ACTIVITATEA #4

SUBIECT: FIZIOLOGIA MICROORGANISMELOR. METODA DE CERCETARE BACTERIOLOGICĂ (CULTURALĂ). PROPRIETĂȚI BIOCHIMICE ALE MICROORGANISMELOR.

LISTA DE VERIFICARE

Nutriția bacteriilor. Nutrienții sunt surse de carbon și azot. Clasificarea bacteriilor după tipuri de nutriție Autotrofe și chimiorganotrofe

Factorii de creștere și sursele lor. Surse de elemente minerale.

Modalități și mecanisme de transfer al nutrienților prin membrană.

Cerințele energetice ale bacteriilor. Modalități de obținere a energiei în autotrofe (fotosinteză, chimiosinteză). Surse și modalități de obținere a energiei în chemoorganotrofi.

Tipuri aerobe și anaerobe de oxidare biologică în bacterii. Bacterii aerobe, anaerobe, anaerobe facultative și microaerofile. Modalități de a crea condiții anaerobe.

Sarcini, etape, avantaje și dezavantaje ale metodei de cercetare bacteriologică (culturală).

Creșterea și reproducerea microorganismelor. Metode de reproducere. Fisiune binară (simple), mecanism. Reproducerea populațiilor bacteriene.

Principii și metode de cultivare a bacteriilor. Nevoile nutriționale ale microbilor.

Medii nutritive pentru cultivarea bacteriilor. cerinţele nutritive. Clasificarea mediilor nutritive.

Condiții și tehnici de cultivare a bacteriilor. Tehnica de însămânțare pe medii nutritive. Regularități și caracterul creșterii bacteriene pe medii nutritive dense și lichide.

Metode de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe și anaerobe.

Proprietăți utilizate pentru identificarea culturilor izolate.

MUNCĂ INDEPENDENTĂ ȘI DE LABORATOR

Metoda bacteriologică(etape):

1 etapa 1 izolarea unei culturi pure de bacterii aerobe: A) Microscopia materialului patologic.

Colorarea Gram a frotiurilor din material patologic. Schiță de droguri.

B) Însușirea, sub îndrumarea unui profesor, a tehnicii de însămânțare a materialului patologic cu ansă bacteriologică și spatulă pe placă medii nutritive.

Inocularea materialului patologic cu o ansă bacteriologică pe agar lamelar de carne-peptonă (MPA) pentru a obține colonii izolate.

Clasificarea mediilor de cultură(specificați domeniile de aplicare)

1. După consistență:lichid (bulion de carne-peptonă, bilă, bulion de zahăr), mediu dens (2-3% agar) și semi-lichid (0,15-0,7% agar).

2. După origine:naturala - din lapte, carne. ouă, cartofi, ser de sânge uman, animale și alte produse; artificial - 1) amestecuri naturale echilibrate de nutrienți în concentrații și combinații necesare pentru creșterea și reproducerea microorganismelor, o sursă universală de azot și carbon - peptone - produse de descompunere incompletă a proteinelor folosind pepsină sau diferite hidrolizate (pește, cazeină, drojdie etc.) . 2) sintetic cexacte compoziție chimică Soton pentru micobacterii, 199 pentru celule.

3. In compozitie: medii de cultură simple (bulion de carne-peptonă-MPB, agar peptonă de carne-MPA) și cu fals (KA = MPA + 5-10% din sângele animal)

4. Cu programare:

DAR) scop general - universal, destinat cultivării oricăror microorganisme (MPA,KA)

B ) Specialpentru creșterea microorganismelor care nu cresc pe medii universale, diferențierea speciilor și izolarea selectivă a anumitor tipuri de microorganisme:

electiv (selectiv) pentru a izola anumite tipuri de microorganisme și a suprima creșterea celor înrudite - (agar sare pentru stafilococi).

diagnostic diferenţial (DDS)-medii care fac posibilă distincția între tipuri de bacterii prin activitatea enzimatică; Ei Cu posedă: 1) mediu nutritiv universal (MPA, KA); 2) factor de diferențiere - un substrat chimic (de exemplu, carbohidrați), o relație diferită cu care este o caracteristică de diagnosticare pentru un anumit microb. 3) Un indicator a cărui schimbare de culoare indică o reacție biochimică. (mediile Endo, Ploskirev, Giss și altele).

selectiv diferential (DS) - medii care permit aloca bacteriile unei anumite specii în funcţie de caracteristicile lor fiziologice şi se diferenţiază de alte specii în funcţie de activitate enzimatică Acestea conțin: 1) MPA 2) opțional un substrat chimic care inhibă creșterea altor tipuri de bacterii . 3) factor de diferențiere - substrat la care este o caracteristică de diagnosticare pentru acest microb;) 4.) Un indicator a cărui schimbare de culoare indică o reacție biochimică. (Miercuri pentru stafilococi, ICA pentru salmonella, Ploskirev pentru shigella și salmonella).

B) Îmbogățirea medii pentru reproducerea și acumularea bacteriilor de un anumit tip în materialul clinic (sânge în bulion de bilă 20% = salmonella, secreție în gât în ​​ser 10% + 2% telurit = corinebacterii.)

D) Transport mediu pentru colectarea și livrarea (conservarea) materialului clinic = 48 ore (mediu Amies - agar semi-lichid + cărbune activat).)

Medii nutritive(exemple):

Miercuri Endo Tip mediu diagnostic diferenţial pentru enterobacterii Baza nutritivă MPA factor de diferențiere lactoza 1% Indicator fuchsin bazic decolorat cu sulfit de sodiu. E.s oli descompune lactoza în acid - coloniile sunt roșii cu un luciu metalic, patogene incolore;

Agar cu sare Tip mediu selectiv pentru izolarea stafilococilor Baza nutritivă MPA factor electiv clorură de sodiu 10%

Miercuri Ploskirev Tip mediu selectiv diferenţialpentru enterobacterii

Baza nutritivă MPA factor electiv săruri biliare factor de diferențiere lactoză

Indicator roșu neutru

Agar gălbenuș-sare Tip mediu selectiv diferential pentru S . aureus _

Baza nutritivă MPA factor electiv clorură de sodiu 10%

factor de diferențiere gălbenuș de ou

Indicator Nu

2 Etapa 2 metoda de cercetare bacteriologica (izolarea culturii pure):

A) Studiul coloniilor izolate (escherichia, stafilococ) pe MPA lamelar.

Studiu proprietăți culturale	1 tip de colonii	2 tipuri de colonii
forma coloniei	Forma regulata, rotunda	Forma corectă
Consecvență	omogen	omogen
Dimensiunea coloniei	mediu (dimensiune 2-4 mm)
Natura marginii	cu margini netede	cu margini netede
Natura de suprafață	convex

B) Prepararea frotiurilor din coloniile selectate (colorație Gram).

C) Transferul coloniilor izolate în MPA înclinat pentru acumularea culturii pure.

3 Izolarea unei culturi pure de bacterii anaerobe: inocularea unei suspensii de sol pe mediul Kitta-Tarozzi pentru a izola clostridiile patogene

Mediul Kitt-Tarozzi constă din bulion nutritiv, glucoză 0,5% și bucăți de ficat sau carne tocată pentru a absorbi oxigenul din mediu. Înainte de însămânțare, mediul este încălzit într-o baie de apă clocotită timp de 20-30 de minute pentru a elimina aerul din mediu. După însămânțare, mediul nutritiv este imediat umplut cu un strat parafină

Metode de creare a anaerobiozei:

1.Fizic- pomparea aerului, introducerea unui amestec special de gaz fără oxigen (de obicei N 2 - 85% CO 2 - 10%, H 2 - 5%), fierberea prealabilă a mediilor nutritive, inocularea într-o coloană adâncă de agar, umplerea mediului cu ulei de vaselină pentru reducerea accesului la oxigen, utilizarea de flacoane și eprubete închise ermetic, seringi și sticlă de laborator cu gaz inert, folosirea desicatoarelor bine închise cu o lumânare aprinsă

2. Chimic- se folosesc captatori chimici de oxigen.

3. Biologic - cultivarea în comun a aerobilor și anaerobilor stricti (aerobii absorb oxigenul și creează condiții pentru reproducerea anaerobilor - metoda Fortner).

Miercuri Kitt - Tarozzi constă dintr-un bulion nutritiv, 0,5% glucoză și bucăți de ficat sau carne tocată pentru a absorbi oxigenul din mediu. Înainte de însămânțare, mediul este încălzit într-o baie de apă clocotită timp de 20-30 de minute pentru a elimina aerul din mediu. După însămânțare, mediul nutritiv este imediat umplut cu un stratparafină sau ulei de vaselină pentru a izola de accesul la oxigen.

4. Amestecat - utilizați mai multe abordări diferite.

Dispozitive speciale sunt folosite pentru a crea condiții anaerobe - anaerostate. În prezent, cel mai simplu și mai eficient echipament pentru crearea condițiilor anaerobe și microaerofile este o metodă chimică cu pungi speciale care actioneaza pe principiul absorbtiei oxigenului atmosferic in recipiente inchise ermetic .

Wilson-Blair mediu (tuburi, cani):

Baza nutritivă MPA Substratul respirator glucoză

Factorul reducător sulfit de sodiu și clorură ferică sulfit de sodiuN / A 2 ASA DE 3 → N / A 2 S

Pentru mediul Wilson-Blair, baza este agar cu adaos glucoză , Clostridii formează pe acest mediu colonii culoare neagră datorită restaurării sulfit inainte de sulfură - anion , care este legat de cationi glandă (II) dă sare neagră. De obicei negru pe acest mediu educațional colonii , apar în adâncimea coloanei de agar .

Mediu tioglicol (mediu pentru controlul sterilității): (tuburi):

Baza nutritivă BCH Substratul respirator glucoză Factorul reducător tioglicolat de sodiu

Indicator resazurină

Geloza Zeissler cu glucoză din sânge: (cești): Baza nutritivă MPA, sânge

Substratul respirator glucoză Factorul reducător al hemoglobinei

A fost introdus termenul de „anaerobi”.Louis Pasteurcare a descoperit în 1861bacteriifermentație butirică.

DARCursul 3 Fiziologia microorganismelor. Metabolismul bacteriilor .

Fiziologia microorganismelor include :

tipuri de mâncare;

tipuri de respirație;

cultivare (condiții, medii, caracter și ritm de creștere);

activitate biochimică;

variabilitate;

eliberarea de substanțe biologic active, toxine și alți factori de patogenitate;

sensibilitate la antibiotice, bacteriofagi, bacteriocine;

alte proprietăți biologice.

Metabolismul bacteriilor - un ansamblu de procese fizice și chimice (transformări și reacții chimice) care vizează reproducerea structurilor și asigurarea funcțiilor vitale ale unei celule microbiene, cum ar fi:

creștere și reproducere;

depunerea materialului alimentar de rezervă;

transportul nutrienților în celula microbiană;

eliberarea de produse metabolice (toxine, enzime, antibiotice și alte substanțe biologic active);

trafic;

formarea de spori;

aderența pe receptorii sensibili ai celulelor gazdă și pătrunderea în ei;

diverse răspunsuri adaptative la schimbările din mediul extern.

Anabolism- un set de reacții biochimice care realizează sinteza componentelor celulare.

catabolism- un set de reacții care furnizează celulei energie.

Schema studiului metabolismului - etape:

1. Metabolismul inițial (periferic) - pătrunderea substanțelor în celulă din exterior și degradare la produse intermediare.

2. Amfibolismul (metabolismul intermediar) - formarea de produse metabolice intermediare comune căilor catabolice și anabolice.

3. Etapele finale, strict specializate, ale metabolismului constructiv (conduc la construirea structurilor celulare) si metabolismului energetic (formarea ATP).

Mecanisme de pătrundere a nutrienților în celulă:

Difuziune simplă (pentru soluții adevărate). proces independent de energie.

Difuzie facilitată („abur în aval”) - în direcția gradientului de concentrație cu participarea proteinelor purtătoare. proces dependent de energie.

Transportul activ este împotriva concentrației și gradientului electrochimic cu participarea permeazelor (amino-, hidroxiacid, ionic etc.). Procesul merge cu cheltuirea energiei ATP, depinde de sarcina substanțelor și de transformarea lor în procesul de transfer.

Microorganismele sunt împărțite în două grupe în funcție de capacitatea lor de a absorbi sursele de carbon: autotrofe (lat. autoturisme - eu insumi, trofeu - nutriție) sintetizează toate componentele care conțin carbon ale celulei din CO 2 ca unica sursă de carbon și heterotrofe (lat. heteros - celălalt, „hrănirea în detrimentul altora”) utilizează o varietate de compuși organici care conțin carbon.

În funcție de sursele de energie, microorganismele se împart și în fototrofe (fotosintetice), capabile să folosească energia solară, și chemotrofe (chimiosintetice), care primesc energie prin reacții redox.

În funcție de donatorii de electroni utilizați, bacteriile sunt împărțite în litotrofe (folosind donatori de electroni anorganici) și organotrofe (folosind compuși organici).

Prototrofe- microorganisme capabile sa sintetizeze toti compusii organici de care au nevoie din sarurile de glucoza si amoniu.

Auxotrofe- microorganisme incapabile de a sintetiza orice compus organic. Ei obțin acești compuși gata pregătiți mediu inconjurator sau corpul uman.

Enzime(din greacă. fermentum-sourdough) - catalizatori proteici foarte specifici prezenți în toate celulele vii, fără de care viața și reproducerea nu sunt posibile. Enzimele își recunosc metaboliții (substraturile) respectivi, interacționează cu ei și accelerează reacțiile chimice. Enzimele sunt proteine.

Compoziția enzimatică a unui microorganism este determinată de genom și este o trăsătură destul de stabilă. Determinarea enzimelor este utilizată pe scară largă pentru identificarea biochimică a bacteriilor.

Endoenzimele catalizează metabolismul în interiorul celulei.

Exoenzimele sunt secretate de celulă în mediu.

Constitutiv enzimele sunt sintetizate constant la anumite concentraţii.

inductibile enzimele sunt enzime a căror concentrație crește odată cu aportul de substrat corespunzător.

Enzime de agresiune: hialuronidază, fibrinolizină, neuraminidază, colagenază, lecitinază (licitovitelază), coagulază, urază, aminoacizi decarboxilaze, dezoxiribonuclează.

cultivare- obtinerea de culturi de microorganisme in mediu nutritiv artificial.

Obiective de cultivare:

obtinerea de culturi pure de microorganisme patogene si identificarea acestora;

acumularea de biomasă a producătorilor de BAS (vitamine, hormoni, aminoacizi, antibiotice etc.);

obţinerea de preparate de diagnostic şi profilactic (vaccinuri, diagnosticums);

depozitarea culturilor muzeale de referință;

în microbiologie sanitară pentru determinarea microorganismelor sanitar-indicative – indicatori ai poluării mediului.

cultură- o populatie de microorganisme crescute pe un mediu nutritiv.

cultura pura- o populație de un tip de microorganisme crescute dintr-o colonie izolată pe un mediu nutritiv.

Majoritatea microbilor patogeni sunt cultivați pe medii nutritive la 37°C timp de 1-2 zile.

Clasificarea mediilor de cultură

După consistență: lichid, semi-lichid, dens.

Origine: naturale (lapte, cartofi), artificiale, semisintetice, sintetice

In compozitie: simplu (MPA, MPB, legume, lapte), complex (1% glucoză, 10-20% ser, 20-30% lichid ascitic, 5-10% sânge defibrinat).

Cu programare:

universal - mediu pe care se dezvoltă bine multe tipuri de bacterii. Acestea includ bulion de peptonă de carne (MPB) și agar peptonă de carne (MPA);

special - medii special pregătite pentru a obține creșterea bacteriilor care nu cresc pe medii universale;

diagnostic diferențial - medii care fac posibilă distingerea unui tip de bacterii de altele prin activitatea enzimatică;

selectiv - medii care conțin substanțe utilizate de microorganismele anumitor specii și care împiedică creșterea altor microorganisme. Mediile selective vă permit să selectați anumite tipuri de bacterii din materialul studiat;

diferenţial-selectiv - medii care combină proprietăţile mediului de diagnostic diferenţial şi selectiv;

conservant;

concentrându-se.

Reproducerea bacteriilor pe medii nutritive lichide și dense.

Creştere reproducerea coordonată a tuturor componentelor unei celule bacteriene și o creștere a biomasei acesteia. reproducere- reproducerea si cresterea numarului de celule, ducand la formarea unei populatii bacteriene.

Bacteriile se caracterizează printr-o rată ridicată de reproducere. Rata de reproducere depinde de specie, compoziție mediu de creștere, pH, temperatură, aerare.

Pe medii nutritive dense, bacteriile formează grupuri de celule numite colonii. Coloniile de diferite specii diferă ca mărime, formă, consistență, culoare, natura marginilor, natura suprafeței, transparență.

Natura creșterii pe medii nutritive lichide: peliculoasă (formarea unui film pe suprafața mediului nutritiv), turbiditate difuză, aproape de fund (formarea sedimentului).

Fazele dezvoltării unei populații bacteriene

Faza staționară inițială (~ 1-2 ore). Numărul bacteriilor nu crește, celulele nu cresc.

Faza de întârziere sau faza de întârziere a reproducerii (~ 2 ore).

Log-phase - fază logaritmică sau exponențială (~ 3-5h). Populația se împarte cu viteză maximă și are loc o creștere exponențială a indivizilor.

Faza de accelerare negativă (~ 2 ore). Asociat cu epuizarea metabolitului limitator sau acumularea de produse metabolice toxice.

Faza staționară a maximului. Numărul de celule formate și moarte este același.

Faza de moarte accelerată (~ 3 ore).

Faza de moarte logaritmică (~5).

Faza de scădere a ratei decesului - indivizii vii rămași intră într-o stare de repaus.

Metabolismul energetic al bacteriilor

Aerobi- microorganisme care utilizează tipul aerob (oxidativ) de oxidare biologică a substraturilor. Metabolizarea aerobilor se realizează numai în prezența unei concentrații mari de oxigen liber în habitat, care acționează ca acceptor final al electronilor prelevați din substrat. Cultivarea aerobilor se realizează pe medii cu acces deplin la oxigenul atmosferic.

anaerobi obligatorii- microorganisme de tip anaerob oxidare biologică(fermentaţie). Metabolismul are loc numai în medii cu un potențial redox scăzut în absența oxigenului.

O creștere a concentrației de oxigen din mediu duce la moartea formelor vegetative.

Cantitatea de energie extrasă în timpul fermentației este mică, astfel încât anaerobii obligați sunt forțați să fermenteze o cantitate mare de substrat.

Anaerobi facultativi- microorganisme capabile să extragă energie din substraturi prin căi aerobe (oxidative) și anaerobe (fermentative) de oxidare biologică. Metabolizarea poate fi efectuată atât în ​​condiții de acces deplin al oxigenului la mediu, cât și în condiții de anaerobioză.

Metode de creare a anaerobiozei

Fizic

semănat într-o coloană de zahăr MPA;

fierberea (regenerarea) mediilor nutritive lichide urmată de acoperirea cu ulei;

îndepărtarea mecanică a oxigenului în anaerostate;

înlocuirea oxigenului cu un gaz indiferent;

Tuburi Veillon-Vignal.

Chimic

aparatul lui Aristovsky;

lumânare Omelyansky ( soluție alcalină pirogalol);

utilizarea acceptoarelor chimice de oxigen: glucoză, acid piruvic, acid formic de sodiu etc.

Biologic

Kitta-Tarozzi miercuri

Metoda Fortner

Anaerobi - organisme care obțin energie în absența accesului oxigen după substrat fosforilare , produsele finale ale oxidării incomplete a substratului pot fi oxidate cu mai multă energie sub formăATP în prezenţa unui acceptor terminal de protoni de către organismele care .

Respirația anaerobă- agregat reactii biochimice, care apare în celulele organismelor vii atunci când este utilizat ca acceptor final de protoni, nu oxigenși alte substanțe (de exemplu, nitrați) și se referă la procese metabolismul energetic(catabolism,disimilare), care sunt caracterizate oxidarecarbohidrați,lipideși aminoacizi la compuși cu greutate moleculară mică.

DAR bacteriile aerobe și anaerobe sunt identificate preliminar într-un mediu nutritiv lichid prin gradientul de concentrație de O2:

1. aerobic obligatoriu bacteriile (care necesită oxigen) se adună în principal în partea de sus a tubului pentru a absorbi cantitatea maximă de oxigen. (Excepție: micobacterii - creșterea peliculei la suprafață datorită membranei ceară-lipidice.)

2. anaerob obligatoriu bacteriile se adună în partea de jos pentru a evita oxigenul (sau să nu crească). 3. Bacteriile facultative sunt colectate în principal în partea superioară ( fosforilarea oxidativă este mai benefică decât glicoliza), cu toate acestea, ele pot fi găsite în tot mediul, deoarece nu depind de O 2. patru . microaerofile sunt colectate în partea superioară a tubului, dar optimul lor este o concentrație scăzută de oxigen. 5. Aerotolerant anaerobii nu reacţionează la concentraţiile de oxigen şi sunt distribuite uniform în eprubeta.

D pentru măsurare capacitate medii M. Clark a propus utilizarea valorii pH20 - negativ logaritmpresiune parțială gazos hidrogen. Gama caracterizează toate gradele de saturație ale unei soluții apoase cu hidrogen și oxigen. Aerobii cresc la un potențial mai mare, anaerobii facultativi și cei obligatorii la cel mai scăzut.)

Clasificarea anaerobilor, distingeți:

Anaerobi facultativi

anaerobii capneisti și microaerofilii

Anaerobi aerotoleranti

Anaerobi moderat strict

anaerobi obligatorii

Dacă un organism este capabil să treacă de la o cale metabolică la alta (de exemplu, de la respirația anaerobă la aerobicși invers), atunci este denumit în mod condiționat anaerobi facultativi .

Până în 1991, în microbiologie se distingea o clasă de anaerobi capneistici, necesitând o concentrație redusă. oxigenși concentrația crescută de dioxid de carbon (Brucella bovine tip - B. abortus)

Metoda cercetării culturale este izolarea din mediul nutritiv a bacteriilor de un anumit tip prin cultivare, cu identificarea ulterioară a speciilor acestora. Tipul de bacterii este determinat luând în considerare structura acestora, datele culturale și de mediu, precum și indicatorii genetici, biochimici și biologici. Pentru diagnosticul bacteriologic se folosesc scheme care sunt aprobate de Ministerul Sănătății.

Sunt numite noi specii de bacterii derivate dintr-un mediu nutritiv, ale căror proprietăți nu au fost încă determinate cultura pura. După identificarea finală a caracteristicilor lor, bacteriilor derivate dintr-un anumit loc și la un anumit moment li se dă un nume. încordare.În acest caz, este permisă o ușoară diferență în proprietățile, locul sau timpul de izolare a unei tulpini dintr-o specie.

Scopul metodei:

1. Diagnosticul etiologic, adică izolarea și identificarea unei culturi pure de bacterii.

2. Determinarea numărului de microorganisme și a caracteristicilor speciale ale acestora. De exemplu, o reacție specifică la antibiotice.

3. Identificarea diferențelor intragenerice ale microorganismelor, pe baza componentei lor epidemiologice și genetice. Acest lucru este necesar pentru a determina caracterul comun al microorganismelor izolate în diferite locuri și condiții diferite, ceea ce este important în scopuri epidemiologice.

Această metodă de cercetare are un anumit număr de etape, care sunt diferite pentru bacteriile aerobe, facultative și aerobe obligatorii.

Creșterea culturii pure pentru bacterii aerobe și aerobe facultative.

Etapa 1

DAR) Activitati pregatitoare. Această etapă include colectarea, depozitarea și transportul materialului. De asemenea, dacă este necesar, poate fi procesat, în funcție de proprietățile bacteriilor studiate. De exemplu, atunci când se examinează materialul pentru tuberculoză, se folosesc soluții alcaline sau acide pentru a identifica microbacteriile rezistente la acid.

B) Îmbogăţire. Această etapă este opțională și este efectuată dacă numărul de bacterii din materialul de testat nu este suficient pentru a efectua un studiu cu drepturi depline. De exemplu, la izolarea unei culturi de sânge, sângele testat este plasat într-un mediu într-un raport de 1 la 10 și depozitat timp de o zi la o temperatură de 37°C.

LA) Microscopie. Un frotiu din materialul de testat este colorat și examinat la microscop - se examinează microflora, proprietățile și cantitatea acesteia. În viitor, din frotiul primar, este necesar să se izoleze separat toate microorganismele din acesta.

G) Crearea de colonii separate. Se aplică material pe cupă, cu un mediu special, selectiv, pentru aceasta se folosește o buclă sau o spatulă. Apoi, așezați cana cu susul în jos pentru a proteja coloniile de condens și păstrați într-un termostat aproximativ 20 de ore, menținând o temperatură de 37 o.

Important! Trebuie amintit că, în procesul de cercetare, este necesar să se respecte regulile de izolare. Pe de o parte, pentru a proteja materialul de testat și bacteriile care trebuie îndepărtate și, pe de altă parte, pentru a preveni contaminarea persoanelor din jur și a mediului extern.

În ceea ce privește microorganismele patogene condiționat, atunci când sunt îndepărtate, caracteristicile lor cantitative contează. În acest caz, se efectuează însămânțarea cantitativă, în care se efectuează diluții de câteva sute de ori ale materialului în soluție izotonică de clorură de sodiu. După aceea, semănatul se efectuează în vase Petri de 50 μl.

Etapa 2

DAR ) Studiul proprietăți morfologice colonii în medii și microscopia acestora. Sunt examinate felurile de mâncare și se notează proprietățile microorganismelor, numărul acestora, ratele de creștere și mediul nutritiv cel mai potrivit. Pentru studiu, cel mai bine este să alegeți colonii situate mai aproape de centru și, dacă se formează mai multe tipuri de culturi pure, atunci studiați fiecare separat.Pentru a studia puritatea morfotipului culturii, se folosește un frotiu de colonie, este colorat (de obicei folosind metoda Gram sau oricare alta) si atent microscopice.

B) Acumularea culturii pure. Pentru a face acest lucru, coloniile de toate morfotipurile sunt plasate în eprubete separate cu un mediu nutritiv și păstrate într-un termostat la o anumită temperatură (pentru majoritatea microorganismelor, o temperatură de 37 o este potrivită, dar în unele cazuri poate fi diferită).

Mediul Kligler este adesea folosit ca mediu nutritiv pentru acumulare.Are un aspect „înclinat” în eprubete, unde 2/3 din părțile sale sunt sub formă de coloană, iar 1/3 este o suprafață teșită, colorată în roșu deschis. . Compus:

· MPA

· 0,1% glucoză

· 1% lactoză

· Reactiv special pentru hidrogen sulfurat

· Indicator roșu fenolic.

Etapa 3

DAR) Nivelul de creștere și puritatea culturii. În ordinea generală, cultura pură derivată are o creștere uniformă și, la examinare microscopică, celulele au aceeași structură morfologică și tinctorială. Dar există unele tipuri de bacterii cu pleoforism pronunțat, în timp ce există celule care au o structură morfologică diferită.

Dacă mediul Kligler a fost folosit ca mediu nutritiv, atunci caracteristicile biochimice sunt determinate prin schimbarea culorii coloanei și a părții teșite. De exemplu, dacă lactoza se descompune, partea teșită devine galbenă, dacă glucoza - îngălbenirea coloanei; odată cu producerea de hidrogen sulfurat, se produce înnegrirea datorită trecerii sulfatului la sulfură de fier.

După cum puteți vedea în figură, mediul Kligler tinde să-și schimbe culoarea. Acest lucru se datorează faptului că descompunerea substanțelor azotate de către bacterii și formarea de produse alcaline au loc neomogen atât în ​​coloană (condiții anaerobe), cât și pe suprafața înclinată (condiții aerobe).

Într-un mediu aerob (suprafață înclinată) se observă o formare mai activă de alcali decât într-un mediu anaerob (coloană). Prin urmare, atunci când glucoza este descompusă, acidul de pe suprafața înclinată este ușor de neutralizat. Dar, odată cu descompunerea lactozei, a cărei concentrație este mult mai mare, acidul nu poate fi neutralizat.

În ceea ce privește mediul anaerob, se generează foarte puține produse alcaline, așa că aici puteți observa cum este fermentată glucoza.

Orez. Mediul nutritiv al lui Kligler:

1 - mediu inițial,

2 - creștere E coli

3 - crestere S. paratyphi B,

4 - creștere S. Typhi.

E.coli- favorizează descompunerea glucozei și lactozei cu formarea de gaze, nu produce hidrogen . Provoacă îngălbenirea întregului mediu cu discontinuități.

S. paratyphi - favorizează descompunerea glucozei cu formarea de gaze, lactozo-negative. Partea teșită nu își schimbă culoarea, coloana devine galbenă.
S. paratyphi A- nu produce hidrogen sulfurat.
S. paratyphi B - se produce hidrogen sulfurat (în timpul injectării apare o culoare neagră).

S. typhi - glucoza se descompune fara formare de gaz, se produce hidrogen sulfurat, respinge la lactoza. Partea teșită nu își schimbă culoarea, coloana devine galbenă, iar mediul devine negru în timpul injectării.

Shigella spp.- lactoză negativă, glucoză pozitivă, hidrogen sulfurat nu se produce. Coloana capătă o nuanță galbenă, iar partea teșită rămâne aceeași.

B) Identificarea finală a culturii pure și răspunsul acesteia la antibiotice. Pe această etapă sunt studiate proprietățile biochimice, biologice, serologice și genetice ale culturii.

În practica cercetării, nu este nevoie să se studieze întreaga gamă de proprietăți ale microorganismelor. Este suficient să folosiți cele mai simple teste pentru a determina dacă microorganismele aparțin unei anumite specii.

II. METODE OPERAȚIONALE ȘI METODE DE EXAMINARE ȘI TRATAMENT ÎN CHIRURGIA MÂNII

III. METODE AUXILIARE DE CERCETARE INSTRUMENTALA SI DE LABORATOR.

IV. Instrucțiuni metodologice pentru elevi privind pregătirea pentru lecție

POARTĂ:

1. Metode de studiu pentru izolarea culturilor pure de bacterii

2. Stăpânește metoda bacteriologică de diagnosticare a bolilor infecțioase.

REFERINȚĂ TEORETICĂ

Metoda bacteriologică este principala metodă de diagnosticare a bolilor infecțioase. Esența sa este de a determina tipul de agent infecțios, prin urmare, pe baza rezultatelor metodei bacteriologice, se poate face un diagnostic etiologic (final). Principalul dezavantaj al metodei este durata studiului - de la 3 la 5 zile, iar în unele cazuri chiar mai mult.

Succesul metodei bacteriologice depinde în mare măsură de etapa preliminară, inclusiv de prelevarea de probe a materialului de testat și transportul acestuia, precum și de proiectarea unei trimiteri către un laborator bacteriologic. În acest caz, trebuie respectate o serie de reguli.

1. Gard a materialului de testat trebuie efectuată înainte de începerea terapiei cu antibiotice sau la 8-10 ore după ultima doză de antibiotic. Pentru a evita contaminarea probei cu microflora mediului, este necesar să se respecte cea mai strictă asepsie. Pentru a face acest lucru, utilizați material steril: a) tampoane de bumbac pentru prelevarea materialului din rană, din mucoasele (ochi, faringe, nas); b) o buclă de sârmă pentru preluarea materialului din vagin, anus; c) o seringă pentru prelevarea de sânge, puroi; d) vase sterile pentru colectarea directă a urinei, spută, fecale în ea.

2. Transport Materialul primit ar trebui să fie produs cât mai curând posibil (2-3 ore) în biciclete speciale sau cutii de creion.

3. Direcţie atașat probei clinice ca document de însoțire. Acesta conține informațiile de bază necesare pentru efectuarea unui studiu microbiologic:

Numele, numele, patronimul, vârsta pacientului;

Diagnosticul propus al bolii;

Terapie antimicrobiană anterioară;

Natura materialului;

Data și ora preluării materialului;

Scopul studiului;

Denumirea instituției medicale, numărul secției, secției;

Semnătura medicului.

Metoda bacteriologică se realizează în două etape (Fig. 2.1.):

1. Izolarea unei culturi pure a agentului patogen (1-2 zile);

2. Identificarea culturii pure (1-3 zile).

În prima etapă, materialul de testat este semănat pe un mediu nutritiv solid sau lichid, se evaluează proprietățile de cultură, se selectează coloniile suspecte și se cernează pe un agar oblic. Etapa de identificare include un studiu obligatoriu al morfologiei, proprietăților biochimice și structurii antigenice a culturii pure izolate, precum și studii suplimentare pentru a determina sensibilitatea la antibiotice, sensibilitatea fagilor, tiparea fagilor, patogenitatea și proprietățile persistente.

ÎNTREBĂRI DE PREGĂTIRE:

1. Reguli pentru colectarea și transportul materialului de testat pentru examen bacteriologic.

2. Reguli pentru emiterea unei trimiteri pentru examen bacteriologic.

3. Metode de izolare a culturilor pure de microorganisme.

4. Metoda de diagnostic bacteriologic. Ţintă. Etape. valoare de diagnostic.

PLAN DE MUNCĂ INDEPENDENT:

1. Studiați tabelele „Metode de izolare a culturilor pure de bacterii” și „Izolarea și identificarea culturilor pure”.

2. Izolați o cultură pură dintr-un amestec de bacterii și efectuați identificarea acesteia - stăpânește metoda de diagnostic bacteriologic (Lucrul 1)

TEMA: Sterilizare, asepsie, antisepsie, dezinfectare.

Principii, metode de cultivare a microorganismelor și izolarea culturilor pure.

Metoda de cercetare bacteriologică. Etapa 1.

1. Familiarizați-vă cu principalele metode de dezinfecție și sterilizare utilizate în microbiologie și medicină.

2. Cunoașteți caracteristicile metabolismului microorganismelor, principiile cultivării lor în laborator.

3. Master etapa 1 a metodei bacteriologice de diagnosticare a bolilor infectioase.

1. Metode, dispozitive și moduri de sterilizare a mediilor nutritive, sticlărie de laborator, instrumentar medical.

2. Principalele grupe de dezinfectanti, mecanismul lor de actiune, zona si metoda de aplicare.

3. Numirea mediilor nutritive în practica microbiologică.

4. Principiul obținerii de culturi pure de microorganisme și esența metodei bacteriologice ca „standard de aur” în diagnosticul bolilor infecțioase.

5. Scopul și succesiunea efectuării etapei I a metodei bacteriologice de izolare a culturilor pure de microorganisme.

1. Selectați mijloacele, modul de sterilizare și dezinfecție în conformitate cu sarcinile specifice.

2. Descrieți mediile nutritive propuse utilizate în practica microbiologică.

3. Efectuați etapa I a metodei bacteriologice de izolare a culturilor pure de microorganisme aerobe.

întrebări de testare:

1. Efect bacteriostatic și bactericid al temperaturilor scăzute și ridicate asupra microorganismelor.

2. Influența substanțelor chimice diverse clase asupra microorganismelor. Antiseptice și dezinfectante.

3. Concepte: sterilizare, dezinfectare, asepsie, antisepsie.

4. Metode, echipamente și moduri de sterilizare, alegerea acestora în funcție de proprietățile obiectului de sterilizat.

5. Principalele grupe de dezinfectanți și tacticile de utilizare a acestora în unitățile sanitare.

6. Principii și metode de cultivare a microorganismelor.

7. Medii nutritive: concept; cerințe pentru ei; clasificare.

8. Conceptul de specie, tulpină, colonie, cultură pură de microorganisme.

9. Esența metodei bacteriologice și domeniul de aplicare a acesteia.

10. Scopul și succesiunea etapei I a metodei bacteriologice pentru izolarea aerobilor.

Sarcini efectuate în timpul lecției (UIRS):

1. Familiarizați-vă cu dispozitivele folosite pentru sterilizare în practica medicală și microbiologică: sterilizator cu abur (autoclavă), cuptor Pasteur.

2. Selectați dispozitive și moduri de sterilizare a mediilor nutritive, sticlărie de laborator, instrumente medicale.

3. Familiarizați-vă cu dezinfectanții utilizați în practica medicală și microbiologică. Selectați dezinfectanții și modul de dezinfecție pentru obiectele propuse.

4. Familiarizați-vă cu diversele medii nutritive utilizate în practica microbiologică, caracterizați-le în termeni de compoziție, consistență și scop.

5. Efectuați etapa 1 a metodei bacteriologice pentru izolarea culturilor pure de aerobi:

5.1. Se prepară un preparat fix din materialul de testat, se colorează cu Gram, microscopic și se identifică microorganismele identificate prin proprietăți morfologice și tinctoriale.

5.2. Semănați materialul de testat folosind metoda „lovitură cu platformă”.

5.3. Semănați materialul de testat folosind metoda Drygalski (demonstrație).

6. Familiarizați-vă cu setul de instrumente pentru colectarea și transportul materialelor patologice.

Instrucțiuni la sarcina de cercetare:

1. Cunoașterea aparatelor folosite la sterilizare: sterilizator cu abur (autoclavă), cuptor Pasteur.

1.1. Sterilizator cu abur (autoclav) - sterilizare cu abur sub presiune.

Cea mai fiabilă și universală metodă de sterilizare în practica medicală și microbiologică este sterilizarea cu abur sub presiune. Este produs într-o autoclavă, în care obiectele de sterilizat sunt încălzite cu abur saturat la o presiune peste cea atmosferică. Între citirile manometrului și temperatura aburului saturat există următoarea relație:

Presiunea zero este considerată presiune atmosferică normală (760 mm Hg).

Sterilizarea poate fi realizată numai dacă autoclava este pe deplin operațională și este operată corespunzător de personal special instruit. Prin urmare, este necesar să se monitorizeze constant regimul de sterilizare, care se realizează prin metode fizice (termometru maxim etc.), biologice (biotest cu spori ai culturilor de microorganisme testate) și chimice (teste chimice, indicatori precum IS).

Se efectuează controlul modului de sterilizare a autoclavelor prin mijloace chimice de fiecare dată când autoclavul este încărcat. Test chimic - tub de sticla cu chimic având un anumit punct de topire: antipirină, resorcinol - 110 ± 1 °, acid benzoic - 120 ± 2 °, benzamidă - 126 ± 1 °, uree, nicotinamidă, D (+)-manoză - 132 ± 2 °. Parte teste chimice se introduce un colorant de anilină (magenta, violet de gențiană etc.), care colorează uniform substanța atunci când este topită. În prezent, indicatorii de tip IS (Vinar, Rusia) sunt mai des utilizați, reprezentând o bandă de hârtie cu un strat de amestec indicator aplicat pe ea și concepute pentru controlul vizual operațional nu numai al temperaturii, ci și al timpului de sterilizare (IS- 120, IS-132). Regimul de sterilizare este monitorizat trimestrial folosind un biotest cu spori ai culturii de testat Bacil stearotermophilus BKM B-718.

1.2. Cuptor Pasteur - sterilizare la caldura uscata.

In cuptorul Pasteur se sterilizeaza produse din sticla, metale si cauciucuri pe baza de cauciuc siliconic. Mod de sterilizare: 160°C - 150 min; 180°С - 60 min. Controlul modului de sterilizare la fiecare ciclu se realizează cu ajutorul indicatorilor de sterilizare IS-160, IS-180; trimestrial - folosind un biotest cu spori de cultură de testare Bacil licheniformis PCS. G BKM B-1711 D.

2. Completați acasa tabelul numarul 1.

Tabelul 1.

Sterilizarea

3. Familiarizați-vă cu dezinfectanții și umpleți in clasa tabelul nr. 2, folosind aplicațiile nr. 1, 2.

Masa 2.

Dezinfectare

4. Familiarizați-vă cu mediile nutritive și umpleți in clasa tabelul nr 3 „Medii nutritive”.

Tabelul 3

5. Microbiologia clinică ca ramură a microbiologiei medicale rezolvă două sarcini principale: diagnosticul etiologic al unei boli infecțioase și alegerea rațională a terapiei etiotrope.

Principala metodă de diagnostic microbiologic a rezolva aceste probleme este metoda bacteriologica. Esența metodei bacteriologice este de a izola o cultură pură a agentului patogen, de a determina tipul și sensibilitatea acesteia la medicamentele antimicrobiene.

Selectarea materialului studiat depinde de tipul bolii și de localizarea predominantă a agentului patogen într-un anumit stadiu al dezvoltării sale (patogeneză). Materialul poate fi sânge, lichid cefalorahidian, scurgeri ale plăgii, spută, fecale, urină etc. Tehnica de prelevare a materialului are mare importanțăîn obţinerea unor rezultate de încredere.

Succesul izolării unei culturi pure este determinat de corectitudine alegerea mediului nutritiv și a condițiilor de cultivare. Nu există un mediu nutritiv universal, a cărui utilizare va face posibilă izolarea oricăror microorganisme din orice material de testat. Prin urmare, ținând cont de caracteristicile fiziologice ale posibililor agenți patogeni, materialul este semănat pe un mediu nutritiv specific sau un complex de medii nutritive (special, electiv, diagnostic diferenţial). Unele microorganisme necesită și condiții speciale de cultivare (anaerobe, microaerofile, cu conținut ridicat de dioxid de carbon).

Materialul patologic de la un pacient este adesea un amestec de microorganisme. În acest sens, sarcina este de a le separa și obținând colonii izolate. O colonie izolată, ca urmare a reproducerii unei celule microbiene și constând dintr-un tip de celulă, este baza pentru obținerea unei culturi pure. În practica microbiologică se folosesc diverse metode pentru a obține colonii izolate. Următoarele sunt cele mai frecvent utilizate:

1. Semănat materialul de testare metoda „lovitură cu tampon”.- materialul de testat se aplică pe suprafața unui mediu nutritiv dens într-o zonă limitată, apoi se distribuie prin însămânțare cu mișcări paralele frecvente.

2. Metoda Drygalski- materialul aplicat la prima cană cu mediu nutritiv și semănat cu o spatulă se inoculează secvențial cu aceeași spatulă, fără a o steriliza, pentru încă 1-2 căni.

3. Metoda culturii sectoriale– materialul studiat se seamănă secvenţial cu o buclă pe mai multe sectoare. În același timp, o anumită tehnică de însămânțare (metoda gould) permite nu numai obținerea de colonii izolate, ci și determinarea numărului de microorganisme în 1 ml (g) de material de testat, ceea ce este important în aprecierea rolului etiologic al microorganismelor oportuniste (OPM).

5.1.Efectuarea etapei I a metodei bacteriologice pentru izolarea aerobilor:

Se prepară un preparat fix din materialul de testat, se colorează după metoda Gram, microscopic, se identifică microorganismele detectate prin proprietăți morfo-tinctoriale; acordați atenție numărului de microorganisme. Înregistrați rezultatele în protocol și trageți o concluzie;

Semănați materialul de testat pe o jumătate de cană cu un mediu nutritiv dens folosind metoda „lovitură cu platformă”;

· semăna materialul de testat pe trei plăci cu mediu nutritiv folosind metoda Drygalski (demonstrație);

Etichetați vasele cu data inoculării și puneți-le cu capul în jos într-un termostat la 37°C timp de 18-24 ore.

6. Mijloace de colectare și livrare a materialului patologic

Notă: * - utilizat dacă timpul de livrare a materialului la laborator după primirea acestuia depășește 1,5-2 ore.

Întrebări pentru autocontrol:

1. Numiți și justificați principiile cultivării microorganismelor.

2. De ce se folosesc medii elective, de diagnostic diferențial și de acumulare pentru însămânțarea materialului patologic?

3. Justificați principiul obținerii de culturi pure de microorganisme.

4. De ce este metoda bacteriologică „standardul de aur” în diagnosticul microbiologic al bolilor infecțioase?

5. Pe care sunt metodele chimice si biologice de obtinere a culturilor pure de microorganisme pe baza?

6. Care este diferența dintre sterilizare și dezinfecție?

7. Justificați scopul sterilizării și dezinfectării în practica microbiologică și medicală.

8. Justificați avantajul utilizării sistemelor de indicatori termici pentru monitorizarea regimului de sterilizare (pe exemplul unui indicator IS din Vinar, Rusia).

Literatură:

Tutoriale:

1. Borisov L. B. Microbiologie medicală, virologie, imunologie. - M.: MIA SRL, 2002. - S. 26-29, 63-66, 150-159.

2. Pozdeev O. K. Microbiologie medicală / Ed. acad. RAMS V. I. Pokrovsky. - M.: Medicina GEOTAR, 2001. - S. 76-77, 126-130, 253-265.

Literatură suplimentară:

1. Siguranța muncii cu microorganisme din grupele III - IV de patogenitate și helminți: Reguli sanitare. – M.: centru federal Supravegherea Sanitară și Epidemiologică de Stat Ministerul Sănătății al Rusiei, 1999. - 107p.

Prelegeri de microbiologie.

Teste.

Metoda de cercetare bacteriologică. Izolarea unei culturi pure de bacterii aerobe (1-2 etape)

1. Esența metodei bacteriologice

3. Metode de obţinere a coloniilor izolate

4. Metode de obţinere a culturii pure

1. Se efectuează însămânțarea primară prin metoda Koch și Drygalski

2. Izolați cultura pură

Plan de muncă:

1. Metoda cercetării bacteriologice

2. Etapele metodei bacteriologice

3. Concept: cultură pură, tulpină, colonie

4. Metode de obţinere a coloniilor izolate

5. Metode de obţinere a unei culturi pure de bacterii aerobe

Principala metodă de diagnostic de laborator al bolilor infecțioase este metoda bacteriologică. Esența metodei bacteriologice este izolarea agenților patogeni din materialul studiat și identificarea acestuia (definirea genului, speciei, soiurilor).

Metoda bacteriologică vă permite să determinați:

1. Tipul de agent patogen și puneți un diagnostic al bolii

2. Antibiotice care ucid agentul patogen și prescriu tratamentul adecvat

3. Fagovari și serovare ale agentului patogen pentru a identifica sursa de infecție

Prima etapă este inocularea primară a materialului de testat pentru a obține colonii izolate. Semănatul primar se efectuează pe medii de stocare și DDS (medii de cupă).

A doua etapă este caracterizarea coloniilor izolate și obținerea unei culturi pure din acestea prin reînsămânțare pe o coloană înclinată a mediului principal.

A treia etapă este identificarea unei culturi pure - determinarea genului, speciilor, varietăților de agent patogen, determinarea sensibilității la antibiotice, determinarea fagovarelor.

Cultura de microorganisme este o bacterie crescută pe medii nutritive. O cultură pură este o specie de bacterii crescută pe medii nutritive. În cadrul unei specii, există soiuri care diferă într-o singură trăsătură:

1. Morphovars - diferă ca morfologie

2. Chemovars - diferă în proprietăți biochimice

3. Serovarii - diferă prin proprietăți antigenice

4. Fagovari - diferă prin sensibilitate la fagi

O cultură pură este necesară pentru identificarea, determinarea serovariilor, fagovarilor, sensibilitatea la antibiotice. O tulpină este o specie de bacterii izolată dintr-o anumită sursă (râul Volga, Ivanov bolnav etc.). Colonie - o acumulare vizibilă de bacterii din aceeași specie, formată în timpul reproducerii unei celule bacteriene pe un mediu nutritiv dens.

Prima etapă a studiului este inocularea primară a materialului de testat pentru a obține colonii izolate. Înainte de inocularea inițială, se efectuează microscopia materialului de testat. Materialul de testat conține de obicei un amestec de diferite bacterii, inclusiv agenți patogeni. Pentru izolarea agentului patogen este necesar să se obțină colonii izolate (bacterii din aceeași specie) prin selectarea unui mediu nutritiv și folosind metode speciale de însămânțare.

Există două metode de obținere a coloniilor izolate:

1. Metoda Drygalski