR kometos metodu atliekamos naudojant DNR.

„Kometos“ susidaro DNR migracijos (judėjimo) elektriniame lauke (kai yra srovė ir įtampa) procese. Kas vyksta per lizės ir elektroforezė? Mažesnės biomolekulės, sudarančios ląstelę, difuzijos metu „pabėga“ į lizės tirpalą, priešingai nei DNR, kuri dėl savo itin didelis dydis negali judėti. Kai skaidres su DNR atliekama elektroforezė, nepažeista DNR suformuoja „kometos galvą“, o pažeistos molekulių dalys pradeda „bėgti“ link teigiamai įkrauto srovės šaltinio – anodo (nes DNR yra neigiamai įkrauta), suformuodama „uodegą“. “. Norint pamatyti susidariusias „kometas“, jos nudažomos fluorescenciniais dažais (etidžio bromidu, akridino oranžine spalva ir kt.), o vėliau vizualizuojamos naudojant fluorescencinį mikroskopą dideliu padidinimu (4 pav.).

Ostlingas ir Johansonas rašo taip: „Kai ląstelė įterpiama į gelį, joje susidaro įdubimas. Po ląstelių lizės jos DNR užima šią depresiją. Dauguma kitų biomolekulių lengvai difunduoja per agarozės gelį. Taigi beveik visi jie iš ląstelės paliktos ertmės patenka į lizavimo tirpalą. Vienintelė išimtis yra DNR, kuri dėl savo didelės molekulinė masė lieka gelyje. - Red.

4 pav. DNR kometos metodo žingsnių seka(pradedant pagal laikrodžio rodyklę nuo viršaus). * - Šis veiksmas reikalingas tik šarminėje metodo versijoje (pH > 13,0), siekiant neutralizuoti šarmą NaOH.

Kuo stipresnis DNR pažeidimas (o pažeidimo laipsnis priklauso nuo mutageno dozės), tuo ryškesnė „kometos uodega“. Kaip jau supratote, ilga "uodega" nėra labai gerai.

Universalus kareivis

DNR kometos metodas yra plataus diapazono įrankis. Su jo pagalba mokslininkai „sprendžia nusikaltimus“, susijusius su pasikėsinimu į žmonių sveikatą ir aplinkos saugą (žinoma, visa tai tiriant pažeistą DNR). Tokį populiarumą metodas pelnė dėl savo patrauklių savybių – paprastumo, greičio, ekonomiškumo, pakankamai didelio jautrumo, leidžiančio aptikti net ir mažo intensyvumo faktorių (pavyzdžiui, mažos spinduliuotės dozės) sukeltus DNR pažeidimus. Tarp daugelio DNR pažeidimo įvertinimo metodų DNR kometos metodas yra vienas tinkamiausių šioje srityje. Be minėtų privalumų, jis lenkia, pavyzdžiui, gerai žinomus citogenetiniai metodai (ana-telofazinis, metafazių analizės, mikrobranduolių testas) ir dėl kitų svarbių priežasčių.

DNR kometos metodas leidžia dirbti su bet kokiomis DNR turinčiomis ląstelėmis, priešingai nei atliekant mikrobranduolių testą, kuris dažniausiai apima kraujo arba kaulų čiulpų ląsteles. Jei ana-telofazės ir metafazės metodai yra riboti nustatytų sąraše chromosomų aberacijos, tada DNR kometos metodas suteikia platų jo modifikacijų spektrą, kurių dėka tyrėjas gali aptikti įvairius DNR pažeidimus: vienkartinius, dvigubus pažeidimus, šarmines-labilias vietas, apoptozė ir kiti. Būtent šios galimybės daro jį „universaliu kariu“ ir atveria kelią šiam metodui įvairiose srityse. moksliniai tyrimai , :

• aplinkos monitoringas- aplinkos būklės įvertinimas pagal tiriamoje teritorijoje gyvenančių organizmų DNR pažeidimo laipsnį (paprastai lyginami individų iš užterštos ir kontrolinės teritorijos DNR pažeidimo lygiai);
• biologinis monitoringas- mitybos ir kitų išorinių aplinkos veiksnių įtakos organizmui tyrimas pagal DNR pažeidimo laipsnį, pažeidimų kaupimąsi ir atstatymą;
• genotoksiniai tyrimai farmakologiniai preparatai, naujos ir esamos cheminės medžiagos (buitinė chemija, pesticidai ir kt.);
• klinikiniai tyrimai skirtas prenatalinei diagnostikai intrauterinio vystymosi stadijoje, nustatant polinkį į ligas;
• efektyvumo ženklas vėžio terapija ir jos kontrolė.

Pokyčių išmokstama lyginant

Aplinkos būklės stebėjimas, vadinamasis. aplinkos monitoringas, padeda mokslininkams atpažinti aplinkos pokyčius ir laiku įspėti (ypač avarinėse situacijose, pavyzdžiui, Černobylio atominėje elektrinėje 1986 m. arba Fukušimos Daiičio atominėje elektrinėje 2011 m.). Kai aplinka užteršta, praverčia DNR-kometos metodas kartu su indikatoriniais organizmais. Būdingų organizmų sąrašai skirtingos aplinkos buveinės ir jautriausios aplinkos būklės pokyčiams, yra gana plačios ir apima įvairias rūšis nuo bakterijų Escherichia coli ir genties dumbliai Chlamidomonas ir baigiant aukštesniais augalais ( Lemna minor, Pinus sylvestris), žinduoliai ( Microtus oeconomus) ir, žinoma, žmogus (5 pav.). Taikant DNR kometų metodą, paprastai dalyvauja ne ištisi organizmai, o jų „komponentinės dalys“ – ląstelės, kurios ypač jautrios aplinkos veiksnių pokyčiams, arba audiniai, iš kurių galima gauti šias ląsteles. Kraujo ląstelės paprastai paimamos iš gyvūnų: eritrocitai ir limfocitai, hemocitai(eritrocitų analogai bestuburiuose), celomocitai(ląstelės, kurios atlieka sliekų imuninę funkciją); augaluose – meristemos ląstelės, intensyviai besidalijančios audinys.

Pastaba: Analizuojant DNR pažeidimą, taip pat gali būti naudojami sveiki individai, jei juos vaizduoja viena ląstelė, kaip, pavyzdžiui, Chlorella vulgaris.

5 pav. Indikatorių organizmų, naudojamų aplinkos būklei įvertinti naudojant DNR kometų metodą, pavyzdžiai.

svetainės scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com,functionecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Kaip šiuo atveju veikia DNR kometos metodas? Mokslininkai lygina tiriamose (užterštose) ir kontrolinėse (neužterštose) teritorijose gyvenančių indikatorinių organizmų DNR pažeidimo laipsnį: veikiami užteršto dirvožemio, vandens ir pan., ir tokie patys, bet gyvenantys normaliomis kontrolės sąlygomis, t.y. kai tiriamo veiksnio įtakos nėra arba ji yra nereikšminga. DNR pažeidimo laipsnio įvertinimas taip pat atliekamas laboratorijose, griežtai kontroliuojamomis sąlygomis, kai yra tiriamo faktoriaus ar veiksnių grupės (radiacijos, metalų, pesticidų) veikiamų organizmų mėginys ir būtinai kontrolinė grupė ( šio poveikio nepatiria).

Pavyzdys: 2011 m. kovo 11 d., po stipriausio žemės drebėjimo Japonijoje ir po jo kilusio cunamio, Fukušimos Daiichi atominėje elektrinėje įvyko rimta radiacinė avarija. 2014 metais Japonijos mokslininkai atliko tyrimą. Jie pasirinko dvi avarijos paveiktas vietas – vieną su aukštu radiacijos lygiu (2,85 µSv/h), o kitą – su žemu (0,28 µSv/h). Šeimos sliekuose Megascolecidae iš šių vietų buvo analizuojamas DNR pažeidimo laipsnis. Paaiškėjo, kad šis rodiklis yra žymiai didesnis asmenims, kuriuos veikia didelis spinduliuotės lygis, nei asmenims, esantiems mažo poveikio zonoje.

Scenarijai gali skirtis. DNR pažeidimo laipsnis ląstelėse gali padidėti, sumažėti arba likti nepakitęs. Padidėjęs DNR pažeidimo laipsnis organizmuose iš užterštos zonos gali rodyti vidinius ląstelių funkcionavimo pokyčius, dėl kurių atsiranda daugybė DNR „skilimų“.

Pavyzdžiai: Kai kurie metalai, patekę į organizmą, sukelia reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS), sukeldami DNR pažeidimus; jonizuojanti spinduliuotė prisideda prie laisvųjų radikalų susidarymo, kurie taip pat yra DNR „pažeidėjai“. Dėl ultravioletinių spindulių gali susidaryti dimerai DNR, nutraukdamas dviejų jo grandinių ryšį ir taip pakeisdamas molekulės konformaciją.

Sumažėjęs DNR pažeidimas arba jokio skirtumo rodo, kad organizmai susidorojo su „priespauda“ genotoksinių medžiagų ir prisitaikė prie gyvenimo šiose nepalankiomis sąlygomis. Ši adaptacija vadinama adaptacija. Bet tai visiškai kita istorija.

Paveldimumas yra baisi jėga

Ar girdėjote apie tokias ligas kaip chromosomų lūžio sindromas (Nijmegeno pažeidimo sindromas), pigmentinė kseroderma ir trichotiodistrofija? Jie atsiranda tik tada, kai abu tėvai yra defektuoto geno nešiotojai (6 pav.).

Literatūroje yra duomenų apie galimybę diagnozuojant šias paveldimas ligas panaudoti DNR kometos metodą, o tai ypač svarbu prenatalinėje stadijoje, t.y. nėštumo metu.

Nijmegen traumos sindromas (Nijmegen lūžio sindromas, NBS) yra liga, susijusi su nuolatiniais DNR vientisumo pažeidimais. Problema ta, kad genas NBS1 atsiranda mutacija, kuri "išsijungia" nibrinas- baltymas, kontroliuojantis spinduliuotės sukeltų porinių DNR pertrūkių taisymą. Štai kodėl žmonės, kenčiantys nuo šio sindromo, yra itin jautrūs radiacijai. Bozena Novotna iš Prahos Eksperimentinės medicinos instituto savo tyrime teigia, kad DNR kometos metodas puikiai tinka identifikuoti heterozigotinius geno nešiklius. NBS1 anomaliai aukštas lygis DNR grandžių pažeidimas limfocitų „kometose“.

Ne mažiau pavojingi pigmentinė kseroderma ir trichotiodistrofija. Tai sunkios žmonių ligos, kurios yra paveldimos. Pirmuoju atveju, kai vaikai trumpai būna saulėje ant atvirų odos vietų (rankų, kaklo, veido), pirmiausia atsiranda raudonos dėmės, kurios vėliau virsta ryškia pigmentacija iki auglių susidarymo. Antroji liga pasireiškia lūžinėjančiais plaukais ir nagais, protiniu atsilikimu ir kaukolės struktūros anomalijomis.

Šias ligas vienija pažeidimas nukleotidų ekscizijos taisymo darbe. Remiantis vaisiaus ląstelių nukleotidų ekscizijos taisymo sėkme DNR kometos metodu, galima nustatyti, ar vaikas nesirgs šiomis ligomis. Tokios diagnozės atvejai aprašyti literatūroje.

Tyrėjai susidūrė su užduotimi prieš gimimą išsiaiškinti, ar vaikai nesusirgs pigmentine kseroderma ir trichotiodistrofija. Eksperimentai buvo atlikti šeimose, kuriose tėvai yra pigmentinės xeroderma genų nešiotojai. X šeima) ir trichotiodistrofija ( Y šeima) ir jau turi šiomis ligomis sergančių vaikų.

Šeima X: nėštumas 15 savaičių, mama yra xeroderma pigmentosa geno nešiotoja, yra 3 metų vaikas, sergantis šia liga.

Šeima Y: nėštumas 10 savaičių, tėvas ir mama - trichotiodistrofijos geno nešiotojai, du vaikai, sergantys trichotiodistrofija, mirė sulaukę 22 mėnesių ir 6 metų, dar vienas - dėl savaiminio aborto (persileidimo).

Visos ląstelės buvo veikiamos ultravioletine spinduliuote 45 minutes.

X šeimos studija: DNR pažeidimo lygis vaisiaus ląstelėse, nustatytas DNR kometos metodu, buvo artimas DNR pažeidimo lygiui nešiotojos motinos fibroblastuose, t.y. atitiko grandinės pažeidimo lygį normaliomis DNR ekscizijos taisymo sąlygomis. Išvada – vaisius sveikas. Ši išvada pasitvirtino gimus normaliam vaikui.

Šeimos Y tyrimas: vaisiaus ląstelėse, lyginant su tėvo ir motinos fibroblastais, buvo nustatytas ekscizinio remonto darbo defektas, kurį patvirtino ir kitas metodas, neparemtas atstatymo tyrimu. Atskleidžiama, kad vaisius serga. Po pokalbio su šeima buvo nuspręsta pasidaryti abortą.

Pramonė yra žmonių sveikatos priešas

Žmonių, dirbančių pramonės objektuose ar gyvenančių aplinkai nepalankiose vietovėse, sveikatai kyla pavojus kiekvieną dieną. Pavojus slypi ne tik kasdieniame artimame organizmo kontakte su genotoksinėmis medžiagomis (jonizuojančia spinduliuote, sunkiaisiais metalais ir kitomis cheminėmis medžiagomis), bet ir avarinių situacijų tikimybe (žr. aukščiau pateiktus pavyzdžius), kurių pasekmės organizmams gali būti katastrofiškos. Kūno būklės pokyčiai gali būti labai įvairūs – nuo ​​lengvų negalavimų, tokių kaip galvos skausmas, iki vėžio.

DNR kometos metodas gali būti naudojamas kaip perspektyvi priemonė pradinis įvertinimasžmonių, dirbančių ar gyvenančių nepalankiomis aplinkai sąlygomis, genomo būklė. Tai reiškia, kad DNR kometos gali būti naudojamos ne tik šiose tyrimų srityse, bet ir kitose srityse ateityje, praplėsti metodo panaudojimo galimybes klinikiniuose tyrimuose, medicinoje ir dar daugiau.

Pavyzdžiai: Lenkijoje įvykus nelaimingam atsitikimui baterijų gamykloje, darbuotojai patyrė didelį švino ir kadmio kiekį, todėl DNR pažeidimai šiek tiek, bet reikšmingai padidėjo, palyginti su grupe žmonių, kurie tokio streso nepatyrė. Suvirinimo dujomis aerozolių, turinčių sunkiųjų metalų – mangano, chromo, nikelio, kadmio, kobalto, švino, molibdeno, geležies – genotoksinis poveikis leukocitų DNR buvo atskleistas žmonėms, kurių darbas nuo seno siejamas su suvirinimu.

Yra tam tikrų sunkumų

Norint teisingai naudoti DNR kometos metodą, reikia „iš matymo“ žinoti ne tik jo galimybes ir pranašumus prieš kitus metodus, bet ir, žinoma, trūkumus, apribojimus ir sunkumus, kurių reikia stebėti. Metodas reikalauja optimizavimas lizė, elektroforezė ir kitos sąlygos, priklausomai nuo mokslininko naudojamų ląstelių tipo ir tyrimo tikslų.

Paaiškinimas: Augalų ir gyvūnų ląstelėms DNR išsiskyrimui reikalingos skirtingos sąlygos, t.y. lizė. Dėl celiuliozės ląstelių sienelės augalų ląstelės lizuojasi ilgiau nei gyvūnų ląstelės.

Iš pirmojo sunkumo kyla antrasis nepatogumas: metodo pritaikymas analizės problemoms gali būti labai sunkus. varginantis procesas(nors pati technika yra paprasta ir suprantama), ypač jei niekas nedirbo su jūsų tiriamu objektu DNR kometos metodu. Pasitaiko, kad metodikos „derinimas“ šiuo atveju reikalauja daug laiko.

Kartais yra sunkumai interpretuojant rezultatai, gauti pagal DNR pažeidimo laipsnį, nes pažeidimo laipsnis ne visada gali būti koreliuojamas su įtakojančio faktoriaus doze.

Paaiškinimas: Tokia problema gali būti susijusi su nepakankamu metodo optimizavimu, kai kai kurios žalos rūšys sumaišomos su kitomis ir taip iškraipomi rezultatai. Reparacinės sistemos, ištaisančios tam tikrą dalį atsiradusių pažeidimų, taip pat gali „sutrikdyti“ tikrąjį DNR pažeidimo laipsnį.

Vienas iš didžiausių sunkumų gali būti rezultatų palyginimas DNR kometų metodu gautas skirtingų mokslininkų įvairiose laboratorijose ir tyrimų institutuose. DNR pažeidimams įvertinti naudojami metodai su modifikacijomis ir visiškai skirtingais rodikliais (pavyzdžiui, DNR procentas „kometos uodegoje“ arba „uodegos“ ilgis).

Paaiškinimas:„Kometos uodegos“ ilgis yra atstumas, per kurį DNR migravo nuo uodegos „galvos“. DNR procentinė dalis kometos uodegoje yra DNR, kuri migravo į uodegą, kiekis, išreikštas procentais. NUO pilnas sąrašas DNR pažeidimo balus galima rasti adresu www.cometassayindia.org.

Stengiamasi standartizuoti DNR kometos metodo naudojimą, kuris padės mokslininkams palyginti rezultatus. Pavyzdžiui, genotoksinių tyrimų metu buvo sukurti protokolai ir rekomendacijos.

Paaiškinimas: Federalinio Rospotrebnadzor higienos ir epidemiologijos centro gairėse aiškiai apibrėžiami tiriamieji objektai (žmogaus ląstelės) ir išsamiai aprašomi visi analizės etapai. Remiantis šiomis rekomendacijomis, naudojant DNR kometų metodą, galima tirti buitinės chemijos ir gaminių, pagamintų iš polimerinių medžiagų, genotoksiškumą.

Išvada

„Kas ginkluotas, tas apsaugotas“ – toks yra darbo su DNR kometos metodu šūkis. Žinios apie naudojimo privalumus ir trūkumus šis metodas DNR pažeidimo įvertinimas leidžia meistriškai manipuliuoti darbo eiga, išvengti „spąstų“ ir gauti teisingus rezultatus.

DNR kometos metodas atlieka „stebuklingos lazdelės“ vaidmenį vertinant bendrą kūno būklę, kaip taisyklė. ankstyvosios stadijos poveikį neigiami veiksniai aplinką. Ant Pradinis etapas būtent DNR pažeidimas yra greičiausias, taigi ir vienintelis išmatuojamas organizmo atsakas į neigiamus padarinius dar gerokai iki pokyčių atsiradimo fiziologiniame lygmenyje.

Dabar žinote, kaip biologai gauna „kometas“ laboratorijose ir kodėl jiems jų taip reikia.

Literatūra

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Kometos tyrimas: jautrus metodas DNR pažeidimams atskirose ląstelėse aptikti. metodus. 48 , 46–53;
2. Inge-Vechtomov S.G. Genetika su atrankos pagrindais: vadovėlis universiteto studentams švietimo įstaigų(3-asis leidimas, pataisytas ir papildytas). Sankt Peterburgas: N-L, 2015. - 720 p.;
3. Piperakis S.M. (2009). Kometos tyrimas: trumpa istorija. Ląstelių biol. Toksikolis. 25 , 1–3;
4. Yarmonenko S.P. Žmogaus ir gyvūnų radiobiologija. M.: Aukštesnis. mokykla, 2004. - 549 p.;
5. Virėjas P.R. ir Brazell I.A. (1976). Branduolinių struktūrų, turinčių superspiralinę DNR, apibūdinimas. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. ir Johanson K.J. Vienos grandinės lūžių vienos žinduolių ląstelėse įvertinimas. In: DNR taisymo mechanizmai / red. pateikė Hanawalt P.C, Friedberg E.C, Fox C.F. NY: Academic, 1978. p. 465–468;
7. Ostling O. ir Johanson K.J. (1984). Radiacijos sukeltų DNR pažeidimų atskirose žinduolių ląstelėse mikroelektroforetinis tyrimas. Biochem. Biofizė. Res. bendruomenė. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. ir Ferardas J.F. (1999). Kometos tyrimas genetinėje ekotoksikologijoje: apžvalga. Aplinka. Mol. Mutagenas. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. ir kt. (2000). Vienos ląstelės gelio / kometos tyrimas: gairės in vitro ir in vivo genetinės toksikologijos tyrimai. Aplinka. Mol. Mutagenas. 35 , 206–221;
10. Filippovas E.V. (2014). „DNR kometos“ metodo panaudojimas augalų, gyvūnų ir žmogaus organizmų ląstelių DNR pažeidimo dėl aplinkos veiksnių aptikimui ir įvertinimui (apžvalga) . Mokslas ir švietimas. 2 , 72–78;
11. Collinsas A.R. (2004). DNR pažeidimo ir taisymo kometos tyrimas: principai, taikymas ir apribojimai. Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Aplinkos radioaktyvumas pažeidžia Japonijos Fukušimos prefektūros sliekų DNR. Euras. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Ar urano poveikis teleostean sukelia genotoksiškumą? Danio Rerio? Pirmieji eksperimentiniai rezultatai. Radioapsauga. 40 , 175–181;
14. Kagan M.Yu., Shulakova N.S., Tumirova R.A., Zlodeeva E.A., Reznik N.V. (2012). Nijmegen sindromas (klinikinis stebėjimas). Vaikų farmakologija. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Kometos tyrimas kaip Xeroderma pigmentosum ir trichotiodistrofijos prenatalinės diagnozės atkūrimo testas. J. Invest. Dermatolis. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoksinis švino ir kadmio poveikio darbo vietoje poveikis. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Tomilinas N.V., Petrovas A.N., Filko O.A., Khrabrova A.V., Solovieva N.E., Ivanova T.M. ir kiti (2015). Žmonių, profesionaliai susijusių su sunkiųjų metalų veikimu, periferinių kraujo ląstelių branduolinės DNR pažeidimo laipsnio įvertinimas. Sveikatos organizacija. 16 , 383–392;
18. Genotoksinių savybių įvertinimas DNR kometos metodu in vitro: Gairės . M.: federalinis centras Rospotrebnadzor higiena ir epidemiologija, 2010.- 16 p.