Бактериологичното изследване е изследване, предназначено за изолиране и изследване на техните свойства с цел поставяне на микробиологична диагноза.
Материалът за изследване трябва да се вземе при асептични условия в стерилни съдове и да се достави в лабораторията възможно най-скоро. Ако е необходимо, пробите трябва да се съхраняват в хладилник. Техниката на вземане на проби зависи от обекта, характера на заболяването и свойствата на микроорганизма. Един от най-разпространените методи за бактериологично изследване е бактериоскопията.
За изследване на нефиксирани бактерии се използват два метода: смачкана (между предметното и покривното) капка и. Трябва да се помни, че препаратите от нефиксирани бактерии са заразни.
Натривки се използват за бактериоскопия на фиксирани препарати. За да ги приготвите, капка от тестовата течност се нанася върху повърхността на предметно стъкло и след това се изсушава. Най-често срещаният метод за фиксиране на лекарството е пренасянето му през пламъка на газова горелка. В някои случаи се използват фиксиращи съединения. Фиксираните препарати обикновено се оцветяват (вижте Оцветяване на микроорганизми). Към номера основни елементибактериологичните изследвания включват инокулации и субкултури, произведени от бактериална бримка или пипета на Пастьор. Примката се стерилизира чрез изпичане на пламък, след което се охлажда чрез докосване на област от неинокулиран агар или чрез изплакване в стерилна течност. При използване на пастьорова пипета върхът й се отчупва с пинсета, пипетата се прекарва няколко пъти през пламъка на горелката и се оставя да изстине. При сеитба се използват течни и твърди хранителни среди. При засяване върху наклонен агар културата от бактерии се втрива с примка върху повърхността на агара. При засяване в дебелината на агар или желатинова колона, хранителната среда се пробива до дъното на епруветката с бримка или специална игла. При засяване в течна среда е необходимо да се гарантира, че течността не се разлива и не намокря ръбовете на епруветките и запушалките. Инокулациите и субкултурите трябва да се извършват близо до пламъка на газова горелка, епруветките не трябва да остават отворени дълго време, бримката или пипетата на Пастьор с културата не трябва да докосват нищо; преди да затворите тръбата, краищата й трябва да бъдат изгорени. Инокулираните епруветки трябва незабавно да бъдат етикетирани.
Най-важната стъпка в бактериологичното изследване е идентификацията - определяне на вида или вида на бактериите, получени под формата на чиста култура. При идентифициране на бактерии се изследват техните физиологични и биохимични свойства, образуването на токсини. Серологичните методи за идентифициране на бактерии са широко използвани (реакции и). В много случаи биологичният метод за идентифициране на микроорганизми е ефективен, базиран на заразяване на лабораторни животни с тестовия материал или получената бактериална култура и идентифициране на характерни патологични промени при животните.
За изолиране на чисти култури се използват механични и биологични методи. Пример за механичен метод: капка от тестовия материал се разтрива със същата стерилна шпатула или бактериална примка върху плътна повърхност. растежна среда, последователно в първи, втори и трети . Изолирането на чиста култура се извършва от отглеждани индивидуални колонии и се състои в тяхното изследване и скрининг върху свежа хранителна среда. Биологичните методи за изолиране на чисти култури се основават на отчитане на едно или друго свойство на изолирания микроб, което го отличава от другите микроби, присъстващи в изследвания материал.
При биологичния метод се използва този вид хранителни среди, в които се създават условия, благоприятни за развитието на определен вид микроби. Биологичните методи също включват заразяване на лабораторни животни, чувствителни към изолирания вид бактерии.
Бактериологичното изследване е набор от методи за откриване на патогенни микроорганизми в пациент, в носител или върху обекти на околната среда. Бактериологични изследванияТе се използват и за откриване на условно патогенни и санитарно-показателни микроби, които характеризират степента на замърсяване на външната среда, за изследване на микробния пейзаж на определена среда (обект). Бактериологичните изследвания могат да се използват за диагностика, профилактика на инфекциозни заболявания, за санитарни и хигиенни характеристики на околната среда около човек, за научни изследвания.
Материалът и методът на бактериологичното изследване зависят от целта на анализа, условията на околната среда, патогенезата и хода на заболяването. При наличие на бактериемия микробът се открива чрез хемокултура. При тежки локални лезии, патогенът трябва да се търси в изхвърлянето или секретите на засегнатия орган (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.). И накрая, при заболявания със сложен курс, когато (както например при коремен тиф) бактериемията се заменя с лезии на тънките черва, на всеки етап се използва подходящ метод за изследване: кръвни култури се извършват през първата седмица от заболяване, а серологичното изследване е най-надеждно през втората, като се започне от третата седмица се получава положителен резултат при засяване на изпражнения; последният метод се използва и като контролно изследване за откриване на бактериални носители сред реконвалесценти и за тяхното наблюдение.
Изпълнението на всяка от тези задачи се извършва с помощта на методи, предназначени за изолиране и идентифициране на микроорганизми. В зависимост от характеристиките на микроба се използва целият комплекс от методи или части от него.
Бактериоскопията е най-достъпната техника, базирана на микроскопско изследване на материала. При микроскопия на пресни препарати могат да се използват някои микрохимични реакции (например оцветяване на йодофилни бактерии с разтвор на Лугол) или селективно оцветяване на различни структурни части на бактерии.
Бактериите могат да бъдат по-ясно идентифицирани в оцветения препарат. Тестовият материал се нанася върху предметно стъкло на тънък и възможно най-равномерен слой. Оставете препарата да изсъхне на въздух и го фиксирайте по един от общоприетите методи, но най-често чрез пламък, т.е. два или три пъти бързо задържане на препарата над пламъка на горелката, така че стъклото да е топло, но не горещо. Препаратът, охладен след фиксация, се оцветява с обикновено или диференциално оцветяване (виж Оцветяване на микроорганизми). При флуоресцентната микроскопия се използват както нативни, така и сухи препарати. В този случай третирането с определени багрила кара структурите на микробното тяло или целия микроб да светят в ултравиолетови или къси сини лъчи. В друга модификация микробите се третират със специфични серуми, маркирани с флуоресцентни (багрила). Бактериите, съответстващи на серума, ще светят, когато етикетираният серум се отложи върху тях. Хетероложните бактерии няма да светят.
Методът на бактериоскопията се използва широко за бактериологична диагностика на някои инфекциозни заболявания (гонорея, туберкулоза, рецидивираща треска), както и при изследване на целия комплекс от микрофлора на орган (сливици, вагина), продукт или друг обект.
Методът на засяване, т.е. изолирането на чиста култура от желания микроорганизъм, е по-точен и надежден метод за бактериологична диагностика от бактериоскопията. Пресният материал се намазва върху повърхността на плътна хранителна среда, излята в петриеви панички. Първичната инокулация се извършва на конвенционални среди, благоприятни за даден микроб, на диференциални или селективни среди. Изборът на хранителна среда (виж), както и методът за предварителна обработка на пресен материал за сеитба зависи от степента на замърсяването му със съпътстваща външна микрофлора. След 24-48 часа. съдържание в термостат при оптимална температура за даден микроб, чашките се изследват и подозрителните колонии се инокулират върху среда, която насърчава възпроизвеждането на този патоген. Така се получава култура от хомогенни бактерии, които трябва да бъдат идентифицирани.
Идентифицирането на микроб започва с изследване на неговата морфология в боядисания препарат и в натрошена капка (виж), за да се определи формата на микробите и тяхната мобилност. Следващата стъпка е да се изследва ензимната способност на бактериите да разграждат въглехидрати, аминокиселини и урея в комбинации, специфични за всеки вид. Бактериите имат най-изучената захар и протеолитични ензими.
Идентифицирането на микроб трябва да бъде допълнено от изследване на други свойства, характерни за всеки род и вид микроорганизми. Тези свойства включват способността за селективно разтваряне на еритроцитите на различни животни (хемолиза), коагулация на кръвната плазма (плазмена коагулация), разтваряне на фибринов съсирек (фибринолиза) и др. Всички тези характеристики на бактериите могат да се използват при идентифицирането им като диференциални признаци.
Окончателната идентификация на микроби от някои видове, главно патогенни бактерии от семейството на червата, включва серологична идентификация (виж Микробна идентификация). Обикновено за това се задава реакция на аглутинация, т.е. натрупването на бактерии се открива под въздействието на едноименния имунен серум. Аглутинацията на микроби в серума срещу определен вид показва принадлежност към този вид. Обикновено реакцията на аглутинация се поставя приблизително върху стъкло и за окончателно определяне в епруветки със серумни разреждания.
Редица микроби не могат да бъдат напълно определени по описания начин. Тогава идентификацията трябва да бъде допълнена от инфекция на лабораторни животни, тъй като някои бактерии се характеризират с патогенност или токсигенност, която се разкрива, когато животните са заразени. В някои случаи инфекцията на животни също служи като метод за натрупване на патогенни микроби.
Само сравнение на всички характеристики на културата, събрани по време на изследването на морфологията, биохимичните, серологичните и, когато е необходимо, нейните биологични свойства, може да даде основания за идентификация. Отговорът с положителен резултат от изследването не е труден, ако изолираният микроб е типичен. В този случай се посочват родът, видът и, ако е определен, видът на бактерията. При изолиране на микроб, който се отклонява по някои свойства от типична характеристика, се дава отговор, който посочва отклоняващия се признак. В този случай е полезно да се повтори изследването, ако ходът на заболяването или условията на събиране на материала позволяват. Също така е полезно културата на атипичните микроби да се подложи на допълнително изследване чрез други, по-сложни методи.
Отрицателните резултати от бактериологично изследване са от относително значение и показват само, че изследваната част от материала не съдържа желаните микроби или не е жизнеспособна. Те обаче могат да присъстват в различна част. Ето защо, например, при изследване за бацилоносители (коремен тиф, дизентерия, дифтерия) са необходими повторни изследвания.
За изследване на анализите за наличието на определени бактерии в тях се използват различни диагностични методи, включително бактериоскопичният метод. Характеристиките на този метод, както и методът на бактериологично изследване, ще бъдат обсъдени в тази статия.
Същността на бактериоскопския метод за диагностика
Бактериоскопският метод за изследване на проба е предназначен за идентифициране на микроорганизми в тестваното вещество, както и за подробно изследване на свойствата на тези микроорганизми, изясняване на техния брой и поведение в разглежданата среда. Предимствата на този метод за изследване на анализите са простота, бързина и достъпност. Може да се извърши в почти всяка лаборатория с минимален брой инструменти и химикали. Неговите недостатъци включват невъзможността да се получи пълна картина на поведението на микробите.
Необходими материали за изследване
За изследване на анализите чрез бактериоскопски метод са необходими следните инструменти:
- Метална примка.
- Пързалка. Този елемент трябва да е чист, тъй като всяко замърсяване може да повлияе на състоянието на пробата.
- пинсети.
- Филтърна хартия.
Новите предметни стъкла се почистват с 1% разтвор на сода. След кипене в такъв разтвор стъклото се измива с дестилирана вода, слаб разтвор на солна киселинаи след това отново с дестилирана вода. Използваните стъкла се почистват на няколко етапа: първо се поставят в разтвор на сярна киселина за 60-120 минути, след това се изваряват в разтвор на сода, след което стъклото се измива с вода. След това чашата се потапя в медицински спирт.
Съхранявайте чашите за инструменти в алкохол или в плътно затворени съдове. И в последния случай стъклото трябва да е сухо.
За това изследване ще ви трябват и следните химични реактиви:
- алкохол;
- разтвор на Лугол;
- багрила.
Най-често използваните багрила са Ziehl magenta, метиленово синьо и карболово тинтява виолетово. Последното багрило е разтвор на обикновен фуксин в пет процента карболова вода.
Напредък на изследванията
Можете да изследвате културата както в нейната оригинална, така и в рисувана форма. В последния случай както колониите от микроорганизми, така и отделните бактерии ще бъдат мъртви, което прави възможно по-доброто запознаване със структурата на тези прости организми. Когато изучава лекарството в оригиналната му форма, на свой ред лаборантът получава повече информация за активността на микробите. И в двата случая лекарството се изследва с помощта на микроскоп.
Оцветяването на средата се извършва на два етапа, като първо се подготвя препаратът за процедурата и едва след това се оцветява. Подготовката на пробата протича по следния начин:
- Пробата, предназначена за изследване, се разпределя равномерно върху стъклото на инструмента под формата на кръг или овал. Ако в материала има чужди примеси (например гной), 1-2 капки вода се нанасят върху стъклото, преди да се добави тестовата проба.
- След това полученото намазка трябва да изсъхне.
- Веднага след като намазката изсъхне, тя трябва да се фиксира с пламък от горелка.
За да се фиксира по този начин, инструменталното стъкло се държи три пъти над пламъка. Ако намазката е фиксирана достатъчно здраво, тогава лаборантът, който провежда експеримента, ще почувства парене в пръстите.
В края на тази процедура пробата се оцветява.
Методи за оцветяване на проби
Оцветяването може да бъде просто, като се използва само една боя. И комплекс, в който, за да се разграничат точно бактериалните клетки според една или друга от тях характеристикиняколко различни химикала за оцветяване се прилагат последователно към пробата. Пример за сложно оцветяване са методите на Грам и Зил-Нилсен.
Метод на Грама
Методът на Грам ви позволява да определите химичен съставклетъчната мембрана. Благодарение на този метод е въведена класификацията на бактериите по Грам: грам-положителните бактерии (които включват причинителите на много заболявания) след оцветяване придобиват тъмно лилав цвят, а грам-отрицателните бактерии придобиват характерен червен нюанс. Методът на Грам се състои от следните стъпки:
- Първо, лекарството се третира с разтвор на Lugol за една минута.
- След третиране с Lugol пробата се обезцветява с алкохол.
- След това препаратът се измива с дестилирана вода и допълнително се оцветява с фуксин.
Метод на Ziehl-Neelsen
Методът на Ziehl-Nielsen се използва за определяне на чувствителни към киселина бактерии, чиито клетъчни мембрани съдържат голямо количество липиди, например туберкулозни патогени. Работата по този метод се извършва на пет етапа:
- Филтърна хартия се поставя върху предметно стъкло, върху което след това се нанася малко количество фуксин на Ziel.
- След това предметното стъкло се нагрява, докато се появят характерни пари. След появата на пара стъклото се оставя да изстине. Тази процедура се повтаря още два пъти, след което чашата отново се оставя да изстине.
- След това фуксинът се измива от стъклото на инструмента с дестилирана вода, след отстраняване на хартията.
- След това стъклото се поставя в разтвор на солна или сярна киселина до пълна загуба на цвета на пробата.
- Накрая върху обезцветения препарат се нанася разтвор на метиленово синьо, стъклото се измива с дестилирана вода и се оставя да изсъхне за по-нататъшно изследване на получения препарат под микроскоп.
Метод на Leffler
Сред простите методи за оцветяване е методът на Leffler. С него всички бактерии придобиват Син цвят. Този метод работи в две стъпки:
- Върху намазката се поставя филтърна хартия, върху която се нанася разтвор на метиленово синьо Leffler. В това състояние лекарството се оставя за 3-5 минути.
- След този период от време препаратът се измива с вода и се изсушава, след което може да се изследва под микроскоп.
При бактериоскопския метод се оцветяват поне два препарата, като единият от тях се оцветява прост метода едното е сложно.
Бактериологичен метод
Често, когато се изследват анализите, става необходимо да се определи чувствителността на патогена към определено лекарство. В този случай пробата се изследва чрез бактериологичен метод. Този методсе състои от следните стъпки:
- Първо, трябва да почистите културата, за да идентифицирате специфични видове микроби. За да направите това, пробата трябва да бъде поставена в среда, в която е най-вероятно развитието на бактериите, които ще бъдат открити. Възможно е и механично отделяне на биоматериала по време на инокулацията му.
- След получаване на чиста култура, взетите от нея проби се изследват с бактериоскопски метод.
Следват примери за среди, използвани за откриване на микроорганизми:
- Среда на Elschnig, състояща се от една трета конски серум и две трети бульон.
- Серум на Loeffler, който се използва за откриване на патогени на дифтерия. Тази среда се състои от 3/4 конски или говежди серум и 1/4 1% глюкозен бульон.
- Кръвен агар, използван за откриване на стрептококи и тестване на тяхната чувствителност към ефектите на антибактериални лекарства. Тази среда се състои от 5-10% животински серум и агар.
Видове бактериоскопски анализи
Бактериоскопия на изпражненията
За бактериоскопско изследване на фекален анализ е необходима проба от анализа на пациента. Ако е необходимо да се анализира чревната микрофлора, чиито нарушения показват наличието на дисбактериоза или инфекциозни заболявания на храносмилателната система, пробата се взема с помощта на бримка, която се вкарва в ануса на дълбочина около 10 сантиметра.
При изследване на проба от изпражнения могат да бъдат открити следните опасни микроорганизми:
- Стафилококи.
- Klebsiella, чието присъствие показва увреждане на дебелото черво.
- Pseudomonas aeruginosa, който отделя изключително опасни за хората токсини.
Наличието на Pseudomonas aeruginosa в човешкото тяло може да доведе до отравяне на кръвта и менингит - заболявания, които могат да бъдат фатални.
Бактериоскопия на тестове за урина
Изследване на урината за бактериоскопско изследване се дава при съмнение за възпаление на отделителната система и наличие на заболявания като пиелонефрит и цистит, чиито причинители са ешерихия коли и съответно някои патогени на полово предавани болести. За такова изследване са необходими от 50 до 100 ml урина, като урината трябва да се съхранява в стерилен съд. Преди да преминете анализа, е необходимо да се измиете добре, така че в урината да има по-малко примеси от трети страни. Не се препоръчва уриниране по време на менструация.
Бактериоскопският анализ на урината е незаменим за откриване на заболявания на пикочната система при кърмачета. В този случай урината се събира през катетър в стерилен контейнер. Изследването на пробата от урина трябва да се извърши възможно най-скоро, в противен случай откриването на патогени ще бъде трудно.
Бактериоскопия на храчките
При анализ на храчки се изследват две намазки. Един от тях се изследва за наличие на бацили на Кох - причинителите на туберкулозата. Въз основа на резултатите от второто изследване се правят заключения за наличието на други микроби в храчките.
За да се анализира храчката за туберкулоза, пробата се оцветява по метода на Ziehl-Neelsen.
За да се анализира наличието на други микроби, пробата се оцветява по метода на Грам. С помощта на бактериоскопски метод, използващ оцветяване по Грам, е възможно да се идентифицира пневмокок, бактерия, която причинява пневмония. Също така при работа с проба по тази схема е възможно да се открие наличието на стрептококи в храчките - причинителите на ангина, както и Staphylococcus aureus. Последният микроорганизъм представлява особена опасност за човешкото здраве. Провокира гнойни процеси и образуване на абсцеси, включително върху вътрешни органи.
Обобщаване
Бактериоскопският диагностичен метод е един от основните методи за изследване в микробиологията. Въпреки недостатъците си, този метод се използва широко в съвременна медициназа диагностициране на голямо разнообразие от заболявания, някои от които, например туберкулозата, представляват особена опасност за хората.
Бактериологичен метод на изследване (BLMI)- метод, основан на изолирането на чисти култури от бактерии чрез култивиране върху хранителни среди и тяхната идентификация на вида въз основа на изследване на морфологични, културни, биохимични, генетични, серологични, биологични, екологични характеристики на микроорганизмите.
Бактериологичната диагностика на инфекциите се извършва по стандартни диагностични схеми, одобрени от Министерството на здравеопазването.
Чиста култура -бактерии от същия вид, отглеждани върху хранителна среда, чиито свойства са в процес на изследване.
Прецедете- идентифицирана чиста култура от микроорганизми от същия вид, изолирана от определен източник в точно определено време. Щамовете от един и същи вид могат да се различават незначително по биохимични, генетични, серологични, биологични и други свойства, както и по мястото и времето на изолиране.
Цели на BLMI:
1. Етиологична диагноза: изолиране на чиста култура от микроорганизми и нейното идентифициране.
2. Определяне на допълнителни свойства, например чувствителността на микроорганизма към антибиотици и бактериофаги.
3. Определяне на броя на микроорганизмите (важно при диагностиката на инфекции, причинени от UPM).
4. Типизиране на микроорганизми, т.е. определяне на вътрешноспецифични различия въз основа на изследването генетичнии епидемиологични(фаговари и серовари) маркери.Това се използва за епидемиологични цели, тъй като ви позволява да установите сходството на микроорганизмите, изолирани от различни пациенти и от различни обекти на външната среда, в различни болници, географски региони.
BLMI включва няколко етапа,различни за аероби, факултативни анаероби и облигатни анаероби.
I. Етапи на BLMI при изолиране на чиста култура от аероби и факултативни анаероби.
Сцена.
А. Събиране, транспортиране, съхранение, предварителна обработка на материала.Понякога преди сеитбата се извършва селективна обработка на материала, като се вземат предвид свойствата на изолирания микроорганизъм. Например, преди да се изследва храчка или друг материал за наличие на устойчиви на киселина Mycobacterium tuberculosis, материалът се третира с киселинни или алкални разтвори.
B. Посяване в среда за обогатяване(ако е необходимо) Извършва се, ако тестовият материал съдържа малко количество бактерии, например при изолиране на кръвна култура. За да направите това, кръвта, взета в разгара на треската в голям обем (8-10 ml при възрастни, 4-5 ml при деца), се инокулира в средата в съотношение 1:10 (за преодоляване на бактерицидното действие на кръвта). фактори); посевът се инкубира при температура 37 0 С за 18-24 часа.
Б. Микроскопия на изследвания материал.От изследвания материал се приготвя цитонамазка, оцветява се по Грам или друг метод и се микроскопира. Оценете наличната микрофлора, нейното количество. В хода на по-нататъшното изследване трябва да се изолират микроорганизми, присъстващи в първичната намазка.
Ж. Засяване върху хранителни среди за получаване на изолирани колонии.Материалът се инокулира с бримка или шпатула чрез механично отделяне върху блюдо с диференциално диагностична или селективна среда с цел получаване на изолирани колонии. След сеитбата съдът се обръща с дъното надолу (за да се избегне размазване на колониите с капчици кондензационна течност), подписва се и се поставя в термостат при температура 37 0 С за 18-24 часа.
Трябва да се помни, че при засяване и повторно засяване на микробни култури вниманието на работника трябва да се насочи към спазването на правилата за асептика, за да се предотврати замърсяване на хранителните среди и да се предотврати инфекция на други и самоинфекция!
В случай на инфекции, причинени от опортюнистични микроорганизми, когато броят на микроорганизмите, присъстващи в патологичния материал, има значение, се прави количествена инокулация на материала, за която се приготвя серия от 100-кратни разреждания на материала (обикновено 3 разреждания). в стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки. След това 50 μl от всяко разреждане се засяват върху хранителни среди в петриеви панички.
Сцена.
А. Изследване на морфотипове на колонии върху среди, тяхната микроскопия.Те преглеждат съдовете и отбелязват оптималната хранителна среда, скоростта на растеж и естеството на растежа на микроорганизмите. Изберете да учите изолирани колонии, разположени по хода, по-близо до центъра.Ако растат няколко вида колонии, всеки се изследва отделно. Оценете признаците на колониите (табл. 7). Ако е необходимо, съдовете с култури се гледат през лупа или с помощта на микроскоп с леща с ниско увеличение и стеснен отвор. Те изучават тинкториалните свойства на различни морфотипове на колонии; за това се подготвя част от изследваната колония намазвам,оцветяват се по Грам или други методи, микроскопски и се определя морфологията на чистотата на културата.При необходимост се поставят указателен RA на стъклос поливалентни серуми.
Б. Натрупване на чиста култура.За да се натрупа чиста култура, изолирани колонии от всички морфотипове се субкултивират в отделни епруветки с наклонен агар или друга хранителна среда и се инкубират в термостат при +37 0 C (тази температура е оптимална за повечето микроорганизми, но може да бъде различна, например за Campylobacterium spp.- +42 0 C, Candida spp. и Yersinia pestis- +25 0 С).
Средата на Kligler обикновено се използва като среда за натрупване на ентеробактерии.
Съставът на средата Kligler: MPA, 0,1% глюкоза, 1% лактоза, сероводороден реагент (железен сулфат + натриев тиосулфат + натриев сулфит), индикатор фенолово червено. Първоначалният цвят на средата е малиново-червен, средата е „наклонена“ в епруветките: има колона (2/3) и скосена повърхност (1/3).
Засяването в средата на Kligler се извършва чрез щрих върху повърхността и инжектиране в колона.
Сцена.
А. Отчитане на растежа върху средата за натрупване, оценка на чистотата на културатав цитонамазка по Грам. модели на растежизолирана чиста култура. Визуално чистата култура се характеризира с равномерен растеж. При микроскопско изследванеоцветена намазка, приготвена от такава култура, в нея се откриват морфологично и тинкториално хомогенни клетки в различни зрителни полета. Въпреки това, в случай на изразен плеоморфизъм, присъщ на някои видове бактерии, клетки с различна морфология могат да се появят едновременно в намазки от чиста култура.
Ако като среда за натрупване е използвана индикаторната среда Kligler, тогава се оценяват нейните промени в цвета в колоната и скосената част, според които се определят биохимичните свойства: ферментация на глюкоза, лактоза и производство на сероводород. Когато лактозата се разложи, наклонената част на средата става жълта, когато глюкозата се разлага, колоната става жълта. С образуването на CO 2 по време на разлагането на захарите се образуват газови мехурчета или прекъсване на колоната. В случай на производство на сероводород се забелязва почерняване по дължината на инжектирането поради превръщането на железен сулфат в железен сулфид.
Естеството на промяната в цвета на средата на Kligler (фиг. 23) се обяснява с неравномерната интензивност на разграждането на азотните вещества от микроорганизмите и образуването на алкални продукти при аеробни (на наклонена повърхност) и анаеробни (при колона) условия.
При аеробни условия се получава по-интензивно алкално образуване на наклонена повърхност, отколкото в средна колона. Следователно, по време на разлагането на глюкозата, присъстваща в средата в малко количество, киселината, образувана върху скосената повърхност, бързо се неутрализира. В същото време, по време на разграждането на лактозата, която присъства в среда във висока концентрация, алкалните продукти не са в състояние да неутрализират киселината.
При анаеробни условия в колоната се образуват алкални продукти в незначително количество, така че тук се открива ферментация на глюкоза.
Ориз. 23.Среден индикатор Kligler:
1 - първоначално,
2 - с растеж E. coli
3- с ръст S. paratyphi B,
4 - с растеж S. typhi
E. coliразграждат глюкозата и лактозата с образуване на газ, не произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната и скосената част с прекъсвания на медията.
S. paratyphiразграждат глюкозата с образуване на газ, лактоза-отрицателна. Те причиняват пожълтяване на колоната с прекъсвания, скосената част не променя цвета си и остава малинова. При което S. paratyphi Bпроизвеждат сероводород (по време на инжектирането се появява черен цвят), S. paratyphi Aне се произвежда сероводород.
S. typhiразграждат глюкозата без образуване на газ, лактоза-отрицателни, произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната без прекъсвания, скосената част не променя цвета си и остава малинова, по време на инжектирането се появява черен цвят.
Shigella spp.глюкозо-положителни, лактозо-отрицателни, не произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната (с или без прекъсвания в зависимост от серовара), скосената част не променя цвета си и остава пурпурна.
Б. Окончателна идентификация на чистата култура(определяне на системното положение на изолирания микроорганизъм до ниво вид или вариант) и определяне на спектъра на чувствителност на изолираната култура към антибиотици.
За идентифициране на чиста култура на този етап се изследват биохимични, генетични, серологични и биологични характеристики (Таблица 8).
В рутинната лабораторна практика не е необходимо да се изследват всички свойства по време на идентификацията. Използвайте информативен, достъпен, прости тестове, достатъчни за определяне на видовата (вариантна) принадлежност на изолирания микроорганизъм.
9. Бактериологичен метод за диагностика на инфекциозни заболявания
Основен метод за микробиологична диагностика и "златен стандарт" на микробиологията е бактериологичният метод.
Целта на бактериологичния методсе състои в изолиране на чиста култура на патогена от тестовия материал, натрупване на чиста култура и идентифициране на тази култура чрез набор от свойства: морфологични, тинкториални, културни, биохимични, антигенни, чрез наличие на фактори на патогенност, токсигенност и определяне на нейната чувствителност. към антимикробни лекарства и бактериофаги.
Бактериологичният метод на изследване включва:
1. инокулация на тестовия материал в хранителни среди
2. изолация на чиста култура
3. идентификация на микроорганизми (определяне на принадлежност към вид).
Изолирането и идентифицирането на чисти култури от аеробни и анаеробни бактерии включва следните изследвания:
I етап (работа с роден материал)
Цел: получаване на изолирани колонии
1. Предварителната микроскопия дава приблизителна представа за микрофлората
2. Подготовка на материал за изследване
3. Засяване върху плътни хранителни среди за получаване на изолирани колонии
4. Инкубация при оптимална температура, най-често 37°C, за 18-24 часа
II етап
Цел: получаване на чиста култура
1. Макроскопско изследване на колонии в пропусната и отразена светлина (характеризиране на размера, формата, цвета, прозрачността, консистенцията, структурата, контура, повърхността на колониите).
2. Микроскопско изследване на изолирани колонии
3. Тестване за аеротолерантност (за потвърждаване наличието на строги анаероби в тестовия материал).
4. Засяване на колонии, характерни за даден вид, върху чиста среда за натрупване на култура или елективна среда и инкубиране при оптимални условия.
Етап III
Цел: Идентифициране на изолирана чиста култура
1. За идентифициране на изолираната култура чрез комплекс от биологични свойства се изследва следното:
морфология и тинкториални свойства
културни свойства (естество на растеж върху хранителни среди)
биохимични свойства (ензимна активност на микроорганизми)
серологични свойства (антигенни)
вирулентни свойства (способност да произвежда фактори на патогенност: токсини, ензими, защитни и агресивни фактори)
патогенност за животните
способност за фаги (чувствителност към диагностични бактериофаги)
чувствителност към антибиотици
други индивидуални имоти
Етап IV (Заключение)
По изследваните свойства се прави извод за изолираната култура
Първият етап от изследването.Изследването на патологичния материал започва с микроскопия. Микроскопията на оцветен нативен материал позволява да се установи приблизително съставът на микробния пейзаж на изследвания обект, някои морфологични характеристики на микроорганизмите. Резултатите от микроскопията на нативния материал до голяма степен определят хода на по-нататъшните изследвания и впоследствие се сравняват с данните, получени по време на инокулацията върху хранителни среди.
При достатъчно съдържание на патогенни микроорганизми в пробата, засяването се извършва върху плътна хранителна среда (за получаване на изолирани колонии). Ако има малко бактерии в тестовия материал, тогава инокулацията се извършва върху течна хранителна среда за обогатяване. Хранителните среди се подбират според изискванията на микроорганизмите.
Култивирането на микроорганизми е възможно само при създаване на оптимални условия за тяхната жизнена дейност и спазване на правилата, които изключват замърсяване (случайно замърсяване от чужди микроби) на тестовия материал. В епруветка, колба или петриево блюдо могат да се създадат изкуствени условия, които изключват заразяване на културата от други видове. Всички прибори и хранителни среди трябва да бъдат стерилни и след инокулация на микробен материал, защитени от външно замърсяване, което се постига с помощта на запушалки или метални капачки и капаци. Манипулациите с изпитвания материал трябва да се извършват в зоната на пламъка на спиртна лампа, за да се изключи замърсяването на материала от външната среда, както и за да се спазват правилата за безопасност.
Посяването на материала върху хранителни среди трябва да се извърши не по-късно от 2 часа от момента на събирането им.
Вторият етап на изследването.Изследване на колонии и изолиране на чисти култури. След един ден инкубация колониите растат върху плочите, като при първия удар растежът е непрекъснат, а при следващия - изолирани колонии. Колонията е колекция от микроби от един и същи вид, които са израснали от една клетка. Тъй като материалът най-често е смес от микроби, растат няколко вида колонии. Различните колонии се маркират с молив, като се очертават с кръг от страната на дъното и се изследват (Таблица 11). Първо, проучете колониите с просто око: макроскопични признаци. Чашата се гледа (без да се отваря) от дъното на пропускаща светлина, отбелязва се прозрачността на колониите (прозрачна, ако не улавя светлина; полупрозрачна, ако частично улавя светлина; непрозрачна, ако светлината не преминава през колонията), измерете (в mm) размера на колониите. След това изучават колониите от страната на капака, отбелязват формата (правилна кръгла, неправилна, плоска, изпъкнала), естеството на повърхността (гладка, лъскава, матова, грапава, набръчкана, мокра, суха, лигавица), цвят (безцветен, оцветен).
Таблица 11. Схема на изследване на колонии
|
Възможни характеристики на колонията |
||
|
Плосък, изпъкнал, куполообразен, вдлъбнат, кръгъл, розетков, звездообразен |
||
|
Размер, мм |
Голям (4-5 mm), среден (2-4 mm), малък (1-2 mm), джудже (< 1 мм) |
|
|
Повърхностна природа |
Гладка (S-форма), грапава (R-форма), мазна (M-форма), набраздена, неравна, матова, лъскава |
|
|
Безцветен, боядисан |
||
|
Прозрачност |
Прозрачни, непрозрачни, полупрозрачни |
|
|
Естеството на ръбовете |
Гладка, назъбена, с ресни, влакнеста, назъбена |
|
|
Вътрешна структура |
Хомогенна, гранулирана, разнородна |
|
|
Последователност |
Вискозен, лигав, ронлив |
|
|
Емулгиране в капка вода |
Добро Лошо |
Забележка: 5-7 точки се изследват при малко увеличение на микроскопа.
Можете да видите разликата между колониите още по-добре, когато ги увеличите. За да направите това, затворена чиния се поставя с главата надолу върху предметна маса, кондензаторът се спуска леко, използва се малко увеличение на обектива (x8), премествайки чинията, микроскопичните признаци се изследват в колониите: естеството на ръба ( гладка, вълнообразна, назъбена, назъбена), структура (хомогенна, зърнеста, влакнеста, хомогенна или различна в центъра и по периферията).
След това се изследва морфологията на микробните клетки от колониите. За целта се правят петна от част от всяка от маркираните колонии, оцветени по Грам. Когато вземате колонии, обърнете внимание на консистенцията (суха, ако колонията се рони и се хваща трудно; мека, ако се хваща лесно на примката; лигава, ако колонията достига до примката; твърда, ако е част от колонията не се взема от цикъла, само цялата колония може да бъде премахната) .
При преглед на петна се установява, че колонията е представена от един вид микроб, следователно могат да се изолират чисти култури от бактерии. За да направите това, от изследваните колонии се извършва повторно засяване върху наклонен агар. При повторно засяване от колонии трябва да се внимава да се вземат точно предвидените колонии, без да се докосва примката на близките колонии. Епруветките се подписват и се инкубират в термостат при 37°C за 24 часа.
Третият етап на изследване.Идентифициране на изолираната култура. Идентификация на микробите - определяне на системното положение на изолираната от материала култура спрямо вида и варианта. Първото условие за надеждността на идентификацията е безусловната чистота на културата. За идентифициране на микроби се използва набор от признаци: морфологични (форма, размер, наличие на камшичета, капсули, спори, относителна позиция в намазка), тинкториални (връзка с оцветяване по Грам или други методи), химически (съотношение гуанин + цитозин в ДНК молекула), културни (изисквания към хранителни вещества, условия на култивиране, скорост на растеж и характер на различни хранителни среди), ензимни (разделяне различни веществас образуването на междинни и крайни продукти), серологични (антигенна структура, специфичност), биологични (вирулентност за животни, токсигенност, алергенност, ефект на антибиотици и др.).
За биохимична диференциация способността на бактериите да ферментират въглехидрати с образуването на междинни и крайни продукти, способността за разграждане на протеини и пептони и изследване на редокс ензими.
За изследване на захаролитичните ензими изолираните култури се инокулират в епруветки с полутечна среда, съдържаща лактоза, глюкоза и други въглехидрати и многовалентни алкохоли. При полутечни среди инокулацията се извършва чрез инжектиране в дълбочината на средата. При сеитба чрез инжектиране епруветката със средата се държи под ъгъл, запушалката се отстранява и ръбът на епруветката се изгаря. Материалът се взема със стерилна примка и с него почти до дъното се набожда колонка с хранителна среда.
За определяне на протеолитичните ензими изолираната култура се инокулира върху пептонна вода или MPB. За да направят това, те вземат епруветка с инокулация по-близо до себе си и епруветка със средата - по-далеч от себе си. И двете епруветки се отварят едновременно, като се захващат запушалките им с малкия пръст и ръба на дланта, краищата на епруветките се изгарят, малко култура се улавя с калцинирана охладена примка и се прехвърля във втората епруветка, стрива се в течна среда върху стената на епруветката и се измива със средата.
При сеитба и повторно засяване трябва да се обърне внимание на спазването на правилата за стерилност, за да не заразите посевите си с чужда микрофлора, а също и да не заразите околен свят. Епруветките се етикетират и се поставят в термостат за инкубиране при 37°C за един ден.
Заключение
Отчитане на резултатите. Заключение от изследването. Резултатите от идентификацията се вземат предвид и въз основа на съвкупността от получените данни, въз основа на класификацията и характеристиките на типовите щамове, описани в ръководството (ръководство на Bergy, 1994-1996), се определя типът на изолираните култури.
Бактериологичен метод на изследване. Изолиране на чиста култура от аеробни бактерии (1-2 етапа)
1. Същността на бактериологичния метод
3. Методи за получаване на изолирани колонии
4. Методи за получаване на чиста култура
1. Извършете първично засяване по метода на Кох и Дригалски
2. Изолирайте чиста култура
Работен план:
1. Метод на бактериологично изследване
2. Етапи на бактериологичния метод
3. Понятие: чиста култура, щам, колония
4. Методи за получаване на изолирани колонии
5. Методи за получаване на чиста култура от аеробни бактерии
Основният метод за лабораторна диагностика на инфекциозни заболявания е бактериологичният метод. Същността на бактериологичния метод е изолирането на патогени от изследвания материал и неговата идентификация (определяне на рода, вида, сорта).
Бактериологичният метод ви позволява да определите:
1. Вид на патогена и направете диагноза на заболяването
2. Антибиотици, които убиват патогена и предписват подходящо лечение
3. Фаговари и серовари на патогена за идентифициране на източника на инфекция
Първият етап е първичната инокулация на тестовия материал за получаване на изолирани колонии. Първичното засяване се извършва върху среда за съхранение и DDS (среда в чаша).
Вторият етап е характеризирането на изолираните колонии и получаването на чиста култура от тях чрез повторно засяване върху наклонена колона от основната среда.
Третият етап е идентифицирането на чиста култура - определяне на рода, вида, разновидностите на патогена, определяне на антибиотична чувствителност, определяне на фаговари.
Културата на микроорганизмите е бактерия, отглеждана върху хранителни среди. Чистата култура е един вид бактерии, отглеждани върху хранителни среди. В рамките на един вид има сортове, които се различават по един признак:
1. Морфовари – различават се по морфология
2. Хемовари - се различават по биохимични свойства
3. Серовари - различават се по антигенни свойства
4. Фаговари - различават се по чувствителност към фаги
Необходима е чиста култура за идентификация, определяне на серовари, фаги, чувствителност към антибиотици. Щамът е един вид бактерии, изолирани от определен източник (река Волга, болен Иванов и др.). Колония - видимо натрупване на бактерии от един и същи вид, образувано по време на размножаването на една бактериална клетка върху плътна хранителна среда.
Първият етап от изследването е първичната инокулация на тестовия материал за получаване на изолирани колонии. Преди първичната инокулация се извършва микроскопия на тестовия материал. Тестовият материал обикновено съдържа смес от различни бактерии, включително патогени. За да се изолира патогенът, е необходимо да се получат изолирани колонии (бактерии от същия вид) чрез избор на хранителна среда и използване на специални методи за засяване.
Има два метода за получаване на изолирани колонии:
1. Метод на Дригалски
