Colorarea frotiurilor după metoda Gram Cea mai comună metodă de colorare a bacteriilor, care face posibilă clasificarea celulelor în funcție de tipul de colorare a peretelui ca gracilicute (gram-negative) sau firmicutes (gram-pozitive).

O bucată de hârtie de filtru este plasată pe un frotiu fix, se toarnă peste ea o soluție carbolice de violet de gențiană timp de 30-50 de secunde. Se scurge colorantul, se indeparteaza hartia, se aplica solutia Lugol timp de 60 de secunde. Renunță la soluția lui Lugol. Clătiți medicamentul în etanol la 95 ° timp de 30-50 de secunde până când colorantul încetează să mai plece, ceea ce depinde de grosimea frotiului. Preparatul se spală cu apă, se colorează timp de 30-60 de secunde cu Pfeiffer fuchsin, se spală cu apă, se usucă și se microscopează. Imagine microscopică: bacterii gram-pozitive - violet, gram-negative - roșii.

Practica arată că se obțin preparate mai curate, fără a prejudicia diferențierea, dacă, după colorarea cu violet de gențiană, frotiul este ușor clătit cu apă, resturile căreia se scutură și abia apoi se aplică soluția Lugol.

Modificare conform A.P. Sineva. Pe un frotiu fix se pune o fâșie de hârtie cu un colorant, se toarnă 2-3 picături de apă și se pătează timp de 2 minute. Apoi procedați așa cum este descris mai sus.

Modificare Kerry. Frotiul se colorează timp de 1-2 minute cu o soluție alcoolică de violet de gențiană, se tratează cu soluție de iod timp de 1-2 minute, apoi cu etanol timp de 30-40 de secunde. Spălat. Tratat în mod repetat timp de 1 minut cu soluție de iod, spălat, colorat timp de 1-2 minute cu fucsin sau un amestec de safranină cu verde strălucitor.

Modificarea lui Burke. Soluția A: soluție de cristal violet 1% în apă distilată.

Mordant: iod cristalin - 1 g, iodură de potasiu - 2 g, apă distilată - 100 ml.

Solvent de decolorare: eter etilic - 1 volum, acetonă - 3 volume.

Colorant suplimentar: soluție 2% de safranină în apă distilată.

Metodologie. Frotiul fixat prin încălzire se scufundă în soluția A. Frotiul se clătește în mordant de iod și se acoperă cu mordant proaspăt timp de 2 minute. Clătiți cu apă și apoi cu înălbitor până când solventul de scurgere nu are vopsea. După uscare, colorați cu colorant suplimentar timp de 5-10 secunde, clătiți cu apă și microscop.

Modificare prostituată

Soluția A: cristal violet - 2 g, etanol 95% - 20 ml.

Soluția B: oxalat de amoniu - 0,8 g, apă distilată - 80 ml.

Soluția A și B în volumele preparate se amestecă într-un flacon închis la culoare și se lasă la temperatura camerei timp de 24 de ore.

Soluția B: soluție de safranină 2,5% (în etanol 96%) - 10 ml, apă distilată - 100 ml.

Metodologie. Frotiul fixat prin încălzire se scufundă într-un amestec de soluții A și B timp de 1 min, după care preparatul se spală cu apă și se tratează cu soluție de Lugol timp de 1 min, apoi se spală din nou cu apă și se usucă; Etanol 96% se aplică timp de 30 s, preparatul se spală bine cu apă, se usucă, se pune în soluția B timp de 10 secunde, se spală ușor cu apă, se usucă, se microscopează.

Test de hidroxid de potasiu pentru a monitoriza rezultatele colorației Gram bacteriene. Dacă pata Gram nu este clară, această metodă vă permite să rafinați rezultatul.

Configurarea testului. Pe o lamă de sticlă se aplică 1-2 picături dintr-o soluție de KOH 3%. Cultura de agar este introdusă în KOH cu o buclă bacteriologică, amestecată, iar apoi bucla este ridicată. Dacă cultura sub formă de „fir” ajunge la buclă - gram-negativ, în absența acestui fenomen - bacterie gram-pozitivă.

Metode de colorare a bacteriilor acido-rezistente

Colorație Ziehl-Nielsen. Se prepară colorantul Fuchsin Carbol: fucsin bazic - 0,3 g, etanol 95% - 10 ml, fenol (cristale topite la încălzire) - 5 ml, apă distilată - 95 ml.

Fucsina bazică se dizolvă în etanol, se adaugă fenol dizolvat în apă, se amestecă, se menține 5-7 zile la temperatura camerei; filtrat prin hârtie de filtru înainte de utilizare.

Solvent de decolorare (alcool clorhidric): etanol 95% - 97 ml, acid clorhidric concentrat - 3 ml. Colorant suplimentar: albastru de metilen - 0,3 g, apă distilată - 100 ml.

Metodologie. Colorantul carbol-fucsin se toarnă pe un frotiu fixat prin încălzire, se încălzește până când vaporii scapă (dar nu se fierbe!). Se spală cu apă după 5 minute. Apoi frotiul este tratat cu un solvent de albire timp de 30-50 de secunde, spălat cu apă, după care pelicula de bacterii de pe frotiu devine roz pal.

Frotiu este colorat timp de 3-5 minute cu un colorant suplimentar (albastru de metilen etc.), se spală cu apă și se usucă.

Microorganismele acido-rezistente din frotiu sunt roșii, altele sunt albastre.

Pata de auramina. Soluția A: auramină - 1,5 g, rodamină B - 0,75 g, glicerină - 75 ml, fenol topit - 10 ml, apă distilată - 50 ml.

Coloranti: fenolul si glicerina se dizolva in 25-30 ml apa, se adauga volumul de apa ramas si se filtreaza prin vata de sticla.

Soluția B: etanol 70% - 99,5 ml, acid clorhidric concentrat - 0,5 ml.

Soluția B: permanganat de potasiu - 0,5 g, apă distilată - 99,5 ml.

Metodologie. Un frotiu fixat peste flacăra unui arzător este colorat timp de 15 minute cu soluția A la temperatura camerei sau la 37-38 ° C. Se spală sub jet de apă până la decolorare. Soluția B se toarnă pe frotiu timp de 3-5 minute, se spală și se colorează încă 2-4 minute cu soluția C. Se spală, se usucă, microscopic la microscop fluorescent sub imersie (filtru de lumină excitantă BG-12, blocant OG-1) .

Bacterii rezistente la acido galben-portocaliu pe un fundal întunecat.

Colorarea muștei. Medicamentul rezistă 24 de ore într-o soluție de violet de metil (10 ml de soluție saturată de alcool de violet de metil, 100 ml de soluție apoasă 2% de acid carbolic). Soluția Lugol se aplică timp de 1-2 minute, apoi se aplică o soluție 5% timp de 1 minut acid azoticși 10 secunde soluție 3%. de acid clorhidric. Apoi, pe preparat se aplică un amestec de etanol și acetonă (1:1) până când vopseaua nu se mai desprinde, se spală cu apă, se usucă și se microscopează.

Metode de colorare a sporilor

metoda lui Aujeszky. Un frotiu uscat la aer fără fixare se tratează timp de 2-3 minute (când este încălzit) cu acid sulfuric 0,5%, se spală și se fixează pe flacără. Se colorează 7-8 minute cu carbol fuchsin Ziel la încălzire, vopseaua se scurge. Frotiul se tratează timp de 5-7 secunde cu o soluție de acid sulfuric 5%, se spală și se colorează cu albastru de metilen timp de 4-5 minute. La microscopie, partea vegetativă a celulei este albastră, sporul este roșu.

metoda lui Meller. Un frotiu fixat peste o flacără este gravat timp de 2-3 minute cu acid cromic 5%, se spală și se colorează cu fuchsin carbolic Ziel. Înălbiți și colorați în același mod ca metoda Aujeszky.

metoda Peshkov. Frotiul fix este colorat cu albastru de metilen încălzit până la fierbere. Vopseaua este spălată și colorată cu o soluție apoasă de neutralitate 1% timp de 10 secunde. Spălate, uscate. Sporii sunt albaștri, celulele vegetative sunt roșii.

Metoda Schaeffer-Fulton. O soluție apoasă 0,5% de verde de malachit se toarnă pe un frotiu fixat prin încălzire, acoperit cu hârtie de filtru. Frotiu se pune timp de 5 minute peste apa clocotita. Se spală și se contracolorează timp de 30 de secunde cu soluție apoasă de safranină 2%. Spălate, uscate. Sporii sunt de culoare verde strălucitor, celulele vegetative sunt roșii-maronii.

Metoda Trujillo. Frotiul se fixează pe flacăra unui arzător, se acoperă cu o soluție apoasă saturată de verde malachit, se încălzește până la apariția aburului și se colorează timp de 3 minute. Vopseaua este spălată cu apă și frotiul este colorat cu o soluție apoasă 0,25% de fucsin bazic timp de 1 min. Spălate, uscate. Sporii sunt verzi, celulele vegetative sunt roșii.

Metoda Dorner. Un frotiu fixat pe flacăra unui arzător se colorează timp de 5-10 minute cu carbol fuchsin când este încălzit, se decolorează timp de 1 minut cu alcool acid clorhidric (3 ml acid clorhidric concentrat și 97 ml etanol 96%). Medicamentul se spală, se usucă cu hârtie de filtru și se toarnă pe frotiu cu un strat subțire de soluție 10% de nigrozină într-o soluție de formol 0,5%. Fără spălare, frotiu este uscat la aer și microscopat. Sporii sunt roșii, celulele vegetative sunt incolore pe fond negru.

metoda lui Waldman. Lefleur blue (alcalin) se aplică preparatului fix și se încălzește până la fierbere, apoi se răcește și se spală cu apă. Se colorează cu soluție neutră 1% timp de 30 de secunde. Imagine microscopică: spori - albastru, celule vegetative - roșii.

Metoda Ozheshka. O soluție 0,5% de HC1 se toarnă pe un frotiu nefixat și se încălzește timp de 1-2 minute. Se scurge acidul, se spală preparatul cu apă, se usucă, se fixează pe flacără și se colorează după metoda Ziehl-Neelsen. Imagine microscopică: spori - roșii, celule vegetative - albastre.

Metode de colorare a capsulelor

Metoda Romanovsky-Giemsa. Un frotiu fixat în etanol sau lichid Nikiforov se pune în vopsea Romanovsky-Giemsa (15-20 picături de vopsea la 10 ml apă distilată) timp de 15-20 de minute. Spălate, uscate. Corpul bacteriei este colorat cu albastru închis, capsulele sunt roz.

metoda lui Olt. Frotiurile fixe peste flacăra arzătorului sunt colorate timp de 1-3 minute cu o soluție apoasă 2% de safranină (safranina se dizolvă în apa fierbinte, se filtrează, se aplică o soluție proaspăt preparată). Corpul bacteriei este colorat maro, capsula este galben pal.

metoda lui Rebiger. Un frotiu nefixat se colorează timp de 15-20 de secunde cu o soluție de violet de gențiană în formol (15-20 g de violet de gențiană se dizolvă în 100 ml de formol 40%, se depune, se filtrează), se spală cu apă. Corpul bacteriei este violet închis, capsula este violet roșcat.

drumul lui Anton. Frotiu este colorat timp de 2 minute cu o soluție apoasă 1% de violet cristal. Vopseaua este spălată cu o soluție apoasă 20% de sulfat de cupru (CuSO 4 ·5H 2 O), excesul de soluție este scuturat și frotiul este uscat cu hârtie de filtru fără clătire cu apă. Microbi - violet închis, capsulă - albastru deschis.

Metoda ginurilor. O picătură de cerneală neagră diluată 1:3 cu apă distilată este aplicată pe o lamă de sticlă și centrifugată la 3000 rpm timp de 15 minute. Într-o picătură de carcasă, cultura este suspendată cu o buclă și se face un frotiu (asemănător cu un frotiu de sânge). Se usucă, se fixează peste flacăra unui arzător, se colorează cu carbol fuchsin al lui Ziel, diluat 1:3. Corpurile bacteriene sunt roșii. Capsula pe un fundal întunecat este vizibilă ca un halou ușor în jurul bacteriilor.

metoda lui Mikhin. Frotiul se colorează timp de 3-5 minute cu albastru Leffleur (este potrivită doar vopseaua care a fost păstrată cel puțin 20-30 de zile, deoarece în timpul depozitării se formează azur, dând metacromaticitate). Corpurile bacteriene sunt albastre, capsula este roz.

Metoda Giss. O picătură de ser sanguin normal de bovine sau cai (sau o picătură de lapte degresat) se aplică pe o lamă de sticlă, cultura este introdusă în ea cu o buclă, suspendată și se prepară un frotiu. Filmul suspensiei bacteriene se usucă în aer, se fixează pe flacăra unui arzător și se colorează cu violet cristal apos 0,1% timp de 1 min. Frotiul se spală cu o soluție apoasă 20% de sulfat de cupru, se usucă cu hârtie de filtru. Capsulele dintr-un frotiu sunt albastru pal, corpurile bacteriene sunt violet închis.

metoda lui Dugid. O picătură de cerneală neagră este plasată pe o lamă de sticlă, iar cultura este suspendată în ea. Picătura este acoperită cu o sticlă de acoperire, excesul de cerneală este îndepărtat cu hârtie de filtru. Pe un fundal maro-negru, sunt vizibile bacteriile care refractează lumina, înconjurate de o capsulă sub forma unei zone transparente.

drumul lui Jon. O picătură de cerneală diluată 1:2-1:4 cu apă distilată este aplicată la un capăt al suprafeței lamei de sticlă. Bacteriile sunt suspendate într-o picătură și se prepară un frotiu (ca un frotiu de sânge). Preparatul se usucă la aer, se fixează pe flacăra unui arzător și se colorează timp de 2 minute cu o soluție apoasă 2% de violet de gențiană sau o soluție 1% de fuchsin. Se spală cu apă, se tratează cu soluție de acid acetic 2% timp de 8-10 secunde și se spală din nou. Într-un frotiu, o capsulă nepătată este vizibilă în jurul bacteriilor intens colorate.

metoda de colorare a flagelului

Prezența flagelilor în bacterii este apreciată prin semne indirecte, de exemplu, prin mobilitatea celulelor din preparatele „picătură zdrobită”, „picătură suspendată”, precum și prin natura creșterii culturii de testat în semi-lichid. agar (0,15-0,3%). În acest din urmă caz, cultura de testat este inoculată cu o înțepătură în pancreas și incubată timp de 18-24 de ore. În procesul de creștere, bacteriile mobile migrează de pe linia de injectare, provocând tulburări ale mediului, în timp ce bacteriile imobile cresc doar de-a lungul injectării.

În unele cazuri, se vor folosi metode de colorare care permit observarea directă a flagelilor

Pentru toate metodele de colorare, lamele trebuie preparate din culturi tinere de agar (14-20 ore de creștere). O soluție apoasă 0,5% de peptonă se adaugă în tuburi cu cultură pe agar oblic timp de 30-40 de minute. Lichidul este decantat, pentru sedimentarea microbilor care au trecut în el, se centrifug. Sedimentul este turnat cu soluție salină și centrifugat din nou. Pentru a preveni pierderea flagelilor, precipitatul spălat este resuspendat în soluție de formol 10% pentru a obține o suspensie ușor tulbure.

Flageli colorați cu acid osmic. Pe un obiect curat degresat sau pe un geam de ceas, o picătură dintr-o suspensie de bacterii este amestecată cu o picătură dintr-o soluție 2% de acid osmic. Picătura rezultată din amestec este aplicată pe o lamă de sticlă curată, fără grăsimi, cu un capilar subțire al unei pipete Pasteur. Uscați la aer și fixați pe flacără (evitați supraîncălzirea!).

Un mordant preparat în câteva zile este turnat pe un preparat fix (1 ml dintr-o soluție alcoolică saturată de fuchsin, 10 ml dintr-o soluție apoasă 20% de tanin și 5,5 ml dintr-o soluție apoasă saturată de sulfat de fier de amoniac). După 15 minute, mordantul este spălat cu apă, colorat cu fucsin timp de 4 minute, spălat și microscopic.

Colorarea flagelilor cu argint. Din suspensie se prepară un frotiu subțire, se usucă și se fixează timp de 2-3 minute cu o soluție de acid osmic 2%. Medicamentul este spălat prin scufundare timp de 2-3 s într-o soluție apoasă de azotat de argint 0,5% și, fără spălare, scufundat timp de 2-3 s într-un murat (pirogalol sau acid galic - 2,0 g, tanin - 1,2 g, acetat de sodiu). - 4,0 g, apă distilată - 150 ml). Se scoate din mordant și se scufundă din nou într-o soluție de azotat de argint, păstrând până când preparatul devine negru. După spălare, se efectuează microscopia.

Colorarea flagelilor conform Plimmer. Se prepară vopseaua: tanin - 5,0 g, clorură de zinc - 5,0 g, clorură de aluminiu - 10,0 g, pudră de fuchsin - 0,75 g dintr-o probă din componentele enumerate sunt măcinate într-un mojar, adăugând treptat 40 ml etanol 60% până la dizolvarea completă. . Înainte de utilizare, vopseaua este diluată cu apă (1:5).

O bandă de hârtie de filtru este plasată pe un frotiu subțire uscat și umplută cu vopsea pregătită. După 2 minute, vopseaua se spală cu apă și se colorează suplimentar cu Ziehl carbol fuchsin. Bacteriile și flagelii sunt roșii.

Colorarea flagelilor după Benichetti. Se prepară în prealabil 3 soluții. Soluția 1: sulfat de zinc - 0,5 g, tanin - 8,0 g, apă distilată - 50 ml. Soluția 2: soluție saturată de alaun de potasiu. Soluția 3: Soluție saturată de violet de gențiană sau violet cristal. Înainte de utilizare, soluțiile sunt amestecate (5:5:3). Un amestec de soluții se toarnă pe frotiu uscat și se încălzește până când apar aburi. Se spală după 3 minute și se microscopează. Flageli violet-negru.

Colorare după Valenti. Frotiul se tratează timp de 3 minute cu o soluție de tanin 20% când este încălzit, se spală, se colorează timp de 10 minute cu fucsin carbolic când este încălzit. Spălat, microscopic. Bacteriile și flagelii sunt roșii.

Colorare gri. Soluția A: acid tanic 20% apos - 2 ml, soluție apoasă saturată de alaun de potasiu - 5 ml, clorură de mercur, soluție apoasă saturată - 2 ml, fuchsin bazic 3% în etanol 96% - 0,4 ml. Colorantul (magenta) se adaugă la restul ingredientelor imediat înainte de utilizare, iar după dizolvarea acestuia, soluția rezultată este filtrată prin hârtie de filtru. Soluția B: Fuchsin carbolic Ziel (fucsin de bază 3% în etanol 95% - 10 ml, fenol - 5 ml, apă distilată - 95 ml).

Metodologie. O picătură de bacterii (suspensie) în formol se aplică pe sticlă și se lasă să se scurgă. Uscați la aer. Se pune o fâșie de hârtie de filtru și se toarnă soluția A timp de 4-6 minute.Se spală cu apă și se colorează cu soluția B timp de 3 minute prin hârtie de filtru.Se spală, se usucă, la microscop. Flagelii și bacteriile sunt roșii.

Colorare conform Lifeson. Pregătiți 3 soluții. Soluția 1: soluție de clorură de sodiu 1,5% în apă distilată. Soluția 2: soluție de acid tanic 3% în apă distilată. Soluția 3: acid acetic rozanilină - 0,9 g, acid clorhidric prozanilin - 0,3 g, etanol 96% - 100 ml. Soluțiile 1 și 2 se amestecă în mod egal și apoi se toarnă 2 volume din acest amestec în 1 volum de soluție 3. Amestecul se păstrează la frigider până la 3 luni.

Metodologie. O picătură de suspensie se aplică pe un pahar bine degresat și se lasă să se scurgă. După uscare, marginile peliculei bacteriene sunt conturate cu un creion pe sticlă, zona este umplută cu colorant timp de 7-15 minute. Rezistă până când suprafața vopselei capătă o culoare aurie, iar filmul de bacterii nu este acoperit cu sediment. Spălate, uscate. Bacteriile și flagelii sunt roșii.

Metode de colorare a peretelui celular

Colorarea peretelui celular are valoare diagnostică în diferențierea micoplasmelor de bacterii.

metoda Gutstein. Medicamentul se fixează timp de 1-2 ore în lichidul lui Bouin, se păstrează 2-3 minute într-o soluție apoasă de tanin 5-10%, se clătește cu apă și se microscopează într-o picătură de soluție apoasă 0,01% de cristal violet.

metoda Peshkov. Medicamentul se fixează timp de 15 minute într-un lichid cu următoarea compoziție: etanol 90% - 60 ml, cloroform - 30 ml, esență acetică - 10 ml. In continuare, preparatul se tine 2-5 minute intr-o solutie apoasa de tanin 10%, se spala cu apa, se vopseste 30-60 secunde cu Pfeiffer magenta si, fara agitare, se usuca si se microscopeaza.

Metoda) Robinow. Microorganismul studiat este crescut pe un mediu de agar într-o cutie Petri, se decupează un bloc de agar și se așează pe o lamelă cu suprafața sa, pus peste noapte în lichidul lui Bouin. A doua zi, agarul este îndepărtat, paharul se pune cu fața în jos pe suprafața unei soluții apoase de acid tanic 5-10% timp de 20-30 de minute. Apoi preparatul se spală cu apă, se pune un pahar de acoperire cu celule bacteriene în jos pe suprafața unei soluții apoase 0,02% de cristal violet timp de 5-10 secunde. Ca urmare, membranele celulare și partițiile sunt colorate cu albastru închis sau negru, iar citoplasma rămâne necolorată.

Metode de colorare a incluziunilor citoplasmatice

La identificarea microorganismelor, datele privind prezența incluziunilor în celule care reflectă tipul și direcția metabolismului constructiv sunt de o importanță deosebită. Incluziunile citoplasmatice includ acid poli-β-hidroxibutiric, boabe de metacromatină (volutină) și polizaharide.

Acidul poli-β-hidroxibutiric este un poliester al acidului beta-hidroxibutiric, care se acumulează în citoplasma celulelor sub formă de granule rotunde sau ovale de 200-800 nm. Metacromatina este polifosfați, iar polizaharidele sunt glucani, constând din D-glucoză, cu dimensiuni de până la 200 nm. Incluziunile enumerate acționează ca un fel de rezerve de substanțe celulare și pot fi detectate prin metode speciale de colorare.

Detectarea acidului poli-beta-hidroxibutiric

Un frotiu fixat peste flacăra unui arzător este colorat timp de 5-15 minute cu o soluție 0,3% de negru Sudan B în etilen glicol. Vopseaua se scurge si, dupa uscarea la aer fara spalare cu apa, se clateste cu xilen. După ce a lăsat frotiul să se usuce, acesta este coborât timp de 5-10 secunde într-o soluție apoasă 0,5% de safranină. Se spală cu apă, se usucă și se microscopează. Incluziunile de acid poli-β-hidroxibutiric sunt vizibile pe fundalul roz al citoplasmei ca formațiuni negru-albastru.

Detectarea metacromatinei (volutina)

metoda Neisser. Pregătiți 4 soluții. Soluția A: albastru de metilen - 0,1 g, etanol 95% - 2 ml, acid acetic glacial - 6 ml, apă distilată - 100 ml. Soluția B: cristal violet - 1 g, etanol 95% - 100 ml, apă distilată - 300 ml. Soluția B iod cristalin - 1 g, iodură de potasiu - 2,0 g, apă distilată - 300 ml. Soluția D: crisoidina - 1 g, apă distilată - 300 ml (crisoidina se dizolvă în apă fierbinte). Un amestec de soluție A și B în raport de 2:1 se toarnă pe un frotiu fixat deasupra flăcării unui arzător timp de 1 min (amestecul se prepară înainte de vopsire). Vopseaua se scurge, se trateaza 1 minut cu solutia B (solutia Lugol) si se spala cu apa, se usuca, microscopic. Celulele bacteriene sunt de culoare galben deschis, boabele de volutină sunt albastre închis.

metoda lui Ruskin. Pregătiți vopsea cu următoarea compoziție: Tsilia fuchsin carbolic - 4 ml, soluție saturată de alcool albastru de metil- 4 ml, acid acetic glacial - 5 ml, etanol 96% - 95 ml, apă distilată - 92 ml. Se toarnă un colorant pe un frotiu fixat deasupra flăcării arzătorului, se încălzește peste arzător până când alcoolul este ars, se spală cu apă, se usucă și se microscopează. Celulele bacteriene sunt colorate în roșu deschis, boabele de volutină sunt colorate în negru și albastru.

Detectarea polizaharidelor

Colorat cu reactiv Schiff. Pregătiți 4 soluții. Soluție A (soluție de periodat): soluție de acid iod 4% 20 ml, soluție apoasă de acetat de sodiu 0,2 M 10 ml, etanol 96% 70 ml. Soluția este sensibilă la lumină, așa că trebuie păstrată într-o sticlă întunecată la întuneric.

Distingeți metodele simple și complexe de colorare.

Metode simple de colorare numită pre-colorare

paraty orice vopsea. Unele microorganisme (spirochete) care sunt greu de detectat cu pete pozitive sunt ușor de detectat atunci când sunt colorate cu pete negative.

Tehnica de gătit medicament este după cum urmează. Preparatul fix este plasat pe lamele de sticlă paralele (punte) care se află deasupra cuvei. O soluție apoasă 1% de fucsin sau albastru de metilen este aplicată pe frotiu folosind un picurător timp de 1-2 minute. Asigurați-vă că soluția de colorant nu se usucă în timpul colorării. După terminarea colorării, vopseaua este scursă. Medicamentul este spălat cu apă până când apa care curge devine incoloră. Apoi, medicamentul este uscat. Pentru a face acest lucru, partea inferioară a preparatului este șters cu hârtie de filtru, iar partea superioară este uscată cu grijă din părți, fără a atinge frotiu. Medicamentul este în cele din urmă uscat în aer sau deasupra flăcării unei lămpi cu alcool. Pentru a obține preparate mai pure, colorantul se aplică pe un frotiu acoperit cu hârtie de filtru. Metoda de colorare în modificarea Sineva vă permite să utilizați hârtie de filtru preimpregnată cu aceasta în locul unei soluții de colorant. Într-un preparat corect colorat și bine spălat, câmpul vizual este luminos și curat, doar celulele sunt colorate. Preparate microscopice cu sistem de imersie.

La metode complexe (diferențiatoare). colorarea aceluiași preparat este afectată de mai multe substanțe colorante, dintre care una se numește principală, altele - suplimentare. Pe lângă coloranți, se folosesc diverși agenți de albire: alcooli, acizi, acetonă etc. Folosind metode complexe de colorare, sunt relevate caracteristicile citologice ale celulelor microorganismelor (structuri celulare, incluziuni etc.).

Pata Gram este cea mai versatilă dintre metodele complexe de colorare. Colorarea este baza diferențierii bacteriene și reflectă capacitatea celulelor de a percepe și reține complexul colorant de violet de gențiană și iod în interiorul celulei sau de a-l pierde după tratamentul cu alcool. În consecință, gram-pozitive ( bacil, Clostridium, Stafilococ, streptococ, Lactobacillus, Sarcina, etc.) si gram negative (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) forme.

Frotiurile cu colorație Gram trebuie preparate din culturi tinere, în creștere activă (de obicei, de o zi) pentru a obține rezultate fiabile, deoarece celulele din culturi vechi dau uneori o reacție Gram instabilă. Bacteriile Gram-negative pot apărea ca Gram-pozitive dacă pelicula bacteriană (frotiul) este prea groasă și decolorarea alcoolului nu este completă. Bacteriile Gram-pozitive pot apărea ca Gram-negative dacă frotiul este decolorat cu alcool.

Esența metodei . Pe suprafața citoplasmei celulare la microorganismele gram-pozitive există un complex de proteine ​​și ribonucleat de magneziu, care este absent în bacteriile gram-negative. Colorația Gram pe suprafața celulelor gram-pozitive formează un complex puternic de proteine, ribonucleat de magneziu, violet de gențiană și iod, care nu este distrus prin tratamentul cu alcool. Astfel de bacterii rămân colorate cu albastru. Violet. Bacteriile Gram-negative nu au capacitatea de a reține vopseaua și devin decolorate atunci când sunt tratate cu alcool. Pentru a le identifica, preparatul este colorat cu fucsin. Bacteriile Gram negative colorează roșu.

Etape ale colorației Gram diferențiate:

Un frotiu fix este acoperit cu o bucată de hârtie de filtru (1,5 x 1,5 cm) și se aplică o soluție carbolic de violet de gențiană sau violet cristal până la umezirea completă (modificarea Sinev este mai des folosită). Colorarea se efectuează timp de 1-2 minute.

Se indeparteaza hartia, se scurge colorantul si, fara a se spala preparatul cu apa, solutia Lugol se aplica pe preparat timp de 1-2 minute pana cand frotiu devine negru.

Soluția de Lugol se scurge, frotiul colorat este decolorat cu alcool etilic 96º. Pentru a face acest lucru, medicamentul este plasat de 2-3 ori într-un pahar cu alcool până când fluxurile violet nu se mai desprind (timpul de decolorare nu este mai mare de 30 s) sau se toarnă 2-4 picături de alcool pe frotiu timp de 30- 45 s.

Medicamentul este spălat rapid cu apă (așa cum este descris mai sus).

Frotiul este colorat suplimentar timp de 1-2 minute cu o soluție apoasă de fuchsin (fuchsin Pfeiffer).

Vopseaua se scurge, preparatul se spală cu apă, se usucă cu hârtie de filtru.

microscopat cu un sistem de imersie.

Bacteriile Gram pozitive colorează violet, bacteriile Gram negative se colorează cu roz.

Nucleoid. Este dificil să detectezi un nucleoid într-o celulă bacteriană folosind un microscop cu lumină. Pentru colorarea selectivă a nucleoidului, celulele fixe sunt pre-tratate cu ribonuclează sau acid clorhidric diluat pentru a degrada ARN-ul ribozomal. Colorarea ulterioară cu colorantul principal face posibilă dezvăluirea nucleoidului sub formă de corpuri dense cu contururi neregulate situate în centrul sau la polii celulei.

Colorarea Ziehl-Neelsen a bacteriilor acido-rezistente reflectă caracteristicile micobacteriilor și nocardiei.

Principiul metodei. Rezistența la acid a acestor bacterii este asociată cu continut ridicat lipidele din peretele celular. Bacteriile rezistente la acizi sunt colorate cu fuchsin carbolic Ziehl atunci când preparatul este încălzit în roșu și păstrează această culoare după decolorare cu acid sulfuric. Bacteriile non-acido-rezistente sunt decolorate cu acid și apoi colorate cu albastru cu albastru de metilen.

Pentru detectarea capsulelor folosind o varietate de metode, inclusiv Metoda Burri și Burri Guinsa . Metoda se bazează pe contrast negativ. Deoarece capsula sau corpul celulei microbiene nu percep coloranții, doar fundalul micropreparatului este colorat cu cerneală. Capsula este vizibilă ca o zonă nepătată pe fundalul întunecat al frotiului de cerneală. Conform metodei Burri-Gins, corpurile celulelor microbiene sunt în plus colorate în roșu cu fuchsin.

Pentru colorarea flagelului Au fost propuse mai multe metode, pasul comun pentru care este gravarea preparatului (de obicei cu soluții de tanin, KAl(SO 4) 2 , HgCl 2) și colorarea ulterioară (adesea cu o soluție carbolica de fuchsin). Ca urmare, colorantul este depus pe flageli, datorită căruia se realizează simultan atât o creștere a grosimii lor, cât și o scădere a transparenței. Una dintre metodele propuse pentru colorarea flagelilor este metoda lui Leifson. Preparatul este microscopat cu un sistem de imersie. Celulele bacteriene devin roșii, flagelii iau forma unor filamente groase care se extind din celulă.

Întrebări pentru autocontrol

1 Enumerați principalele tipuri de celule morfologice ale microorganismelor.

2 Descrieți structura schematică a unei celule bacteriene.

3 Enumerați etapele de preparare a preparatelor fixe de microorganisme, descrieți-le.

5 Clasificați coloranții utilizați în microbiologie, caracterizați-i.

Practica 4

Ţintă: familiarizarea cu metodele de preparare a preparatelor fixe, metode simple și complexe de colorare; familiarizarea cu morfologia și citologia diferitelor microorganisme.

Materiale si echipamente: microscoape biologice, lame de microscop și lamele, lămpi cu spirt, bucle bacteriene, ulei de imersie, pipete sterile, pensete, hârtie de filtru, chibrituri, tampoane igienice de vată, markere, vase Petri sterile, pe grup - într-un balon de 50 ml apă sterilă de robinet, distilată apă pentru spălări, spălări, cuve, punți, un set de soluții de vopsea gata făcute în suport, alcool 96 0, pipete, infuzii din materiale naturale: carne, mazăre etc.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="(!LANG:> TEHNICA DE PREGĂTIREA CURSULUI. METODE DE VOPSIE.">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="(!LANG:> Reguli de siguranță în sala de microbiologie (laborator)"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="(!LANG:> Reguli pentru lucrul cu cultura vie. 1. Principalul lucru atunci când semănat cultură vie – aceasta este"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="(!LANG:> Reguli pentru pregătirea și păstrarea ochelarilor (subiect, coperți) Subiectul și lamelele"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="(!LANG:> salvare"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в !} solutie alcalina paharele se clătesc cu apă curentă de la robinet, se scufundă timp de 10-15 minute într-o soluție de acid clorhidric 5-10% și apoi se spală cu apă curentă. Lamelele și lamelele uzate contaminate cu vopsea și ulei de imersie sunt tratate în felul următor: se scufundă timp de 2 ore în concentrat. acid sulfuric sau amestec de crom, apoi spălat bine cu apă curentă de la robinet; se toarnă 5% soluție de bicarbonat de sodiu sau alcali (potașă caustică sau sodă caustică), se pune la foc mic și se fierbe 30-40

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="(!LANG:> ETAPE DE PREGĂTIRE. 1. Pregătirea frotiului 2. Uscarea 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="(!LANG:> Retete pentru prepararea colorantilor Carbolic"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="(!LANG:>"> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В !} mâna stângă luați o eprubetă cu o soluție fizică sterilă (apă distilată) și puneți-o între degetele 1 și 2 astfel încât palma să fie sub eprubetă și gâtul eprubetei să fie îndreptat către zona lămpii cu alcool. bucla bacteriana in dreapta, ca un creion.Bucla este flambata pana la inrosire, mai intai pe orizontala, apoi pe verticala.bule de eliberare, degetul mic mana dreapta apăsați dopul fizic. soluția pe palma și scoateți-o cu grijă din eprubetă. Mișcările trebuie să fie netede.Gâtul eprubetei este ars în flacără și se introduce o buclă.Se preiau cu o buclă de ieșire fizică. soluție și puneți câteva picături pe sticlă în limitele frotiului. Închideți dopul, trecând în prealabil dopul și gâtul eprubetei prin flacăra lămpii cu spirt. Așezați eprubeta într-un trepied.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="(!LANG:> Luați tubul de cultură în mâna stângă și puneți-l ca tub"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="(!LANG:>"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt="(!LANG:>Schema de pregătire a frotiului">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="(!LANG:> Tipuri de fixare q Fizic - în flacăra unei lămpi cu alcool q Substanță chimică"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="(!LANG:> Metode de colorare: Complex simplu (Gram, Ziehl-Nielsen, Orzesh) , Buri-Gins).">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="(!LANG:> METODE SIMPLE PENTRU COLORAREA SMEARS-urilor anilină, coloranți de bază"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt="(!LANG:> Cu o metodă simplă de colorare, câteva picături de orice alcool sau apă"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt="(!LANG:>Cu o colorare simplă, corpurile microbiene percep culoarea vopselei aplicate la fel de intens ca"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из !} cultură pură) sunt vopsite în aceeași culoare, dar oarecum mai palide. Magenta și violeta de gențiană sunt vopsele de colorare mai intens; petele de albastru de metilen mult mai palide. Percepția culorii depinde nu numai de proprietățile culorilor, ci și de proprietățile microbilor care sunt vopsiți. Majoritatea microbilor se colorează ușor și rapid cu apă sau soluții de vopsele alcool-apă. Pentru a crește capacitatea de colorare, vopseaua este expusă la temperaturi ridicate (încălzire) până când apar vapori (până la fierbere). Variind gradul de încălzire, este posibil să se obțină diferite grade de rezistență a culorii. Extinderea timpului de expunere al soluției de colorare la obiect poate, de asemenea, spori gradul de colorare într-o anumită măsură.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="(!LANG:> COMPLEX Metode de colorare Bazate pe caracteristicile structurii fizico-chimice celula microbiană.Esenţa acestor metode"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="(!LANG:> METODA GRAM v Aplicați violet de gențiană pe un tampon fix"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt="(!LANG:>Raportul dintre bacterii și colorația Gram este determinat de capacitatea lor de a retine formata in"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="(!LANG:> GRAM-NEGATIV ȘI GRAM-POZITIV"> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt="(!LANG:>Streptococci Gr+ coci dispuşi în lanţuri Streptococcus Gr+faptogene Enterococcus Gr+coccus picococcus fapt."> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="(!LANG:> Vibrio Gr- Vibrio cholerae"> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="(!LANG:> DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI PLAMANE PRIN BACTERODIOSCOPIC)"> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt="(!LANG:>COLORARE a) Acoperiți frotiul cu hârtie de filtru și aplicați pe întreaga suprafață a hârtiei fuchsin carbolic"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="(!LANG:> METODA ZIEHL-NIELSEN (INSTRUCȚIUNE 1999)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="(!LANG:> METODA ZIEHL-NIELSEN"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="(!LANG:> DETECȚIA CAPSULELOR ÎN BACTERII Unii microbi"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="(!LANG:>"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt="(!LANG:>BURRI AND BURRI-GINS Stain Capsule in Klebsiella pneumonia">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="(!LANG:>"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="(!LANG:> PETA OZZHZKO Pe frotiu uscat (nefixat!) + mai multe!"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="(!LANG:> Studiu de motilitate a microorganismelor."> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="(!LANG:> METODA PICĂRĂRII STRĂMITE O picătură este aplicată pe o lamă de sticlă cu un pipeta sau bucla"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="(!LANG:> Flagelele vin în lungimi diferite. Diametrul lor este atât de mic încât sunt invizibili în"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt="(!LANG:>Determinarea motilității bacteriene prin metoda „picăturii suspendate”. Young. picătură (18 -20 ore) bulion"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="(!LANG:> METODA DE ARGÂNTARE"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля!}

Trăim într-o lume a bacteriilor. Sunt în jurul nostru și în interiorul corpului nostru. Nu e de mirare că vrem să știm cât mai multe despre ele. Dar cum să iei în considerare și cu atât mai mult să studiezi ceva atât de mic? Microscopul, se pare, ar trebui să rezolve această problemă. Dar nu totul este atât de simplu - în starea lor naturală, microorganismele sunt transparente ca sticla. Diverse metode de colorare a bacteriilor ajută la „arată” imaginea, ajutând la explorarea structurii externe și interne a microbilor.

La sfârșitul secolului al XIX-lea, biologul danez Christian Gram a propus o soluție la această problemă. Dacă ceva este invizibil, trebuie să fie pictat și să vedeți ce se întâmplă. Metoda de colorare a bacteriilor propusă de Gram a fost atât de convingătoare încât până în prezent microorganismele sunt împărțite în gram-pozitive (reține culoarea) și gram-negative (decolorarea după tratamentul cu alcool).

După cum sa dovedit, celulele sunt acoperite cu o membrană similară cu firele împletite. Și deși nutrienții necesari celulei trec liber în golurile dintre fire, carcasa protejează în mod fiabil „lumea interioară” de factorii externi agresivi. La diferite tipuri de bacterii, peretele exterior al celulei are o grosime, densitate și o densitate diferită compoziție chimică. Pe această proprietate a membranelor celulare se bazează metoda colorării Gram.

Pe baza lucrărilor lui Christian Gram, biologii au dezvoltat noi metode care permit nu numai determinarea formei și dimensiunii celulelor, ci și luarea în considerare a unor detalii ale structurii lor. Uneori, microorganismele care sunt complet identice ca aspect reacţionează diferit la coloranţi. Informațiile obținute fac posibilă determinarea rapidă și precisă a tipului de bacterii.

Vechi nu înseamnă rău

Poate cea mai practică și utilizată metodă de colorare a microorganismelor este metoda Gram. Frotiul, fixat prin foc, se acoperă cu colorant violet de metil, se fixează cu iod, se usucă și se spală cu alcool. În această etapă, în funcție de proprietățile membranei celulare, bacteriile devin:

• albastru strălucitor (gram-pozitiv);
• incolor (gram negativ).

Grosimea învelișului celulelor care rămân incolore nu permite colorantului să pătrundă în interior și este ușor de îndepărtat de pe suprafața bacteriilor. Etapa finală în colorația Gram este utilizarea colorantului roșu, care rămâne pe suprafața membranei celulare și îi conferă o nuanță roz sau roșie.

Bacteriile Gram-pozitive sunt în general periculoase pentru oameni. În această categorie sunt incluse streptococii, stafilococii, bacilii, clostridiile etc. Cei Gram negativi nu sunt atât de periculoși. De asemenea, pot provoca boli și inflamații, dar numai în anumite condiții. Astfel, prin simpla preparare a unui preparat colorat, se poate face o idee despre gradul de pericol al microorganismelor studiate.

Metode vitale de colorare

În funcție de starea organismelor studiate în microbiologie, există:

• metodă vitală, adică lucrul cu bacterii vii (periculoasă, necesită respectarea strictă a măsurilor de siguranță);
• metoda post-vitală – lucru cu celule fixe (ucise);
• negativ, poate fi vital și post-vital, convenabil pentru lucrul cu capsule.

Metoda vitală este de departe cea mai periculoasă, deoarece cercetătorii trebuie să se ocupe de celule vii, uneori mortale. Cu toate acestea, această metodă face posibilă studierea nu numai a structurii celulei, ci și a întregului său ciclu de viață și a interacțiunii cu mediul.

Pentru multe studii microbiologice, este important să menținem bacteriile în viață. Aceasta înseamnă că este necesar să se utilizeze coloranți speciali netoxici sau cu toxicitate scăzută, care, în plus, pătrund ușor în structura celulară prin învelișul exterior. Acestea sunt așa-zișii coloranți vitali, cărora le pot fi destinați lumina vizibila sau fluorescent. După compoziția chimică, coloranții sunt împărțiți în:

• bazic (portocaliu de acridină, albastru de metilen);
• acid sau acru (indigo carmin, fuchsin acru);
• neutru (rodamină B).

Lucrul cu medicamente fixe

În funcție de complexitatea lucrării, metodele de colorare a celulelor fixe (nevii) sunt împărțite în:

1. Metode simple. În acest caz, se folosește o singură vopsea, de obicei roșu (magenta) sau albastru (albastru de metilen). Diferența dintre acești coloranți este viteza de expunere. Fuchsin dă rezultatul după 1-2 minute, în timp ce rezultatul vopselei albastre trebuie așteptat 3-5 minute. De asemenea, este convenabil să folosiți o soluție de fuchsin în acid carbolic (așa-numita fucsină a lui Ziel), deoarece preparatul preparat nu își pierde proprietățile de colorare timp de câteva luni. Colorantul albastru de metilen poate fi preparat în prealabil într-o soluție puternică de alcool.
2. Metode complexe (diferențiale). Acest lucru va necesita mai mulți coloranți (cel puțin doi), având culoare diferita. Acest lucru va permite nu numai să vedeți bacteriile, ci și să studiați structura lor internă mai detaliat, deoarece diferite părți ale celulei pot percepe coloranții în mod diferit. Cele complexe includ metodele Gram, Ziehl-Nielsen (pentru bacterii acido-rezistente), Benignetti (colorarea flagelilor bacterieni), Gins (identificarea capsulelor), metoda de diferențiere a Romanovsky-Giemsa (colorarea sporilor) și altele.

Metodele complexe sunt deosebit de importante pentru diagnosticarea bolilor infecțioase, de exemplu, metoda colorării Neisser ajută la distingerea bacilului difteric de difteria falsă.

Metoda de diferențiere a Romanovsky - Giemsa se bazează pe utilizarea unei pulberi speciale gata preparate, pe baza căreia laboratoarele pregătesc o soluție de colorant cu concentrația dorită. Avantajul acestei metode este că citoplasma și nucleul celulei primesc o culoare diferită, ceea ce facilitează identificarea și studiul microorganismelor.

Metoda Neisser este folosită în medicină pentru a detecta boabele de volutină (granule cu hrană pentru multe celule procariote) în agenții patogeni difteriei. Ca urmare a colorării, bacteria dobândește galben, iar granulele de volutină sunt albastre.

Alb pe negru

Un alt tip de colorare a bacteriilor se bazează pe proprietățile negativului, adică bacteriile incolore sunt clar vizibile pe fundalul întunecat al preparatului, cu alte cuvinte, mediul este pătat și nu organismul însuși.

Uneori, bacteriile, ajungând în anumite condiții, formează capsule. Acestea sunt formațiuni mucoase care acoperă celula, oarecum asemănătoare cu un gel. Capsulele sunt transparente, compoziția lor chimică poate varia foarte mult în diferite tipuri de bacterii, de exemplu. doar pictați și evaluați rezultatul după culoarea rezultată nu va funcționa.

În plus, capsulele sunt moi și fragile, își pot pierde forma atunci când sunt vopsite. Agenții de colorare nu interacționează bine cu structura gelatinoasă a capsulelor și sunt ușor de spălat în timpul procesării. Pentru a detecta, dar nu a deteriora capsulele, este utilă o metodă de colorare negativă.

Una dintre metodele de detectare a capsulelor este metoda de colorare Guins. Pe marginea unei lame de sticlă se aplică o picătură de cerneală neagră, se adaugă materialul de testat, se amestecă și se distribuie pe toată suprafața. Frotiul este uscat la aer, fixat și colorat cu Ziehl magenta. După 2-3 minute, clătiți cu apă și uscați. Ca rezultat, celulele roz înconjurate de capsule transparente sunt clar vizibile la microscop pe un fundal general întunecat.

Colorarea bacteriilor care formează spori

Dacă vorbim despre membranele celulare, atunci nu putem să nu ne amintim bacteriile care formează spori. Sporii se formează în condiții nefavorabile pentru celulă și pot exista într-un mediu agresiv destul de mult timp. Ceea ce este bun pentru conservarea celulei este rău pentru studierea ei. Sporii sunt foarte denși și aproape impermeabili la lichide, în plus, sunt rezistenți la acizi. Prin urmare, o simplă pată sau metoda Gram va lăsa sporii incolori.

Înainte de colorare, suprafața sporilor trebuie tratată chimic, astfel încât să își schimbe ușor structura și să permită coloranților să pătrundă în interior. În acest caz, întreaga citoplasmă a celulei este, de asemenea, colorată. Pentru a decolora citoplasma, preparatul este spălat și uscat. Colorantul din spori, datorită structurii lor mai dense, este reținut mai bine decât în ​​citoplasmă.

Metodele de colorare a sporilor pot fi diferite, de exemplu, Orzeshko sau Ziehl-Nielsen, dar toate se reduc la aceeași schemă:

• slăbirea suprafeței sporilor chimicale(acizi, amoniac, sodă caustică);
• colorarea unei celule cu un spor (de obicei atunci când este încălzită);
• decolorarea citoplasmei.

Ca rezultat, obținem un spor viu colorat perfect vizibil și o citoplasmă palidă, aproape transparentă.

Cum se examinează flagelul bacterian

O altă sarcină dificilă este colorarea bacteriilor cu flageli. Acestea sunt fire foarte subțiri răsucite spiralat pe care microorganismele le folosesc pentru a se deplasa. Flagelii sunt neobișnuit de subțiri; atunci când sunt colorați, se desprind ușor de celulă. Prin urmare, înainte de colorare, flagelii sunt gravați, crescând artificial în volum.

La pregătirea microorganismelor pentru studiu, cultura bacteriană este subcultivată de mai multe ori pe un mediu nutritiv proaspăt timp de câteva zile. Apoi bacteriile cu flageli sunt transferate într-o eprubetă cu apă sterilă (t 37⁰С). Faceți acest lucru cu mare atenție, fără a amesteca lichidul, pentru a nu deteriora flagelul.

Conținutul eprubetei este lăsat timp de aproximativ o oră, astfel încât bacteriile să fie distribuite uniform în volum. Înainte de începerea studiului, se verifică motilitatea celulară într-o picătură suspendată. Dacă nu există nicio mișcare, tubul este lăsat mai mult timp.

Când soluția este aplicată pe o lamă de sticlă, celulele își pot pierde cu ușurință flagelul. Prin urmare, suprafața de sticlă trebuie să fie perfect curată și fără grăsimi. Înainte de a aplica picături de soluție, o lamă de sticlă este ținută peste partea fierbinte a flăcării arzătorului, astfel încât picăturile căzute la suprafață să se răspândească și să se usuce rapid.

După uscare, frotiu este gravat, după 15 minute substanța chimică este spălată. Următoarea etapă - colorarea cu fuchsin - se realizează prin scufundarea sticlei într-o soluție de colorant pentru a nu deteriora flagelul la aplicarea vopselei.

După menținerea timpului potrivit, frotiul se spală cu apă și se usucă. Acum puteți trece la studiul rezultatului rezultat.

Tehnica de colorare

Pentru a obține un preparat colorat, nu se poate lua pur și simplu o pensulă, vopsește și prinde o bacterie. Există o anumită schemă pentru lucrul cu microorganisme:

1. Prepararea frotiului. Pe o lamă de sticlă (sterilă) se aplică o picătură de apă, în care materialul de laborator este apoi introdus cu o ansă bacteriologică și distribuit pe suprafață.
2. Uscare. Excesul de lichid este fie uscat în mod natural la temperatura camerei, fie frotiul este ușor încălzit deasupra flăcării arzătorului.
3. Fixare. Nu este suficient doar să eliminați apa, trebuie să fixați bacteriile pe o lamă de sticlă. Pentru a face acest lucru, puteți folosi foc (mai multe treceri peste partea cea mai fierbinte a flăcării) sau lichid (alcool, acetonă). După o astfel de prelucrare, microorganismele absorb mai repede vopseaua.
4. Colorare directă. Vopseaua ar trebui să acopere complet întreaga suprafață a frotiului. După ce a rezistat la momentul potrivit (pentru fiecare colorant propriu), vopseaua este îndepărtată și preparatul este spălat cu apă.

După uscare (de obicei în mod natural), rezultatul poate fi folosit în scopul propus.

Colorarea microorganismelor este un întreg sistem de metode, tehnici, scheme care vizează detectarea și recunoașterea celulelor cu ajutorul unui microscop. Fără cercetare medicală sau munca stiintificaîn microbiologie nu se pot face fără pregătirea prealabilă și colorarea materialului studiat.

Colorarea microorganismelor (vopsirea microbilor) este un set de metode și tehnici pentru studiul exteriorului și structura interna microorganisme, o metodă de tehnologie microbiologică care permite să se facă distincția între tipurile de microorganisme. Metoda este utilizată pe scară largă în bacteriologia aplicată pentru a determina forma, dimensiunea, structura, localizarea, poziția relativă a microbilor și structura organelelor lor. Fără colorare, microbii, cu excepția unor ciuperci, sunt practic invizibili la microscopul optic, datorită contrastului lor scăzut. După tratament, membranele și/sau organitele microbilor capătă o culoare care contrastează cu fundalul.

// Informatii generale despre metoda

Preparatele microbiene sunt expuse la reactivi chimici, de obicei coloranți sau tetroxid de osmiu. Ca urmare a procesului fizico-chimic de interacțiune a colorantului cu compuși chimici obiectelor, pentru a-i conferi artificial o anumită culoare, devine posibil să se determine tipul de microorganism, sau cel puțin tipul membranei acestuia (vezi colorația Gram).

Metodele de vopsire sunt împărțite în vitale, post-vitale și negative, acestea din urmă pot fi vitale și post-vitale.

Metoda de colorare vitală

Pentru vopsirea vitală (pe durata de viață), se folosesc soluții apoase 0,2-0,001% de albastru de metilen și toluoidină, neutralrot și roșu Congo, care se adaugă la picăturile de cultură presate sau suspendate. Această metodă dezvăluie spirochete, protozoare, determină mobilitatea bacteriilor, umflarea imună a capsulei, dar utilizarea acesteia necesită respectarea strictă a regulilor care exclud infecția de laborator.

Metode de colorare postvitală

Metodele de vopsire a preparatelor fixe (post-vitale) sunt împărțite în simple și complexe. Cu metode simple, soluții de colorare de Pfeiffer fuchsin (expunere 1-2 minute), albastru de metilen alcalin (3-5 minute) sunt aplicate pe un preparat fix, astfel încât să acopere complet frotiul, colorantul este scurs, preparatul este spălat cu un jet de apă, agitat, uscat și microscopat.
Căi simple fac posibilă aprecierea dimensiunii, formei, localizarii, aranjarea reciprocă a celulelor individuale, dar cu ajutorul lor este imposibil să se stabilească structura microbilor și adesea relația lor diferențiată cu coloranții.
Dintre metodele complexe de colorare a bacteriilor, metoda Gram diferențiată, detectarea rezistenței la acizi conform Ziehl-Nelson, determinarea granulelor de volutină după Leffler sau Neisser, metoda diferențierii Romanovsky-Giemsa, metoda negativ-pozitiv pentru determinarea capsula după Gins-Burri, detectarea sporilor după Peshkov sau Ziel - Nelson și alții.
Pentru colorarea protozoarelor se utilizează metoda Romanovsky-Giemsa și colorarea cu hematoxilină-eozină.
Ciupercile sunt examinate nepătate sau prin metodele Gram, Ziel - Nelson, Leffler, Romanovsky - Giemsa, precum și soluția Lugol, lactofuchsin etc.

Metoda Gram este o metodă de colorare a microorganismelor pentru cercetare, care permite diferențierea bacteriilor în funcție de proprietățile biochimice ale peretelui lor celular. Propus în 1884 de medicul danez G.K. Gram.

Potrivit Gram, bacteriile sunt colorate cu coloranții principali - gențiană sau violet de metil etc., apoi colorantul este fixat cu o soluție de iod. La spălarea ulterioară a preparatului colorat cu alcool, acele tipuri de bacterii care se dovedesc a fi puternic colorate se numesc bacterii gram-pozitive - spre deosebire de gram-negative (Gram (-)), care se decolorează la spălare.

// Utilizare în diagnosticare

Pata Gram are mare importanțăîn taxonomia bacteriilor, precum și pentru diagnosticul microbiologic al bolilor infecțioase.

Formele gram-pozitive ale bacteriilor cocice și purtătoare de spori, precum și drojdiile, sunt vopsite în culoarea albastru-negru (albastru închis).

Multe bacterii care nu poartă spori sunt gram-negative, se colorează în roșu, nucleii celulelor devin roșii aprinse, citoplasma devine roz sau purpurie.

Tehnica de colorare

Colorarea Gram se referă la o metodă complexă de colorare atunci când un frotiu este expus la doi coloranți, dintre care unul este principalul, iar celălalt este unul suplimentar. Pe lângă coloranți, agenții de albire sunt folosiți pentru metode complexe de colorare: alcool, acizi etc.

Pentru colorația Gram se folosesc cel mai des coloranții din grupa trifenilmetanului: gențiană, violet de metil sau violet cristal. Microorganismele Gram-pozitive Gram (+) dau o legătură puternică cu coloranții indicați și cu iodul. În același timp, nu se decolorează atunci când sunt expuse la alcool, drept urmare, cu colorarea suplimentară cu fucsin Gram (+), microorganismele nu schimbă culoarea violet adoptată inițial.

Microorganismele Gram-negative Gram (-) formează un compus ușor distrus de alcool cu ​​coloranți bazici și iod. Ca urmare, microbii se decolorează și apoi se pătează cu magenta, devenind roșii.

Pregătirea materialului pentru vopsire

Materialul de testat este întins într-un strat subțire pe suprafața unei lame de sticlă bine degresate. Frotiul preparat este uscat la aer și fixat după uscare completă. Secțiunile histologice sunt pregătite după o tehnică de rutină, fixând bucăți de țesut în formol și înglobând în parafină.

Fixare

La fixare, frotiul este fixat pe suprafața lamei de sticlă și, prin urmare, în timpul colorării ulterioare a preparatului, celulele microbiene nu sunt spălate. În plus, celulele microbiene ucise se colorează mai bine decât cele vii.

Se face o distincție între metoda fizică de fixare, care se bazează pe efectul temperaturii ridicate asupra celulei microbiene, și metodele chimice, care implică utilizarea de substanțe chimice care provoacă coagularea proteinelor citoplasmatice.

Mod fizic de fixare

Lama de sticlă cu preparatul se ia cu penseta sau degetele I și II ale mâinii drepte de coaste cu un frotiu în sus și cu o mișcare lină se efectuează de 2-3 ori peste partea superioară a flăcării arzătorului. Întregul proces de fixare nu trebuie să dureze mai mult de 2 secunde.

Fiabilitatea fixării este verificată prin următoarea metodă: suprafața lamei de sticlă liberă de frotiu este aplicată pe suprafața din spate a mâinii stângi. Cu fixarea corectă a frotiului, paharul ar trebui să fie fierbinte, dar să nu provoace o senzație de arsură.

Metoda chimică comite

Pentru a fixa frotiurile, alcool metilic, acetonă, amestecul lui Nikiforov (un amestec de alcool etilic 96% și ester anestezic în raport de 1: 1), lichidul lui Carnoy (alcool etilic 96% - 60%, cloroform 30%, acid acetic glacial 10). %), alcool -formol (40% formol 5 ml, alcool etilic 96 ° - 95 ml). O lamă cu frotiu uscat este scufundată într-o sticlă cu fixativ timp de 10-15 minute și apoi uscată la aer. Se folosește și fixarea în vapori de formol 40% pentru câteva secunde.

Procesul de colorare

Unul dintre coloranții principali este turnat pe un frotiu fix timp de 2-3 minute. Pentru a evita precipitarea, pătați prin hârtie de filtru.

Scurgeți vopseaua, îndepărtați cu grijă hârtia de filtru. Frotiul se umple cu soluție Lugol sau soluție de iodură Gram (o soluție apoasă de iodură de potasiu și iod cristalin în raport de 2: 1) timp de 1-2 minute până când preparatul devine negru.

Soluția se scurge, frotiul se clătește cu alcool etilic la 96 ° sau acetonă, se toarnă și se scurge până când frotiul se decolorează și lichidul care curge este limpede (aproximativ 20-40-60 de secunde).

Clătiți bine lamelele în apă curentă sau distilată timp de 1-2 minute.

Pentru a identifica grupul gram-negativ de bacterii, preparatele sunt colorate suplimentar cu fucsină sau safranină (2-5 min).

Clătiți cu apă curentă și uscați cu hârtie de filtru.

Tehnica de colorare a bacteriilor în secțiuni histologice conform Gram-Weigert

Secțiunile deparafinate sunt aduse la apă.

Se colorează timp de 20 de minute într-o soluție 1% de pararosanilină sau fuchsin bazic în 1% acid acetic(soluția de colorant este încălzită până la fierbere, răcită și filtrată).

Se spală în 3 schimburi de apă distilată.

Se colorează timp de 5 minute în cristal violet 1% în apă distilată.

Clătiți rapid în soluție de clorură de sodiu 1%.

Tratat timp de 30 de secunde într-un amestec: 1 parte iod + 2 părți iodură de potasiu + 100 părți apă distilată.

Udați cu hârtie de filtru.

Diferențiați prin aplicarea unui amestec pe tăietură volume egale anilină și xilen (1 - 2 ml); soluțiile se scurg până când norii de colorant încetează să se îndepărteze de tăietură.

Treceți prin 3 schimburi de xilen

Închis în balsam sau orice rășină dizolvată în xilen.

Rezultat: Bacteriile Gram pozitive sunt albastru-negru, fibrina este violet, nucleii sunt roșii.

Metoda Peshkov este folosită pentru colorarea endosporilor bacterieni.

Tehnica de colorare

Preparatul uscat dintr-o cultură de bacterii gram-pozitive se fixează în lichidul Carnoy timp de 15 minute, apoi se spală cu apă, se toarnă albastru de metilen conform Leffler și se încălzește până la apariția vaporilor, se fierbe 15-20 minute, după răcire preparatul este se spală și se colorează cu o soluție apoasă 0,5% de roșu neutru sau magenta conform Pfeifer 30-60 de secunde. Se usucă cu hârtie de filtru și microscop.

Rezultat colorare

Ca urmare, endosporii maturi sunt colorați cu albastru, endosporii tineri sunt colorați cu albastru închis, citoplasma este roșie, iar granulele de cromatină sunt colorate în violet.

Metoda de colorare Ziehl-Nelsen este o metodă de colorare a microorganismelor pentru a detecta micobacteriile rezistente la acid (agenți cauzatori ai tuberculozei, micobacteriozei, lepră), actinomicete și alte microorganisme rezistente la acid. Rezistența la acid a microorganismelor se datorează prezenței lipidelor, ceară și hidroxiacizilor în celulele acestora. Astfel de microorganisme se colorează slab cu soluții de coloranți diluate. Pentru a facilita pătrunderea colorantului în celulele microorganismelor, fuchsinul fenolic Tsilia aplicat preparatului este încălzit pe o flacără a arzătorului. Microorganismele colorate nu sunt decolorate de soluții slabe de acizi minerali și alcool.

Metoda poartă numele medicilor germani - microbiologul Franz Ziel (1857-1926) și patologul Friedrich Nelsen (1854-1898), care au dezvoltat-o ​​în 1882-1883.

Etape de colorare

1. Un frotiu fix este acoperit cu hârtie de filtru plată și se toarnă pe el fenol fuchsin Ziehl. Frotiu este încălzit peste flacăra unui arzător până când apar vapori, apoi este luat pentru răcire și se adaugă o nouă porție de colorant. Încălzirea se repetă de 2-3 ori. După răcire, îndepărtați hârtia de filtru și spălați preparatul cu apă.

2. Medicamentul se decolorează prin scufundare sau aplicarea unei soluții de acid sulfuric 5% sau alcool clorhidric 3% și se spală de mai multe ori cu apă.

3. Se colorează preparatele cu o soluție de apă-alcool de albastru de metilen timp de 3-5 minute, se clătesc cu apă și se usucă.

Când sunt colorate conform metodei Ziehl-Nelsen, bacteriile rezistente la acid devin intens roșii, restul microflorei se colorează în albastru deschis.

Colorația Romanovsky-Giemsa este o metodă citologică de colorare a protozoarelor, bacteriilor, structurilor celulare și țesuturilor de diferite tipuri (inclusiv sânge) folosind microscopia cu lumină. Colorează formațiunile acidofile în diferite nuanțe de roșu, formațiuni bazofile în culori de la violet la albastru.

// Pregătirea vopselei

Înainte de colorarea frotiurilor, colorantul lichid finit este diluat cu o rată de 1-2 picături de colorant la 1 ml de apă distilată. Frotiurile sunt colorate timp de 20 - 25 de minute la 37°C într-o cameră umedă (cuvă Petri închisă cu un filtru umezit în partea de jos). După colorare, frotiurile sunt spălate în apă curentă, uscate la aer și examinate prin imersie în ulei.

Amestecul colorant Romanovsky-Giemsa, care se bazează pe vopseaua lui Romanovsky Wright, sub formă de pulbere (colorant comercial) este dizolvat într-un amestec de volume egale de alcool metilic și glicerină (800 mg de colorant la 100 ml de solvent). Colorantul se dizolvă slab, așa că este mai bine să-l măcinați cu un solvent în cantitate de 300 mg la 100 ml, apoi, amestecând, adăugați colorantul până când se obține concentrația dorită. Pregătirea vopselei durează adesea câteva zile. Este important să folosiți ca solvenți alcool metilic și glicerină pur chimic, deoarece impuritățile degradează proprietățile colorantului. În loc de alcool metilic, se poate folosi alcool etilic 100%. Amestecul de colorant preparat este depozitat într-un loc uscat și răcoros, într-un vas bine închis.

tehnica de colorare

Frotiurile fixate în alcool metilic se colorează cu o soluție (1 ml de vopsea lichidă finită + 2 ml de soluție tampon de bază + 47 ml de apă distilată) timp de 40-120 de minute (durata colorării este selectată empiric). Ei folosesc un tampon fosfat, dar pH-ul tamponului depinde de tipul de frotiu: pentru un frotiu de măduvă osoasă - 5,8 - 6,0, pentru un frotiu de sânge - 6,4 - 6,5, pentru detectarea protozoarelor - 6,8, plasmodium malaric - 7 , 0 - 7,2.

Clătiți în apă distilată, uscați și examinați prin imersare.

Rezultat de culoare

Bacteriile colorează roșu-violet, albastru citoplasma celulară, nucleii roșu. La colorarea protozoarelor, citoplasma lor devine albastră, iar nucleii devin roșu-violet.