AKTIVNOST #4
TEMA: FIZIOLOGIJA MIKROORGANIZAMA. BAKTERIOLOŠKA (KULTURALNA) METODA ISTRAŽIVANJA. BIOHEMIJSKA SVOJSTVA MIKROORGANIZAMA.
CHECKLIST
Ishrana bakterija. Nutrijenti su izvori ugljika i dušika. Klasifikacija bakterija prema vrstama ishrane Autotrofi i hemoorganotrofi
Faktori rasta i njihovi izvori. Izvori mineralnih elemenata.
Načini i mehanizmi prijenosa hranjivih tvari kroz membranu.
Energetske potrebe bakterija. Načini dobivanja energije kod autotrofa (fotosinteza, kemosinteza). Izvori i načini dobivanja energije u hemoorganotrofima.
Aerobni i anaerobni tipovi biološke oksidacije u bakterijama. Aerobne, anaerobne, fakultativno anaerobne i mikroaerofilne bakterije. Načini stvaranja anaerobnih uslova.
Zadaci, faze, prednosti i nedostaci bakteriološkog (kulturološkog) metoda istraživanja.
Rast i razmnožavanje mikroorganizama. Metode reprodukcije. Binarna (jednostavna) fisija, mehanizam. Reprodukcija bakterijskih populacija.
Principi i metode uzgoja bakterija. Nutritivne potrebe mikroba.
Hranjive podloge za uzgoj bakterija. potrebe za nutrijentima. Klasifikacija hranljivih podloga.
Uslovi i tehnike uzgoja bakterija. Tehnika sjetve na hranljive podloge. Pravilnosti i karakter rasta bakterija na gustim i tekućim hranjivim podlogama.
Metode za izolaciju čistih kultura aerobnih i anaerobnih bakterija.
Svojstva koja se koriste za identifikaciju izolovanih kultura.
SAMOSTALNI I LABORATORIJSKI RAD
Bakteriološka metoda(etape):
1 1. faza izolacija čiste kulture aerobnih bakterija: A) Mikroskopija patološkog materijala.
Bojenje razmaza iz patološkog materijala po Gramu. Nacrt droge.
B) Ovladavanje, pod vodstvom nastavnika, tehnikom sijanja patološkog materijala bakteriološkom petljom i lopaticom na tanjirne hranljive podloge.Inokulacija patološkog materijala bakteriološkom petljom na lamelarnom mesno-peptonskom agaru (MPA) za dobivanje izoliranih kolonija.
Klasifikacija medija kulture(navesti područja primjene)
1. Po konzistentnosti:tečnost (mesno-peptonski bujon, žuč, šećerna čorba), gusta (2-3% agar) i polutečna (0,15-0,7% agar) podloga.
2. Po poreklu:prirodno - od mleka, mesa. jaja, krompir, ljudski krvni serum, životinjski i drugi proizvodi; umjetna - 1) prirodne uravnotežene mješavine nutrijenata u koncentracijama i kombinacijama potrebnim za rast i reprodukciju mikroorganizama, univerzalni izvor dušika i ugljika - peptoni - proizvodi nepotpune razgradnje proteina pomoću pepsina ili raznih hidrolizata (riba, kazein, kvasac itd.). 2) sintetički cprecizan hemijski sastav Soton za mikobakterije, 199 za ćelije.
3. U sastavu: jednostavni mediji kulture (mesno-peptonski bujon-MPB, mesno-peptonski agar-MPA) i so netačno (KA = MPA + 5-10% životinjske krvi)
4. Po dogovoru:
ALI) opće namjene - univerzalna, namijenjena za uzgoj svih mikroorganizama (MPA, KA)
B ) Posebanza uzgoj mikroorganizama koji ne rastu na univerzalnim podlogama, diferencijaciju vrsta i selektivnu izolaciju određenih vrsta mikroorganizama:
izborni (selektivni) za izolaciju određenih vrsta mikroorganizama i suzbijanje rasta srodnih - (slani agar za stafilokoke).
diferencijalna dijagnostika (DDS)-okruženja koja omogućavaju razlikovanje vrsta bakterija prema enzimskoj aktivnosti; Oni sa poseduju: 1) univerzalnu hranljivu podlogu (MPA, KA); 2) faktor diferencijacije - hemijski supstrat (npr. ugljeni hidrat), različit odnos prema kome je dijagnostičko obeležje za dati mikrob 3) Indikator čija promena boje ukazuje na biohemijsku reakciju. (okruženje Enda, Ploskireva, Gissa i dr.).
diferencijalno selektivni (DS) - okruženja koja dozvoljavaju dodijeliti bakterije određene vrste prema svojim fiziološkim karakteristikama i razlikuju se od drugih vrsta prema enzimska aktivnost Sadrže: 1) MJU 2) izborni hemijski supstrat koji inhibira rast drugih vrsta bakterija . 3) faktor diferencijacije - supstrat na koji je dijagnostička karakteristika za ovaj mikrob;) 4.) Indikator čija promjena boje ukazuje na biohemijsku reakciju. (Srijedom za stafilokoke, ICA za salmonelu, Ploskirev za šigelu i salmonelu).
B) Obogaćivanje medij za razmnožavanje i nakupljanje bakterija određene vrste u kliničkom materijalu (krv u 20% žuči = salmonela, iscjedak iz grla u 10% seruma + 2% telurit = korinebakterija.)
D) Transport medij za sakupljanje i isporuku (očuvanje) kliničkog materijala = 48 sati (Amies medijum - polutečni agar + aktivni ugljen).)
Hranljivi mediji(primjeri):
srijeda Endo Srednji tip diferencijalna dijagnostika za enterobakterije Nutrient Base MPA faktor diferencijacije laktoza 1% Indikator osnovni fuksin obezbojen natrijum sulfitom. E.s oli razgrađuju laktozu do kiseline - kolonije su crvene s metalnim sjajem, patogeno bezbojne;
Slani agar Srednji tip selektivno za izolaciju stafilokoka Nutrient Base MPA elektivni faktor natrijum hlorid 10%
srijeda Ploskirev Srednji tip diferencijalno selektivnoza enterobakterije
Nutrient Base MPA elektivni faktor žučne soli faktor diferencijacije laktoza
Indikator neutralno crvena
Agar od žumanca i soli Srednji tip diferencijalna selektivna za S . aureus _
Nutrient Base MPA elektivni faktor natrijum hlorid 10%
faktor diferencijacije žumance
Indikator br
2 Faza 2 bakteriološka metoda istraživanja (izolacija čiste kulture):
A) Proučavanje izolovanih kolonija (ešerihija, stafilokok) na lamelarnom MPA.
|
Proučavao kulturna dobra |
1 vrsta kolonija |
2 vrste kolonija |
|
oblik kolonije |
Pravilnog oblika, okrugla |
Ispravna forma |
|
Dosljednost |
homogena |
homogena |
|
Veličina kolonije |
srednje (veličina 2-4 mm) | |
|
Priroda ruba |
sa glatkim ivicama |
sa glatkim ivicama |
|
Priroda površine |
konveksan |
B) Priprema razmaza iz odabranih kolonija (boja po Gramu).
C) Transfer izolovanih kolonija u nagnutu MPA radi akumulacije čiste kulture.
3 Izolacija čiste kulture anaerobnih bakterija: inokulacija zemljišne suspenzije na podlogu Kitta-Tarozzi za izolaciju patogenih klostridija
Kitt-Tarozzi medijum se sastoji od hranljive čorbe, 0,5% glukoze i komada jetre ili mlevenog mesa za apsorpciju kiseonika iz medijuma. Prije sjetve, medij se zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji 20-30 minuta kako bi se uklonio zrak iz podloge. Nakon sjetve, hranljivi medij se odmah napuni slojem parafin
Metode za stvaranje anaerobioze:
1.fizički- ispumpavanje zraka, uvođenje posebne mješavine plinova bez kisika (obično N 2 - 85% CO 2 - 10%, H 2 - 5%), prethodno prokuhavanje medija za kulturu, inokulacija u duboku kolonu agara, punjenje podloge vazelinskim uljem radi smanjenja pristupa kiseoniku, upotreba hermetički zatvorenih bočica i epruveta, špriceva i laboratorijskog staklenog posuđa sa inertnim gasom, upotreba dobro zatvorenih eksikatora sa upaljenom svijećom
2. Hemijski- koriste se hemijski hvatači kiseonika.
3. Biološki - zajednički uzgoj strogih aerobnih i anaerobnih (aerobni apsorbiraju kisik i stvaraju uvjete za razmnožavanje anaeroba - Fortnerova metoda).
Wednesday Kitt - Tarozzi sastoji se od hranjivog bujona, 0,5% glukoze i komada jetre ili mljevenog mesa za apsorpciju kisika iz okoline. Prije sjetve, medij se zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji 20-30 minuta kako bi se uklonio zrak iz podloge. Nakon sjetve, hranljivi medij se odmah napuni slojemparafin ili vazelinsko ulje za izolaciju od pristupa kiseoniku.
4. Miješano - koristiti nekoliko različitih pristupa.
Za stvaranje anaerobnih uslova koriste se posebni uređaji - anaerostati. Trenutno najjednostavnija i najefikasnija oprema za stvaranje anaerobnih i mikroaerofilnih uslova je hemijska metoda sa specijalnim vrećicama koje djeluju na principu upijanja atmosferskog kisika u hermetički zatvorenim posudama .
Wilson-Blair medij (tube, šolje):
Nutrient Base MPA Respiratorni supstrat glukoze
Redukcioni faktor natrijum sulfit i gvožđe hlorid natrijum sulfitN / A 2 SO 3 → N / A 2 S
Za Wilson-Blair okruženje, osnova je agar sa dodatkom glukoze , Clostridia formu na ovom mediju kolonije crna boja zbog restauracije sulfit prije sulfid - anion , što je povezano sa katjoni žlezda (II) daje crnu so. Tipično crno na ovom obrazovnom mediju kolonije , pojavljuju se u dubini kolone agara .
Tioglikolni medij (medij za kontrolu steriliteta): (cijevi):
Nutrient Base BCH Respiratorni supstrat glukoze Redukcioni faktor natrijum tioglikolat
Indikator resazurin
Zeissler agar glukoze u krvi: (šalje): Nutrient Base MPA, krv
Respiratorni supstrat glukoze Redukcioni faktor hemoglobina
Uveden je termin "anaerobi".Louis Pasteurkoji je otkrio 1861bakterijemaslačna fermentacija.
ALIPredavanje 3 Fiziologija mikroorganizama. Metabolizam bakterija .
Fiziologija mikroorganizama uključuje :
vrste hrane;
vrste disanja;
uzgoj (uslovi, okruženje, karakter i stopa rasta);
biohemijska aktivnost;
varijabilnost;
oslobađanje biološki aktivnih supstanci, toksina i drugih faktora patogenosti;
preosjetljivost na antibiotike, bakteriofage, bakteriocine;
druga biološka svojstva.
Metabolizam bakterija - skup fizičkih i hemijskih procesa (hemijske transformacije i reakcije) čiji je cilj reprodukcija struktura i obezbeđivanje vitalnih funkcija mikrobne ćelije, kao što su:
rast i reprodukcija;
taloženje rezervnog prehrambenog materijala;
transport nutrijenata u mikrobnu ćeliju;
oslobađanje metaboličkih proizvoda (toksini, enzimi, antibiotici i druge biološki aktivne supstance);
saobraćaj;
formiranje spora;
adhezija na osjetljivim receptorima ćelija domaćina i prodiranje u njih;
različite adaptivne reakcije na promjene u vanjskom okruženju.
Anabolizam- skup biohemijskih reakcija koje provode sintezu ćelijskih komponenti.
katabolizam- skup reakcija koje ćeliji daju energiju.
Shema proučavanja metabolizma - faze:
1. Početni (periferni) metabolizam – prodiranje supstanci u ćeliju izvana i raspadanje do međuprodukata.
2. Amfibolizam (intermedijarni metabolizam) - stvaranje srednjih metaboličkih proizvoda zajedničkih kataboličkim i anaboličkim putevima.
3. Završne, strogo specijalizovane faze konstruktivnog metabolizma (dovode do izgradnje ćelijskih struktura) i energetskog metabolizma (formiranje ATP-a).
Mehanizmi za prodiranje hranljivih materija u ćeliju:
Jednostavna difuzija (za prava rješenja). energetski nezavisan proces.
Olakšana difuzija ("para nizvodno") - u pravcu gradijenta koncentracije uz učešće proteina nosača. energetski ovisan proces.
Aktivni transport je protiv koncentracijskog i elektrohemijskog gradijenta uz učešće permeaza (amino-, hidroksi-kiselinskih, jonskih itd.). Proces teče sa utroškom energije ATP, zavisi od naboja supstanci i njihove transformacije u procesu prenosa.
Mikroorganizmi se dijele u dvije grupe prema njihovoj sposobnosti da apsorbuju izvore ugljika: autotrofi (lat. autos - sebe, trofej - ishrana) sintetišu sve komponente ćelije koje sadrže ugljenik iz CO 2 kao jedinog izvora ugljenika i heterotrofa (lat. heteros - drugi, “hranjenje na račun drugih”) koriste različite organske spojeve koji sadrže ugljik.
Ovisno o izvorima energije, mikroorganizmi se također dijele na fototrofe (fotosintetske), sposobne za korištenje sunčeve energije, i kemotrofe (kemosintetske), koji energiju primaju redoks reakcijama.
Ovisno o korištenim donorima elektrona, bakterije se dijele na litotrofe (koristeći neorganske donore elektrona) i organotrofe (koristeći organska jedinjenja).
Prototrofi- mikroorganizmi sposobni sintetizirati sve organske spojeve koji su im potrebni iz soli glukoze i amonijuma.
Auksotrofi- mikroorganizmi nesposobni da sintetiziraju bilo koje organsko jedinjenje. Ova jedinjenja dobijaju gotova okruženje ili ljudsko telo.
Enzimi(od grč. fermentum-kiselo) - visoko specifični proteinski katalizatori prisutni u svim živim ćelijama, bez kojih život i reprodukcija nisu mogući. Enzimi prepoznaju svoje odgovarajuće metabolite (supstrate), stupaju u interakciju s njima i ubrzavaju kemijske reakcije. Enzimi su proteini.
Enzimski sastav mikroorganizma određen je genomom i prilično je stabilna osobina. Određivanje enzima se široko koristi za biohemijsku identifikaciju bakterija.
Endoenzimi katalizuju metabolizam unutar ćelije.
Egzoenzime ćelija luči u okolinu.
Konstitutivni enzimi se konstantno sintetiziraju u određenim koncentracijama.
inducibilno enzimi su enzimi čija koncentracija raste sa unosom odgovarajućeg supstrata.
Enzimi agresije: hijaluronidaza, fibrinolizin, neuraminidaza, kolagenaza, lecitinaza (licitovitelaza), koagulaza, ureaza, dekarboksilaze aminokiselina, deoksiribonukleaza.
uzgoj- dobijanje kultura mikroorganizama u vještačkom hranljivom mediju.
Ciljevi kultivacije:
dobijanje čistih kultura patogenih mikroorganizama i njihova identifikacija;
akumulacija biomase proizvođača BAS (vitamini, hormoni, aminokiseline, antibiotici, itd.);
nabavka dijagnostičkih i profilaktičkih preparata (cjepiva, dijagnostikuma);
skladištenje referentnih muzejskih kultura;
u sanitarnoj mikrobiologiji za određivanje sanitarno-indikativnih mikroorganizama – indikatora zagađenja životne sredine.
kulture- populacija mikroorganizama uzgajanih na hranljivoj podlozi.
čista kultura- populacija jedne vrste mikroorganizama uzgojenih iz izolirane kolonije na hranljivoj podlozi.
Većina patogenih mikroba se uzgaja na hranljivim podlogama na 37°C 1-2 dana.
Klasifikacija medija kulture
Po konzistentnosti: tečno, polutečno, gusto.
Porijeklo: prirodni (mlijeko, krompir), vještački, polusintetički, sintetički
U sastavu: jednostavne (MPA, MPB, povrće, mlijeko), složene (1% glukoze, 10-20% seruma, 20-30% ascitične tekućine, 5-10% defibrinirane krvi).
Po dogovoru:
univerzalni - mediji na kojima dobro rastu mnoge vrste bakterija. Tu spadaju mesno-peptonski bujon (MPB) i mesno-peptonski agar (MPA);
specijalne - podloge posebno pripremljene za dobijanje rasta bakterija koje ne rastu na univerzalnim podlogama;
diferencijalna dijagnostika - okruženja koja omogućuju razlikovanje jedne vrste bakterija od drugih enzimskom aktivnošću;
selektivni - mediji koji sadrže supstance koje koriste mikroorganizmi određenih vrsta i sprečavaju rast drugih mikroorganizama. Selektivni mediji vam omogućavaju da odaberete određene vrste bakterija iz materijala koji se proučava;
diferencijalno-selektivna - okruženja koja kombinuju svojstva diferencijalne dijagnostičke i selektivne sredine;
konzervans;
koncentriranje.
Razmnožavanje bakterija na tekućim i gustim hranjivim podlogama.
Rast koordiniranu reprodukciju svih komponenti bakterijske ćelije i povećanje njene biomase. reprodukcija- razmnožavanje i povećanje broja ćelija, što dovodi do stvaranja bakterijske populacije.
Bakterije karakterizira visoka stopa razmnožavanja. Brzina reprodukcije ovisi o vrsti, sastavu medij za rast, pH, temperatura, aeracija.
Na gustim hranjivim podlogama, bakterije formiraju nakupine stanica koje se nazivaju kolonije. Kolonije različitih vrsta razlikuju se po veličini, obliku, konzistenciji, boji, prirodi rubova, prirodi površine, transparentnosti.
Priroda rasta na tekućim hranjivim podlogama: filmska (formiranje filma na površini hranljivog medija), difuzna zamućenost, pri dnu (formiranje sedimenta).
Faze razvoja bakterijske populacije
Početna faza mirovanja (~ 1-2 sata). Broj bakterija se ne povećava, ćelije ne rastu.
Lag faza ili faza odlaganja razmnožavanja (~ 2 sata).
Log-faza - logaritamska ili eksponencijalna faza (~ 3-5h). Populacija se dijeli maksimalnom brzinom i postoji eksponencijalni porast jedinki.
Faza negativnog ubrzanja (~ 2 sata). Povezan sa iscrpljivanjem ograničavajućeg metabolita ili akumulacijom toksičnih metaboličkih proizvoda.
Stacionarna faza maksimuma. Broj formiranih i umirućih ćelija je isti.
Faza ubrzane smrti (~ 3 sata).
Logaritamska faza smrti (~5).
Faza smanjenja stope umiranja - preostali živi pojedinci prelaze u stanje mirovanja.
Energetski metabolizam bakterija
Aerobes- mikroorganizmi koji koriste aerobni (oksidativni) tip biološke oksidacije supstrata. Metabolizam aeroba se odvija samo u prisustvu visoke koncentracije slobodnog kiseonika u staništu, koji deluje kao konačni akceptor elektrona uzetih iz supstrata. Uzgoj aeroba se vrši na podlogama sa punim pristupom atmosferskom kiseoniku.
obavezni anaerobi- mikroorganizmi koji koriste anaerobni tip biološka oksidacija(fermentacija). Metabolizam se dešava samo u sredinama sa niskim redoks potencijalom u nedostatku kiseonika.
Povećanje koncentracije kisika u okolišu dovodi do odumiranja vegetativnih oblika.
Količina energije koja se ekstrahuje tokom fermentacije je mala, pa su obvezni anaerobi prisiljeni da fermentiraju veliku količinu supstrata.
Fakultativni anaerobi- mikroorganizmi sposobni da izvlače energiju iz supstrata aerobnim (oksidativnim) i anaerobnim (fermentativnim) putevima biološke oksidacije. Metabolizam se može odvijati kako u uvjetima punog pristupa kisika okolini, tako i u uvjetima anaerobioze.
Metode za stvaranje anaerobioze
Fizički
sijanje u kolonu šećera MPA;
prokuvavanje (regeneracija) tečnih hranjivih podloga praćeno uljem;
mehaničko uklanjanje kisika u anaerostatima;
zamjena kisika indiferentnim plinom;
Veillon-Vignal cijevi.
Hemijski
aparat Aristovskog;
svijeća Omelyansky ( alkalni rastvor pirogalol);
upotreba hemijskih akceptora kiseonika: glukoze, pirogrožđane kiseline, natrijum mravlje kiseline itd.
Biološki
Kitta-Tarozzi srijeda
Fortnerova metoda
Anaerobi - organizmi koji dobijaju energiju u nedostatku pristupa kiseonik prema supstratu fosforilacija , krajnji proizvodi nepotpune oksidacije supstrata mogu se oksidirati s više energije u oblikuATP u prisustvu terminalnog akceptora protona od strane organizama koji .
Anaerobno disanje- agregat biohemijske reakcije, koji se javlja u ćelijama živih organizama kada se koristi kao konačni akceptor protona, ne kiseonik i druge supstance (npr. nitrati) i odnosi se na procese energetski metabolizam(katabolizam,disimilacija), koji su okarakterisani oksidacijaugljikohidrati,lipida i amino kiseline na jedinjenja male molekularne težine.
ALI 
aerobne i anaerobne bakterije se preliminarno identificiraju u tekućem hranjivom mediju pomoću gradijenta koncentracije O2:
1. obavezni aerobik(bakterije koje zahtijevaju kisik) se uglavnom skupljaju na vrhu cijevi kako bi apsorbirale maksimalnu količinu kisika. (Izuzetak: mikobakterije - rast filma na površini zbog voštano-lipidne membrane.)
2. obavezna anaerobna bakterije se skupljaju na dnu kako bi izbjegle kisik (ili ne rastu). 3. Fakultativne bakterije sakupljaju se uglavnom u gornjim ( oksidativna fosforilacija je korisniji od glikolize), međutim, mogu se naći u cijelom mediju, jer ne ovise o O 2. četiri . mikroaerofili skupljaju se u gornjem dijelu epruvete, ali njihov optimum je niska koncentracija kisika. 5. Aerotolerantna anaerobi ne reagiraju na koncentracije kisika i ravnomjerno su raspoređeni po epruveti.
D 
za merenje kapacitet okruženja M. Clark predloženo je korištenje pH20 vrijednosti - negativno logaritamparcijalni pritisak gasoviti vodonik. Opseg karakteriše sve stepene zasićenosti vodenog rastvora vodonikom i kiseonikom. Aerobni rastu s većim potencijalom, fakultativni anaerobi, a obveznici s najmanjim.)
Klasifikacija anaeroba, razlikovati:
Fakultativni anaerobi
Kapneistički anaerobi i mikroaerofili
Aerotolerantni anaerobi
Umjereno strogi anaerobi
obavezni anaerobi
Ako se organizam može prebaciti s jednog metaboličkog puta na drugi (na primjer, s anaerobnog disanja na aerobna i obrnuto), tada se uslovno naziva fakultativnim anaerobima .
Do 1991. godine u mikrobiologiji je bila izdvojena klasa kapneističkih anaeroba koji zahtijevaju smanjenu koncentraciju kiseonik i povećana koncentracija ugljičnog dioksida (Brucella goveđi tip - B. abortus)
Metoda kulturološkog istraživanja je izolacija iz hranjivog medija bakterija određene vrste uzgojem, uz njihovu naknadnu identifikaciju vrsta. Vrsta bakterije se određuje uzimajući u obzir njihovu strukturu, kulturne i ekološke podatke, kao i genetske, biohemijske i biološke pokazatelje. Za bakteriološku dijagnostiku koriste se šeme koje je odobrilo Ministarstvo zdravlja.
Nazivaju se nove vrste bakterija koje potiču iz hranjivog medija čija svojstva još nisu utvrđena čista kultura. Nakon konačne identifikacije njihovih karakteristika, bakterije koje potiču iz određenog mjesta iu određeno vrijeme dobivaju ime. naprezati. U tom slučaju je dozvoljena mala razlika u svojstvima, mjestu ili vremenu izolacije soja jedne vrste.
Svrha metode:
1. Etiološka dijagnoza, odnosno izolacija i identifikacija čiste kulture bakterija.
2. Određivanje broja mikroorganizama i njihovih posebnih karakteristika. Na primjer, specifična reakcija na antibiotike.
3. Identifikacija intrageneričkih razlika mikroorganizama, na osnovu njihove epidemiološke i genetske komponente. Ovo je neophodno radi utvrđivanja zajedničkosti mikroorganizama izolovanih na različitim mestima i različitim uslovima, što je važno u epidemiološke svrhe.
Ova metoda istraživanja ima određeni broj faza, koje su različite za aerobne, fakultativne i obavezne aerobne bakterije.
Uzgoj čiste kulture za aerobne i fakultativne aerobne bakterije.
Faza 1
ALI) Pripremne aktivnosti. Ova faza uključuje prikupljanje, skladištenje i transport materijala. Također, ako je potrebno, može se preraditi, ovisno o svojstvima proučavane bakterije. Na primjer, kada se ispituje materijal na tuberkulozu, alkalne ili kisele otopine se koriste za identifikaciju mikrobakterija otpornih na kiseline.
B) Obogaćivanje. Ova faza je neobavezna i provodi se ako broj bakterija u materijalu za ispitivanje nije dovoljan za provedbu cjelovite studije. Na primjer, kod izolacije hemokulture, krv za ispitivanje se stavlja u podlogu u omjeru 1 prema 10 i čuva jedan dan na temperaturi od 37°C.
AT) Mikroskopija. Razmaz ispitivanog materijala se boji i ispituje pod mikroskopom - ispituje se mikroflora, njena svojstva i količina. U budućnosti, iz primarnog razmaza, potrebno je posebno izolirati sve mikroorganizme u njemu.
G) Stvaranje zasebnih kolonija. Materijal se nanosi na šolju, posebnim, selektivnim medijumom, za to se koristi petlja ili lopatica. Zatim okrenite čašu naopako da zaštitite kolonije od kondenzacije i ostavite u termostatu oko 20 sati, održavajući temperaturu od 37 o.
Bitan! Treba imati na umu da je u procesu istraživanja potrebno pridržavati se pravila izolacije. S jedne strane, za zaštitu ispitnog materijala i bakterija koje treba ukloniti, as druge strane, za sprječavanje kontaminacije okolnih osoba i vanjskog okruženja.
Što se tiče uslovno patogenih mikroorganizama, kada se uklone, bitne su njihove kvantitativne karakteristike. U ovom slučaju se provodi kvantitativno zasijavanje, pri čemu se nekoliko stotina puta razrjeđuje materijal u izotoničnoj otopini natrijevog klorida. Nakon toga se vrši setva u Petrijeve posude od 50 μl.
Faza 2
ALI ) Studija morfološka svojstva kolonije u podlozi i njihova mikroskopija. Posuđe se ispituje i zapaža svojstva mikroorganizama, njihov broj, brzina rasta i najpogodniji hranljivi medij. Za proučavanje je najbolje odabrati kolonije koje se nalaze bliže centru, a ako se formira nekoliko vrsta čistih kultura, onda proučavati svaku posebno. Za proučavanje čistoće morfotipa kulture koristi se razmaz kolonije, boji se (obično pomoću Gramove metode ili bilo koje druge) i pažljivo mikroskopski.
B) Akumulacija čiste kulture. Da bi se to postiglo, kolonije svih morfotipova stavljaju se u zasebne epruvete s hranjivim medijem i drže u termostatu na određenoj temperaturi (za većinu mikroorganizama prikladna je temperatura od 37 o, ali u nekim slučajevima može biti drugačija).
Kliglerov medij se često koristi kao hranljiva podloga za akumulaciju.U epruvetama ima "koso" izgled, gde je 2/3 njegovih delova u obliku stuba, a 1/3 je zakošena površina, obojena svetlocrvenom bojom. . spoj:
· MPA
· 0,1% glukoze
· 1% laktoze
· Specijalni reagens za vodonik sulfid
· Fenolno crveni indikator.
Faza 3
ALI) Nivo rasta i čistoća kulture. U opštem poretku, dobijena čista kultura ima ujednačen rast i, pod mikroskopskim pregledom, ćelije imaju istu morfološku i tinktorijalnu strukturu. No, postoje neke vrste bakterija s izraženim pleoforizmom, dok postoje stanice koje imaju drugačiju morfološku strukturu.
Ako je kao hranljivi medij korišten Kliglerov medij, tada se biokemijske karakteristike određuju promjenom boje kolone i zakošenog dijela. Na primjer, ako se laktoza razgradi, zakošeni dio postaje žut, ako glukoza - žuti kolona; s proizvodnjom sumporovodika dolazi do pocrnjenja zbog prijelaza sulfata u željezni sulfid.
Kao što možete vidjeti na slici, Kliglerov medij ima tendenciju promjene boje. To je zbog činjenice da se razgradnja dušičnih tvari od strane bakterija i stvaranje alkalnih produkata odvijaju nehomogeno kako u stupcu (anaerobni uvjeti) tako i na nagnutoj površini (aerobni uvjeti).
U aerobnom okruženju (kosa površina) uočava se aktivnije stvaranje alkalija nego u anaerobnom okruženju (kolona). Stoga, kada se glukoza razgradi, kiselina na kosoj površini se lako neutralizira. Ali, razgradnjom laktoze, čija je koncentracija mnogo veća, kiselina se ne može neutralizirati.
Što se tiče anaerobnog okruženja, stvara se vrlo malo alkalnih produkata, tako da ovdje možete vidjeti kako se glukoza fermentira.
Rice. Kliglerov hranljivi medij:
1 - početno okruženje,
2 - rast E. coli
3 - rast S. paratyphi B,
4 - rast S. Typhi.
E.coli- pospješuje razgradnju glukoze i laktoze uz stvaranje plinova, ne proizvodi vodonik . Izaziva žutilo cijelog medija s prekidima.
S. paratyphi - pospješuje razgradnju glukoze sa stvaranjem plinova, negativnih na laktozu. Zakošeni dio ne mijenja boju, stupac postaje žut.
S. paratyphi A- ne proizvodi sumporovodik.
S. paratyphi B - nastaje sumporovodik (crna boja se pojavljuje tokom ubrizgavanja).
S. typhi - glukoza se razgrađuje bez stvaranja plina, proizvodi se sumporovodik, odbija laktozu. Zakošeni dio ne mijenja boju, kolona postaje žuta, a medij postaje crn tokom injekcije.
Shigella spp.- laktoza-negativan, glukoza-pozitivan, vodonik sulfid se ne proizvodi. Stup dobiva žutu nijansu, a zakošeni dio ostaje isti.
B) Konačna identifikacija čiste kulture i njen odgovor na antibiotike. Na ovoj fazi proučavaju se biohemijska, biološka, serološka i genetička svojstva kulture.
U istraživačkoj praksi nema potrebe za proučavanjem čitavog spektra svojstava mikroorganizama. Dovoljno je najjednostavnijim testovima utvrditi pripadaju li mikroorganizmi određenoj vrsti.
CILJ:
1. Metode istraživanja za izolaciju čistih kultura bakterija
2. Savladati bakteriološku metodu dijagnostike zaraznih bolesti.
TEORIJSKA REFERENCA
Bakteriološka metoda je glavna metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti. Njegova je suština odrediti vrstu infektivnog agensa, pa se na osnovu rezultata bakteriološke metode može postaviti etiološka (konačna) dijagnoza. Glavni nedostatak metode je trajanje studije - od 3 do 5 dana, au nekim slučajevima i više.
Uspjeh bakteriološke metode u velikoj mjeri ovisi o preliminarnoj fazi, uključujući uzimanje uzorka materijala za ispitivanje i njegov transport, te osmišljavanje upućivanja u bakteriološku laboratoriju. U tom slučaju se moraju poštovati brojna pravila.
1. Ograda test materijala mora se izvršiti prije početka antibiotske terapije ili 8-10 sati nakon posljednje doze antibiotika. Da bi se izbjegla kontaminacija uzorka mikroflorom okoline, potrebno je pridržavati se najstrože asepse. Za to koristite sterilni materijal: a) pamučne štapiće za uzimanje materijala iz rane, sa sluzokože (oči, ždrijelo, nos); b) žičana omča za vađenje materijala iz vagine, anusa; c) špric za vađenje krvi, gnoja; d) sterilne posude za direktno sakupljanje urina, sputuma, fecesa u njega.
2. Prijevoz Primljeni materijal treba proizvesti što je prije moguće (2-3 sata) u posebnim biciklima ili pernicama.
3. Smjer priložen uz klinički uzorak kao prateći dokument. Sadrži osnovne informacije potrebne za provođenje mikrobiološke studije:
Prezime, ime, patronim, starost pacijenta;
Predložena dijagnoza bolesti;
Prethodna antimikrobna terapija;
Priroda materijala;
Datum i vrijeme preuzimanja materijala;
Svrha studije;
Naziv zdravstvene ustanove, broj odjeljenja, odjeljenja;
Potpis ljekara.
Bakteriološka metoda se izvodi u dvije faze (slika 2.1.):
1. Izolacija čiste kulture patogena (1-2 dana);
2. Identifikacija čiste kulture (1-3 dana).
U prvoj fazi, ispitni materijal se sije na čvrstu ili tečnu hranljivu podlogu, procjenjuju se kulturološka svojstva, odabiru sumnjive kolonije i pregledavaju na kosom agaru. Faza identifikacije uključuje obavezno proučavanje morfologije, biohemijskih svojstava i antigenske strukture izolirane čiste kulture, kao i dodatne studije za određivanje osjetljivosti na antibiotike, osjetljivosti na fage, tipiziranja faga, patogenosti i perzistentnih svojstava.
PITANJA ZA PRIPREMU:
1. Pravila prikupljanja i transporta test materijala za bakteriološko ispitivanje.
2. Pravila za izdavanje uputa za bakteriološko ispitivanje.
3. Metode izolacije čistih kultura mikroorganizama.
4. Bakteriološka dijagnostička metoda. Target. Faze. dijagnostička vrijednost.
SAMOSTALNI PLAN RADA:
1. Proučiti tabele "Metode izolacije čistih kultura bakterija" i "Izolacija i identifikacija čistih kultura".
2. Izolirati čistu kulturu iz mješavine bakterija i izvršiti njenu identifikaciju - savladati bakteriološku dijagnostičku metodu (1. rad)
TEMA: Sterilizacija, asepsa, antisepsa, dezinfekcija.
Principi, metode uzgoja mikroorganizama i izolacije čistih kultura.
Metoda bakteriološkog istraživanja. Faza 1.
1. Upoznajte se sa glavnim metodama dezinfekcije i sterilizacije koje se koriste u mikrobiologiji i medicini.
2. Poznavati karakteristike metabolizma mikroorganizama, principe njihovog uzgoja u laboratoriji.
3. Master stadijum 1 bakteriološke metode za dijagnostikovanje zaraznih bolesti.
1. Metode, uređaji i načini sterilizacije hranljivih podloga, laboratorijskog stakla, medicinskih instrumenata.
2. Glavne grupe dezinficijensa, njihov mehanizam djelovanja, područje i način primjene.
3. Određivanje hranljivih podloga u mikrobiološkoj praksi.
4. Princip dobijanja čistih kultura mikroorganizama i suština bakteriološke metode kao „zlatnog standarda“ u dijagnostici zaraznih bolesti.
5. Svrha i redosled izvođenja 1. etape bakteriološke metode za izolovanje čistih kultura mikroorganizama.
1. Odabrati sredstva, način sterilizacije i dezinfekcije u skladu sa specifičnim zadacima.
2. Opišite predložene hranljive podloge koje se koriste u mikrobiološkoj praksi.
3. Provesti 1. fazu bakteriološke metode za izolovanje čistih kultura aerobnih mikroorganizama.
1. Bakteriostatsko i baktericidno djelovanje niskih i visokih temperatura na mikroorganizme.
2. Utjecaj hemikalija razne klase na mikroorganizme. Antiseptici i dezinficijensi.
3. Pojmovi: sterilizacija, dezinfekcija, asepsa, antisepsa.
4. Metode, oprema i načini sterilizacije, njihov izbor u zavisnosti od svojstava predmeta koji se steriliše.
5. Glavne grupe dezinficijensa i taktika njihove upotrebe u zdravstvenim ustanovama.
6. Principi i metode uzgoja mikroorganizama.
7. Hranljivi mediji: koncept; zahtjevi za njih; klasifikacija.
8. Pojam vrste, soja, kolonije, čiste kulture mikroorganizama.
9. Suština bakteriološke metode i obim njene primjene.
10. Svrha i redoslijed 1. faze bakteriološke metode za izolaciju aeroba.
Zadaci obavljeni tokom časa (UIRS):
1. Upoznajte se sa uređajima koji se koriste za sterilizaciju u medicinskoj i mikrobiološkoj praksi: parni sterilizator (autoklav), Pasteur peć.
2. Odabrati uređaje i načine sterilizacije hranljivih podloga, laboratorijskog stakla, medicinskih instrumenata.
3. Upoznajte se sa dezinficijensima koji se koriste u medicinskoj i mikrobiološkoj praksi. Odaberite sredstva za dezinfekciju i način dezinfekcije za predložene objekte.
4. Upoznati različite hranljive podloge koje se koriste u mikrobiološkoj praksi, okarakterisati ih u smislu sastava, konzistencije i namene.
5. Izvršiti 1. fazu bakteriološke metode za izolaciju čistih kultura aeroba:
5.1. Pripremiti fiksirani preparat od ispitivanog materijala, obojiti po Gramu, mikroskopski i identificirati identificirane mikroorganizme po morfološkim i tinktorijalnim svojstvima.
5.2. Posijajte ispitni materijal metodom "hod platformom".
5.3. Posijati ispitni materijal metodom Drygalskog (demonstracija).
6. Upoznajte se sa setom alata za sakupljanje i transport patološkog materijala.
Smjernice na istraživački zadatak:
1. Upoznavanje sa uređajima koji se koriste za sterilizaciju: parni sterilizator (autoklav), Pasteur peć.
1.1. Parni sterilizator (autoklav) - sterilizacija parom pod pritiskom.
Najpouzdanija i univerzalna metoda sterilizacije u medicinskoj i mikrobiološkoj praksi je sterilizacija parom pod pritiskom. Proizvodi se u autoklavu, u kojem se predmeti koji se sterilišu zagrijavaju zasićenom parom na tlaku iznad atmosferskog. Između očitavanja manometra i temperature zasićene pare postoji sljedeći odnos:
Nulti pritisak se smatra normalnim atmosferskim pritiskom (760 mm Hg).
Sterilizacija se može postići samo ako je autoklav potpuno operativan i ako ga pravilno koristi posebno obučeno osoblje. Stoga je potrebno stalno pratiti režim sterilizacije, koji se provodi fizičkim (maksimalni termometar i sl.), biološkim (biotest sa sporama test kultura mikroorganizama) i hemijskim (hemijska ispitivanja, indikatori kao što je IS) metodama.
Vrši se kontrola načina sterilizacije autoklava hemijskim putem svaki put kada se autoklav puni. Hemijski test - staklena cijev sa hemijski koji imaju određenu tačku topljenja: antipirin, resorcinol - 110 ± 1 °, benzojeva kiselina - 120 ± 2 °, benzamid - 126 ± 1 °, urea, nikotinamid, D (+)-manoza - 132 ± 2 °. dio hemijska ispitivanja uvodi se anilinska boja (magenta, gentian violet, itd.), koja ravnomjerno boji supstancu kada se otopi. Trenutno se češće koriste indikatori tipa IS (Vinar, Rusija), koji predstavljaju traku papira na koju se nanosi sloj indikatorske mješavine i dizajnirane za operativnu vizualnu kontrolu ne samo temperature, već i vremena sterilizacije (IS- 120, IS-132) . Režim sterilizacije se prati kvartalno korišćenjem biološke analize sa sporama test kulture Bacillus stearotermophilus BKM B-718.
1.2. Pasteur pećnica - sterilizacija suvom toplotom.
U Pasteur pećnici se sterilišu proizvodi od stakla, metala i gume na bazi silikonske gume. Način sterilizacije: 160°C - 150 min; 180°S - 60 min. Kontrola režima sterilizacije u svakom ciklusu vrši se uz pomoć indikatora sterilizacije IS-160, IS-180; tromjesečno - korištenjem biotesta sa sporama test kulture Bacillus licheniformis PCS. G BKM B-1711 D.
2. Popunite kod kuce tabela broj 1.
Tabela 1.
Sterilizacija
3. Upoznajte se sa sredstvima za dezinfekciju i punjenjem u razredu tabela br. 2, koristeći aplikacije br. 1, 2.
Tabela 2.
Dezinfekcija
4. Upoznajte se sa hranljivim podlogama i napunite u razredu tabela br. 3 "Hranljivi mediji".
Tabela 3
5. Klinička mikrobiologija kao grana medicinske mikrobiologije rješava dva glavna zadatka: etiološku dijagnozu zarazne bolesti i racionalan izbor etiotropne terapije.
Glavna metoda mikrobiološke dijagnostike rješavanje ovih problema je bakteriološka metoda. Suština bakteriološke metode je izolacija čiste kulture patogena, određivanje njegove vrste i osjetljivosti na antimikrobne lijekove.
Odabir materijala koji se proučava ovisi o vrsti bolesti i dominantnoj lokalizaciji patogena u određenoj fazi njegovog razvoja (patogeneza). Materijal može biti krv, likvor, iscjedak iz rane, sputum, izmet, urin, itd. Tehnika uzorkovanja materijala ima veliki značaj u dobijanju pouzdanih rezultata.
Uspjeh izolacije čiste kulture određen je ispravnošću izbor hranljive podloge i uslova uzgoja. Ne postoji univerzalni hranljivi medij, čija će upotreba omogućiti izolaciju bilo kojeg mikroorganizma iz bilo kojeg ispitnog materijala. Stoga, uzimajući u obzir fiziološke karakteristike mogućih patogena, materijal se sije na određeni hranljivi medij ili kompleks hranljivih podloga (specijalni, elektivni, diferencijalno dijagnostički). Neki mikroorganizmi zahtijevaju i posebne uslove uzgoja (anaerobni, mikroaerofilni, sa visokim sadržajem ugljičnog dioksida).
Patološki materijal pacijenta često je mješavina mikroorganizama. U tom smislu, zadatak je razdvojiti ih i dobijanje izolovanih kolonija. Izolovana kolonija, kao rezultat reprodukcije jedne mikrobne ćelije i koja se sastoji od jedne vrste ćelija, osnova je za dobijanje čiste kulture. U mikrobiološkoj praksi koriste se različite metode za dobivanje izoliranih kolonija. Najčešće se koriste sljedeće:
1. Sjetva ispitnog materijala metodom "udara sa podmetačem".- ispitivani materijal se nanosi na površinu guste hranjive podloge u ograničenom prostoru, a zatim se distribuira sjetvom čestim paralelnim potezima.
2. Metoda Drygalskog- materijal nanesen na prvu čašu sa hranljivim podlogom i posejan lopaticom se uzastopno inokuliše istom lopaticom, bez sterilizacije, još 1-2 šolje.
3. Metoda sektorske kulture– proučavani materijal se sije uzastopno jednom petljom na nekoliko sektora. Istovremeno, određena tehnika sjetve (metod gould) omogućava ne samo dobivanje izoliranih kolonija, već i određivanje broja mikroorganizama u 1 ml (g) ispitivanog materijala, što je važno u procjeni etiološke uloge oportunističkih mikroorganizama (OPM).
5.1.Provođenje 1. faze bakteriološke metode za izolaciju aeroba:
Od ispitivanog materijala pripremiti fiksirani preparat, obojiti po Gram metodi, mikroskopski, identifikovati otkrivene mikroorganizme po morfo-tinktorskim svojstvima; obratite pažnju na broj mikroorganizama. Zabilježiti rezultate u protokol i donijeti zaključak;
Posijajte ispitni materijal na pola šolje sa gustim hranljivim medijumom metodom „poteza sa platformom“;
· posijati ispitni materijal na tri ploče sa hranljivim podlogama metodom Drygalskog (demonstracija);
Označite posude datumom inokulacije i stavite ih naopako u termostat na 37°C 18-24 sata.
6. Sredstva za prikupljanje i dostavu patološkog materijala
Napomena: * - koristi se ako vrijeme isporuke materijala u laboratoriju nakon njegovog prijema prelazi 1,5-2 sata.
Pitanja za samokontrolu:
1. Navedite i obrazložite principe uzgoja mikroorganizama.
2. Zašto se za setvu patološkog materijala koriste elektivna, diferencijalno-dijagnostička i akumulirajuća sredstva?
3. Obrazložiti princip dobijanja čistih kultura mikroorganizama.
4. Zašto je bakteriološka metoda „zlatni standard“ u mikrobiološkoj dijagnostici zaraznih bolesti?
5. Na čemu se zasnivaju hemijske i biološke metode za dobijanje čistih kultura mikroorganizama?
6. Koja je razlika između sterilizacije i dezinfekcije?
7. Obrazložiti svrhu sterilizacije i dezinfekcije u mikrobiološkoj i medicinskoj praksi.
8. Obrazložiti prednost upotrebe termo indikatorskih sistema za praćenje režima sterilizacije (na primjeru IS indikatora iz Vinara, Rusija).
književnost:
Tutorijali:
1. Borisov L. B. Medicinska mikrobiologija, virologija, imunologija. - M.: MIA LLC, 2002. - S. 26-29, 63-66, 150-159.
2. Pozdeev O.K. Medicinska mikrobiologija / Ed. akad. RAMS V. I. Pokrovski. - M.: GEOTAR Medicina, 2001. - S. 76-77, 126-130, 253-265.
Dodatna literatura:
1. Sigurnost rada sa mikroorganizmima III - IV grupe patogenosti i helmintima: Sanitarna pravila. – M.: federalni centar Državni sanitarni i epidemiološki nadzor Ministarstvo zdravlja Rusije, 1999. - 107 str.
Predavanja iz mikrobiologije.
Testovi.
Metoda bakteriološkog istraživanja. Izolacija čiste kulture aerobnih bakterija (1-2 faze)
1. Suština bakteriološke metode
3. Metode za dobijanje izolovanih kolonija
4. Metode za dobijanje čiste kulture
1. Primarnu setvu izvršiti metodom Koch i Drygalski
2. Izolirajte čistu kulturu
Plan rada:
1. Bakteriološka metoda istraživanja
2. Faze bakteriološke metode
3. Koncept: čista kultura, soj, kolonija
4. Metode za dobijanje izolovanih kolonija
5. Metode za dobijanje čiste kulture aerobnih bakterija
Glavna metoda laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti je bakteriološka metoda. Suština bakteriološke metode je izolacija patogena iz materijala koji se proučava i njegova identifikacija (definicija roda, vrste, sorte).
Bakteriološka metoda vam omogućava da odredite:
1. Vrsta patogena i postaviti dijagnozu bolesti
2. Antibiotici koji ubijaju patogen i propisuju odgovarajući tretman
3. Fagovari i serovari patogena za identifikaciju izvora infekcije
Prva faza je primarna inokulacija ispitnog materijala kako bi se dobile izolirane kolonije. Primarna setva se vrši na podloge za skladištenje i DDS (čaš podloge).
Druga faza je karakterizacija izolovanih kolonija i dobijanje čiste kulture od njih ponovnim zasejavanjem na kosi stub glavnog medijuma.
Treća faza je identifikacija čiste kulture - određivanje roda, vrste, varijeteta patogena, određivanje osjetljivosti na antibiotike, određivanje fagovara.
Kultura mikroorganizama je bakterija uzgojena na hranjivim podlogama. Čista kultura je jedna vrsta bakterija koja se uzgaja na hranjivim podlogama. Unutar vrste postoje sorte koje se razlikuju po jednoj osobini:
1. Morfovari - razlikuju se po morfologiji
2. Chemovari - razlikuju se po biohemijskim svojstvima
3. Serovari - razlikuju se po antigenskim svojstvima
4. Fagovari - razlikuju se po osjetljivosti na fage
Za identifikaciju, određivanje serovara, fagovara, osjetljivost na antibiotike potrebna je čista kultura. Soj je jedna vrsta bakterija izolirana iz određenog izvora (rijeka Volga, bolesni Ivanov itd.). Kolonija - vidljiva akumulacija bakterija iste vrste, nastala tijekom reprodukcije jedne bakterijske ćelije na gustom hranjivom mediju.
Prva faza studije je primarna inokulacija ispitnog materijala kako bi se dobile izolirane kolonije. Prije inicijalne inokulacije, vrši se mikroskopija ispitnog materijala. Materijal za ispitivanje obično sadrži mješavinu različitih bakterija, uključujući patogene. Za izolaciju patogena potrebno je dobiti izolirane kolonije (bakterije iste vrste) odabirom hranjivog medija i posebnim metodama sjetve.
Postoje dvije metode za dobivanje izoliranih kolonija:
1. Metoda Drygalskog
