Генотоксичността, т.е. увреждащият ефект на определено съединение върху генома, и канцерогенността са свързани явления. Методът на ДНК кометата позволява да се оцени степента на увреждане на геномната ДНК както в експеримента, така и в научни цели, а при решаване на практически задачи: оценка на въздействието околен святили условия на работа, контрол на трансплантационния материал по време на размразяване, в тъканното инженерство. Увреждането на ДНК, открито чрез ДНК кометен тест, може да показва както предразположение към онкология, така и промените, свързани с нея. Увеличаването на увреждането на ДНК, открито от ДНК комети, е характерно за туморните клетки. И въпреки че през десетилетията от неговото развитие методът е широко разпространен само в специализирани области, той може да намери приложение в диагностиката и проследяването на лечението на различни заболявания. Предимствата на ДНК кометите са чувствителност, ниски изисквания за количество материал, бърз протокол на работа, относителна простота и ниска цена.

За изследване се използва методът на ДНК кометите различни видовеклетки, както в култура, така и в проби от биологични течности и тъкани. Основното изискване за анализ на ДНК комети е прехвърлянето на тъканни клетки в суспензия, следователно при дисекция на лабораторни животни отстранените фрагменти от органи трябва да бъдат подложени на подходяща обработка и клетките, съдържащи се в кръвта или спермата, могат да бъдат изследвани директно. 80% от злокачествените новообразувания са с епителен произход. Епител, изложен както на външни, така и на външни влияния вътрешна средаорганизмите са най-подходящи за оценка на генотоксичността чрез ДНК кометния метод. Неинвазивен метод за получаване на човешки епителни клетки е намазка от епитела на устната кухина и селекция на ексфолиативен материал от епитела на слъзния канал. Оралните епителни клетки живеят 10-14 дни и наличието на увредена ДНК в тях показва скорошно излагане на генотоксично съединение. Изследванията на целостта на ДНК на оралния епител могат да помогнат за проследяване на ефектите на веществата, свързани с професионална дейности хранителни продукти.

Клетките, поставени в агароза върху стъкло, се третират с лизиращ разтвор и, ако е необходимо, с ензими, специфични за определени заболявания. Разделянето се извършва в алкален буфер. ДНК излиза от клетката и се придвижва до анода, образувайки струя, която може да се види с помощта на флуоресцентен микроскоп. Колкото повече прекъсвания има в ДНК, толкова по-изразено е движението на нейните фрагменти. След процедурата слайдовете се неутрализират и оцветяват с интеркалиращи багрила за визуализация на ДНК. ДНК електрофоретичната подвижност се оценява с помощта на флуоресцентен микроскоп. Когато практически цялото ДНК на една клетка е фрагментирано, това обикновено е мъртва клетка. Ако единични клетки имат такава степен на увреждане на генома, те се изключват от анализа.

Най-често използваният протокол за алкална ДНК комета (разделяне при pH > 13) позволява откриване на едноверижни скъсвания, кръстосани връзки в ДНК и между ДНК и протеини. Използването на алкална обработка по време на подготовката на пробата повишава чувствителността на метода, тъй като повечето генотоксични агенти не въвеждат двойно верижно прекъсване в ДНК веригата, а образуват едноверижни прекъсвания или региони с свръхчувствителносткъм алкали. Освен това се използват ензими, които въвеждат прекъсвания в ДНК области със специфично увреждане. Формамидопиримидин ДНК гликозилазата разрязва ДНК вериги в областта на окислени нуклеотиди, формамид пиримидини (аденин и гуанин с отворен пръстен) и други гуанинови производни; OGG1 открива окислени пурини и формамидопиримидини, ендонуклеаза III открива окислени пиримидини, Т4 ендонуклеаза V разпознава пиримидинови димери, 3-метиладенин ДНК гликозилаза II (AlkA) е специфична за 3-метиладенин; и урацил ДНК гликозилаза открива урацил, погрешно вмъкнат в ДНК. Такива протоколи за обработка на материала може да са необходими за решаване на специфични проблеми, например съдържанието на окислени пиримидини и Т4 места на ендонуклеаза V се увеличава в замразени тъкани, докато други смущения не се наблюдават. Методът на ДНК комета с подходящо ензимно третиране може да се използва за оценка на състоянието на присадката преди трансплантация.

Една от областите на клиничната диагностика, в която се използва ДНК комет технологията, е диагностиката на мъжкото безплодие. Поради структурата на сперматозоида, рискът от увреждане на структурата на ДНК в тези клетки се увеличава и възстановителните системи не компенсират напълно възникналите нарушения. При мъжкото безплодие се наблюдава повишена степен на увреждане на ДНК на сперматозоидите. Броят на разкъсванията на ДНК в сперматозоидите обикновено достига ~10 6 - 10 7 на геном, както при хора, така и при лабораторни мишки, което е много по-висок от броя на разкъсванията на генома в лимфоцитите или клетките на червения костен мозък. Оплождането със сперматозоид, съдържащ увреждане на ДНК, активира възстановителните процеси в овоцита, които възстановяват тези увреждания, но рискът от мутации и вродени заболявания при детето се увеличава. Честотата на спонтанните аборти корелира със степента на увреждане на ДНК на спермата. Това е свързано с повишена честота на вродени заболявания и нарушения в развитието при деца с ICSI.

Методът на ДНК комета се използва не само за оценка на състоянието на ДНК, но и за изследване на процесите на възстановяване в клетките. В този случай изследваните клетки се унищожават и полученият хомогенат се обработва от ДНК, в която предварително се въвежда увреждане от определен тип, към сместа се добавят нуклеотидите и ATP, необходими за възстановяване. Способността на хомогената да възстановява определени щети се използва за преценка на активността на възстановителните системи в клетките. Типът увреждане, което се въвежда в ДНК, зависи от това кой механизъм за възстановяване се изследва. Например, увредена от светлина ДНК, съдържаща 8-оксогуанин, се използва за оценка на базовата ексцизионна поправка, а UV-облъчена ДНК, съдържаща пиримидинови димери, се използва за нуклеотидна ексцизионна поправка. Едноверижни разкъсвания се въвеждат чрез третиране с водороден прекис, рентгеново или гама облъчване, алкилирането на ДНК се извършва чрез третиране с метил метансулфонат. За изследване на възстановяването чрез изрязване на нуклеотиди се използва оценка на натрупването на разкъсвания на ДНК, когато се блокират полимеразите, участващи в този процес, като се използва афидоколин или арабинозид цитозин в комбинация с хидроксиурея.

Анализът на експресията на гени, свързани с възстановяването, не винаги може да бъде обективен индикатор за състоянието на ДНК в клетките; следователно методът на ДНК кометите позволява да се получи ценен Допълнителна информация. Повишената активност на възстановителните системи показва не само, че клетките са по-устойчиви на увреждане на генома, но и че са изложени на генотоксичен агент, в резултат на което се активира синтеза на протеини, участващи в възстановяването. Хранителна добавка с Q10, витамин С в бавноразтварящи се капсули, повишава основната активност на възстановяване на ексцизията. Подобен ефект се наблюдава, ако вместо лекарства се използват плодове и зеленчуци, богати на антиоксиданти. Това намалява активността на системата за възстановяване на нуклеотидната ексцизия, тъй като тя вече не е необходима.

Микронуклеарният тест е директен индикатор за канцерогенност, насоките на ICH препоръчват използването му в комбинация с кометна ДНК. Методът ДНК комета може да се комбинира с флуоресцентна хибридизация FISH, за да определи дали промените засягат определени региони на генома. За анализ на голям брой ДНК струи, получени в резултат на процедурата на ДНК комета. препоръчват се автоматизирани решения. Това ще намали субективизма на оценката и ще оцени по-точно размера и формата на получените струи, което е особено важно предвид необходимостта от събиране на данни за голям брой струи във всеки препарат. Кометната ДНК може да се използва като метод за клинична диагностика и за изследователски цели - за оценка на генотоксичността на дадено съединение.

1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Последните постижения в тестовете за генотоксичност in vivo: прогнозиране на канцерогенен потенциал с помощта на кометен и микронуклеарен анализ при животински модели / J Cancer Prev. - 2013. Т.18, N.4. - С. 277-88.
2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Епителните клетки като алтернативни човешки биоматрици за кометен анализ / Front Genet. - 2014. V5. № 386.
3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O "Neill Gaivão I, Collins A. Кометен анализ за измерване на възстановяването на ДНК: подход и приложения / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Източникът и значението на увреждането на ДНК в човешките сперматозоиди; коментар върху диагностичните стратегии и заблудите на човечеството / Mol Hum Reprod. - 2013. - Т.19. N.8. - С. 475-85.

Оценка на въздействието на гама лъчите върху ДНК на лимфоцит чрез метода на ДНК комета. Микрофотографии (A) и обработени изображения (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Оценка на кометния анализ за оценка на връзката доза-отговор на ДНК Щети, причинени от йонизиращо лъчение / Int. J. Mol. наука - 2013. - Т.14. N.11. - P.22449-22461.

Ефектът на водородния пероксид върху ДНК на спермата на мидиХоромитилов хор

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Оценка на геномната цялост в спермата на Choromytilus chorus (Molina, 1782) чрез кометен анализ / Gayana. - 2008. - Т.72. N.1. - С.36-44.

Методът на едноклетъчната гел електрофореза или ДНК кометният метод е с висока чувствителност и осигурява висока достоверност на получените резултати, като в същото време е относително лесен и бърз за изпълнение, а също така е международно стандартизиран (OECD No. 489). Този метод е най-обещаващият за решаване на следните проблеми:

Биомониторинг на хората и околната среда, т.е. идентифициране на последствията от индуцирана мутагенеза, когато човек влезе в контакт с ксенобиотици (лекарства, хранителни добавки, пестициди, парфюми и козметика, домакински химикали, както и най-често срещаните вода, въздух и промишлени опасности, наноматериали);

Изследвания в областта на онкологията;

Изследвания на системи за възстановяване на ДНК;

Методът се основава на регистриране на различна подвижност в постоянно електрическо поле на увредена ДНК и/или ДНК фрагменти от отделни лизирани клетки, затворени в тънък агарозен гел върху стандартно предметно стъкло. В същото време клетъчната ДНК мигрира, образувайки електрофоретична следа, визуално наподобяваща "опашка на комета", чиито параметри зависят от степента на увреждане на ДНК. След завършване на електрофорезата предметните стъкла се оцветяват и анализират с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Получаването на изображения и обработката на данните се извършва с помощта на хардуерно-софтуерен комплекс, който включва високочувствителна камера, комбинирана с микроскоп, и специализиран софтуер.

Универсалният интелигентен софтуер, включен в този комплекс, осигурява:

Автоматизираният анализ на изображения на ДНК комети "едно натискане на клавиш", включва всички основни параметри на измерване, включително % ДНК в опашката на кометата;

- висока възпроизводимост;

Анализът на параметрите на ДНК кометите се извършва както в режим "в реално време", така и от съхранени цифрови изображения;

Програмата обработва данните и ги показва под формата на протокол в съответствие с международните изисквания на GLP;

Анализ и сравнение на данни;

Програмата е напълно валидирана и отговаря на международните изисквания за GLP. Има йерархична система за достъп и защита на данните.

Комплектът включва:

1. Луминесцентен биомедицински микроскоп Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50W епи-флуоресцентна осветителна система, комплекти филтър-дихроични огледални филтри за багрила DAPI, FITC, TRITC.

3. Монохромна CCD IEEE1394 FireWire камера за луминесценция. Basler Scout scA1300-32fm. Размер на пиксела - 3.75 µm x 3.75 µm. Резолюция - 1296 px x 966 px. Размер на сензора 1/3 инча. Матрица - Sony. Пренос на данни през високоскоростен порт - 1394 BUS. Скорост на кадрите при максимална резолюция - 32 кадъра / сек. Осигурява работа с обекти в реално време

4. Comet Assay IV - софтуерен пакет за Windows с генератор на електронни таблици за Microsoft Excel, за работа с монохромна CCD IEEE1394 FireWire видеокамера в реално време (възможни са измервания и анализ както на видео поток, така и на снимки), инструкция ръководство и CD за инсталиране и валидиране на програмата.

5. Едногодишен лиценз за четирима потребители.

6. Дистанционно обучениечрез интернет мрежа от четирима потребители.

Допълнително се предлагат:

1. Оператор на данни за използване на Comet Assay IV в XML версии на бази данни за търсене, филтриране и извличане на данни и одит чрез защитена база данни на Oracle, запазена във формат на електронна таблица на MS Excel. Включва възможност за преглед на автоматично запазени изображения, подписи, архивирани данни и данни от автоматичен одит. Освен това включва възможност за експортиране на неподписани и цифрово подписани данни в XML формат. Включва само Crypto-Key-Prove за преглед на цифрово подписани данни в различни формати.

2. Мениджърски достъп до GLP системата. Access Manager е програма за контрол и управление на достъпа на служители до бази данни. Унифицирана система за PI генетична токсикология. Включва цялостен одит на системата. Външен одит. Администриране на потребителски акаунти и потребителски дейности, свързани с програми, достъп, пароли, ревизии и др. Използва Oracle за сигурна защита на потребителите и данните за одит. Пълно съответствие с окончателните правила на FDA 21 CFR част 11 за електронни записи и електронни подписи.

3. Обучение за единичен потребител, базирано на инструменти на Perceptive в Обединеното кралство

Методът се състои в това, че от биологичен препарат, монтиран на флуоресцентен микроскоп с видеокамера, в компютър се въвежда изображение с кометоподобни обекти - "комети", които представляват набор от слети и отделни флуоресцентни точки с различна яркост. След това тези "комети" се търсят в изображението, контурът им се разграничава с дефиниране на границите на "главата" и "опашката" и се извършва микроскопска морфометрия. Преди търсене на „комети“ в изображението, нивата на яркост на изображението се оптимизират и се извършва нискочестотно филтриране, за да се комбинират отделни точки от „комети“ в размазани области. След това се извършва сегментиране на полученото изображение въз основа на прага на яркост, дефиниран като отместване спрямо фона, намиране на контурите на „комети“ чрез запълване на ограничена област „със семе“, където семето е произволна точка, принадлежаща на "комета", намиране на центъра на главата на всяка "комета", чрез определяне на центъра на тежестта на точки с интензитет на светене, близък до максимума. Определянето на виртуалната граница на "главата" и "опашката" се извършва от огледално отражениеразпределение на интензитетите на светене на точките на предната част на главата на кометата, след което се извършва микроскопска морфометрия на "кометите" чрез измерване на: дължината на "кометата", "опашката", диаметъра на главата". След това се изчислява процентът на ДНК в цялата "комета", в "опашката" и мерките за увреждане на ДНК. Тези операции се извършват автоматично, едновременно върху всички "комети" в поредица от изображения. Техническият резултат е повишаване на точността и скоростта на обработка и анализ на изображения на "комети".

Методът за обработка и анализ на изображения на кометоподобни обекти, получени по метода "ДНК-комети" (comet assay или single cell gel electrophoresis - SCGE), в биологичните препарати, се отнася до областта на обработката и анализа на изображения на обекти - "комети" и е предназначен за компютъризиране (автоматизиране) на процеси на морфометрични изследвания в областта на биомедицината, извършвани за определяне на степента на увреждане на ДНК молекулите, причинени от различни агенти на околната среда, за изследване на възстановяването на ДНК молекули на ниво единични клетки, за оценка на интегралната цялост на генома, за определяне на индивидуалната радиочувствителност на пациенти с рак, подложени на лъчева терапия, за биоиндикация на крайбрежни морски води, с други думи, за наблюдение на широк спектър от увреждане на ДНК, причинено от мутагенни фактори на околната среда.

Изображенията на „кометите“ са набор от слети и отделни флуоресцентни точки с различна яркост, получени чрез гел електрофореза на лизирани единични клетки (метод „ДНК-комети“), поради което не е възможно да бъдат обработени и анализирани чрез методи, предназначени за изображения на обикновени (твърди) предмети.

Понастоящем изображенията на "ДНК комети" се анализират или чрез визуално наблюдение под флуоресцентен микроскоп и тяхното диференциране според степента на увреждане на ДНК, или с помощта на компютърни инструменти за обработка на изображения.

При визуален анализ (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for the determination of photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), стр.44-57) "ДНК комети" са класирани в пет условни типа със съответните цифрови стойности от 0 до 4. Степента на увреждане на ДНК се изразява с индекса "ДНК комети" (I dna), определя се по формула

И ДНК =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/,

където n 0 -n 4 е броят на "ДНК комети" от всеки тип, е сумата от преброените "ДНК комети".

Този метод на обработка и анализ е много времеемък, субективен, има само пет нива на диференциация градация "ДНК-комети" и следователно има ниска точност, а оттам и ниската надеждност на резултатите.

Най-близо до предложеното техническо решение е методът за компютърен анализ на изображения "ДНК комети", реализиран в софтуер SCGE-Pro (вижте Chaubery R.C. Компютърен софтуер за анализ на изображения за кометния анализ. Методи в молекулярната биология 2005; 291:97-106), взет като прототип. Този метод за анализ на "кометите" е по-малко трудоемък и е особено необходим за обективна оценка на техните параметри (например дължината на "кометата", дължината на "опашката", диаметърът на "главата", процентДНК в "главата" или "опашката" и т.н.), които се използват като индикатори, характеризиращи нивото на увреждане на ДНК в изследваните клетки. Методът позволява да се откриват "комети" в изображението и да се изчисляват параметрите им както ръчно, така и автоматично.

Недостатъкът на известния метод е методът за определяне на границите на "кометата" с помощта на правоъгълна област, което намалява точността на изчисляване на параметрите, необходими за оценка на увреждането (особено ако увреждането е леко) на ДНК, тъй като в това случай, смущенията, които са наблизо, също могат да бъдат приписани на кометата. В допълнение, с този метод на анализ, границата на „главата“ и „опашката“ се определя като права линия, перпендикулярна на оста на „кометата“ и разделяща кометата на „глава“ и „опашка“, което значително намалява точността на изчисляване на дължината на "кометната опашка" и процента на ДНК в "главата" и в "опашката".

Техническият резултат от изобретението е да се повиши точността и скоростта на обработка и анализ на изображения на "комети", получени по метода "ДНК-комети", включително филтриране, сегментиране на "комети", подчертаване на техния контур с дефинирането на граница на "главата" и "опашката", което позволява да се повиши надеждността на резултатите от микроскопската морфометрия, необходима за компютъризация на процесите на биометрични изследвания, извършвани при наблюдение на широк спектър от увреждания на ДНК, причинени от различни мутагенни фактори на околната среда.

Техническият резултат се постига чрез факта, че методът за обработка и анализ на изображения на кометоподобни обекти, получени по метода "ДНК-комети", се състои в това, че се въвежда изображение с кометоподобни обекти - "комети". в компютър от биологичен препарат, инсталиран на флуоресцентен микроскоп с видеокамера, представляващ набор от обединени и отделни флуоресцентни точки с различна яркост, те търсят тези „комети“ в изображението, избират контура им с дефинирането на границата на „главата“ и „опашката“, извършват микроскопична морфометрия, докато преди търсенето на „комети“ в изображението се извършва оптимизиране на нивата, яркост на изображението и нискочестотно филтриране, за да се комбинират отделни точки от „комети“ в размазани области , след което се извършва сегментиране на полученото изображение на базата на прага на яркост, дефиниран като отместване спрямо фона, намиране на контурите на „комети“ чрез запълване на ограничена област „със семе“, намиране на централната „глава“ на всеки „ комета“, като дефинира разделяне на центъра на тежестта на точки с интензитет на светене, близък до максимума, определяне на виртуалната граница на "главата" и "опашката", чрез огледално отразяване на разпределението на интензитетите на светене на точките от предната част на " глава на комета”, след което се извършва микроскопска морфометрия на “кометите”, чрез измерване на: комета”, “опашка”, диаметър на “главата” и изчисляване на процентното съдържание на ДНК в цялата “комета”, “в опашката”. ", мерки за увреждане на ДНК и много други параметри, характеризиращи степента на увреждане на ДНК в зависимост от решавания проблем, като изброените операции се извършват автоматично, едновременно над всички "комети" в изображението или серия от изображения.

Методът се осъществява чрез извършване на последователност от следните процедури:

1. Въвеждане в компютър от биологичен препарат, монтиран на флуоресцентен микроскоп с видеокамера, на изображения с кометоподобни обекти - "комети", които представляват набор от слети и отделни флуоресцентни точки с различна яркост.

2. Оптимизиране на нивата на яркост на изображението. Нулева яркост е фонът, максималната яркост е центърът на главата на "кометата".

3. Извършва се Гаусово нискочестотно филтриране (замъгляване) с голям радиус, равен на 1/10 от радиуса на средната "комета", за да се комбинират отделни точки от "комети" в замъглени области. За да се предотврати сливането на „комети“, които са близо една до друга, се използва интерактивно регулиране на радиуса на замъгляване.

4. Сегментирането на получените замъглени области се извършва въз основа на прага на яркост. Прагът се определя автоматично като отместване спрямо фона (в изображението няма странични включвания и други обекти, освен „комети“), но прагът може да се коригира интерактивно.

5. Намиране на контурите на "комети" чрез запълване на ограничена област "със семе", където семето е произволна точка, принадлежаща на "кометата".

Намиране на центъра на главата на кометата. Могат да се използват два метода за определяне: чрез максималното разпределение на интензитета на светене на точките на „кометата“ по хоризонталната ос или чрез центъра на тежестта на точки с интензитет на светене над 80% от максимума.

Определяне на виртуалната граница на "главата" и "опашката", чрез огледално отразяване на разпределението на интензитетите на светене на точките от предната част на "главата на кометата" (предната част е частта до предната граница на "глава на комета").

Извършване на микроскопска морфометрия на "комети" чрез измерване на: дължината на "кометата", дължината на "опашката", диаметъра на "главата" и изчисляване на процента на ДНК в цялата "комета", "в опашката" ", мерки за увреждане на ДНК и много други параметри, които характеризират степента на увреждане на ДНК, в зависимост от задачата, която се решава.

9. Извеждането на стойностите на получените параметри на всяка комета се извършва в таблицата на MS EXCEL, за да се приложи декларацията за задача на потребителя, например за по-нататъшно Статистически анализили класификация на "комети" според степента на увреждане на структурата на ДНК.

По този начин, в предложения метод, всяка област на кометата се определя от техния сложен контур, което повишава точността на изчисляване на параметрите, за разлика от известния метод, където границите на "кометите" се определят с помощта на правоъгълна област, което намалява точността на изчисляване на параметрите, необходими за оценка на щетите (особено ако щетите са слабо изразени) "ДНК-комети", тъй като в този случай намесата, която е наблизо, също може да бъде приписана на "кометата". В допълнение, в известния метод, границата на "главата" и "опашката" се определя като права линия, перпендикулярна на оста на кометата и разделяща кометата на "глава" и "опашка". Предложеният метод използва виртуална граница, определена чрез изчисляване на центъра на "главата на кометата" и отразяваща разпределението на интензитета на светене на точките от предната част на "главата на кометата". Това значително подобрява точността на изчисляване на дължината на опашката на кометата и процента на ДНК в главата и опашката.

Трябва да се отбележи, че всички изброени операции се извършват автоматично едновременно върху всички "комети" на изображение или серия от изображения.

ИСК

Метод за обработка и анализ на изображения на кометоподобни обекти, получени по метода "ДНК-комети", който се състои във въвеждане на изображение с кометоподобни обекти - "комети", които представляват набор от слети и отделни флуоресцентни точки на различни яркост, търсене на тези „комети“ в изображението, подчертаване на контура им с дефинирането на границата на „главата“ и „опашката“, извършване на микроскопска морфометрия, характеризираща се с това, че преди търсене на „комети“ в изображението, яркостта на изображението нивата се оптимизират и нискочестотното филтриране за комбиниране на отделни точки от „комети“ в замъглени области, след което се извършва сегментиране на полученото изображение въз основа на прага на яркост, дефиниран като отместване спрямо фона, намиране на контурите на „кометите“ чрез запълване на ограничена област "със семе", където семето е произволна точка, принадлежаща на "кометата", намиране центъра на главата на всяка "комета" чрез определяне на центъра на тежестта на точки с интензитет на светене, близък до максимума, определяне на виртуалната граница на "главата" и "опашката" чрез огледално отразяване на разпределението на интензитетите на светене на точки на предната част на главата на кометата, след това се извършва микроскопска морфометрия на "кометите" чрез измерване на дължината на "кометата", "опашката", диаметъра на "главата" и изчисляване на процента на ДНК в цялата "комета", в "опашката" и мерки за увреждане на ДНК, като горните операции се извършват автоматично, едновременно на всички "комети" в поредица от изображения.

Статия за конкурса "био/мол/текст": Знаете ли, че кометите се изучават не само от астрономи, но и от молекулярни биолози? Тяхната работа е свързана с космоса само косвено. Те гледат комети през микроскоп. Служи като звездно небе слайд с гел- микроскопично стъкло, покрито с агароза с изследваните клетки. Това стана възможно благодарение на откриването през 1984 г. на метод за анализ на ДНК, наречен метод на ДНК комета.

За популярността в цифри

Фигура 2. Примери за увреждане на ДНК в резултат на действието на фактори от различно естество

Както можете да видите, "разбойниците" могат да извършат огромен набор от "престъпления" и да причинят значителни щети на целостта на ДНК. Но в клетката безопасността на ДНК се охранява от възстановителни системи, „лечители“, които коригират увреждането на молекулата с помощта на специални „лекарства“ - ензими, които могат да „залепят раните“, причинени от генотоксиканти. Има много възстановителни ензими. Към момента е известно, че ремонт на ексцизияувреждане на ДНК, т.е. в операциите, когато мястото първо се изрязва и след това се сглобява, участват 13 ензима!

Не всичко обаче е толкова гладко, колкото изглежда на пръв поглед. Операциите в "репарационния отдел" не винаги завършват успешно, т.е. възстановяване на оригиналната ДНК молекула. Резултатът от работата на системите за възстановяване може да бъде нова повреда. Причината за това е много плътното опаковане на ДНК вериги в ядрото.

Но какво да кажем за учените? Те действат като „ченгета“, които трябва да идентифицират „съставите на престъплението“, т.е. намерете „престъпника“ и неговите „съучастници“ (определете генотоксикантите, техните дози и концентрации) и установете тежестта на „престъплението“ (определете степента на увреждане на ДНК). Именно в такива ситуации помага методът ДНК комета.

Първоначално от Швеция

Опити, насочени към изучаване на ядрените структури на клетката и количествено определяне на увреждането на ДНК веригата в единични клетки на организми, бяха направени още през 80-те години на миналия век. XX век от учени като Кук и Бразел, Ридберг и Йохансон. Въпреки това едва през 1984 г. шведските изследователи Ostling и Johanson разработват нов метод за откриване на увреждане на ДНК. Именно те забелязаха, че изображенията на ДНК фрагменти, мигриращи в електрическо поле, приличат на астрономически комети. Имаше прилика. "Кометите", получени от учени от Швеция, имаха основните характеристики на космическите "братя": имаха "глава" и "опашка". Ето откъде идва такова романтично име - методът на ДНК кометите.

Методът има редица други имена - гел електрофореза на единични (изолирани) клетки и електрофореза в микрогел . Първото име неправилно отразява същността на анализа. Електрофорезата се извършва не в единични клетки, а в агарозен гел, където ДНК, изолирана от същите тези клетки, се движи от един полюс към друг. Второто е правилно, т.к електрофорезата се извършва в агарозен гел, нанесен върху предметни стъкла. Но този термин не се наложи. Тези наименования не са много популярни и се използват рядко, за разлика от "метода на ДНК кометите".

Заклинание за получаване на "комети"

Фигура 3. Структурата на "кометата".

Лабораторните "комети" са интересни обекти. Появата им пряко зависи от факторите на влияние, тяхната сила и условията на анализа. Информацията за "кометите" не е тайна, забулена в мрак, така че почти всичко се знае за техния състав, структура и формиране.

В публикация от 1984 г. шведите Ostling и Johanson наричат ​​мигриралата ДНК „опашка“, а останалата в кухината ДНК „център“. Сега практически нищо не се е променило: „кометата“ условно се отличава с „глава“ и „опашка“ (фиг. 3).

Трябва ясно да се разбере, че "кометата" се образува не от клетка на жив организъм, а от неговата ДНК. вграден в агарозен слой клетъчна суспензияобразува кухини, които в процеса лизисзаема ДНК на тези клетки. Всички по-нататъшни манипулации в метода ДНК комета се извършват с ДНК.

"Кометите" се образуват в процеса на миграция (движение) на ДНК в електрическо поле (когато има ток и напрежение). Какво се случва по време на лизиси електрофореза? По-малките биомолекули, които изграждат клетката, „избягат“ в лизиращия разтвор по време на дифузия, за разлика от ДНК, която поради изключително голям размерне може да се движи. Когато предметните стъкла с ДНК се подложат на електрофореза, непокътнатата ДНК образува „глава на комета“ и повредените части от молекулите започват да „бягат“ към положително зареден източник на ток – анода (тъй като ДНК е отрицателно заредена), образувайки „опашка“. ". За да се видят получените "комети", те се оцветяват с флуоресцентни багрила (етидиев бромид, акридиново оранжево и др.) и след това се визуализират с помощта на флуоресцентен микроскоп при голямо увеличение (фиг. 4).

Остлинг и Йохансон пишат следното: „Когато една клетка е вградена в гел, тя образува вдлъбнатина в него. След лизис на клетката нейната ДНК заема тази депресия. Повечето други биомолекули лесно дифундират през агарозния гел. Така почти всички те излизат от кухината, оставена от клетката, в лизиращия разтвор. Единственото изключение е ДНК, която поради голямата си молекулно теглоостава в гела. - Изд.

Фигура 4. Последователността от стъпки на метода на ДНК кометата(започвайки по часовниковата стрелка отгоре). * - Стъпката е необходима само в алкалната версия на метода (pH > 13,0) за неутрализиране на основата с NaOH.

Колкото по-силно е увреждането на ДНК (и степента на увреждане зависи от дозата на мутагена), толкова по-изразена е "кометната опашка". Както вече разбрахте, дългата "опашка" не е много добра.

Универсален войник

Методът на ДНК кометите е инструмент с широк обхват. С негова помощ учените „разкриват престъпления“, свързани с покушение върху човешкото здраве и безопасността на околната среда (разбира се, всичко това чрез изследване на увредена ДНК). Методът придоби такава популярност благодарение на привлекателните си характеристики - простота, бързина, икономичност и достатъчно висока чувствителност, което позволява да се открият увреждания на ДНК, причинени дори от фактори с ниска интензивност (например ниски дози радиация). Сред многото методи за оценка на увреждането на ДНК, методът на ДНК комета е един от най-подходящите в тази област. В допълнение към горните предимства, той превъзхожда, например, добре познатите цитогенетични методи (ана-телофазен, метафазови анализи, микронуклеарен тест), и по други основателни причини.

Методът на ДНК комета ви позволява да работите с всякакви клетки, съдържащи ДНК, за разлика от микронуклеарния тест, който най-често включва клетки от кръв или костен мозък. Ако анателофазните и метафазните методи са ограничени в списъка на определените хромозомни аберации, тогава методът на ДНК кометата предоставя широк спектър от неговите модификации, благодарение на които изследователят може да открие различни увреждания на ДНК: единични, двойни увреждания, алкално-лабилни места, апоптозаи други. Именно тези възможности го правят "универсален войник" и проправят пътя на метода в различни области. научно изследване , :

• мониторинг на околната среда- оценка на състоянието на околната среда по степента на увреждане на ДНК на организми, живеещи в изследваната зона (като правило се сравняват нивата на увреждане на ДНК на индивиди от замърсени и контролни зони);
• биологичен мониторинг- изследване на влиянието на храненето и други фактори на външната среда върху организма по отношение на степента на увреждане на ДНК, натрупване на увреждане и възстановяване;
• генотоксични изследванияфармакологични препарати, нови и съществуващи химикали (битова химия, пестициди и др.);
• клинични изследваниянасочени към пренатална диагностика на етапа на вътрематочно развитие, идентифициране на предразположеност към заболявания;
• знак за ефективностлечение на рак и контрол върху него.

Промяната се научава чрез сравнение

Наблюдение на състоянието на околната среда, т.нар. мониторинг на околната среда, помага на изследователите да идентифицират промените в околната среда и да алармират навреме (особено в извънредни ситуации, например в атомната електроцентрала в Чернобил през 1986 г. или в атомната електроцентрала Fukushima Daiichi през 2011 г.). Когато околната среда е замърсена, методът ДНК-комета в комбинация с индикаторни организми идва на помощ. Списъци на организми, характерни за различни средиместообитанията и най-чувствителните към промените в състоянието на околната среда са доста обширни и включват видове, вариращи от бактерии Ешерихия колии водорасли от род Хламидомонадаи завършва с висши растения ( Lemna minor, Pinus sylvestris), бозайници ( Microtus oeconomus) и, разбира се, човек (фиг. 5). В метода на ДНК комета, като правило, не участват цели организми, а техните „съставни части“ - клетки, които са особено чувствителни към промените във факторите на околната среда, или тъкани, от които могат да бъдат получени тези клетки. Кръвните клетки обикновено се вземат от животни: еритроцитии лимфоцити, хемоцити(аналози на еритроцитите при безгръбначни), целомоцити(клетки, изпълняващи имунна функция при земните червеи); в растенията - клетки на меристема, интензивно деляща се тъкан.

Забележка:При анализа на увреждане на ДНК могат да се използват и цели индивиди, ако са представени от една клетка, като напр. Chlorella вулгарис.

Фигура 5. Примери за индикаторни организми, използвани за оценка на състоянието на околната среда чрез метода на ДНК кометите.

сайтове scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Как работи методът на ДНК кометите в този случай? Учените сравняват степента на увреждане на ДНК на индикаторни организми, живеещи в изследваните (замърсени) и контролни (незамърсени) територии: изложени на замърсена почва, вода и т.н., и същите, но живеещи в нормални контролни условия, т.е. когато няма влияние на изследвания фактор или то е незначително. Оценката на степента на увреждане на ДНК се извършва и в лаборатории, при строго контролирани условия, когато има проба от организми, изложени на изследвания фактор или група фактори (радиация, метали, пестициди), и задължително контролна група ( без да изпитвате този ефект).

Пример:На 11 март 2011 г. в резултат на най-силното земетресение в Япония и последвалото го цунами се случи сериозна радиационна авария в АЕЦ Фукушима Даичи. През 2014 г. японски учени направиха проучване. Те избраха две места, засегнати от аварията, една с високо ниво на радиация (2,85 µSv/h) и една с ниско ниво (0,28 µSv/h), като контроли. При земните червеи от сем Megascolecidaeот тези места беше анализирана степента на увреждане на ДНК. Оказа се, че този показател е значително по-висок при лица, изложени на високи нива на радиация, отколкото при лица в зона с ниско ниво на облъчване.

Сценариите могат да варират. Степента на увреждане на ДНК в клетките може да се увеличи, намали или да остане непроменена. Повишената степен на увреждане на ДНК в организми от замърсена зона може да показва вътрешни промени във функционирането на клетките, които водят до многобройни "счупвания" на ДНК.

Примери:Някои метали, влизайки в тялото, предизвикват реактивни кислородни видове (ROS), причинявайки увреждане на ДНК; йонизиращото лъчение допринася за образуването на свободни радикали, които също са "нарушители" на ДНК. Действието на ултравиолетовите лъчи може да доведе до образуването димери в ДНК, прекъсвайки връзката на двете си вериги и по този начин променяйки конформацията на молекулата.

Намаленото увреждане на ДНК или липсата на разлика предполага, че организмите са се справили с „потисничеството“ генотоксикантии адаптирани към живота в тези неблагоприятни условия. Тази адаптация се нарича адаптация. Но това е съвсем различна история.

Наследствеността е страшна сила

Чували ли сте за такива заболявания като синдром на хромозомно счупване (синдром на увреждане на Nijmegen), пигментна ксеродерма и трихотиодистрофия? Те се появяват само когато и двамата родители са носители на дефектния ген (фиг. 6).

В литературата има данни за възможността за използване на метода на ДНК комета при диагностицирането на тези наследствени заболявания, което е особено важно в пренаталния етап, т.е. по време на бременност.

Синдром на нараняване на Nijmegen (Синдром на счупване на Nijmegen, NBS) е заболяване, свързано с трайни нарушения на целостта на ДНК. Проблемът е, че ген NBS1възниква мутация, която "изключва" нибрин- протеин, който контролира възстановяването на сдвоени прекъсвания на ДНК, предизвикани от радиация. Ето защо хората, страдащи от този синдром, са изключително радиочувствителни. Божена Новотна от Пражкия институт по експериментална медицина в своето проучване твърди, че методът на ДНК кометите е отличен при идентифицирането на хетерозиготни носители на гена NBS1от аномално високо нивоувреждане на ДНК вериги в "кометите" на лимфоцитите.

Не по-малко опасни са ксеродерма пигментозаи трихотиодистрофия. Това са сериозни човешки заболявания, които се предават по наследство. В първия случай, при кратко излагане на слънце при деца на открити участъци от кожата (ръце, шия, лице), първо се появяват червени петна, които впоследствие се превръщат в изразена пигментация до образуването на тумори. Второто заболяване се изразява в чупливост на косата и ноктите, умствена изостаналост и аномалии в структурата на черепа.

Тези заболявания са обединени от нарушение в работата на възстановяването на ексцизията на нуклеотидите. Въз основа на успеха на възстановяването на нуклеотидната ексцизия в клетките на плода с помощта на метода на ДНК комета е възможно да се определи дали детето ще страда от тези заболявания. В литературата са описани случаи на такава диагноза.

Изследователите са били изправени пред задачата да разберат преди раждането дали децата ще страдат от ксеродерма пигментоза и трихотиодистрофия. Експериментите са проведени в семейства, в които родителите са носители на гени на xeroderma pigmentosum ( семейство X) и трихотиодистрофия ( Y семейство) и вече имат деца с тези заболявания .

Семейство X: бременност 15 седмици, майката е носител на гена на xeroderma pigmentosa, има дете на 3 години с това заболяване.

Семейство Y: бременност 10 седмици, баща и майка - носители на гена за трихотиодистрофия, две деца с трихотиодистрофия починаха на възраст 22 месеца и 6 години, още едно - в резултат на спонтанен аборт (спонтанен аборт).

Всички клетки бяха изложени на ултравиолетово лъчение в продължение на 45 минути.

X Семейно изследване: Нивото на увреждане на ДНК в клетките на плода, определено чрез метода на ДНК комета, е близко до нивото на увреждане на ДНК във фибробластите на майката носител, т.е. съответства на нивото на увреждане на веригата при нормални условия на ремонт на ексцизия на ДНК. Заключение - плодът е здрав. Това заключение се потвърди след раждането на нормално дете.

Семейство Y проучване:в клетките на плода, в сравнение с фибробластите на бащата и майката, беше разкрит дефект в работата на ексцизионния ремонт, който също беше потвърден от друг метод, който не се основава на изследването на ремонта. Установява се, че плодът е болен. След разговор със семейството беше решено да се направи аборт.

Индустрията е враг на човешкото здраве

Здравето на хората, работещи в промишлени съоръжения или живеещи в екологично неблагоприятни райони, е изложено на риск всеки ден. Опасността се крие не само в ежедневния близък контакт на тялото с генотоксиканти (йонизираща радиация, тежки метали и други химикали), но и във вероятността от извънредни ситуации (вижте примерите по-горе), последствията от които могат да бъдат катастрофални за организмите. Промените в състоянието на тялото могат да бъдат много различни, от леки заболявания като главоболие до рак.

Методът на ДНК кометите може да се използва като обещаващ инструмент първоначална оценкасъстоянието на генома на хора, работещи или живеещи в екологично неблагоприятни условия. Това означава, че ДНК кометите могат да се използват не само в тези области на изследване, но и в други области в бъдеще, разширяване на възможностите за използване на метода в клинични изследвания, медицина и много други.

Примери:В Полша инцидент във фабрика за батерии изложи работниците на високи нива на олово и кадмий, което доведе до малко, но значително увеличение на увреждането на ДНК в сравнение с група хора, които не са преживели такъв стрес. Генотоксичният ефект на газовите заваръчни аерозоли, съдържащи тежки метали - манган, хром, никел, кадмий, кобалт, олово, молибден, желязо - върху ДНК на левкоцитите беше разкрит за хора, чиято работа е свързана със заваряване от дълго време.

Има някои трудности

За да използвате правилно метода на ДНК кометата, трябва да „познавате от поглед“ не само неговите възможности и предимства пред други методи, но и, разбира се, недостатъците, ограниченията и трудностите, за които трябва да внимавате. Методът изисква оптимизациялизис, електрофореза и други условия в зависимост от типа клетки, които ученият използва и целите на изследването.

Обяснение:Растителните и животинските клетки изискват различни условия за освобождаване на ДНК, т.е. лизис. Поради наличието на целулозна клетъчна стена, растителните клетки се лизират по-дълго от животинските клетки.

От първата трудност следва второто неудобство: адаптирането на метода към проблемите на анализа може да бъде много трудно. трудоемък процес(въпреки че самата техника е проста и разбираема), особено ако никой не е работил с обекта на вашето изследване по метода на ДНК кометата. Случва се, че „настройката“ на методологията в този случай изисква много време.

Понякога има трудност при тълкуванерезултати, получени от степента на увреждане на ДНК, тъй като степента на увреждане не винаги може да бъде свързана с дозата на влияещия фактор.

Обяснение:Такъв проблем може да бъде свързан с недостатъчна оптимизация на метода, когато някои видове щети се смесват с други и по този начин изкривяват резултатите. Системите за възстановяване, които коригират част от произтичащите нарушения, също могат да „нарушат“ действителната степен на увреждане на ДНК.

Една от най-големите трудности може да бъде сравнение на резултатитеполучени чрез метода на ДНК кометите от различни учени в различни лаборатории и изследователски институти. За оценка на увреждането на ДНК се използват методи с модификации и напълно различни показатели (например процентът на ДНК в „опашката на кометата“ или дължината на „опашката“).

Обяснение:Дължината на "кометната опашка" е разстоянието, на което ДНК е мигрирала от "главата" на опашката. Процентът на ДНК в опашката на кометата е количеството ДНК, което е мигрирало в опашката, изразено като процент. ОТ пълен списъкРезултатите за увреждане на ДНК са налични на www.cometassayindia.org.

Полагат се усилия за стандартизиране на използването на метода на ДНК кометите, което ще помогне на учените да сравняват резултатите. Например, протоколи и насоки са разработени в генотоксични изследвания.

Обяснение:Указанията на Федералния център по хигиена и епидемиология на Роспотребнадзор ясно определят тестовите обекти (човешки клетки) и описват подробно всички етапи на анализа. Съгласно тези препоръки с помощта на метода на ДНК кометите домакинските химикали и продуктите от полимерни материали могат да бъдат тествани за генотоксичност.

Заключение

„Който е въоръжен е защитен” – това е мотото на работата с метода ДНК комета. Познаване на предимствата и недостатъците на използването този методоценката на увреждането на ДНК ви позволява майсторски да манипулирате хода на работа, да избягвате "клопки" и да получавате правилни резултати.

Методът на ДНК комета играе ролята на „вълшебна пръчица“ при оценката на общото състояние на тялото, като правило, на ранни стадиивъздействие неблагоприятни факториоколен свят. На начална фазатова е увреждането на ДНК, което е най-бързият и следователно единственият измерим отговор на тялото на неблагоприятните ефекти много преди появата на промени на физиологично ниво.

Сега знаете как биолозите получават "комети" в лабораториите и защо се нуждаят от тях толкова много.

Литература

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Кометният анализ: Чувствителен метод за откриване на увреждане на ДНК в отделни клетки. методи. 48 , 46–53;
2. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основите на селекцията: учебник за студенти образователни институции(3-то издание, преработено и допълнено). Санкт Петербург: N-L, 2015. - 720 с.;
3. Пиперакис С.М. (2009). Кометен анализ: кратка история. Cell biol. Токсикол. 25 , 1–3;
4. Ярмоненко С.П. Радиобиология на човека и животните. М.: По-високо. училище, 2004. - 549 с.;
5. Кук П.Р. и Бразел И.А. (1976). Характеризиране на ядрени структури, съдържащи суперспирална ДНК. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. и Johanson K.J. Оценка на едноверижни разкъсвания в единични клетки на бозайници. В: Механизми за възстановяване на ДНК / ред. от Hanawalt P.C., Friedberg E.C., Fox C.F. NY: Academic, 1978. стр. 465–468;
7. Ostling O. и Johanson K.J. (1984). Микроелектрофоретично изследване на индуцирани от радиация увреждания на ДНК в отделни клетки на бозайници. Biochem. Biophys. Рез. общ. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. и Ferard J.F. (1999). Кометен анализ в генетичната екотоксикология: преглед. Environ. Mol. Мутаген. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Едноклетъчен гел/комет анализ: насоки за инвитрои in vivoгенетично токсикологично изследване. Environ. Mol. Мутаген. 35 , 206–221;
10. Филипов Е.В. (2014 г.). Използването на метода "ДНК комета" за откриване и оценка на степента на увреждане на ДНК на клетките на растителни, животински и човешки организми, причинени от фактори на околната среда (обзор) . Наука и образование. 2 , 72–78;
11. Колинс А.Р. (2004). Кометният анализ за увреждане и възстановяване на ДНК: принципи, приложения и ограничения. Mol. Биотехнология. 26 , 249–261;
12. Фуджита Й., Йошихара Й., Сато И., Сато С. (2014). Радиоактивността на околната среда уврежда ДНК на земните червеи в префектура Фукушима, Япония. Евро. J. Wildl. Рез. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Излагането на уран предизвиква ли генотоксичност в телеостеана Данио рерио? Първи експериментални резултати. Радиозащита. 40 , 175–181;
14. Каган М.Ю., Шулакова Н.С., Тумирова Р.А., Злодеева Е.А., Резник Н.В. (2012). Синдром на Nijmegen (клинично наблюдение). Педиатрична фармакология. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Кометният анализ като ремонтен тест за пренатална диагностика на Xeroderma pigmentosum и трихотиодистрофия. J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Генотоксични ефекти от професионална експозиция на олово и кадмий. Мутат. Рез. 540 , 19–28;
17. Томилин Н.В., Петров А.Н., Филко О.А., Храброва А.В., Соловьова Н.Е., Иванова Т.М. и др. (2015). Оценка на степента на увреждане на ядрената ДНК в клетките на периферната кръв на хора, професионално свързани с действието на тежки метали. Здравна организация. 16 , 383–392;
18. Оценка на генотоксичните свойства по ДНК кометния метод инвитро: Насоки . М.: федерален центърхигиена и епидемиология на Роспотребнадзор, 2010.- 16 с.