Bojenje razmaza po Gram metodi Najčešća metoda bojenja bakterija, koja omogućava klasifikaciju ćelija prema vrsti bojenja zida na gracilikute (gram-negativne) ili firmikute (gram-pozitivne).

Komad filter papira se stavlja na fiksiran razmaz, na njega se sipa karbonski rastvor gencijan violeta 30-50 sekundi. Boja se ocijedi, papir se uklanja, Lugolova otopina se nanosi 60 sekundi. Odbacite Lugolov rastvor. Ispirite lijek u 95° etanolu 30-50 sekundi dok boja ne prestane da izlazi, što ovisi o debljini razmaza. Preparat se ispere vodom, boji 30-60 sekundi Pfeiffer fuksinom, ispere vodom, osuši i mikroskopira. Mikroskopska slika: gram-pozitivne bakterije - ljubičaste, gram-negativne - crvene.

Praksa pokazuje da se čistiji preparati bez štete po diferencijaciju dobijaju ako se nakon bojenja gentian violetom bris lagano ispere vodom, čiji se ostaci otresu i tek onda nanese Lugolova otopina.

Modifikacija prema A.P. Sineva. Traka papira sa bojom stavlja se na fiksni razmaz, sipa se 2-3 kapi vode i boji se 2 minute. Zatim nastavite kako je gore opisano.

Kerry modifikacija. Razmaz se boji 1-2 minuta alkoholnim rastvorom gentian violet-a, tretira rastvorom joda 1-2 minuta, zatim etanolom 30-40 sekundi. Opran. Više puta tretiran 1 minut rastvorom joda, ispran, bojen 1-2 minuta fuksinom ili mešavinom safranina sa briljantnom zelenom.

Burkeova modifikacija. Rastvor A: 1% rastvor kristalno ljubičaste boje u destilovanoj vodi.

Mast: kristalni jod - 1 g, kalijum jodid - 2 g, destilovana voda - 100 ml.

Rastvarač za diskoloraciju: etil etar - 1 zapremina, aceton - 3 zapremine.

Dodatna boja: 2% rastvor safranina u destilovanoj vodi.

Metodologija. Razmaz fiksiran zagrijavanjem se uroni u otopinu A. Razmaz se ispere u jodnoj jedilici i prekrije svježim razmazom 2 minute. Isperite vodom, a zatim otapalom za izbjeljivanje sve dok otapalo za odvod ne ostane bez boje. Nakon sušenja, premazati dodatnom bojom 5-10 sekundi, isprati vodom i mikroskopirati.

Hooker modifikacija

Rastvor A: kristalno ljubičasta - 2 g, 95% etanol - 20 ml.

Rastvor B: amonijum oksalat - 0,8 g, destilovana voda - 80 ml.

Otopina A i B u pripremljenim količinama pomiješaju se u tamnoj bočici i ostave na sobnoj temperaturi 24 sata.

Rastvor B: 2,5% rastvor safranina (u 96% etanolu) - 10 ml, destilovana voda - 100 ml.

Metodologija. Razmaz fiksiran zagrijavanjem se potopi u mješavinu otopina A i B na 1 min, nakon čega se preparat ispere vodom i tretira Lugolovim rastvorom 1 min, zatim ponovo ispere vodom i osuši; Nanosi se 96% etanol 30 s, preparat se dobro opere vodom, osuši, stavi u rastvor B na 10 sekundi, malo ispere vodom, osuši, mikroskopira.

Test kalijum hidroksida za praćenje rezultata bakterijske boje po Gramu. Ako boja po Gramu nije jasna, ova metoda vam omogućava da precizirate rezultat.

Postavljanje testa. 1-2 kapi 3% rastvora KOH se nanose na stakalce. Agar kultura se uvodi u KOH bakteriološkom petljom, miješa se, a zatim se omča podiže. Ako kultura u obliku "nit" posegne za omčom - gram-negativna, u nedostatku ovog fenomena - gram-pozitivna bakterija.

Metode za bojenje bakterija otpornih na kiselinu

Ziehl-Nielsen bojenje. Priprema se karbonska fuksinska boja: bazični fuksin - 0,3 g, 95% etanol - 10 ml, fenol (kristali se rastopljeni pri zagrevanju) - 5 ml, destilovana voda - 95 ml.

Osnovni fuksin se rastvori u etanolu, doda se fenol rastvoren u vodi, promeša, drži 5-7 dana na sobnoj temperaturi; prije upotrebe procijediti kroz filter papir.

Rastvarač za promjenu boje (hlorovodonični alkohol): etanol 95% - 97 ml, koncentrovana hlorovodonična kiselina - 3 ml. Dodatna boja: metilensko plavo - 0,3 g, destilovana voda - 100 ml.

Metodologija. Karbol-fuksin boja se sipa na mrlju fiksiranu zagrijavanjem, zagrijava dok pare ne pobjegnu (ali ne proključa!). Opran vodom nakon 5 minuta. Zatim se bris tretira rastvaračem za izbjeljivanje 30-50 sekundi, ispere vodom, nakon čega film bakterija na razmazu postaje blijedoružičast.

Razmaz se boji 3-5 minuta dodatnom bojom (metilensko plavo i sl.), ispere vodom i suši.

Mikroorganizmi otporni na kiselinu u razmazu su crveni, drugi su plavi.

Auramine mrlja. Rastvor A: auramin - 1,5 g, rodamin B - 0,75 g, glicerin - 75 ml, rastopljeni fenol - 10 ml, destilovana voda - 50 ml.

Boje: fenol i glicerin se rastvore u 25-30 ml vode, doda se preostali volumen vode i filtrira kroz staklenu vunu.

Rastvor B: 70% etanol - 99,5 ml, koncentrovana hlorovodonična kiselina - 0,5 ml.

Rastvor B: kalijum permanganat - 0,5 g, destilovana voda - 99,5 ml.

Metodologija. Razmaz fiksiran na plamenu plamenika se boji 15 minuta otopinom A na sobnoj temperaturi ili na 37-38 °C. Opran pod tekućom vodom do promjene boje. Rastvor B se sipa na razmaz 3-5 minuta, pere i boji još 2-4 minuta rastvorom C. Opran, osušen, mikroskopski u fluorescentnom mikroskopu pod uranjanjem (uzbudljivi svetlosni filter BG-12, blokirajući OG-1) .

Bakterije otporne na kiselinu žuto-narandžaste na tamnoj pozadini.

Fly bojanje. Lijek izdržava 24 sata u otopini metil violeta (10 ml zasićenog alkoholnog rastvora metil ljubičice, 100 ml 2% vodenog rastvora karbonske kiseline). Lugolova otopina se primjenjuje 1-2 minute, a zatim se nanosi 5% otopina u trajanju od 1 minute azotne kiseline i 10 sekundi 3% rastvor hlorovodonične kiseline. Zatim se mešavina etanola i acetona (1:1) nanosi na preparat dok boja ne prestane da se skida, ispere se vodom, osuši i mikroskopira.

Metode bojenja spora

Aujeszkyjeva metoda. Na vazduhu osušen razmaz bez fiksacije tretira se 2-3 minuta (zagrejan) sa 0,5% sumpornom kiselinom, opere i fiksira na plamenu. Boji se 7-8 minuta Zielovim karbonskim fuksinom kada se zagrije, boja se ocijedi. Razmaz se tretira 5-7 sekundi sa 5% rastvorom sumporne kiseline, opere i boji metilen plavim 4-5 minuta. Pod mikroskopom, vegetativni dio ćelije je plave boje, spora je crvena.

Mellerova metoda. Razmaz fiksiran na plamenu se nagriza 2-3 minuta sa 5% hromne kiseline, opere i boji Zielovim karbonskim fuksinom. Izbjeljivati ​​i farbati na isti način kao Aujeszky metoda.

Metoda Peškova. Fiksni razmaz se boji metilenskim plavim zagrijanim do ključanja. Boja se ispere i boji 1% vodenim rastvorom neutralnosti 10 sekundi. Opran, osušen. Spore su plave, vegetativne ćelije crvene.

Schaeffer-Fulton metoda. 0,5% vodeni rastvor malahit zelene sipa se na razmaz fiksiran zagrijavanjem, prekriven filter papirom. Razmaz se stavi na 5 minuta iznad kipuće vode. Opran i protivbojan 30 sekundi sa 2% vodenim rastvorom safranina. Opran, osušen. Spore su jarko zelene, vegetativne ćelije su crveno-smeđe.

Trujillo metoda. Razmaz se fiksira iznad plamena plamenika, prelije zasićenom vodenom otopinom malahit zelene boje, zagrijava dok se ne pojavi para i boji 3 minute. Boja se ispere vodom i bris se boji 0,25% vodenim rastvorom bazičnog fuksina 1 min. Opran, osušen. Spore su zelene, vegetativne ćelije crvene.

Dornerova metoda. Razmaz fiksiran na plamen gorionika se boji 5-10 minuta karbol fuksinom kada se zagrije, a 1 minutu mijenja boju alkoholom hlorovodonične kiseline (3 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline i 97 ml 96% etanola). Lijek se ispere, osuši filter papirom i izlije na razmaz tankim slojem 10% otopine nigrozina u 0,5% otopini formalina. Bez ispiranja, razmaz se suši na vazduhu i mikroskopira. Spore su crvene, vegetativne ćelije su bezbojne na crnoj pozadini.

Waldmanova metoda. Lefleur blue (alkalna) se nanosi na fiksirani preparat i zagreva do ključanja, zatim se ohladi i ispere vodom. Bojite 1% neutralnom otopinom 30 sekundi. Mikroskopska slika: spore - plave, vegetativne ćelije - crvene.

Ozheshka metoda. 0,5% rastvor HC1 se sipa na nefiksirani razmaz i zagreva 1-2 minuta. Kiselina se ocijedi, preparat ispere vodom, osuši, fiksira na plamenu i boji po Ziehl-Neelsen metodi. Mikroskopska slika: spore - crvene, vegetativne ćelije - plave.

Metode bojenja kapsula

Metoda Romanovsky-Giemsa. Razmaz fiksiran u etanolu ili Nikiforovljevoj tečnosti stavlja se u boju Romanovsky-Giemsa (15-20 kapi boje na 10 ml destilovane vode) na 15-20 minuta. Opran, osušen. Tijelo bakterije je obojeno tamno plavom bojom, kapsule su ružičaste.

Oltova metoda. Fiksne mrlje iznad plamena gorionika se boje 1-3 minuta 2% vodenim rastvorom safranina (safranin se rastvara u vruća voda, filtrirati, nanijeti svježe pripremljeni rastvor). Tijelo bakterije je obojeno smeđom bojom, kapsula je blijedožuta.

Rebigerova metoda. Nefiksirani razmaz se boji 15-20 sekundi rastvorom gentian violet-a u formalinu (15-20 g gentian violet-a se rastvori u 100 ml 40% formalina, taloži, filtrira), ispere vodom. Tijelo bakterije je tamnoljubičasto, kapsula je crvenkasto ljubičasta.

Antonov način. Razmaz se boji 2 minute sa 1% vodenim rastvorom kristalno ljubičaste boje. Boja se ispere sa 20% vodenim rastvorom bakar sulfata (CuSO 4 ·5H 2 O), višak rastvora se otrese i mrlja se osuši filter papirom bez ispiranja vodom. Mikrobi - tamno ljubičasta, kapsula - svijetlo plava.

Gins metoda. Kap crne tinte razrijeđene destilovanom vodom u omjeru 1:3 nanosi se na staklo i centrifugira na 3000 o/min 15 minuta. U kapi trupa kultura se suspendira omčom i napravi bris (slično krvnom razmazu). Osušiti, fiksirati na plamenu plamenika, premazati Zielovim karbonskim fuksinom, razrijeđenim 1:3. Tijela bakterija su crvena. Kapsula na tamnoj pozadini vidljiva je kao svijetli oreol oko bakterije.

Mikhinova metoda. Razmaz se boji 3-5 minuta Leffleurovim plavim (prikladna je samo boja koja je čuvana najmanje 20-30 dana, jer se u njoj tokom skladištenja formira azur koja daje metahromatnost). Tijela bakterija su plava, kapsula je ružičasta.

Gissova metoda. Kap normalnog krvnog seruma goveda ili konja (ili kap obranog mlijeka) nanese se na stakalnu pločicu, kultura se unese u njega petljom, suspendira i pripremi bris. Film bakterijske suspenzije se suši na vazduhu, fiksira iznad plamena plamenika i boji 0,1% vodenog kristalno ljubičastog 1 min. Razmaz se ispere sa 20% vodenim rastvorom bakar sulfata, osuši filter papirom. Kapsule u razmazu su blijedoplave, tijela bakterija su tamnoljubičasta.

Dugidov metod. Kap crne tinte stavlja se na staklo, a kultura se suspenduje u njemu. Kap se prekriva pokrivnim staklom, višak mastila se uklanja filter papirom. Na smeđe-crnoj pozadini vidljive su bakterije koje lome svjetlost, okružene kapsulom u obliku prozirne zone.

Jonov put. Kap tinte razrijeđene 1:2-1:4 sa destilovanom vodom nanosi se na jedan kraj površine staklenog tobogana. Bakterije se suspenduju u kapi i priprema se bris (kao bris krvi). Preparat se suši na vazduhu, fiksira nad plamenom plamenika i boji 2 minuta sa 2% vodenim rastvorom gentian violet-a ili 1% rastvorom fuksina. Opran vodom, tretiran 2% rastvorom sirćetne kiseline 8-10 sekundi i ponovo ispran. U razmazu je vidljiva neobojena kapsula oko intenzivno obojene bakterije.

metoda bojenja flageluma

Prisutnost flagela u bakterijama procjenjuje se po indirektnim znakovima, na primjer, po pokretljivosti ćelija u preparatima "zgnječena kap", "viseća kap", kao i po prirodi rasta test kulture u polutečnosti. agar (0,15-0,3%). U potonjem slučaju, test kultura se inokulira ubodom u pankreas i inkubira 18-24 sata. U procesu rasta, pokretne bakterije migriraju sa linije ubrizgavanja, uzrokujući zamućenje podloge, dok nepokretne bakterije rastu samo uz injekciju.

U nekim slučajevima će se koristiti metode bojenja koje omogućavaju direktno promatranje flagela

Za sve metode bojenja, stakalce treba pripremiti od mladih kultura agara (14-20 sati rasta). 0,5% vodeni rastvor peptona se dodaje u epruvete sa kulturom na kosom agaru 30-40 minuta. Tečnost se taloži, za taloženje mikroba koji su u nju prešli, centrifugira se. Talog se prelije fiziološkim rastvorom i ponovo centrifugira. Da bi se spriječio gubitak flagela, isprani precipitat se resuspendira u 10% otopini formalina kako bi se dobila blago zamućena suspenzija.

Flagele obojene osmičkom kiselinom. Na čistom odmašćenom predmetu ili staklu sata, kap suspenzije bakterija pomiješa se s kapljicom 2% otopine osmičke kiseline. Dobivena kap smjese se nanosi na čisto staklo bez masti sa tankom kapilarom Pasteurove pipete. Osušite na zraku i učvrstite na plamenu (izbjegavajte pregrijavanje!).

Na fiksirani preparat se sipa jedilica pripremljena za nekoliko dana (1 ml zasićenog alkoholnog rastvora fuksina, 10 ml 20% vodenog rastvora tanina i 5,5 ml zasićenog vodenog rastvora gvožđe sulfata amonijaka). Nakon 15 minuta, mordant se ispere vodom, boji se fuksinom 4 minute, opere i mikroskopski.

Bojenje flagela srebrom. Od suspenzije se priprema tanak razmaz, koji se suši i fiksira 2-3 minuta sa 2% rastvorom osmičke kiseline. Lijek se ispere potapanjem 2-3 s u 0,5% vodeni rastvor srebrnog nitrata i, bez pranja, potopi se 2-3 s u kiseli krastavčić (pirogalol ili galna kiselina - 2,0 g, tanin - 1,2 g, natrijum acetat - 4,0 g, destilovana voda - 150 ml). Izvadi se iz mordanta i ponovo uroni u rastvor srebrnog nitrata, držeći dok preparat ne pocrni. Nakon pranja, vrši se mikroskopija.

Boja flagela prema Plimmeru. Boja se priprema: tanin - 5,0 g, cink hlorid - 5,0 g, aluminijum hlorid - 10,0 g, prah fuksina - 0,75 g uzorka navedenih komponenti se melje u malteru, postepeno dodajući 40 ml 60% etanola dok se potpuno ne otopi. . Prije upotrebe, boja se razrijedi vodom (1:5).

Traka filter papira stavlja se na osušeni tanki mrlja i puni pripremljenom bojom. Nakon 2 minute, boja se ispere vodom i dodatno boji Ziehl carbol fuksinom. Bakterije i flagele su crvene.

Boja flagela prema Benichettiju. Unaprijed se pripremaju 3 rješenja. Rastvor 1: cink sulfat - 0,5 g, tanin - 8,0 g, destilovana voda - 50 ml. Rješenje 2: zasićeni rastvor kalijum alum. Rješenje 3: Zasićena otopina gentian violet ili kristal violet. Prije upotrebe otopine se pomiješaju (5:5:3). Mješavina otopina se sipa na osušeni razmaz i zagrijava dok se ne pojavi para. Isprati nakon 3 minute i mikroskopirati. Ljubičasto-crna flagela.

Bojanje po Valentiju. Razmaz se tretira 3 minuta sa 20% rastvorom tanina kada se zagreje, pere, zagreva se 10 minuta boji karboličnim fuksinom. Opran, mikroskopski. Bakterije i flagele su crvene.

Siva boja. Rastvor A: taninska 20% vodena kiselina - 2 ml, zasićeni vodeni rastvor kalijum alum - 5 ml, živ hlorid, zasićeni vodeni rastvor - 2 ml, bazni fuksin 3% u 96% etanolu - 0,4 ml. Boja (magenta) se dodaje ostatku sastojaka neposredno prije upotrebe, a nakon njenog otapanja, dobiveni rastvor se filtrira kroz filter papir. Rešenje B: Zielov karbolični fuksin (osnovni fuksin 3% u 95% etanolu - 10 ml, fenol - 5 ml, destilovana voda - 95 ml).

Metodologija. Kap bakterija (suspenzija) u formalinu se nanese na staklo i ostavi da se ocijedi. Suhi zrak. Stavlja se traka filter papira i sipa rastvor A 4-6 minuta.Ispere se vodom i boji rastvorom B 3 minuta kroz filter papir.Ispere, osuši, mikroskopski. Flagele i bakterije su crvene.

Bojenje prema Lifesonu. Pripremite 3 rješenja. Rastvor 1: 1,5% rastvor natrijum hlorida u destilovanoj vodi. Rastvor 2: 3% rastvor taninske kiseline u destilovanoj vodi. Rastvor 3: sirćetna kiselina rozanilin - 0,9 g, hlorovodonična kiselina prozanilin - 0,3 g, 96% etanol - 100 ml. Rastvori 1 i 2 se pomešaju podjednako i zatim se 2 zapremine ove mešavine sipaju u 1 zapreminu rastvora 3. Mešavina se čuva u frižideru do 3 meseca.

Metodologija. Kap kaše se nanese na dobro odmašćenu čašu i ostavi da se ocijedi. Nakon sušenja, granice bakterijskog filma se ocrtavaju olovkom na staklu, područje se puni bojom 7-15 minuta. Izdržati dok površina boje ne dobije zlatnu boju, a film bakterija nije prekriven sedimentom. Opran, osušen. Bakterije i flagele su crvene.

Metode bojenja ćelijskog zida

Bojenje staničnog zida ima dijagnostičku vrijednost u razlikovanju mikoplazme od bakterija.

Gutstein metoda. Lijek se fiksira 1-2 sata u Bouinovoj tekućini, drži 2-3 minute u 5-10% vodenom rastvoru tanina, ispere vodom i mikroskopira u kapi 0,01% vodenog rastvora kristalno ljubičastog.

Metoda Peškova. Lijek se fiksira 15 minuta u tekućini sljedećeg sastava: etanol 90% - 60 ml, hloroform - 30 ml, sirćetna esencija - 10 ml. Zatim se preparat drži 2-5 minuta u 10% vodenom rastvoru tanina, ispere vodom, boji 30-60 sekundi sa Pfeiffer magenta i, bez mešanja, osuši i mikroskopira.

Metoda) Robinow. Proučavani mikroorganizam se uzgaja na agar podlozi u Petrijevoj posudi, izrezuje se blok agara i svojom površinom stavlja na pokrovno staklo, stavlja preko noći u Bouinovu tečnost. Sutradan se agar uklanja, čaša se stavlja licem nadole na površinu 5-10% vodenog rastvora taninske kiseline na 20-30 minuta. Zatim se preparat ispere vodom, a na površinu 0,02% vodene otopine kristalno ljubičastog na 5-10 sekundi stavi se pokrivno staklo sa ćelijama bakterija nadole. Kao rezultat toga, stanične membrane i pregrade su obojene tamnoplavom ili crnom bojom, a citoplazma ostaje neobojena.

Metode bojenja citoplazmatskih inkluzija

Prilikom identifikacije mikroorganizama, podaci o prisutnosti inkluzija u stanicama koji odražavaju vrstu i smjer konstruktivnog metabolizma su od posebne važnosti. Citoplazmatske inkluzije uključuju poli-β-hidroksibuternu kiselinu, zrna metahromatina (volutina) i polisaharide.

Poli-β-hidroksimaslačna kiselina je poliester beta-hidroksimaslačne kiseline, koja se akumulira u citoplazmi ćelija u obliku okruglih ili ovalnih granula veličine 200-800 nm. Metahromatin je polifosfat, a polisaharidi su glukani, koji se sastoje od D-glukoze, veličine do 200 nm. Navedene inkluzije djeluju kao svojevrsne rezerve ćelijskih supstanci i mogu se otkriti posebnim metodama bojenja.

Detekcija poli-beta-hidroksibuterne kiseline

Razmaz fiksiran na plamenu plamenika se boji 5-15 minuta sa 0,3% rastvorom sudanske crne B u etilen glikolu. Boja se ocijedi i nakon sušenja na zraku bez pranja vodom, ispire u ksilenu. Nakon što se bris osuši, spušta se na 5-10 sekundi u 0,5% vodeni rastvor safranina. Opran vodom, osušen i mikroskopiran. Inkluzije poli-β-hidroksimaslačne kiseline vidljive su na ružičastoj pozadini citoplazme kao crno-plave formacije.

Detekcija metahromatina (volutina)

Neisserova metoda. Pripremite 4 rješenja. Rastvor A: metilensko plavo - 0,1 g, 95% etanol - 2 ml, glacijalna sirćetna kiselina - 6 ml, destilovana voda - 100 ml. Rastvor B: kristalno ljubičasta - 1 g, etanol 95% - 100 ml, destilovana voda - 300 ml. Rastvor B kristalni jod - 1 g, kalijum jodid - 2,0 g, destilovana voda - 300 ml. Rastvor D: krizoidin - 1 g, destilovana voda - 300 ml (hrizoidin se rastvara u vrućoj vodi). Smjesa otopine A i B u omjeru 2:1 se sipa na mrlju fiksiranu iznad plamena gorionika 1 min (smjesa se priprema prije bojenja). Boja se ocijedi, tretira 1 min rastvorom B (Lugolova otopina) i opere vodom, osuši, mikroskopski. Bakterijske ćelije su svijetložute, zrna volutina su tamnoplava.

Ruskinov metod. Pripremite boju sljedećeg sastava: Tsilya carbolic fuchsin - 4 ml, zasićena alkoholna otopina metilensko plavo- 4 ml, glacijalna sirćetna kiselina - 5 ml, etanol 96% - 95 ml, destilovana voda - 92 ml. Boja se sipa na mrlju fiksiranu iznad plamena gorionika, zagrijava se iznad gorionika dok alkohol ne izgori, ispere vodom, osuši i mikroskopira. Bakterijske ćelije su obojene svijetlocrvenom bojom, zrna volutina su obojena crno i plavo.

Detekcija polisaharida

Obojen Šifovim reagensom. Pripremite 4 rješenja. Rastvor A (rastvor periodata): 4% rastvor jodne kiseline 20 ml, 0,2 M vodeni rastvor natrijum acetata 10 ml, 96% etanol 70 ml. Rastvor je osjetljiv na svjetlost, pa ga treba čuvati u tamnoj boci na mraku.

Razlikujte jednostavne i složene metode bojanja.

Jednostavne metode bojenja nazvano prethodno bojenje

paraty bilo koju boju. Neki mikroorganizmi (spirohete) koje je teško otkriti pozitivnim mrljama lako se otkrivaju kada se boje negativnim mrljama.

Tehnika kuvanja lijek je kako slijedi. Fiksni preparat se postavlja na paralelne staklene letvice (most) koje leže iznad kivete. 1% vodeni rastvor fuksina ili metilen plavog nanosi se na razmaz pomoću kapaljke 1-2 minuta. Pazite da se rastvor boje ne osuši tokom bojenja. Nakon što je bojenje završeno, boja se odvodi. Lijek se ispire vodom sve dok voda koja teče ne postane bezbojna. Zatim se lijek osuši. Da biste to učinili, donja strana preparata se upija filter papirom, a gornja se pažljivo osuši sa strana, bez dodirivanja mrlja. Lijek se konačno suši na zraku ili visoko iznad plamena alkoholne lampe. Da bi se dobili čistiji preparati, boja se nanosi na mrlju prekrivenu filter papirom. Metoda bojenja u modifikaciji Sineva omogućava korištenje filter papira prethodno impregniranog njime umjesto otopine boje. Kod pravilno obojenog i dobro opranog preparata vidno polje je svijetlo i čisto, obojene su samo ćelije. Mikroskopski preparati sa sistemom za uranjanje.

At kompleksne (diferencirajuće) metode na bojenje na istom preparatu utječe nekoliko tvari za bojenje, od kojih se jedna naziva glavnom, a druge - dodatnom. Osim boja, koriste se različita sredstva za izbjeljivanje: alkoholi, kiseline, aceton itd. Složenim metodama bojenja otkrivaju se citološke karakteristike ćelija mikroorganizama (ćelijske strukture, inkluzije itd.).

Boja po Gramu je najsvestranija od složenih metoda bojenja. Bojenje je osnova za diferencijaciju bakterija i odražava sposobnost stanica da percipiraju i zadrže kompleks boje gentian violet i joda unutar ćelije, ili ga izgube nakon tretmana alkoholom. Shodno tome, gram-pozitivna ( bacil, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, itd.) i gram negativni (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, itd.) forme.

Razmazi za bojenje po Gramu moraju se pripremiti od mladih, aktivno rastućih (obično jednodnevnih) kultura kako bi se dobili pouzdani rezultati, jer ćelije iz starih kultura ponekad daju nestabilnu Gram reakciju. Gram-negativne bakterije mogu se pojaviti kao Gram-pozitivne ako je bakterijski film (razmaz) predebeo i alkoholna diskoloracija nije potpuna. Gram-pozitivne bakterije mogu se pojaviti kao Gram-negativne ako je bris promijenjen alkoholom.

Method Essence . Na površini ćelijske citoplazme kod gram-pozitivnih mikroorganizama nalazi se kompleks proteina i magnezijevog ribonukleata, kojeg nema kod gram-negativnih bakterija. Bojenje po Gramu na površini gram-pozitivnih ćelija formira snažan kompleks proteina, magnezijum ribonukleata, gencijan violeta i joda, koji se ne uništava alkoholom. Takve bakterije ostaju plavo obojene. ljubičasta. Gram-negativne bakterije nemaju sposobnost zadržavanja boje i promjene boje kada se tretiraju alkoholom. Za njihovu identifikaciju preparat se boji fuksinom. Gram-negativne bakterije obojene u crveno.

Faze diferenciranog bojenja po Gramu:

Fiksni razmaz se prekriva komadom filter papira (1,5 x 1,5 cm) i na njega se nanosi karbonska otopina gentian violeta ili kristal violeta dok se potpuno ne navlaži (češće se koristi modifikacija Sinev). Bojenje se vrši 1-2 minute.

Papir se uklanja, boja se ocijedi i, bez pranja preparata vodom, Lugolova otopina se nanosi na preparat 1-2 minute dok mrlja ne pocrni.

Lugol rastvor se ocijedi, obojeni razmaz se obezboji 96º etil alkoholom. Da biste to učinili, lijek se stavlja 2-3 puta u čašu s alkoholom dok ne prestanu izlaziti ljubičasti potoci (vrijeme promjene boje nije više od 30 s), ili se 2-4 kapi alkohola sipaju na razmaz 30- 45 s.

Lijek se brzo ispere vodom (kao što je gore opisano).

Razmaz se dodatno boji 1-2 minute vodenim rastvorom fuksina (Pfeifferov fuksin).

Boja se ocijedi, preparat ispere vodom, osuši filter papirom.

mikroskopirano sa sistemom za uranjanje.

Gram-pozitivne bakterije obojene u ljubičasto, Gram-negativne bakterije u ružičasto.

Nukleoid. Teško je otkriti nukleoid u bakterijskoj ćeliji pomoću svjetlosnog mikroskopa. Za selektivno nukleoidno bojenje, fiksirane ćelije se prethodno tretiraju ribonukleazom ili razrijeđenom hlorovodoničnom kiselinom kako bi se razgradila ribosomska RNK. Naknadno bojenje glavnom bojom omogućava otkrivanje nukleoida u obliku gustih tijela s nepravilnim obrisima smještenih u središtu ili na polovima ćelije.

Ziehl-Neelsen bojenje bakterija otpornih na kiselinu odražava karakteristike mikobakterija i nokardije.

Princip metode. Otpornost ovih bakterija na kiselinu je povezana sa visokog sadržaja lipida u ćelijskom zidu. Bakterije otporne na kiseline su obojene Ziehl karboličnim fuksinom kada se preparat zagrije crveno i zadržava tu boju nakon izbjeljivanja sumpornom kiselinom. Bakterije koje nisu otporne na kiselinu su obezbojene kiselinom i zatim obojene u plavo metilen plavim.

Za otkrivanje kapsula koristeći različite metode, uključujući Burri metoda i Burri Guinsa . Metoda se zasniva na negativnom kontrastu. Budući da kapsula ili tijelo mikrobne ćelije ne percipira boje, samo je pozadina mikropreparata obojena tintom. Kapsula je vidljiva kao neobrađeno područje na tamnoj pozadini mrlje od tinte. Prema Burri-Gins metodi, tijela mikrobnih stanica su dodatno obojena u crveno fuksinom.

Za bojenje flageluma Predloženo je nekoliko metoda, a uobičajeni korak je jetkanje preparata (obično rastvorima tanina, KAl(SO 4) 2 , HgCl 2) i naknadno bojenje (često karbonskim rastvorom fuksina). Kao rezultat toga, boja se taloži na flagellama, zbog čega se istovremeno postiže i povećanje njihove debljine i smanjenje prozirnosti. Jedna od predloženih metoda za bojenje flagela je Leifsonova metoda. Preparat je mikroskopiran sa imersion sistemom. Bakterijske ćelije postaju crvene, flagele poprimaju oblik debelih filamenata koji se protežu iz ćelije.

Pitanja za samokontrolu

1 Navedite glavne morfološke tipove ćelija mikroorganizama.

2 Opišite šematsku strukturu bakterijske ćelije.

3 Navedite faze pripreme fiksiranih preparata mikroorganizama, opišite ih.

5 Klasificirajte boje koje se koriste u mikrobiologiji, okarakterizirajte ih.

Vježba 4

Cilj: upoznavanje sa načinima pripreme fiksnih preparata, jednostavnim i složenim metodama bojenja; upoznavanje sa morfologijom i citologijom različitih mikroorganizama.

Materijali i oprema: biološki mikroskopi, mikroskopska stakalca i pokrovna stakalca, špiritus lampe, bakterijske petlje, ulje za uranjanje, sterilne pipete, pincete, filter papir, šibice, higijenski pamučni štapići, markeri, sterilne Petrijeve zdjelice, po grupi - u tikvici od 50 ml sterilna voda iz slavine, destilirana voda za pranje, podloške, kivete, mostovi, set gotovih rastvora boja u postolju, alkohol 96 0, pipete, infuzije od prirodnih materijala: meso, grašak itd.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="(!LANG:> TEHNIKA PRIPREME POTEZA. METODE BOJENJA.">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="(!LANG:> Sigurnost u mikrobiološkoj sobi (laboratorij) Pravila"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="(!LANG:> Pravila za rad sa živom kulturom. 1. Glavna stvar kada sijanje žive kulture - to je"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="(!LANG:> Pravila za pripremu i čuvanje čaša (predmet, korice) Predmet i naslovni listići"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="(!LANG:> sačuvaj"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в !} alkalni rastvorčaše se ispiru tekućom vodom iz slavine, potapaju na 10-15 minuta u 5-10% rastvor hlorovodonične kiseline, a zatim isperu tekućom vodom. Korištena stakalca i pokrovna stakla kontaminirana bojom i imerzionim uljem tretiraju se na sljedeći način: potapaju se 2 sata u koncentriranu sumporna kiselina ili smjesu hroma, a zatim temeljito isprati tekućom vodom iz slavine; preliti 5% rastvorom natrijum bikarbonata ili alkalije (kaustična potaša ili kaustična soda), staviti na laganu vatru i kuvati 30-40

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="(!LANG:> KORACI PRIPREME. 1. Priprema. Dr.br. 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="(!LANG:> Recepti za pravljenje boja Carbolic"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="(!LANG:>"> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В !} lijeva ruka uzmite epruvetu sa sterilnom fizikalnom otopinom (destiliranom vodom) i stavite je između prstiju 1 i 2 tako da je dlan ispod epruvete, a vrat epruvete usmjeren u zonu alkoholne lampe. bakterijska petlja desno, kao olovka.Omca je flambirana do crvenila, prvo horizontalno, zatim okomito. omce za otpuštanje, mali prst desna ruka pritisnite čep fizički. rastvor na dlan i pažljivo ga izvadite iz epruvete. Pokreti treba da budu glatki.Grlo epruvete se spaljuje u plamenu i ubacuje se omča.Uzimaju se fizičkom izlaznom petljom. rastvora i ukapajte par kapi na staklo unutar granica razmaza Zatvorite čep, prethodno prošavši istovremeno čep i grlo epruvete kroz plamen špiritusne lampe. Stavite epruvetu u tronožac

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="(!LANG:> Uzmite epruvetu za kulturu u lijevu ruku i postavite je kao tube"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="(!LANG:>"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt="(!LANG:>Šema pripreme razmaza">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="(!LANG:> Vrste fiksacije q Fizička - u plamenu alkoholne lampe q Hemijski"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="(!LANG:> Metode bojenja: Jednostavni kompleks (Gram, Ziehl-Nielsen) , Buri-Gins).">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="(!LANG:> JEDNOSTAVNE METODE ZA BOJANJE MRLJA, sodybasniic"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt="(!LANG:> Jednostavnim načinom bojenja, nekoliko kapi bilo kojeg alkohola ili vode"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt="(!LANG:>Jednostavnim bojenjem, mikrobna tijela percipiraju boju nanesene boje koliko toliko intenzivno"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из !} čista kultura) su ofarbane u istu boju, ali nešto bljeđe. Magenta i gentian violet boje su intenzivnije boje; metilensko plavo mrlje mnogo bljeđe. Percepcija boje ne zavisi samo od svojstava boja, već i od svojstava mikroba koji se boje. Većina mikroba se lako i brzo oboji vodom ili alkoholno-vodenim rastvorima boja. Da bi se povećala sposobnost bojenja, boja se izlaže visokoj temperaturi (zagrijavanju) sve dok se ne pojave pare (do ključanja). Promjenom stepena zagrijavanja moguće je dobiti različite stupnjeve jačine boje. Produženje vremena ekspozicije rastvora za bojenje na objektu takođe može povećati stepen obojenosti do određene mere.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="(!LANG:> KOMPLEKSNE metode bojenja na osnovu karakteristika fizičko-hemijske strukture mikrobne ćelije.Suština ovih metoda"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="(!LANG:> GRAM METODA v Nanesite gentian violet na fiksni swab"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt="(!LANG:>Odnos bakterija prema Gramu boje je određen njihovom sposobnošću da zadržati formiran u"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="(!LANG:> GRAM-NEGATIVNI I GRAM-POZITIVNI"> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt="(!LANG:>Streptococci Gr+ cocci poređani u lancima Streptococci Gr+ cocci poređani u lancima Strepcus piphylocok"> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="(!LANG:> Vibrio Gr- Vibrio cholerae"> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="(!LANG:> DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE PLUĆA METOKLOZOM PLUĆA"> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt="(!LANG:>BOJA a) Pokrijte mrlju filter papirom i nanesite na cijelu površinu papira karbolic fuksin"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="(!LANG:> ZIEHL-NIELSEN METODA (UPUTSTVO 1999)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="(!LANG:> ZIEHL-NIELSEN METODA"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="(!LANG:> DETEKCIJA KAPSULA U BAKTERIJAMA Neki mikrobi"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="(!LANG:>"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt="(!LANG:>BURRI AND BURRI-GINS Stain Capsule in Klebsia Stain Capsule in Klebsia">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="(!LANG:>"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="(!LANG:> OZZHZKO MRLJA Na osušenom mrlju!) + nekoliko nefiksiranih"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="(!LANG:> Studija pokretljivosti mikroorganizama."> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="(!LANG:> METODA DREVLJENE KAPI Kapljica se nanosi na staklo pipeta ili omča"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="(!LANG:> Flagele dolaze u različitim dužinama. Njihov prečnik je toliko mali da nevidljivi su u"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt="(!LANG:>Određivanje pokretljivosti bakterija metodom "viseće kapi"). kap (18 -20 sati) bujon"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="(!LANG:> METODA VISEĆE KAPI"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля!}

Živimo u svijetu bakterija. Oni su oko nas i unutar našeg tijela. Nije ni čudo što želimo da znamo što je više moguće o njima. Ali kako razmotriti, a još više proučavati nešto tako malo? Čini se da bi mikroskop trebao riješiti ovaj problem. Ali nije sve tako jednostavno - u svom prirodnom stanju, mikroorganizmi su prozirni poput stakla. Različite metode bojenja bakterija pomažu da se "prikaže" slika, pomažući u istraživanju vanjske i unutrašnje strukture mikroba.

Krajem devetnaestog veka danski biolog Kristijan Gram predložio je rešenje za ovaj problem. Ako je nešto nevidljivo, treba ga ofarbati i vidjeti šta će se dogoditi. Metoda bojenja bakterija koju je predložio Gram bila je toliko uvjerljiva da se do danas mikroorganizmi dijele na gram-pozitivne (zadržavaju boju) i gram-negativne (promjeni boje nakon tretmana alkoholom).

Kako se ispostavilo, ćelije su prekrivene membranom sličnom isprepletenim nitima. I iako hranjive tvari potrebne za ćeliju slobodno prolaze u praznine između niti, ljuska pouzdano štiti "unutarnji svijet" od vanjskih agresivnih faktora. Kod različitih vrsta bakterija, vanjski zid ćelije ima različitu debljinu, gustoću i hemijski sastav. Metoda bojenja po Gramu je zasnovana na ovom svojstvu ćelijskih membrana.

Na temelju rada Christiana Grama, biolozi su razvili nove metode koje omogućuju ne samo određivanje oblika i veličine ćelija, već i razmatranje nekih detalja njihove strukture. Ponekad mikroorganizmi koji su potpuno identični po izgledu različito reagiraju na boje. Dobivene informacije omogućavaju brzo i precizno određivanje vrste bakterije.

Staro ne znači loše

Možda najpraktičnija i najčešće korištena metoda za bojenje mikroorganizama je Gramova metoda. Razmaz, fiksiran vatrom, prelije se metil violet bojom, fiksira jodom, osuši i ispere alkoholom. U ovoj fazi, ovisno o svojstvima stanične membrane, bakterije postaju:

• svijetlo plava (gram-pozitivna);
• bezbojni (gram negativni).

Debljina ljuske stanica koje ostaju bezbojne ne dozvoljava boji da prodre unutra, a lako se ispere s površine bakterije. Posljednji korak u bojenju po Gramu je upotreba crvene boje, koja ostaje na površini ćelijske membrane i daje joj ružičastu ili crvenu nijansu.

Gram-pozitivne bakterije su općenito opasne za ljude. U ovu kategoriju spadaju streptokoke, stafilokoke, bacile, klostridije itd. Gram-negativni nisu toliko opasni. Oni također mogu uzrokovati bolest i upalu, ali samo pod određenim uvjetima. Dakle, jednostavnom pripremom obojenog preparata, može se dobiti predodžbu o stepenu opasnosti od proučavanih mikroorganizama.

Vitalne metode bojenja

Prema stanju proučavanih organizama u mikrobiologiji razlikuju se:

• vitalna metoda, tj. rad sa živim bakterijama (opasan, zahtijeva strogo pridržavanje sigurnosnih mjera opreza);
• post-vitalna metoda – rad sa fiksnim (ubijenim) ćelijama;
• negativan, može biti vitalan i postvitalni, pogodan za rad sa kapsulama.

Vitalna metoda je daleko najopasnija, jer se istraživači moraju nositi sa živim ćelijama, ponekad smrtonosnim. Međutim, upravo ova metoda omogućava proučavanje ne samo strukture ćelije, već i cijelog njenog životnog ciklusa i interakcije s okolinom.

Za mnoga mikrobiološka istraživanja važno je održati bakterije u životu. To znači da je potrebno koristiti posebne netoksične ili niskotoksične boje, koje, osim toga, lako prodiru u staničnu strukturu kroz vanjsku ljusku. To su takozvane vitalne boje, za koje mogu biti namijenjene vidljivo svetlo ili fluorescentne. Prema hemijskom sastavu, boje se dijele na:

• bazični (akridin narandžasta, metilen plava);
• kiselo ili kiselo (indigo karmin, kiseli fuksin);
• neutralan (rodamin B).

Rad sa fiksnim lijekovima

Prema složenosti posla, metode bojenja fiksnih (neživih) ćelija dijele se na:

1. Jednostavne metode. U ovom slučaju koristi se samo jedna boja, obično crvena (magenta) ili plava (metilen plava). Razlika između ovih boja je brzina izlaganja. Fuchsin daje rezultat nakon 1-2 minute, dok se rezultat plave boje mora čekati 3-5 minuta. Pogodno je koristiti i rastvor fuksina u karbonskoj kiselini (tzv. Zielov fuksin) jer pripremljeni preparat ne gubi svojstva bojenja nekoliko meseci. Metilen plava boja se također može pripremiti unaprijed u jakom alkoholnom rastvoru.
2. Kompleksne (diferencijalne) metode. Za to će biti potrebno nekoliko boja (najmanje dvije), koje imaju različite boje. To će omogućiti ne samo da se vide bakterije, već i da se detaljnije prouči njihova unutarnja struktura, jer različiti dijelovi ćelije mogu različito percipirati boje. U složene spadaju metode Gram, Ziehl-Nielsen (za kiselo otporne bakterije), Benignetti (bojenje bakterijskih flagela), Gins (identifikacija kapsula), diferencirajuća metoda Romanovsky-Giemsa (bojenje spora) i neke druge.

Kompleksne metode su posebno važne za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, na primjer, Neisserova metoda mrlja pomaže u razlikovanju bacila difterije od lažne difterije.

Metoda razlikovanja Romanovsky - Giemsa temelji se na upotrebi specijalnog gotovog praha, na osnovu kojeg laboratorije pripremaju otopinu boje željene koncentracije. Prednost ove metode je u tome što citoplazma i jezgro ćelije dobijaju drugačiju boju, što olakšava identifikaciju i proučavanje mikroorganizama.

Neisserova metoda se koristi u medicini za otkrivanje zrna volutina (granule sa zalihama hrane za mnoge prokariotske stanice) u patogenima difterije. Kao rezultat bojenja, bakterija stječe žuta, a granule volutina su plave.

Bijelo na crnom

Druga vrsta bojenja bakterija temelji se na svojstvima negativa, odnosno bezbojne bakterije su jasno vidljive na tamnoj pozadini preparata, drugim riječima, boji se okolina, a ne sam organizam.

Ponekad bakterije, ulazeći u određena stanja, formiraju kapsule. To su mukozne formacije koje prekrivaju ćeliju, donekle slične gelu. Kapsule su prozirne, njihov hemijski sastav može jako varirati kod različitih vrsta bakterija, tj. samo obojite i procijenite rezultat prema rezultujućoj boji neće raditi.

Osim toga, kapsule su meke i krhke, mogu izgubiti svoj oblik kada se farbaju. Sredstva za bojenje ne komuniciraju dobro sa želeastom strukturom kapsula i lako se ispiru tokom obrade. Da biste otkrili, ali ne i oštetili kapsule, korisna je metoda negativnog bojenja.

Jedna od metoda za otkrivanje kapsula je Guinsova metoda bojenja. Kap crne tinte nanosi se na ivicu staklenog stakala, dodaje se ispitni materijal, miješa i raspoređuje po cijeloj površini. Razmaz se suši na vazduhu, fiksira i boji Ziehl magenta. Nakon 2-3 minute isperite vodom i osušite. Kao rezultat toga, ružičaste ćelije okružene prozirnim kapsulama jasno su vidljive pod mikroskopom na opštoj tamnoj pozadini.

Bojenje bakterija koje stvaraju spore

Ako govorimo o ćelijskim membranama, onda se ne možemo ne prisjetiti bakterija koje stvaraju spore. Spore se formiraju u nepovoljnim uslovima za ćeliju i mogu postojati u agresivnom okruženju dosta dugo. Ono što je dobro za očuvanje ćelije loše je za njeno proučavanje. Spore su vrlo guste i gotovo nepropusne za tekućine, osim toga, otporne su na kiseline. Stoga, jednostavna mrlja ili Gramova metoda će ostaviti spore bezbojnim.

Prije bojenja potrebno je kemijski tretirati površinu spora tako da malo promijeni svoju strukturu i omogući bojama da prodru unutra. U ovom slučaju, cijela citoplazma ćelije također je obojena. Za promjenu boje citoplazme, preparat se ispere i osuši. Boja u sporama, zbog njihove gušće strukture, zadržava se bolje nego u citoplazmi.

Metode bojenja spora mogu biti različite, na primjer, Orzeshko ili Ziehl-Nielsen, ali sve se svode na istu shemu:

• labavljenje površine spora hemikalije(kiseline, amonijak, kaustična soda);
• bojenje ćelije sporom (obično kada se zagrije);
• promjena boje citoplazme.

Kao rezultat, dobijamo savršeno vidljivu sporu jarke boje i blijedu, gotovo prozirnu citoplazmu.

Kako pregledati bakterijske flagele

Još jedan težak zadatak je bojenje bakterija flagelama. To su spiralno uvijene vrlo tanke niti koje mikroorganizmi koriste za kretanje. Flagele su neobično tanke; kada su obojene, lako se odvajaju od ćelije. Stoga se prije bojenja flagele urezuju, umjetno povećavajući volumen.

Prilikom pripreme mikroorganizama za ispitivanje, bakterijska kultura se subkulturi nekoliko puta na svježem hranjivom mediju nekoliko dana. Zatim se bakterije sa flagelama prenose u epruvetu sa sterilnom vodom (t 37⁰S). Radite to vrlo pažljivo, bez miješanja tekućine, kako ne biste oštetili flagele.

Sadržaj epruvete se ostavi oko sat vremena kako bi se bakterije ravnomjerno rasporedile po volumenu. Prije početka studije provjerava se pokretljivost ćelija u visećoj kapi. Ako nema kretanja, cijev se ostavlja još neko vrijeme.

Kada se rastvor nanese na predmetno staklo, ćelije mogu lako izgubiti svoje flagele. Stoga staklena površina mora biti savršeno čista i bez masnoće. Prije nanošenja kapi otopine, na vrući dio plamena gorionika se drži predmetno staklo kako bi se kapljice koje su pale na površinu raširile i brzo suše.

Nakon sušenja, razmaz se nagriza, nakon 15 minuta hemikalija se ispere. Sljedeća faza - bojenje fuksinom - provodi se uranjanjem stakla u otopinu boje kako se ne bi oštetile flagele prilikom nanošenja boje.

Nakon održavanja pravog vremena, bris se ispere vodom i osuši. Sada možete nastaviti s proučavanjem rezultirajućeg rezultata.

Tehnika bojenja

Da bi se dobio obojeni preparat, ne može se jednostavno uzeti kist, boje i uhvatiti bakterija. Postoji određena shema za rad s mikroorganizmima:

1. Priprema razmaza. Kap vode se nanosi na predmetno staklo (sterilno), u koje se zatim bakteriološkom petljom unosi laboratorijski materijal i raspoređuje po površini.
2. Sušenje. Višak tečnosti se ili suši prirodnim putem na sobnoj temperaturi, ili se razmaz lagano zagreva visoko iznad plamena gorionika.
3. Fiksacija. Nije dovoljno samo ukloniti vodu, potrebno je fiksirati bakterije na stakalcu. Da biste to učinili, možete koristiti vatru (nekoliko prolaza preko najtoplijeg dijela plamena) ili tekućinu (alkohol, aceton). Nakon takve obrade, mikroorganizmi brže upijaju boju.
4. Direktno bojenje. Boja treba u potpunosti pokriti cijelu površinu razmaza. Nakon što izdrži pravo vrijeme (za svaku boju svoju), boja se uklanja i preparat se ispere vodom.

Nakon sušenja (obično prirodno), rezultat se može koristiti za namjeravanu svrhu.

Bojenje mikroorganizama je čitav sistem metoda, tehnika, shema koje imaju za cilj otkrivanje i prepoznavanje ćelija pomoću mikroskopa. Bez medicinskog istraživanja ili naučni rad u mikrobiologiji ne mogu bez prethodne pripreme i bojenja materijala koji se proučava.

Bojenje mikroorganizama (bojenje mikroba) je skup metoda i tehnika za proučavanje spoljašnjih i unutrašnja struktura mikroorganizmi, metoda mikrobiološke tehnologije koja omogućava razlikovanje vrsta mikroorganizama. Metoda se široko koristi u primijenjenoj bakteriologiji za određivanje oblika, veličine, strukture, lokalizacije, relativnog položaja mikroba i strukture njihovih organela. Bez bojenja, mikrobi su, osim nekih gljivica, praktički nevidljivi u svjetlosnom mikroskopu, zbog niskog kontrasta. Nakon tretmana, membrane i/ili organele mikroba dobijaju boju koja je u kontrastu s pozadinom.

// Opće informacije o metodi

Mikrobni preparati su izloženi hemijskim reagensima, obično bojama ili osmijum tetroksidu. Kao rezultat fizičko-hemijskog procesa interakcije boje sa hemijska jedinjenja predmeta, kako bi mu se umjetno dala određena boja, postaje moguće odrediti vrstu mikroorganizma, ili barem vrstu njegove membrane (vidi Gramova boja).

Metode bojenja dijele se na vitalne, post-vitalne i negativne, potonje mogu biti vitalne i post-vitalne.

Vitalna metoda bojenja

Za vitalno (vitalno) bojenje koriste se 0,2-0,001% vodeni rastvori metilenskog i toluidin plavog, neutralnog i kongo crvenog, koji se dodaju u presovanu ili viseću kap kulture. Ovom metodom se otkrivaju spirohete, protozoe, utvrđuje se pokretljivost bakterija, imunološki otok kapsule, ali njena upotreba zahtijeva strogo poštivanje pravila koja isključuju laboratorijsku infekciju.

Metode postvitalnog bojenja

Metode bojenja fiksnih preparata (postvitalnih) dijele se na jednostavne i složene. Jednostavnim metodama na fiksirani preparat se nanose otopine za bojenje Pfeiffer fuksina (ekspozicija 1-2 minute), alkalnog metilenskog plavog (3-5 minuta) tako da potpuno prekrije razmaz, boja se ocijedi, preparat ispere sa mlaz vode, protresen, osušen i mikroskopiran.
Simple Ways omogućavaju suđenje o veličini, obliku, lokalizaciji, međusobnom rasporedu pojedinih ćelija, ali je uz njihovu pomoć nemoguće utvrditi strukturu mikroba i često njihov diferencirani odnos prema bojama.
Od kompleksnih metoda bojenja bakterija, diferencirana Gramova metoda, detekcija kiselinske rezistencije po Ziehl-Nelsonu, određivanje zrna volutina prema Leffleru ili Neisseru, diferencirajuća metoda Romanovsky-Giemsa, negativno-pozitivna metoda za određivanje kapsula prema Gins-Burriju, detekcija spora prema Peškovu ili Zielu - Nelsonu i drugi.
Za bojenje protozoa koristi se metoda Romanovsky-Giemsa i bojenje hematoksilin-eozinom.
Gljive se ispituju bez boje ili metodama Gram, Ziel - Nelson, Leffler, Romanovsky - Giemsa, kao i Lugolov rastvor, laktofuksin itd.

Gramova metoda je metoda bojenja mikroorganizama za istraživanje, koja omogućava razlikovanje bakterija prema biokemijskim svojstvima njihovog ćelijskog zida. Predložio ga je 1884. danski doktor G.K. Gram.

Prema Gramu, bakterije se boje glavnim bojama - encijan ili metil violet itd., zatim se boja fiksira otopinom joda. Nakon naknadnog pranja obojenog preparata alkoholom, one vrste bakterija za koje se ispostavi da su jako obojene nazivaju se gram-pozitivnim bakterijama – za razliku od gram-negativnih (Gram (-)), koje pri pranju obezboje.

// Upotreba u dijagnostici

Boja po Gramu ima veliki značaj u taksonomiji bakterija, kao i za mikrobiološku dijagnostiku zaraznih bolesti.

Gram-pozitivni kokni i sporonosni oblici bakterija, kao i kvasac, obojeni su u plavo-crnu (tamnoplavu) boju.

Mnoge bakterije koje ne nose spore su gram-negativne, obojene su u crveno, jezgra stanica postaju svijetlocrvena, citoplazma postaje ružičasta ili grimizna.

Tehnika bojenja

Boja po Gramu se odnosi na složenu metodu bojenja kada se razmaz izloži dvjema bojama, od kojih je jedna glavna, a druga dodatna. Osim boja, sredstva za izbjeljivanje koriste se za složene metode bojenja: alkohol, kiseline itd.

Za bojenje po Gramu najčešće se koriste boje trifenilmetanske grupe: encijan, metil ljubičasta ili kristalno ljubičasta. Gram-pozitivni Gram (+) mikroorganizmi daju jaku vezu sa naznačenim bojama i jodom. Istovremeno, ne mijenjaju boju kada su izloženi alkoholu, zbog čega, uz dodatno bojenje fuksinom Gram (+), mikroorganizmi ne mijenjaju prvobitno usvojenu ljubičastu boju.

Gram-negativni gram (-) mikroorganizmi formiraju spoj koji se lako uništava alkoholom s bazičnim bojama i jodom. Kao rezultat toga, mikrobi postaju obojeni, a zatim obojeni magenta, postajući crveni.

Priprema materijala za farbanje

Ispitni materijal se raširi u tankom sloju preko površine dobro odmašćenog staklenog tobogana. Pripremljeni razmaz se suši na vazduhu i fiksira nakon potpunog sušenja. Histološki rezovi se pripremaju rutinskom tehnikom, fiksiranjem komada tkiva u formalin i ugradnjom u parafin.

Fiksacija

Prilikom fiksiranja, razmaz se fiksira na površini predmetnog stakla, pa se pri naknadnom bojenju preparata mikrobne ćelije ne ispiru. Osim toga, ubijene mikrobne ćelije bolje se boje od živih.

Pravi se razlika između fizičke metode fiksacije, koja se zasniva na dejstvu visoke temperature na mikrobnu ćeliju, i hemijskih metoda koje podrazumevaju upotrebu hemikalija koje izazivaju koagulaciju citoplazmatskih proteina.

Fizički način fiksiranja

Stakleno staklo sa preparatom uzima se pincetom ili I i II prstima desne ruke za rebra potezom prema gore i laganim pokretom 2-3 puta preko gornjeg dela plamena gorionika. Cijeli proces fiksacije ne bi trebao trajati više od 2 s.

Pouzdanost fiksacije provjerava se sljedećom metodom: površina staklenog stakalca slobodna od mrlje nanosi se na stražnju površinu lijeve ruke. Uz pravilnu fiksaciju razmaza, staklo bi trebalo biti vruće, ali ne izaziva osjećaj opekotina.

Hemijska metoda obavezuje

Za fiksiranje razmaza, metil alkohol, aceton, mješavina Nikiforova (mješavina etil alkohola 96% i anestetičkog etra u omjeru 1:1), Carnoyeva tekućina (etil alkohol 96% - 60%, kloroform 30%, glacijalni sirćetna kiselina 10%), alkohol-formol (40% formalin 5 ml, etil alkohol 96° - 95 ml). Stakalna pločica sa osušenim razmazom uroni se u bocu sa fiksativom na 10-15 minuta, a zatim se suši na zraku. Koristi se i fiksacija u 40% para formalina u trajanju od nekoliko sekundi.

Proces bojenja

Jedna od glavnih boja se sipa na fiksni razmaz 2-3 minute. Da biste izbjegli padavine, probojite kroz filter papir.

Ocijedite boju, pažljivo uklonite filter papir. Razmaz se puni Lugolovim rastvorom ili rastvorom Gramovog jodida (vodeni rastvor kalijum jodida i kristalnog joda u odnosu 2:1) 1-2 minuta dok preparat ne pocrni.

Otopina se ocijedi, bris se ispere 96° etil alkoholom ili acetonom, sipa i cijedi dok razmaz ne promijeni boju i tekućina koja teče ne postane bistra (otprilike 20-40-60 sekundi).

Temeljno isperite stakalce u tekućoj ili destilovanoj vodi 1-2 minute.

Za identifikaciju gram-negativne grupe bakterija preparati se dodatno boje fuksinom ili safraninom (2-5 min).

Isperite u tekućoj vodi i osušite filter papirom.

Tehnika bojenja bakterija u histološkim rezovima prema Gram-Weigertu

Deparafinizovani delovi se donose u vodu.

Boje se 20 minuta u 1% rastvoru pararosanilina ili baznog fuksina u 1% sirćetna kiselina(rastvor boje se zagreva do ključanja, ohladi i filtrira).

Opran u 3 promjene destilovane vode.

Bojite 5 minuta u 1% kristalno ljubičastom u destilovanoj vodi.

Brzo isperite u 1% rastvoru natrijum hlorida.

Tretirati 30 sekundi u mješavini: 1 dio joda + 2 dijela kalijum jodida + 100 dijelova destilovane vode.

Navlažite filter papirom.

Razlikujte nanošenjem mješavine na posjekotinu jednake zapremine anilin i ksilen (1 - 2 ml); rastvori se odvode sve dok se oblaci boje ne prestanu udaljavati od reza.

Prođite kroz 3 smjene ksilena

Zatvoren u balzam ili bilo koju smolu otopljenu u ksilenu.

Rezultat: Gram-pozitivne bakterije su plavo-crne, fibrin je ljubičasti, jezgra su crvene.

Metoda Peshkov se koristi za bojenje endospora bakterija.

Tehnika bojenja

Osušeni preparat iz kulture gram-pozitivnih bakterija fiksira se u Karnojevoj tečnosti 15 minuta, zatim ispere vodom, sipa se metilensko plavo po Leffleru i zagreva do pojave para, kuva 15-20 minuta, nakon hlađenja preparat se oprati i bojiti 0,5% vodenim rastvorom neutralne crvene ili magenta prema Pfeiferu 30-60 sekundi. Osušite filter papirom i mikroskopom.

Rezultat bojenja

Kao rezultat toga, zrele endospore su obojene u plavo, mlade endospore su obojene u tamnoplavu boju, citoplazma je crvena, a zrna hromatina su obojena u ljubičastu boju.

Ziehl-Nelsenova metoda bojenja je metoda bojenja mikroorganizama za otkrivanje mikobakterija otpornih na kiseline (uzročnika tuberkuloze, mikobakterioze, lepre), aktinomiceta i drugih mikroorganizama otpornih na kiseline. Otpornost mikroorganizama na kiseline je posljedica prisustva lipida, voska i hidroksi kiselina u njihovim stanicama. Takvi mikroorganizmi se slabo boje razrijeđenim otopinama boja. Da bi se olakšalo prodiranje boje u ćelije mikroorganizama, fenolni fuksin Tsilya koji se nanosi na preparat zagrijava se na plamenu plamenika. Obojeni mikroorganizmi ne mijenjaju boju slabim otopinama mineralnih kiselina i alkohola.

Metoda je dobila ime po njemačkim ljekarima - mikrobiologu Franzu Zielu (1857-1926) i patologu Friedrichu Nelsenu (1854-1898), koji su je razvili 1882-1883.

Koraci bojenja

1. Fiksni razmaz se prekriva ravnim filter papirom i na njega se izlije Ziehl-ov fenol fuksin. Razmaz se zagrijava na plamenu plamenika dok se ne pojave pare, zatim se odvodi na hlađenje i dodaje se novi dio boje. Zagrijavanje se ponavlja 2-3 puta. Nakon hlađenja uklonite filter papir i isperite preparat vodom.

2. Lijek se obezbojava potapanjem ili nanošenjem 5% rastvora sumporne kiseline ili 3% hlorovodoničnog alkohola i nekoliko puta se ispere vodom.

3. Obojite preparate vodeno-alkoholnim rastvorom metilen plavog 3-5 minuta, isperite vodom i osušite.

Kada se boje po Ziehl-Nelsen metodi, bakterije otporne na kiseline postaju intenzivno crvene, ostatak mikroflore je obojen svijetlo plavom bojom.

Bojanje po Romanovsky-Giemsa je citološka metoda za bojenje protozoa, bakterija, staničnih struktura i tkiva različitih tipova (uključujući krv) pomoću svjetlosne mikroskopije. Boji acidofilne formacije u raznim nijansama crvene, bazofilne u bojama od ljubičaste do plave.

// Priprema boje

Prije bojenja razmaza, gotova tečna boja se razrjeđuje brzinom od 1-2 kapi boje na 1 ml destilovane vode. Razmazi se boje 20 - 25 minuta na 37°C u vlažnoj komori (zatvorena Petrijeva posuda sa navlaženim filterom na dnu). Nakon bojenja, brisevi se ispiru tekućom vodom, suše na zraku i pregledavaju potapanjem u ulje.

Mješavina za bojenje Romanovsky-Giemsa, koja se temelji na boji Romanovsky Wrighta, u obliku praha (komercijalne boje) otopljena je u mješavini jednakih količina metil alkohola i glicerina (800 mg boje na 100 ml rastvarač). Boja se slabo otapa, pa ju je bolje samljeti otapalom u količini od 300 mg na 100 ml, a zatim, miješajući, dodati boju dok se ne dobije željena koncentracija. Priprema boje često traje nekoliko dana. Važno je koristiti hemijski čisti metil alkohol i glicerin kao rastvarače, jer nečistoće degradiraju svojstva boje. Umjesto metil alkohola može se koristiti 100% etil alkohol. Pripremljena mešavina za bojenje čuva se na hladnom i suvom mestu u dobro zatvorenoj posudi.

tehnika bojenja

Razmazi fiksirani u metil alkoholu se boje rastvorom (1 ml gotove tečne boje + 2 ml osnovnog puferskog rastvora + 47 ml destilovane vode) 40-120 minuta (trajanje bojenja se bira empirijski). Koriste fosfatni pufer, ali pH pufera zavisi od vrste razmaza: za bris koštane srži - 5,8 - 6,0, za bris krvi - 6,4 - 6,5, za detekciju protozoa - 6,8, malarijski plazmodijum - 7 , 0 - 7.2.

Isperite u destilovanoj vodi, osušite i pregledajte potapanjem.

Rezultat boje

Bakterije boje ljubičasto crveno, ćelijska citoplazma plavo, jezgra crveno. Prilikom bojenja protozoa, njihova citoplazma postaje plava, a jezgra postaju crveno-ljubičasta.