ODSTREDENIE

separácia v oblasti odstredivých síl kvapalných disperzných systémov s časticami väčšími ako 100 nm. Používa sa na izoláciu jednotlivých fáz (kvapalina - odstredivka alebo filtrát, pevná látka - sediment) z dvojzložkových (emulzie) a trojzložkových (emulzie obsahujúce pevnú fázu) systémov.

Metódy a vybavenie. Existujú dva spôsoby C.: odstredivé a filtračné. C. sa uskutočňuje v odstredivých strojoch - odstredivkách a kvapalinových odstredivých separátoroch. Hlavné pracovným orgánom týchto strojov je osovo symetrický plášť, alebo rotor (bubon), rotujúci vysokou frekvenciou c -1, vďaka čomu vzniká pole odstredivých síl až 2 x 10 4 g v priemyselných a do 35 x 10 4 g v laboratórnych strojoch ( g- voľné zrýchlenie. pád gravitácie lúka). V závislosti od spôsobu sa C. uskutočňuje v pevných (precipitačných; obr. 1, a) alebo perforovaných (potiahnutých filtračným materiálom; obr. 1, b) rotoroch.

Ryža. jeden. Rotory strojov na odstredivú sedimentáciu (a) a filtráciu ( b): C - suspenzia, F - odstredivka (filtrát), O - sediment; vysvetlenie v texte, r W je polomer voľného povrchu kvapaliny.

C. sa vyznačuje množstvom technológií. parametre, ktoré určujú kvalitu procesu a jeho kinetiku. Patria sem: deliaci faktor (r RT - max. vnútorný polomer rotora), odrážajúci intenzitu odstredivého poľa; odstredivá rýchlosť - produktivita odstredivého stroja z hľadiska počiatočného kvapalného systému alebo jeho komponentov; strhávanie - obsah tuhej fázy v centráte (filtráte); nasýtenie sedimentu kvapalnou fázou (vrátane sedimentu) po C.; jemnosť separácie - min. veľkosť častíc zachytených pri odstredivom usadzovaní.
Kinetika C. závisí od mnohých. faktory sú rozdelené do dvoch skupín. Faktory prvej skupiny sú určené fyzikálnymi. separujete systém (rozdiel fázových hustôt, granulometrického zloženia tuhej fázy, kvapalnej fázy, merného odporu sedimentu pri filtrácii). Na odstredivú sedimentáciu a čiastočne na odstredivú filtráciu majú rozhodujúci vplyv faktory druhej skupiny, určené konštrukciou a rýchlosťou otáčania rotora odstredivého stroja (štruktúra vnútrorotorového prúdenia, jeho hydrodynamika a rýchlostné pole); zasa hydrodynamické. režim závisí od výkonu stroja. Mat. popis prúdenia je daný rovnicami Navier - Stokes a kontinuitou (viď. hydromechanické procesy), do-raže sa vyrábajú s prihliadnutím na geometriu rotora a okrajové podmienky; riešenie sa často nachádza metódami podobnosti teórie.
Odstredivé usadzovanie zahŕňa zahusťovanie, ako aj usadzovanie C. Čírenie - odstránenie tuhej fázy zo suspenzií s obsahom častíc najviac 5 % objemových; používa sa na čistenie napríklad ropných olejov. Zahusťovanie je proces, pri ktorom sú častice dispergovanej fázy zoskupené v relatívne malom objeme disperzného média; umožňuje realizáciu suspenzií (napr. vodná suspenzia kaolínu). Zrážanie C. - oddelenie suspenzií s obsahom pevnej fázy vyšším ako 5-10 % objemových; uplatňovať prevažne. na dehydratáciu pevných zložiek (napr. CaSO 4).
Pri odstredivom usadzovaní dochádza k pohybu pevných častíc pôsobením odstredivej sily ( d- priemer častíc, - rozdiel medzi hustotami tuhej a kvapalnej fázy; r- vzdialenosť od častice k osi rotácie rotora) a odporová sila kvapalného média S. Pomer týchto síl určuje rýchlosť depozície w. V laminárnom režime, charakteristickom pre objasnenie, je sila S vyjadrená Stokesovým zákonom: a kde dynamická. viskozita kvapalnej fázy. Pre turbulentný režim pri ukladaní veľkých častíc, vysoko koncentrovaný. suspenzie, sila S sa zistí z rovnice: (- koeficient odporu; p W - hustota kvapalnej fázy). Hydrodynamika prúdenia určuje čas zotrvania častíc v rotore, aw je čas usadzovania; porovnanie týchto hodnôt vám umožní zistiť jemnosť separácie.
Odstredivá filtrácia prebieha s tvorbou sedimentu na filtračnej prepážke alebo bez nej, ako aj so súčasným prúdením oboch procesov v jej zónach; max. efektívne na získanie zrážok s min. vlhkosť. Proces je zvyčajne rozdelený do troch období: tvorba zrazeniny, odstránenie prebytočnej kvapaliny z nej a odstránenie kvapaliny zadržanej intermolom. sily (kožušina. ťah). Prvá perióda zahŕňa odstredivé usadzovanie a filtráciu cez vrstvu vytvorenej zrazeniny. Na výpočet kinetiky procesu sa používa Darcyho-Weisbachov zákon; hnacia sila (pokles tlaku) je určená odstredivým poľom pôsobiacim na suspenziu: kde je hustota suspenzie; r w - voľný polomer. povrch kvapaliny (obr. 1, b). Je ovplyvnená skĺznutím kvapaliny nad vrstvou sedimentu. Obdobie môže plynúť pri rozdiele. režimy; max. režimy sú charakteristické pri konštantnom a odpruženom výkone. Druhá a tretia perióda závisia od veľkého počtu faktorov spojených so zhutňovaním sedimentu, tvarom jeho pórových kanálikov atď.; budovanie ich mat. modely je veľmi ťažké.
Vzhľadom na zložitosť odstredivých strojov sa výkon odstredivých strojov najčastejšie hodnotí modelovaním podľa tzv. index výkonu, čo znamená F v prvej aproximácii plochu bočného povrchu rotora. Phys. to znamená, že analogicky k sedimentácii v usadzovacích nádržiach je produktivita centrifúg úmerná aj ploche pracovnej plochy, avšak vplyvom odstredivého poľa sa zvyšuje o faktor Fr. V závislosti od konštrukčných vlastností rotora pre stroje každého typu je určený vlastnou rovnicou a používa sa pri prepočítavaní výkonu z jednej veľkosti odstredivky na druhú. Modelovanie sa vykonáva na geom. podobnosti rotorov a identity definujúcich kritérií procesu.

Ryža. 2. Kontinuálna odstredivka: a - usadzovací šnek; b - skrutka filtra; v - od pulzujúce vypúšťanie kalu; g - inerciálna; d - vibrácie; e - precesný; 1 - rotor; 2 - vykladací mechanizmus.

V porovnaní s inými spôsobmi separácie (filtráciou) C. umožňuje získať zrážanie s nižším obsahom vlhkosti. Odstredivou sedimentáciou je na rozdiel od filtrácie možné oddeľovať suspenzie (napr. pri výrobe farieb a lakov) s jemne dispergovanou tuhou fázou, min. veľkosť častíc rezu je 5-10 mikrónov. Dôležitou výhodou C. je možnosť jeho implementácie v zariadeniach relatívne malých objemov; nevýhoda - vysoká spotreba energie.
Stužková. odstredivky sa rozlišujú: podľa princípu separácie - zrážacie, filtračné a kombinované; podľa návrhu - preim. podľa umiestnenia rotora a systému vypúšťania sedimentov (šnek; tlačný alebo piest; pomocou zotrvačných síl); o organizácii procesu - periodické alebo nepretržité pôsobenie.
C. v strojoch periodické. činnosti sa vykonávajú cyklicky v rotoroch s niekedy nastaviteľným nožom alebo ručným vypúšťaním kalu.
Na obr. 2 sú schematické diagramy separácie suspenzií v kontinuálnych strojoch. Usadzovacie závitovkové odstredivky (obr. 2, a) sú určené na separáciu suspenzií s nerozpustnou tuhou fázou (napr. polystyrén, splaškové kaly), dehydratáciu kryštalickej. a granulované produkty, klasifikácia (napr. TiO 2), zahusťovanie (napr. aktivovaný kal). Proces prebieha v pevnom rotore; sediment je nepretržite vypúšťaný skrutkou rotujúcou s frekvenciou Pre túto odstredivku Fr600-3500.
Filtračné závitovkové odstredivky (obr. 2, b) sú bežné pri separácii vysoko koncentrovaných. suspenzie s hrubými pevnými látkami (veľkosť častíc nad 0,2 mm, napr. Glauberova soľ). C. sa vyrába v rámovom rotore s listovým sitom, cez ktoré sa odvádza filtrát. Kal sa odstraňuje z rotora šnekom pod vplyvom rozdielu otáčok Vysoké hodnoty Fr (1200-1800) umožňujú získať produkty s minimálnou vlhkosť.
Hlavne sa používajú filtračné odstredivky s pulzujúcim vypúšťaním sedimentu (obr. 2, c). na rovnaké účely ako skrutka filtra. V dôsledku prítomnosti hrubej vrstvy sedimentu na roštovom site jednostupňového alebo viacstupňového rotora je možné vykonať hlboké premytie produktu (napr. KC1, rafinovaný cukor). Sediment sa vykladá pomocou posúvača, ktorý sa vratne pohybuje. pohyb lineárnou rýchlosťou v; Fr 300-700.
V inerciálnych odstredivkách (obr. 2, d) sa sediment odstraňuje z rotora v dôsledku zložky odstredivého poľa; vo vibračných odstredivkách (obr. 2, e) - v dôsledku vibrácií rotora pozdĺž osi s rýchlosťou v; v precesných odstredivkách (obr. 2, f) - v dôsledku gyroskopu rotorové pohyby s otáčkami a Stroje všetkých typov sa používajú na odstredivú filtráciu vysoko koncentrovanú. suspenzie s hrubými kryštálmi. tuhá fáza (napr. hydrouhlie, kryštálový cukor).
Odroda C. separácia suspenzií a emulzií v odstredivých separátoroch. Ich rotory sú vybavené kužeľovým balíkom. dosky inštalované vo vzťahu k sebe s malou medzerou (0,4-1,5 mm). Vysoký stupeň separácie je dosiahnutý vďaka jeho prúdeniu v tenkej vrstve medzidoskovej medzery v laminárnom režime. Jemne dispergované suspenzie (olejové prísady, hormonálne prípravky atď.) obsahujúce 0,5 – 4,0 % objemu kožušiny. nečistoty sa čistia v separátoroch-čističoch (obr. 3, a). Tuhá fáza, ktorá sa zhromažďuje v kalovom priestore rotora, sa z neho periodicky odstraňuje pri otvorení dna (piestu). Odstredivé zahusťovanie (napr. krmoviny a pekárske droždie) sa vykonáva v separátoroch-zahusťovadlách (obr. 3, b). Kondenzovaná frakcia je kontinuálne vypúšťaná cez dýzy pozdĺž obvodu rotora a vyčistená - cez vrch. zónu. Na separáciu emulzií (napríklad ropných kalov) sa používajú separátory (obr. 4), v rotoroch ktorých je umiestnený balík dosiek s otvormi umiestnenými na rozhraní medzi ťažkými a ľahkými kvapalinami; zložky (fugáty F 1 a F 2) sú zobrazené samostatne. Ak je v emulzii tuhá fáza, používajú sa univerzálne rotory s vyprázdňovaním sedimentu podľa obr. 3, alebo ručne.
Analogicky s centrifúgami sa separačná schopnosť separátorov odhaduje pomocou indexu výkonu

kde z - počet dosiek v balíku, - polovičný uhol kužeľa dosky v hornej časti; R max, R min - vonkajšie a vnútorné. polomery riadu. Simulácia procesov v separátoroch sa vykonáva podobne ako v odstredivkách podľa indexu výkonnosti

Ryža. 3. Separátory na oddeľovanie suspenzií: na obr. separátor-čistička (a) a separátor-zahusťovač ( b); 1 - rotor; 2 - balík tanierov; 3 - pohyblivé dno.

Ryža. štyri. Separátor na oddeľovanie emulzií: 1 - rotor; 2 - balík tanierov; F 1 a F2 - centráty; E - emulzia.

Na štúdium odstredivých procesov v laboratóriu sa používajú modely. odstredivky a separátory s priemerom rotora 150-250 mm, ako aj tzv. pohárové odstredivky (rotor pozostáva z množstva skúmaviek – pohárikov). Tieto malé vzorky umožňujú experimentálne určiť nielen produktivitu plesu. strojov, ale aj možnosť vykladania sedimentu z rotorov, konečná vlhkosť produktu, unášanie. Výskum sa vykonáva s malými objemami produktov na špeciálnych. stojí. Kadičkové odstredivky sa používajú na odhadnutie času usadzovania častíc pri rozklade. fr.
Moderné odstredivá technológia má tendenciu zvyšovať rýchlosť otáčania rotorov, zvyšovať produktivitu, znižovať počet úderov. kovová a energetická náročnosť. Produktivita strojov sa zvyšuje v dôsledku zlepšenia hydrodynamiky rotorov, zväčšenia ich dĺžky (pri usadzovacích odstredivkách) a výšky balíka (v separátoroch). Priemery rotorov vo veľkokapacitných strojoch sa zväčšujú; kombinované sú vytvorené. rotory, v prevedeniach to-rykh sú kombinované dekomp. Metódy C. Zavádzajú sa mikroprocesorové riadiace systémy a nastaviteľné pohony, aby sa C. zabezpečilo optimálne. režimov.
C. je rozšírená v technol. procesy chemicko-lesného komplexu, potravinárske, textilné a iné výroby. C. zohráva významnú úlohu pri riešení ekologických problémov. problémy (čistenie komunálnych a priemyselných odpadových vôd), v technológiách šetriacich zdroje.

Lit.: Sokolov V.I., Centrifugácia, M., 1976; Shkoropad D. E., Novikov O. P., Centrifúgy a separátory pre chemický priemysel, M., 1987.

I. A. Fainerman.

Ultracentrifugácia - metóda separácie a štúdia častíc menších ako 100 nm (makromolekuly živočíšnych a rastlinných organel, vírusy a pod.) v oblasti odstredivých síl. Umožňuje rozdeliť zmesi častíc na frakcie alebo jednotlivé zložky, aby ste našli mólo. hmotnosť a MWD polymérov, hustota ich selvátov. Umožňuje vyhodnotiť tvar a veľkosť makromolekúl v roztoku (viď. disperzná analýza), vplyv statiky tlak na stabilitu častíc, parametre interakcie. asociačný typ - makromolekuly medzi sebou alebo s molekulami s nízkou mol. zložky a ióny, vplyv charakteru rozpúšťadla na konformácie makromolekúl a pod.
Vykonáva sa pomocou ultracentrifúg dodávaných s dutými rotormi, dutiny do-rykh sa uzatvoria a prúdia. Rozlišujte medzi vysokou rýchlosťou a rovnováhou. V prvom prípade sa častice pohybujú po polomere rotora resp. s ich koeficientom sedimentácia, v prvej aproximácii úmerná hmotnosti častice, rozdiel v hustote častice a kvapaliny pri pohybe častíc z osi rotácie rotora na perifériu (sediment), pri - smerom k osi rotácia (plavák). Pri rovnovážnej ultracentrifugácii pokračuje prenos častíc pozdĺž polomeru až do súčtu chemikálií. potenciál a molárna potenciálna energia v každom bode systému sa nestane konštantnou hodnotou, po ktorej sa distribúcia častíc prestane meniť.
T. naz. analyt ultracentrifugácia sa používa pri analýze roztokov, variácií a vykonáva sa pomocou analytu. ultracentrifúgy vybavené rotormi s opticky priehľadnými uzavretými nádržami a optickými. systémy na určenie koncentrácie alebo jej gradientu pozdĺž polomeru rotora v čase; skúmané objemy - od 0,01 do 2 ml s hmotnosťou častíc z niekoľkých. mcg až mg. Preparatívna ultracentrifugácia sa používa na izoláciu zložiek z komplexných zmesí; objem kvapaliny a hmotnosť skúšobnej vzorky b. na viacerých objedná viac ako pri analyte. ultracentrifugácia. Odstredivé zrýchlenia v ultracentrifúgach dosahujú 5 x 10 5 g. Prvý analyt. ultracentrifúgu vytvoril T. Svedberg (1923; 5 x 10 3 g).

Lit.: Bowen T., Úvod do ultracentrifugácie, trans. z angličtiny, M., 1973.

A. D. Morozkin.

Chemická encyklopédia. - M.: Sovietska encyklopédia. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .

Synonymá:

Pozrite sa, čo je „ODSTREDENIE“ v iných slovníkoch:

Separácia nehomogénnych systémov (napr. kvapalných pevných látok) na frakcie podľa hustoty pomocou odstredivých síl. Centrifugácia sa vykonáva v zariadeniach nazývaných centrifúgy. Centrifugácia sa používa na oddelenie sedimentu od ... ... Wikipedia

Separácia nehomogénnych systémov (napríklad kvapalina je pevné teleso) pomocou odstredivých síl; používa sa na separáciu suspenzií, čírenie kontaminovaných kvapalín, triedenie kalu podľa veľkosti pevných častíc a pod.; možnosť rozdelenia ... ... Pojmy jadrová energia

odstreďovanie- Ndp. spojovacia spojka Separácia kvapalných nehomogénnych systémov v rotoroch pôsobením odstredivých síl. [GOST 16887 71] [GOST R 51109 97] Neprípustné, neodporúčané škárovanie Témy priemyselná čistota filtrácia, odstreďovanie, ... ... Technická príručka prekladateľa

odstreďovanie- - spôsob tvarovania výrobkov pomocou odstredivých síl, ktoré vytlačia zo zmesi časť zámesovej vody a unášaného vzduchu. [Terminologický slovník pre betón a železobetón. FSUE "Výskumné centrum" Výstavba "NIIZHB a M. A. A. Gvozdev, ... ... Encyklopédia pojmov, definícií a vysvetlení stavebných materiálov

Separácia nehomogénnych zmesí (suspenzie, emulzie, kaly) na zložky pôsobením odstredivej sily. Vykonáva sa v odstredivkách. Používa sa vo vedeckom výskume, chemickom, potravinárskom, ťažobnom a inom priemysle ... Veľký encyklopedický slovník

Spôsob oddeľovania nehomogénnych, dispergovaných kvapalných systémov v oblasti odstredivých síl (odstredivé pole). Má vyššiu separačnú schopnosť ako lisovanie, usadzovanie a filtrovanie. C. vykonávané v odstredivkách, princíp činnosti do ... ... Mikrobiologický slovník

Exist., počet synoným: 1 ultracentrifugácia (1) ASIS Synonym Dictionary. V.N. Trishin. 2013... Slovník synonym

odstreďovanie- * centrifugácia * centrifugácia využitie síl vytvorených centrifúgou (pozri) na oddelenie molekúl v kvapalnom médiu. Existuje niekoľko typov C.: v hustotnom gradiente, diferenciálnom, v sacharózovom gradiente ... genetika. Encyklopedický slovník - separácia nehomogénnych systémov (napr. kvapalná tuhá látka) pomocou odstredivých síl. Používa sa na separáciu suspenzií, čírenie škodlivín. kvapaliny, hydraulické klasifikácia kalov podľa veľkosti pevných častíc a pod. Vykonáva sa v ... ... Veľký encyklopedický polytechnický slovník

knihy

• Princípy a metódy biochémie a molekulárnej biológie, Derek Gordon, Vzdelávacia publikácia napísaná autormi z Veľkej Británie, predstavuje základy teoretických konceptov biochémie a molekulárnej biológie aplikovaných na moderné výskumné metódy, medzi ... Kategória: Medicína Séria: Metódy v biológii (Laboratórium znalostí) Vydavateľ: Knowledge Lab, elektronická kniha(fb2, fb3, epub, mobi, pdf, html, pdb, lit, doc, rtf, txt)

Práca na kurze

odstreďovanie

1. Princíp metódy

Separácia látok odstreďovaním je založená na rozdielnom správaní častíc v odstredivom poli. Suspenzia častíc umiestnená v skúmavke sa vloží do rotora namontovaného na hnacom hriadeli odstredivky.

V odstredivom poli sa častice s rôznymi hustotami, tvarmi alebo veľkosťami ukladajú rôznymi rýchlosťami. Rýchlosť sedimentácie závisí od odstredivého zrýchlenia, ktoré je priamo úmerné uhlovej rýchlosti rotora a vzdialenosti medzi časticou a osou rotácie:

a odstredivé zrýchlenie potom bude

Keďže jedna otáčka rotora je 2 n radiánov, uhlovú rýchlosť rotora v otáčkach za minútu možno zapísať ako:

Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkách g a nazýva sa relatívne odstredivé zrýchlenie, t.j.

Pri uvádzaní podmienok oddeľovania častíc uveďte rýchlosť otáčania a polomer rotora, ako aj čas odstreďovania. Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkách g, vypočítané z priemerného polomeru otáčania stĺpca kvapaliny v centrifugačnej skúmavke. Dole a Kotzias na základe rovnice zostavili nomogram vyjadrujúci závislosť GCC od rýchlosti rotora a polomeru r.

Rýchlosť sedimentácie guľovitých častíc závisí nielen od odstredivého zrýchlenia, ale aj od hustoty a polomeru samotných častíc a od viskozity suspenzného média. Čas potrebný na sedimentáciu guľovej častice v kvapalnom médiu z tekutého menisku na dno centrifugačnej skúmavky je nepriamo úmerný rýchlosti sedimentácie a je určený nasledujúcou rovnicou:

kde t je čas sedimentácie v sekundách, rj je viskozita média, rh je polomer častice, rf je hustota častice, p je hustota média, hm je vzdialenosť od osi rotácie k menisku kvapaliny, kde je vzdialenosť od osi otáčania k dnu skúmavky.

Ako vyplýva z rovnice, pri danej rýchlosti rotora je čas potrebný na sedimentáciu homogénnych guľových častíc nepriamo úmerný druhej mocnine ich polomerov a rozdielu hustôt častíc a média a je priamo úmerný viskozite média. . Preto je možné oddeliť zmes heterogénnych, približne guľovitých častíc, ktoré sa líšia hustotou a veľkosťou, buď v dôsledku rôznych časov ich usadzovania na dne skúmavky pri danom zrýchlení, alebo v dôsledku distribúcie sedimentujúcich častíc pozdĺž trubice. , ktorý sa zakladá po určitom čase. Pri oddeľovaní látok je potrebné brať do úvahy také dôležité faktory, ako je hustota a viskozita média. Opísané spôsoby môžu oddeliť bunkové organely od tkanivových homogenátov. Hlavné zložky bunky sú uložené v nasledujúcom poradí: najprv celé bunky a ich fragmenty, potom jadrá, chloroplasty, mitochondrie, lyzozómy, mikrozómy a nakoniec ribozómy. Usadzovanie nesférických častíc sa neriadi rovnicou, takže častice rovnakej hmotnosti, ale rôznych tvarov sa ukladajú rôznymi rýchlosťami. Táto vlastnosť sa využíva v štúdii pomocou ultracentrifugácie konformácie makromolekúl.

Preparatívna centrifugácia spočíva v izolácii biologického materiálu pre následné biochemické štúdie. V tomto prípade sa môžu odobrať veľké množstvá počiatočného biologického materiálu, napríklad inokulácie mikrobiálnych buniek zo vsádzkových alebo kontinuálnych kultúr, ako aj inokulácie rastlinných a živočíšnych buniek z kultúr tkanív a krvnej plazmy. Pomocou preparatívnej centrifugácie sa izoluje veľké množstvo bunkových častíc na štúdium ich morfológie, štruktúry a biologickej aktivity. Spôsob sa tiež používa na izoláciu takých biologických makromolekúl, ako je DNA a proteíny, z predtým purifikovaných prípravkov.

Analytická centrifugácia sa používa hlavne na štúdium čistých alebo v podstate čistých prípravkov makromolekúl alebo častíc, ako sú ribozómy. V tomto prípade sa používa malé množstvo materiálu a sedimentácia študovaných častíc sa nepretržite zaznamenáva pomocou špeciálnych optických systémov. Metóda umožňuje získať údaje o čistote, molekulovej hmotnosti a štruktúre materiálu. V pregraduálnych workshopoch sa preparatívna centrifugácia používa oveľa častejšie ako analytická, preto sa jej budeme venovať podrobnejšie, hoci obe metódy sú založené na spoločných princípoch.

2. Preparatívna centrifugácia

2.1 Diferenciálna centrifugácia

Táto metóda je založená na rozdieloch v rýchlostiach sedimentácie častíc, ktoré sa navzájom líšia veľkosťou a hustotou. Materiál, ktorý sa má oddeliť, napríklad tkanivový homogenát, sa odstreďuje s postupným zvyšovaním odstredivého zrýchlenia, ktoré je zvolené tak, aby sa v každom stupni usadila určitá frakcia na dne skúmavky. Na konci každého kroku sa zrazenina oddelí od supernatantu a niekoľkokrát sa premyje, aby sa nakoniec získala čistá vyzrážaná frakcia. Bohužiaľ je prakticky nemožné získať absolútne čistú zrazeninu; Aby sme pochopili, prečo sa to deje, pozrime sa na proces, ktorý sa vyskytuje v centrifugačnej skúmavke na začiatku každého kroku centrifugácie.

Po prvé, všetky častice homogenátu sú rovnomerne rozložené po celom objeme centrifugačnej skúmavky, takže nie je možné získať čisté prípravky precipitátov najťažších častíc v jednom cykle centrifugácie: prvá vytvorená zrazenina obsahuje hlavne najťažšie častice, ale okrem toho aj určité množstvo všetkých počiatočných zložiek. Dostatočne čistý prípravok ťažkých častíc možno získať iba resuspendovaním a odstredením počiatočnej zrazeniny. Ďalšie odstreďovanie supernatantu s následným zvýšením odstredivého zrýchlenia vedie k sedimentácii častíc strednej veľkosti a hustoty a následne k sedimentácii najmenších častíc s najnižšou hustotou. Na obr. 2.3 je diagram frakcionácie homogenátu pečene potkana.

Zdá sa, že diferenciálna centrifugácia je najbežnejšou metódou izolácie bunkových organel z tkanivových homogenátov. Táto metóda sa najúspešnejšie používa na oddelenie takých bunkových organel, ktoré sa navzájom výrazne líšia veľkosťou a hustotou. Ale ani v tomto prípade nie sú získané frakcie nikdy absolútne homogénne a na ich ďalšiu separáciu sa používajú iné metódy, ktoré sú popísané nižšie. Tieto metódy, založené na rozdieloch v hustote organel, poskytujú efektívnejšiu separáciu odstreďovaním v roztokoch s kontinuálnym alebo stupňovitým gradientom hustoty. Nevýhodou týchto metód je, že získanie hustotného gradientu roztoku si vyžaduje čas.

2.2 Rýchlostná zónová centrifugácia

Metóda zonálnej rýchlosti, alebo, ako sa tiež nazýva, s-zonálna centrifugácia, spočíva vo vrstvení testovanej vzorky na povrchu roztoku s kontinuálnym gradientom hustoty. Vzorka sa potom odstreďuje, kým sa častice nerozdelia pozdĺž gradientu v diskrétnych zónach alebo pásoch. Vytvorením gradientu hustoty je možné vyhnúť sa zmiešaniu zón, ktoré sú výsledkom konvekcie. Metóda rýchlostnej zónovej centrifugácie sa používa na oddelenie hybridov RNA-DNA, podjednotiek ribozómov a iných bunkových zložiek.

2.3 Izopyknické odstreďovanie

Izopyknické odstreďovanie sa uskutočňuje v hustotnom gradiente aj obvyklým spôsobom. Ak sa odstreďovanie neuskutočňuje v hustotnom gradiente, prípravok sa najskôr odstredí tak, aby sa usadili častice s molekulovou hmotnosťou vyššou ako majú skúmané častice. Tieto ťažké častice sa odstránia a vzorka sa suspenduje v médiu, ktorého hustota je rovnaká ako hustota frakcie, ktorá sa má izolovať, a potom sa odstreďuje, kým sa skúmané častice neusadia na dne skúmavky a častice s nižšou hustotou plávajú na povrch kvapaliny...

Ďalším spôsobom je vrstvenie vzorky na povrch roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom pokrývajúcim rozsah hustôt všetkých zložiek zmesi. Odstreďovanie sa uskutočňuje dovtedy, kým sa hustota častíc nerovná hustote zodpovedajúcich zón, t.j. kým sa častice nerozdelia do zón. Metóda sa nazýva zonálna izopyknická alebo rezonančná centrifugácia, pretože hlavným bodom je tu vztlaková hustota a nie veľkosť alebo tvar častíc. Množstvo hustoty, pri ktorej častice tvoria izopyknálne pásy, je ovplyvnené povahou suspenzného média; častice môžu byť priepustné pre niektoré zlúčeniny v roztoku a nepriepustné pre iné, alebo môžu pripájať molekuly roztoku. Pri použití zonálneho rotora sa mitochondrie, lyzozómy, peroxizómy a mikrozómy koncentrujú v pásoch so 42 %, 47 %, 47 % a 27 % sacharózy, čo zodpovedá hustote 1,18, 1,21, 1,21 a 1,10 g-cm-3. Hustota subcelulárnych organel závisí aj od ich selektívneho príjmu určitých zlúčenín. Zavedenie detergentu Triton WR-1339 potkanom, ktorý nespôsobuje hemolýzu, vedie k zvýšeniu veľkosti a zníženiu hustoty pečeňových lyzozómov; hustota mitochondrií a peroxizómov zostáva nezmenená. Napriek tomu, že sedimentačné vlastnosti lyzozómov sa spravidla nemenia, ich rovnovážna hustota v gradiente sacharózy klesá z 1,21 na 1,1, čo vedie k zodpovedajúcej separácii lyzozomálno-peroxizomálnej frakcie. Táto vlastnosť sa využíva pri kvantitatívnej separácii lyzozómov, mitochondrií a peroxizómov, založenej na odstránení všetkých častíc s hustotou väčšou ako mikrozómy z homogénneho média a následnej izopyknálnej centrifugácii vyzrážaných ťažkých častíc.

2.4 Odstreďovanie s gradientom rovnovážnej hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa používajú soli ťažkých kovov, ako je rubídium alebo cézium, ako aj roztoky sacharózy. Vzorka, ako je DNA, sa zmieša s koncentrovaným roztokom chloridu cézneho. Rozpustená látka aj rozpúšťadlo sú na začiatku rovnomerne distribuované v celom objeme. Počas odstreďovania sa nastaví rovnovážna distribúcia koncentrácie a následne aj hustota CsCl, pretože cézne ióny majú veľkú hmotnosť. Pôsobením odstredivého zrýchlenia sa molekuly DNA redistribuujú a zhromažďujú sa vo forme oddelenej zóny v časti skúmavky s hustotou zodpovedajúcou im. Metóda sa používa hlavne pri analytickej centrifugácii a použili ju Meselson a Stahl na štúdium mechanizmu replikácie DNA E. coli. Odstreďovanie s rovnovážnym hustotným gradientom je tiež jednou z metód separácie a štúdia lipoproteínov ľudskej plazmy.

2.5 Tvarovanie a extrakcia gradientov

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov roztokov sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dobré oddelenie dosiahne použitím D20 namiesto obyčajnej vody. 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Voľba gradientu je daná špecifickými úlohami frakcionácie. Napríklad fikol vyrábaný spoločnosťou Pharmacia FineChemicals môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou ficol je, že neprechádza cez bunkové membrány. Soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, sa používajú na vytváranie gradientov vyššej hustoty, avšak v dôsledku korozívneho účinku CsCl sa takéto gradienty používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán.

2.5.2 Technika stupňovitého gradientu hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa niekoľko roztokov s postupne klesajúcou hustotou opatrne zavedie do centrifugačnej skúmavky pomocou pipety. Potom sa na najvrchnejšiu vrstvu, ktorá má najnižšiu hustotu, navrství vzorka vo forme úzkej zóny, po ktorej sa skúmavka odstredí. Hladké lineárne gradienty možno získať vyhladzovaním postupných gradientov počas dlhšieho státia roztoku. Proces je možné urýchliť jemným miešaním obsahu skúmavky drôtom alebo jemným potrasením skúmavky.

2.5.3 Technika vytvárania hladkého gradientu hustoty

Vo väčšine prípadov sa na vytvorenie hladkého gradientu hustoty používa špeciálne zariadenie. Skladá sa z dvoch valcových nádob presne definovaného identického priemeru, navzájom komunikujúcich na dne sklenenou trubicou s regulačným ventilom, čo umožňuje nastaviť pomery, v ktorých sa obsah oboch nádob mieša. Jedna z nich je vybavená miešadlom a má výstup, ktorým roztok prúdi do centrifugačných skúmaviek. Hustší roztok sa umiestni do mixéra; druhý valec je naplnený roztokom nižšej hustoty. Výška stĺpca roztokov v oboch valcoch je nastavená tak, aby hydrostatický tlak v nich bol rovnaký. Hustší roztok sa postupne vypúšťa z mixéra do skúmaviek odstredivky a súčasne sa nahrádza rovnakým objemom roztoku s nižšou hustotou vstupujúceho do mixéra z druhého valca cez riadiaci ventil. Homogenita roztoku v miešačke je zabezpečená neustálym miešaním roztoku pomocou miešadla. Keď je roztok odvádzaný do centrifugačných skúmaviek, jeho hustota klesá a v skúmavkách sa vytvára lineárny gradient hustoty. Nelineárne gradienty môžu byť vytvorené pomocou systému pozostávajúceho z dvoch valcov nerovnakého priemeru.

Na vytváranie hustotných gradientov rôznej strmosti sa používa systém dvoch mechanicky ovládaných striekačiek, ktoré sú naplnené roztokmi s nerovnakou hustotou. Zmenou relatívnej rýchlosti piestov možno vytvoriť rôzne gradienty.

2.5.4 Extrakcia gradientov z centrifugačných skúmaviek

Po dokončení odstreďovania a oddelení častíc musia byť vytvorené zóny odstránené. Robí sa to niekoľkými spôsobmi, najčastejšie metódou posunu. Na dne sa prepichne centrifugačná skúmavka a do jej spodnej časti sa pomaly zavedie veľmi husté médium, napríklad 60-70% roztok sacharózy. Horný roztok sa vytlačí a frakcie sa odoberú pomocou injekčnej striekačky, pipety alebo špeciálneho zariadenia pripojeného cez hadičku k zberaču frakcií. Ak sú rúrky vyrobené z celuloidu alebo nitrocelulózy, frakcie sa extrahujú rezaním rúrky špeciálnou čepeľou. Za týmto účelom sa centrifugačná skúmavka upevnená v stojane nareže priamo pod želanou zónou a frakcia sa odsaje injekčnou striekačkou alebo pipetou. Pri vhodnej konštrukcii rezacieho zariadenia bude strata roztoku minimálna. Zber frakcií sa tiež uskutočňuje prepichnutím dna skúmavky tenkou dutou ihlou. Kvapky vytekajúce zo skúmavky cez ihlu sa zachytávajú v zberači frakcií na ďalšiu analýzu.

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich použitie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy. Odstredivky na všeobecné použitie poskytujú maximálnu rýchlosť 6000 otáčok za minútu a RCF až 6000 g. Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranaté a so závesnými okuliarmi. Jednou z vlastností tohto typu centrifúg je ich veľká kapacita - od 4 do 6 dm3, čo umožňuje ich nakladanie nielen centrifugačnými skúmavkami 10,50 a 100 cm3, ale aj nádobami s objemom až 1,25 dm3. Vo všetkých centrifúgach tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a rúrky centrifúgy spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a musia sa líšiť v hmotnosti nie viac ako 0,25 g, mali by byť umiestnené symetricky, jedna proti sebe. iné, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie skúmaviek vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky poskytujú maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min. a RCF až 89 000 g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje zahrievaniu, ku ktorému dochádza v dôsledku trenia počas otáčania rotora. Rýchlobežné odstredivky majú spravidla objem 1,5 dm3 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, ako uhlovými, tak aj závesnými vedrami.

Preparatívne ultracentrifúgy poskytujú maximálnu rýchlosť až 75 000 otáčok za minútu a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000 g. Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby nedochádzalo k prehrievaniu rotora v dôsledku jeho trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory z hliníkovej zliatiny, avšak v prípadoch, kde sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia centrifugačných skúmaviek majú ultracentrifúgy ohybný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g Podobné požiadavky by sa mali dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné účely.

2.6 Konštrukcia rotorov

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so závesnými vedrami

Rotory preparatívnych centrifúg sú zvyčajne dvojakého typu - uhlové a závesné vedrá. Nazývajú sa uhlové, pretože odstredivkové trubice v nich umiestnené sú vždy v určitom uhle k osi otáčania. V rotoroch so závesnými okuliarmi sú skúmavky inštalované vertikálne a pri otáčaní pôsobením výslednej odstredivej sily sa pohybujú do horizontálnej polohy; uhol sklonu k osi otáčania je 90°.

V uhlových rotoroch je vzdialenosť, ktorú prejdú častice k zodpovedajúcej stene skúmavky, veľmi malá, a preto k sedimentácii dochádza pomerne rýchlo. Po zrážke so stenami skúmavky častice skĺznu dolu a na dne vytvoria sediment. Pri odstreďovaní vznikajú konvekčné prúdy, ktoré značne komplikujú separáciu častíc s podobnými sedimentačnými vlastnosťami. Napriek tomu sa rotory podobnej konštrukcie úspešne používajú na separáciu častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie sa značne líši.

V rotoroch s visiacimi pohármi sa tiež pozorujú konvekčné javy, ale nie sú také výrazné. Konvekcia je výsledkom skutočnosti, že pri pôsobení odstredivého zrýchlenia sa častice usadzujú v smere, ktorý nie je striktne kolmý na os rotácie, a preto, ako pri uhlových rotoroch, narážajú na steny skúmavky a skĺznu do dno.

Efektom konvekcie a vírenia je možné do určitej miery zabrániť použitím sektorovo tvarovaných rúrok v rotoroch so závesnými miskami a nastavením rýchlosti rotora; vyššie uvedené, je spôsob odstreďovania v hustotnom gradiente tiež zbavený nevýhod.

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; kapacita rotora závisí od charakteru ukladaného prípravku a pohybuje sa od 100 cm3 do 1 dm3 za minútu. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto nie je znečistený ani postriekaný.

2.6.3 Zonálne alebo Andersonove rotory

Zonálne rotory sú vyrobené z hliníka alebo zliatin titánu, ktoré sú schopné odolávať veľmi výrazným odstredivým zrýchleniam. Zvyčajne majú valcovú dutinu uzavretú odnímateľným krytom. Vo vnútri dutiny je na osi otáčania axiálna rúrka, na ktorú je nasadená tryska s lopatkami, ktorá rozdeľuje dutinu rotora na štyri sektory. Lopatky alebo usmerňovače majú radiálne kanály, cez ktoré je gradient vstrekovaný z axiálnej rúrky k obvodu rotora. Vďaka tomuto dizajnu lopatiek je konvekcia znížená na minimum.

Plnenie rotora sa vykonáva pri jeho otáčaní rýchlosťou asi 3000 ot./min. Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počnúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je držaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily. S následným pridávaním vrstiev s vyšším hustotným gradientom nastáva kontinuálny posun smerom k stredu menej hustých vrstiev. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota je rovnaká alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka, ktorá sa pomocou roztoku s nižšou hustotou vytlačí z trubice do objemu rotora, pričom sa z obvodu odstráni rovnaký objem "vankúšika". Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora prispôsobí prevádzkovej rýchlosti a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknická frakcionácia. Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot/min - min-1. Obsah rotora sa premiestňuje pridaním "vankúše" z periférie, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy. Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestňovaní. Odchádzajúci gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad spektrofotometrickú celu, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorpciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa zbierajú frakcie.

Kapacita zonálnych rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm3, čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zonálne rotory sa používajú na odstránenie proteínových kontaminantov z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Vlastnosti prípravku subcelulárnych častíc získaných frakcionáciou možno pripísať vlastnostiam samotných častíc iba vtedy, ak prípravok neobsahuje nečistoty. Preto je vždy potrebné hodnotiť čistotu získaných prípravkov. Účinnosť homogenizácie a prítomnosť nečistôt v prípravku možno určiť mikroskopickým vyšetrením. Neprítomnosť viditeľných nečistôt však zatiaľ nie je spoľahlivým dôkazom čistoty drogy. Aby sa kvantifikovala čistota získaného prípravku, je podrobený chemickej analýze, ktorá umožňuje určiť obsah proteínov alebo DNA v ňom, určiť jeho enzymatickú aktivitu, ak je to možné, a imunologické vlastnosti.

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na nejakom špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako mitochondriálne markerové enzýmy, kyslé hydrolázy ako lyzozómové markery, kataláza ako peroxizómový marker a glukóza-6- fosfatáza - marker mikrozomálnej membrány. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, napríklad malátdehydrogenáza, P-glukuronidáza, NADP-H-cytochróm-c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii, preto výber enzýmových markerov subcelulárnych frakcií v každej špecifickej k prípadu by sa malo pristupovať veľmi opatrne. Navyše neprítomnosť markerového enzýmu neznamená absenciu zodpovedajúcich organel. Je pravdepodobné, že počas frakcionácie sa enzým organelami stratí alebo je inhibovaný či inaktivovaný, takže aspoň dva markerové enzýmy sa zvyčajne stanovujú pre každú frakciu.

Zlomok	Objem, cm"	Všeobecný chov	Exnulácia, 660 nm	Jednotky aktivity enzýmov	Výťažok aktivity v zlomkoch, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

Výsledky získané z frakcionácie tkaniva sú najvhodnejšie prezentované vo forme grafov. Pri štúdiu distribúcie enzýmov v tkanivách sa teda údaje najlepšie prezentujú vo forme histogramov, ktoré umožňujú vizuálne vyhodnotiť výsledky experimentov.

Enzymatická aktivita obsahu bielkovín vo vzorke sa zisťuje ako v pôvodnom homogenáte, tak aj v každej izolovanej subcelulárnej frakcii samostatne. Celková enzymatická aktivita a obsah bielkovín vo frakciách by sa nemali výrazne líšiť od zodpovedajúcich hodnôt v pôvodnom homogenáte.

Potom sa vypočíta enzymatická aktivita a obsah proteínu v každej frakcii v % z celkového výťažku, na základe čoho sa urobí histogram. Relatívne množstvo proteínu v každej frakcii je postupne vynesené pozdĺž osi x v poradí ich izolácie a relatívna špecifická aktivita každej frakcie je vynesená pozdĺž osi y. Enzymatická aktivita každej frakcie sa teda určuje z plochy tyčí.

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separovať látky a čistiť ich, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickom odstreďovaní používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržite monitorovať sedimentáciu materiálu v odstredivom poli.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosiahnuť rýchlosť až 70 000 otáčok za minútu, pričom generujú odstredivé zrýchlenie až 500 000 g. Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je pomocou struny spojený s motorom, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú inštalované v centrifúge striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, ktorej kapacita je zvyčajne 1 cm3, má sektorový tvar. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že je vzpriamený, funguje na rovnakom princípe ako rotor so zavesenými vedrami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú sledovať sedimentáciu častíc počas celej doby centrifugácie. Vo vopred stanovených časových intervaloch je možné sedimentujúci materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia sleduje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď majú študované roztoky rôzne indexy lomu, pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou sa svetlo láme na hranici zóny. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. V priebehu sedimentácie sa pohybuje hranica a následne vrchol, ktorého rýchlosť môže byť použitá na posúdenie rýchlosti sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako Schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

V biológii sa analytická ultracentrifugácia používa na stanovenie molekulových hmotností makromolekúl, na kontrolu čistoty získaných vzoriek a na štúdium konformačných zmien makromolekúl.

2.8 Aplikácia analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Existujú tri hlavné metódy na stanovenie molekulových hmotností pomocou analytickej ultracentrifugácie: stanovenie rýchlosti sedimentácie, metóda sedimentačnej rovnováhy a metóda aproximácie sedimentačnej rovnováhy.

Najbežnejšou metódou je stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú pohybovať v poradí pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a tou jeho časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pohybuje počas odstreďovania, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou jednej z vyššie uvedených metód, pričom sa tento pohyb zaznamená na fotografickej platni.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

kde x je vzdialenosť od osi rotácie v cm,

t - čas v s,

w je uhlová rýchlosť v rad-s-1,

s je sedimentačný koeficient „molekuly.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia, meria sa v jednotkách Seedberga; 1 Swedbergova jednotka sa rovná 10_13 s. Číselná hodnota s závisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15 S; kataláza má sedimentačný koeficient 11,35S, bakteriálne ribozómové podjednotky od 30 do 50S a eukaryotické ribozómové podjednotky od 40 do 60S.

kde M je molekulová hmotnosť molekuly, R je plynová konštanta, T je absolútna teplota, s je sedimentačný koeficient molekuly, D je difúzny koeficient molekuly, v je čiastočný špecifický objem, ktorý môže byť považovaný za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p je hustota rozpúšťadla.

Metóda sedimentačnej bilancie. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa uskutočňuje pri relatívne nízkych otáčkach rotora, rádovo 7 000 až 8 000 ot./min., aby sa molekuly s veľkou molekulovou hmotnosťou neusadzovali na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa nastaví pôsobením odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, to znamená, kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa podľa výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky „podľa vzorca

kde R je konštanta plynu, T je absolútna teplota, ω je uhlová rýchlosť, p je hustota rozpúšťadla, v je čiastočný špecifický objem, cx a c2 sú koncentrácia rozpustenej látky vo vzdialenostiach r a r2 od os otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho – od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda približovania sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinutá s cieľom zbaviť sa nevýhod predchádzajúcej metódy spojenej s veľkou investíciou času potrebného na "ustanovenie rovnováhy. Pomocou tejto metódy možno určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok v stav priblíženia k rovnováhe. Najprv sa makromolekuly rovnomerne rozložia po celom objeme analytickej kyvety, potom sa pri postupujúcej centrifugácii molekuly usadzujú a hustota roztoku v oblasti menisku sa postupne znižuje. starostlivo zaznamenané a potom zložitými výpočtami zahŕňajúcimi veľký počet premenných sa molekulová hmotnosť danej zlúčeniny určí podľa vzorcov:

kde R je plynová konštanta, T je absolútna teplota, v je čiastočný špecifický objem, p je hustota rozpúšťadla, dcldr je koncentračný gradient makromolekuly, gm a gd sú vzdialenosť k menisku a dnu v skúmavke, cm a sd sú koncentrácie makromolekúl na menisku a y na dne skúmavky, v tomto poradí, Mm a MR sú hodnoty molekulových hmotností, určené z distribúcie koncentrácie látky pri meniskus a dno trubice.

2.8.2 Hodnotenie čistoty prípravkov

Analytická ultracentrifugácia sa široko používa na hodnotenie čistoty DNA, vírusov a proteínových prípravkov. Čistota prípravkov je nepochybne veľmi dôležitá v prípadoch, keď je potrebné presne určiť molekulovú hmotnosť molekuly. Vo väčšine prípadov možno homogenitu prípravku posúdiť podľa povahy sedimentačnej hranice, pričom sa použije metóda rýchlosti sedimentácie: homogénny prípravok zvyčajne poskytuje jednu ostro definovanú hranicu. Nečistoty prítomné v prípravku sa javia ako ďalší vrchol alebo rameno; určujú aj asymetriu hlavného vrcholu.

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách

Ďalšou oblasťou použitia analytickej ultracentrifugácie je štúdium konformačných zmien v makromolekulách. Molekula DNA môže byť napríklad jednovláknová alebo dvojvláknová, lineárna alebo kruhová. Vplyvom rôznych zlúčenín alebo pri zvýšených teplotách dochádza v DNA k množstvu reverzibilných a ireverzibilných konformačných zmien, ktoré možno určiť zmenou rýchlosti sedimentácie vzorky. Čím je molekula kompaktnejšia, tým je jej koeficient trenia v roztoku nižší a naopak: čím je menej kompaktná, tým je koeficient trenia väčší a tým pomalšie sedimentuje. Rozdiely v rýchlosti sedimentácie vzorky pred a po rôznych dopadoch na ňu teda umožňujú odhaliť konformačné zmeny vyskytujúce sa v makromolekulách.

V alosterických proteínoch, ako je napríklad aspartáttranskarbamoyláza, dochádza ku konformačným zmenám v dôsledku ich väzby na substrát a malé ligandy. Disociácia proteínu na podjednotky môže byť vyvolaná pôsobením látok, ako je močovina alebo parachlórortuťibenzoát. Všetky tieto zmeny možno ľahko monitorovať pomocou analytickej ultracentrifugácie.

Filtrácia je proces oddeľovania nerozpustených látok v kvapalinách alebo plynoch. Kvapalina alebo plyn s obsahom pevných častíc prechádza cez porézny materiál (filter), ktorého veľkosť pórov je taká malá, že pevné častice neprechádzajú cez filter. Veľkosti pórov určujú schopnosť filtra zadržiavať pevné častice rôznych veľkostí, ako aj jeho výkon, t.j. množstvo kvapaliny, ktoré je možné oddeliť za jednotku času.

Proces filtrácie je ovplyvnený viskozitou kvapaliny a rozdielom tlaku na oboch stranách filtra. Čím vyššia je viskozita kvapaliny, tým náročnejšia je jej filtrácia. Keďže viskozita kvapaliny so zvyšujúcou sa teplotou klesá, horúce kvapaliny sa filtrujú ľahšie ako studené. Filtráciu viskóznych kvapalín možno často uľahčiť ich zriedením rozpúšťadlom, ktoré sa po dokončení filtrácie dá ľahko oddestilovať. Čím väčší je tlakový rozdiel, tým vyššia je rýchlosť filtrácie. Preto sa filtrácia často vykonáva pri zníženom alebo nadmernom tlaku. Pri filtrácii želatínových zrazenín pod tlakom sú tieto tesne pripojené k filtru, ktorého póry sa ľahko upchajú a filtrovanie sa zastaví.

Ak je veľkosť častíc tuhej fázy menšia ako veľkosť pórov filtra, suspenziu nemožno filtrovať. Bežné papierové filtre teda nezadržiavajú jemné častice mnohých koloidných roztokov. V takýchto prípadoch sa pred filtráciou koloidný roztok zahreje alebo sa doň pridá elektrolyt, čo vedie ku koagulácii (zväčšeniu častíc a tvorbe zrazeniny).

Ak je účelom filtrácie získať skôr číry filtrát ako čistú zrazeninu, na lepšie oddelenie jemných častíc od kvapaliny sa do kvapaliny pridá malé množstvo práškového aktívneho uhlia, pretrepe sa a prefiltruje.

Filtráciu zmesí obsahujúcich látky, ktoré upchávajú póry filtra a vytvárajú na ňom viskózne vrstvy, často uľahčuje pridávanie jemného kremenného piesku, kremeliny, azbestového vlákna, celulózovej (papierovej) buničiny.

Filtrácia sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi v závislosti od povahy kvapalín, ktoré sa majú filtrovať, a vlastností tuhej fázy (precipitátu), ktorá sa má oddeliť od kvapaliny alebo plynu.

Ak sa tuhá fáza zmesi ľahko vyzráža, potom je možné väčšinu z nej odstrániť pred samotnou filtráciou dekantáciou. Dekantácia - najjednoduchší spôsob oddeľovania pevnej a kvapalnej fázy - je založená na skutočnosti, že pri absencii miešania sa pevná látka usadzuje na dne nádoby a číru kvapalinu je možné oddeliť odkvapkaním od usadeného precipitátu. Niekedy sa môže dekantácia použiť aj na oddelenie dvoch pevných látok s rôznymi hustotami. Dekantácia sifónu sa často používa na umývanie ťažko rozpustných pevných látok (obr. 118). Dekantačné premývanie je oveľa efektívnejšie ako premývanie filtračného koláča, kde kvapalina zvyčajne nepreniká rovnomerne medzi pevné častice.

Filtrácia pod vplyvom vlastnej hmotnosti kvapaliny

Tento spôsob filtrácie sa zvyčajne používa v prípadoch, keď nie je potrebná prefiltrovaná tuhá fáza (odstránenie mechanických nečistôt z roztokov), alebo keď je možné kvapalnú fázu úplne odstrániť opakovaným spracovaním zrazeniny s vhodným rozpúšťadlom.

Bežná filtrácia sa používa vtedy, keď je potrebné filtrovať horúce koncentrované roztoky alebo roztoky kryštalických látok v prchavých rozpúšťadlách. Keď sa takéto roztoky prefiltrujú vo vákuu, rozpúšťadlo sa odparí pod filtrom, ktorý sa rýchlo ochladí a upchá vyzrážanými kryštálmi.

Ako filtračný materiál sa používajú najmä filtračné papiere rôznych druhov, hotové papierové beztukové a bezpopolové filtre.

Filtračný papier na priame použitie sa vyrába v dvoch kvalitách: FNB - rýchla filtrácia s veľkosťou pórov 3,5-10 mikrónov a FNS - stredorýchlostná filtrácia s veľkosťou pórov 1-2,5 mikrónov. Obsah popola v papieroch týchto tried je do 0,2 %.

Na výrobu bezpopolových a beztukových papierových filtrov sa vyrába filtračný papier troch akostí: FOB - rýchla filtrácia; FOS - stredná filtrácia; POF - pomalá filtrácia.

Hotové papierové filtre okrúhleho tvaru beztukové (so žltou páskou) a bezpopolové sa vyrábajú v rôznych priemeroch v balení po 100 ks. Výber veľkosti filtra závisí od hmotnosti pevných látok, ktoré sa majú oddeliť, nie od objemu kvapaliny, ktorá sa má filtrovať.

Bezpopolové filtre pre laboratórnu prácu sa líšia svojou separačnou (zádržnou) schopnosťou. Tento rozdiel je určený farbou papierovej pásky, ktorá je prelepená cez obal.

Akceptované sú nasledovné označenia: biela páska - rýchla filtrácia, červená - stredná filtrácia, modrá - pomalá filtrácia, určená na filtráciu jemnozrnných sedimentov (typ BaSO4).

Voľba značky filtra v každom jednotlivom prípade závisí od vlastností separovanej pevnej látky. Veľmi husté filtre by sa mali používať iba v nevyhnutných prípadoch.

Filtračný papier a hotové filtre nemožno použiť na filtráciu koncentrovaných roztokov silných kyselín alebo zásad, pretože to znižuje mechanickú pevnosť filtrov.

Papierové filtre sú jednoduché a skladané (obyčajné). Na vytvorenie jednoduchého hladkého filtra sa okrúhly kus filtračného papiera určitej veľkosti štyrikrát prehne a odstrihne nožnicami, aby sa vytvoril kruh. Závislosť priemeru filtra od priemeru skleneného lievika na filtrovanie je znázornená nižšie:

Hladký filter by mal tesne priliehať k stenám lievika, najmä v hornej časti. Aby ste to dosiahli, pri skladaní filtra sa odporúča ohýbať polkruh nie pozdĺž strednej čiary, ale pozdĺž paralelnej čiary blízko nej.

Zložený filter sa umiestni do lievika (môžete ho naplniť sedimentom nie viac ako 1/3 alebo 1/2), navlhčite ho destilovanou vodou a naplňte hubicu (rúru) lievika vodou. Za týmto účelom sa filter zdvihne a rýchlo spustí. Okraje filtra by mali byť 5-10 mm pod okrajom lievika. Mokrý filter sa jemne pritlačí proti lieviku. Okamžite sa spustí filtrácia, aby sa výlevka lievika udržala naplnená kvapalinou. Lievik nenapĺňajte roztokom na viac ako 3/4 objemu. Špička výlevky by sa mala dotýkať vnútornej steny kadičky s filtrátom, aby sa zabránilo striekaniu.

Jednoduché hladké filtre sa bežne používajú v analytických laboratóriách na filtrovanie zriedených roztokov.

Filtrácia je výrazne zrýchlená pri použití skladaných filtrov. Tieto filtre sa dajú ľahko vyrobiť (obr. 119). Záhyby filtra by sa nemali približovať k jeho stredu, inak by sa papier v strede filtra mohol preraziť. Hotový filter sa vloží do lievika tak, aby priliehal k jeho stenám. Ak má lievik uhol väčší alebo menší ako 60°, filter sa mu prispôsobí zmenou polohy druhého záhybu. Je potrebné, aby mal filter dostatočne ostrý koniec, filtračný papier sa opakovaným ohýbaním nepoškodil.

Pred vložením pripraveného filtra do lievika sa tento rozloží a zloží tak, aby vonkajšia strana filtračného papiera bola na vnútornej strane filtra. Filter správne umiestnený v lieviku sa navlhčí filtrovanou kvapalinou alebo destilovanou vodou.

Pri filtrovaní horúcich roztokov a používaní lievikov s veľkým priemerom môže horná časť filtra preraziť. Aby sa toto nebezpečenstvo eliminovalo, do veľkého lievika sa vkladá malá alebo špeciálna perforovaná porcelánová vložka a najlepšie je filtrovať cez dva skladané filtre zložené dohromady.

Zariadenie na filtráciu pri atmosférickom tlaku a izbovej teplote je jednoduché a pozostáva z lievika, filtra, prijímača a stojana. Na filtráciu horúcich nasýtených roztokov tuhých látok sa používajú široké skrátené lieviky a na rýchlu filtráciu veľkých objemov kvapalín vlnité lieviky, ktorých nerovné steny v kombinácii s hladkými filtrami zväčšujú účinnú filtračnú plochu. Lievik je upevnený v krúžku pripevnenom k ​​laboratórnemu stojanu, alebo je vložený priamo do hrdla banky - recipientu filtrátu. V druhom prípade je potrebné pod lievik umiestniť prúžok filtračného papiera, aby vzduch vytlačený filtrátom mohol uniknúť z banky.

Filtrácia je často náročná, ak sa medzi papierovým filtrom a stenou lievika vytvorí vzduchová medzera (vzduchová kapsa). Aby sa tomu zabránilo, vo vnútri lievika sa vytvorí mierny pretlak: lievik sa prikryje kúskom filtračného papiera navlhčeného pozdĺž okrajov a obráteným lievikom s rovnakým priemerom. Vzduch je hnaný cez rúrku horného lievika s gumenou guľôčkou a tým sa eliminuje vzduchová kapsa.

Na urýchlenie filtrácie je lieviková trubica predĺžená: sklenená trubica s rovnakým (alebo o niečo menším) vnútorným priemerom je spojená s výlevkou gumovou trubicou. Po určitom čase sa celá skúmavka naplní stĺpcom filtrátu, čím sa vytvorí vákuum.

Silne alkalické roztoky a roztoky kyseliny fluorovodíkovej sa odporúča filtrovať cez lievik vyrobený z porézneho polyetylénu. Na výrobu takéhoto lievika (obr. 120) sa používajú dva sklenené lieviky, z ktorých vonkajší je v mieste zúženia uzavretý korkom a vnútorný je na tom istom mieste roztavený. Zmes polyetylénového prášku a jemne mletého chloridu sodného v hmotnostnom pomere 1:4 sa umiestni medzi steny lievikov a udržiava sa v peci pri 130-150 °C. Z času na čas sa vnútorný lievik otočí pod tlakom, aby sa polotekutá hmota rovnomerne naniesla na vnútorný povrch vonkajšieho lievika. Po ochladení sa odstráni vnútorný lievik, zátka sa odstráni z rúrky vonkajšieho lievika a spekaná hmota sa premyje teplou vodou, aby sa odstránil chlorid sodný.

Rýchlosť filtrácie je priamo úmerná hydrostatickému tlaku filtrovanej kvapaliny, preto pri filtrovaní veľkých objemov kvapalín je výhodné udržiavať konštantnú hladinu kvapaliny na filtri. Na obr. 121 ukazuje jednoduché domáce zariadenia na automatické pridávanie kvapaliny do filtra. Nádoba na kvapalinu je uzavretá čistou gumenou zátkou vybavenou hadičkou na prívod kvapaliny a hadičkou na prívod vzduchu. Úroveň dolného konca trubice nasávania vzduchu určuje hladinu kvapaliny na filtri. Ak hladina klesne, vzduch vstúpi do nádoby a vytlačí kvapalinu na filter. Výsledkom je, že hladina kvapaliny na filtri stúpa a prístup vzduchu do nádoby je uzavretý.

Filtrácia pri zahrievaní alebo chladení

Zahrievacia filtrácia sa vykonáva, keď je potrebné vyčistiť horúce koncentrované roztoky od nečistôt, filtrovať viskózne roztoky, ako aj roztoky obsahujúce látky, ktoré pri bežnej teplote ľahko kryštalizujú.

Najprv musíte starostlivo vybrať triedu filtračného papiera, veľkosť filtra a lievika, aby ste proces urýchlili. Pred naliatím horúceho roztoku na filter sa lievik s vloženým filtrom zahreje tak, že cez filter prejde trochu horúceho čistého rozpúšťadla alebo pár rozpúšťadla, ak sa zahrieva v kúpeli do varu. V druhom prípade je lievik pokrytý hodinovým sklíčkom. Pred filtráciou sa rozpúšťadlo zo zbernej nádoby vyleje, aby nezriedilo filtrát. Udržujte na filtri vysokú hladinu kvapaliny, aby ste urýchlili filtráciu.

Lievik s filtrom môže byť vyhrievaný aj kovovým lievikom na horúcu filtráciu (obr. 122, a) alebo lievikom, medzi ktorého dvojitými stenami prechádza horúca voda, para alebo horúci vzduch (obr. 122, b). Ohrev sa môže uskutočniť aj ponorením elektrického ohrievača do filtrovaného roztoku, ak tento neobsahuje látky, ktoré reagujú s kovom.

Pletené kryty (čiapky) s elektrickým ohrevom sa používajú aj na rovnomerný ohrev skleneného laboratórneho skla. Zvyčajne sú vyrobené z tenkého skleneného vlákna a obsahujú flexibilné vykurovacie teleso vo forme tenkého drôtu alebo cievky.

Chladená filtrácia sa môže vykonávať v ľadovo chladenom lieviku alebo v lieviku s chladenou soľankou prúdiacou medzi dvojitými stenami.

Filtrácia za zníženého tlaku

Filtrácia za zníženého tlaku umožňuje dosiahnuť úplnejšie oddelenie pevnej látky od kvapaliny a zvýšiť rýchlosť procesu.

Vákuové filtračné zariadenie sa skladá z filtračného zariadenia, prijímača, vodnej trysky a bezpečnostnej fľaše.

Pri filtrácii veľkého množstva látok sa najčastejšie používajú perforované porcelánové alebo štrbinovité sklenené valcové Buchnerove lieviky, vložené do kužeľových baniek na filtráciu vo vákuu s hadičkou; tieto sú spojené s vodným prúdovým čerpadlom cez bezpečnostnú fľašu. Je potrebné, aby veľkosť lievika zodpovedala množstvu prefiltrovanej pevnej látky, ktorá musí úplne pokryť povrch filtra. Príliš hrubá vrstva sedimentu však sťažuje odsávanie a následné umývanie.

Filter pre Buchnerov lievik je okrúhly list filtračného papiera umiestnený na perforovanej prepážke lievika. Priemer filtra by mal byť o niečo menší ako priemer prepážky. Veľké Buchnerove lieviky majú zvyčajne dva filtre naskladané na sebe. Aby nasadený papierový filter dostatočne tesne priliehal k perforovanej prepážke lievika, navlhčí sa na lieviku rozpúšťadlom a rovnomerne sa naň pritlačí. Potom sa po odstránení rozpúšťadla zmes na filtráciu naleje do lievika a odsaje.

V prípade vodných roztokov nezáleží na malých množstvách vody použitej na zvlhčenie filtra. V tých prípadoch, kde je prítomnosť vody neprijateľná, sa mokrý filter po dosiahnutí tesnenia premyje etylalkoholom alebo acetónom a potom rozpúšťadlom, ktorého prítomnosť vo filtráte je prijateľná. Filtračný papier navlhčený organickým rozpúšťadlom sa nelepí na lievik tak dobre, ako keď je navlhčený vodou.

Buechnerove lieviky sú upevnené v kónických bankách s gumovými zátkami alebo hrubými plochými kusmi gumy, ktoré zakrývajú hrdlo banky zhora; posledné uvedené sú vhodné v tom, že ich nemožno nasávať do banky počas filtrácie.

Na úplné oddelenie matečného lúhu sa zrazenina na filtri vytláča plochým povrchom sklenenej zátky alebo hrubostenným valcom s plochým dnom, kým kvapalina neprestane kvapkať. V tomto prípade je potrebné zabezpečiť, aby na povrchu hrubej vrstvy sedimentu nevznikali trhliny, pretože to vedie k neúplnému nasatiu matečného lúhu a kontaminácii sedimentu. Na odstránenie zvyškového materského lúhu sa zrazenina premyje na filtri malými dávkami rozpúšťadla pri atmosférickom tlaku. Keď sa filtračný koláč nasýti rozpúšťadlom, znovu sa použije podtlak.

Pri filtrácii s odsávaním sa ako filtračný materiál okrem bežných papierových filtrov používajú filtre zo syntetických vlákien. Takže filtre vyrobené z PVC alebo polyesterových vlákien sú odolné voči kyselinám a zásadám, ale sú zničené organickými rozpúšťadlami.

Na oddelenie ťažko filtrovateľných lepkavých sedimentov sa často používa azbestová hmota, ktorú možno zhutniť na sacom lieviku alebo Goochovom tégliku. Azbestová hmota sa pripraví nasledovne: azbest sa rozomelie v porcelánovej mažiari s konc. HCl, hmotu preložte do kadičky a varte 20-30 minút v digestore. Potom sa hmota zriedi 20- až 30-násobným objemom destilovanej vody, prefiltruje sa na Buchnerovom lieviku a premýva sa vodou, kým kyslá reakcia vo filtráte nezmizne. Potom sa hmota suší pri 100-120 °C a kalcinuje sa v mufle. Kalcinovaný azbest sa pretrepáva s vodou, kým sa nezíska homogénna hmota, prenesie sa na filtračnú platňu lievika alebo Goochovho téglika, odsaje a zhutní.

Na filtrovanie sú mimoriadne vhodné lieviky, tégliky a plynové filtre s priletovanou doskou z práškového sintrovaného skla. Sklenené filtre sa používajú na oddeľovanie pevných látok od kvapalín pri filtrácii a extrakcii, na odstraňovanie častíc hmly z plynov, na prebublávanie (distribúciu) plynov v kvapalinách. Sklenené filtre sú však nepohodlné v prípadoch, keď sa vyžaduje kvantitatívne zrážanie, pretože je ťažké úplne odstrániť zrazeninu z filtra. Nie sú vhodné na filtrovanie veľmi koncentrovaných horúcich roztokov alkálií a uhličitanov alkalických kovov.

Pórovitosť sklenených filtračných dosiek a ich označenie sa často menili. Podľa GOST 9775-69 trieda filtra závisí od veľkosti pórov (tabuľka 8).

Typy sklenených lievikov a téglikov s poréznymi filtrami sú znázornené na obr. 123.

Okrem sklenených výrobkov s filtrami na kvapaliny sa vyrábajú aj výrobky s filtrami na filtráciu a premývanie plynov.

Dostupné sú aj filtračné lieviky s teplotne regulovanou rúrkou a teplotne regulovaným plášťom (obr. 124). Lievik s elektrickým ohrevom je určený na filtrovanie zahriateho kryštalizujúcich a viskóznych roztokov a suspenzií pri izbovej teplote. Zahriatie filtračného lievika na 130 °C eliminuje tuhnutie roztoku a filtrácia prebieha rýchlo.

Hlavným prvkom filtračného lievika s elektrickým ohrevom a teplotne riadenou trubicou je sklenený filter s priemerom 40 mm s priletovanou tenkostennou sklenenou trubicou, ktorý obsahuje 30 W elektrický ohrievač. Lieviky sú dostupné s filtrami, ktorých veľkosť je 40, 100, 160 mikrónov.

Vo vyhrievanom filtračnom lieviku reguláciu teploty zabezpečuje prúdiaci nosič tepla. Objem lievika nad filtrom s teplotne regulovanou trubicou je 80 ml, s teplotne regulovaným plášťom - 58 ml.

Na oddelenie kvapaliny od pevnej látky sa používa reverzný ponorný filtračný lievik (obr. 123, d). Filter je ponorený do kvapaliny a filtrát vstupuje do prijímača, ku ktorému je pripojený filter. S týmto zariadením je vhodné uskutočňovať filtráciu pri nižšej teplote, pričom sa udržiava nízka teplota zmesi, ktorá sa má filtrovať, pomocou chladiaceho kúpeľa.

Na oddelenie malých množstiev látok použite lievik so skleneným „čuchom“, ktorý je pokrytý okrúhlym kusom filtračného papiera. Za týmto účelom sa koniec sklenenej tyčinky zmäkčí v plameni horáka a potom sa sploští, pričom sa pritlačí k rovnému vodorovnému povrchu kovovej dosky. Je potrebné, aby filter tesne priliehal k „klinčeku“ a okraje filtra boli ohnuté o 1-2 mm pozdĺž steny lievika. Zberač filtrátu je filtračná trubica (s bočným výstupom).

Na filtrovanie látok s nízkou teplotou topenia alebo vysoko rozpustných pri izbovej teplote sa pri chladení používa vákuum. V prípade malých množstiev sedimentu sa lievik a roztok predchladia v chladničke. V iných prípadoch je Buchnerov lievik zabudovaný do fľaše s odrezaným dnom a naplní sa ľadom alebo chladiacou zmesou.

Pri filtrovaní v atmosfére inertného plynu sú inštalácie znázornené na obr. 125.

Analytické aerosólové filtre AFA

Filtre AFA sa používajú na štúdium a kontrolu aerosólov obsiahnutých vo vzduchu alebo iných plynoch. Filtre AFA pozostávajú z filtračného prvku oddeleného alebo nalepeného na nosnom krúžku a ochranných papierových krúžkov s výstupkami.

Ako filtračný prvok je použitý filtračný materiál FP (Petryanov filter) vyrobený z ultratenkých polymérových vlákien (acetát celulózy, perchlorovinyl, polystyrén). Pracovná plocha kruhovej časti filtra 3, 10, 20 a 160 cm2.

odstreďovanie

Centrifugácia je jednou z metód oddeľovania heterogénnych systémov (kvapalina - kvapalina, kvapalina - tuhé častice); v rotoroch pôsobením odstredivých síl. Centrifugáciu je výhodné použiť vtedy, ak prefiltrované látky upchávajú póry filtra, pri kontakte s filtračným materiálom sa znehodnocujú alebo sú jemne rozptýlené.

Centrifugácia sa vykonáva v špeciálnych zariadeniach nazývaných centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor rotujúci vysokou rýchlosťou.

Typy odstrediviek sú početné; delia sa predovšetkým podľa veľkosti separačného faktora. Rovná sa pomeru zrýchlenia odstredivého poľa vyvinutého v centrifúge k gravitačnému zrýchleniu. Separačný faktor je bezrozmerná veličina. Separačný účinok odstredivky sa zvyšuje úmerne so separačným faktorom.

Separačný faktor pre elektrické odstredivky vyrábané domácim priemyslom sa pohybuje od 1 600 do 300 000 a rýchlosť rotora sa pohybuje od 1 000 do 50 000 ot./min.

Heterogénne systémy v odstredivkách sú oddelené buď sedimentáciou alebo filtráciou. V závislosti od toho sa odstredivky dodávajú s pevným rotorom alebo s perforovaným pokrytým filtračným materiálom.

Usadzovacia centrifugácia sa vykonáva na vyčírenie kvapaliny obsahujúcej suspendované pevné látky alebo na usadzovanie tuhej fázy. Pozostáva z usadzovania tuhej fázy, zhutňovania zrazeniny a uvoľňovania supernatantu.

V laboratórnej praxi sa používajú rôzne typy centrifúg: s ručným alebo elektrickým pohonom, stolné (prenosné), mobilné a stacionárne. Podľa veľkosti separačného faktora sa centrifúgy delia na obyčajné (so separačným faktorom menším ako 3500), supercentrifúgy a ultracentrifúgy (so separačným faktorom najmenej 3500). Bežné odstredivky sa používajú hlavne na separáciu nízkodisperzných (väčších ako 10-50 mikrónov) suspenzií rôznych koncentrácií. Supercentrifúgy sa používajú hlavne na separáciu emulzií a jemných suspenzií (veľkosť menej ako 10 mikrónov). Na separáciu a štúdium vysoko disperzných systémov a makromolekulových zlúčenín sú bežné analytické a preparatívne ultracentrifúgy so separačným faktorom viac ako 100 000. Analytické centrifúgy sa používajú na stanovenie molekulovej hmotnosti a stupňa polymerizácie makromolekulových zlúčenín, preparatívne centrifúgy sa používajú na izolovať látky z roztokov, ktoré sú bežne v koloidnom stave alebo vo forme neoddeliteľných suspenzií (proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy).

Rotor ultracentrifúgy sa pri chladení otáča spravidla vo vákuovej komore (chladiace odstredivky).Rýchlosť a čas otáčania rotora, ako aj teplotný režim odstreďovania sú riadené elektronickými zariadeniami.

Spracovaný roztok sa umiestni do špeciálnej nádoby, ktorá sa potom otáča vysokou rýchlosťou na rotore odstredivky. V tomto prípade sú zložky zmesi pôsobením odstredivej sily rozdelené vo vrstvách do rôznych hĺbok (v súlade s hmotnosťami častíc); najťažšie častice sú stlačené na dno nádoby.

Pri použití malých prenosných centrifúg so skúmavkami s ručným alebo elektrickým pohonom sa suspenzia umiestni do sklenených alebo plastových skúmaviek, ktoré sa otáčajú okolo hlavnej osi a sú zavesené na čapoch. Rúrkové odstredivky na periodickú separáciu malých množstiev látky môžu byť dvoch typov. V niektorých sú rúrky držané čapmi na rotore a počas otáčania zaujímajú vodorovnú polohu, v iných sú pevne pripevnené v určitom uhle k osi otáčania (uhlové rotory).

Na obr. 126 je znázornená poloha rúr počas odstreďovania v uhlovom rotore a v rotore s oscilačnými sklami.

Po zastavení centrifúgy sa číra kvapalná fáza (centrifúga) vypustí alebo sa odoberie pipetou. Zrazenina sa premyje a znovu odstredí. Ak je potrebné extrahovať maximálne množstvo sedimentu zo skúmavky, odstredivka sa vyhodí a zrazenina sa vysuší vo vákuovom exsikátore bez toho, aby sa odstránila zo sklenenej skúmavky odstredivky.

Pri použití centrifúg so skúmavkami sa skúmavky z hrubostenného skla alebo syntetického materiálu vkladajú do ochranných kovových pohárikov. Spodná časť sklenených skúmaviek je chránená gumovými tesneniami. Sklenené skúmavky je možné naplniť do polovice objemu a skúmavky zo syntetických materiálov pri vysokých otáčkach rotora (5000 ot./min.) by sa mali plniť takmer po vrch, aby sa pôsobením odstredivej sily nedeformovali. Na zaistenie bezpečnosti práce je potrebné skúmavky s odstredenou suspenziou veľmi presne vyvážiť. Nevyváženosť pri vysokých rýchlostiach môže poškodiť rotor. Vzhľadom na to, že prchavé rozpúšťadlá sa môžu počas odstreďovania odparovať, je lepšie skúmavky uzavrieť zátkami.

Rotory laboratórnych skúmaviek, s výnimkou ručných odstrediviek, sú umiestnené v ochranných kovových krytoch (viečkach), aby pracovníkom nehrozilo nebezpečenstvo, ak by z vešiakov spadla skúmavka s pohárom.

Je potrebné dôsledne dodržiavať pokyny uvedené v návode výrobcu pre túto odstredivku, nesmú byť prekročené otáčky rotora uvedené v návode. Odstredivku je možné uviesť do pohybu len so zatvoreným bezpečnostným krytom; Veko možno otvoriť až po úplnom zastavení odstredivky.

Manuálna odstredivka RTs-4. Táto odstredivka je určená na separáciu kvapalín rôznych hustôt alebo na separáciu suspendovaných alebo premiešaných častíc od kvapalín. Hlavné časti odstredivky: liatinové telo, vo vnútri ktorého sú namontované ozubené kolesá (šnekové koleso), držiak skúmavky, rukoväť a svorka. Na sklopných závesoch držiaka skúmavky sú štyri objímky vyrobené z karbolitu. Kvapaliny a pevné častice s rôznou hustotou sú pri otáčaní rozmiestnené na rôznych miestach skúmavky. Separáciu je možné vykonať súčasne v štyroch skúmavkách. Na jedno otočenie rukoväte urobí držiak trubice osem otočení. Pre prevádzku je odstredivka upevnená svorkou na kryte laboratórneho stola alebo na špeciálnom stojane.

Laboratórna stolová centrifúga TsLN-2. Centrifúga TsLN-2 pracuje s rotorom uhlového typu RU 6x10. Maximálny objem materiálu na odstreďovanie je 60 cm3. Otáčky rotora 3000-8000 ot./min; interval frekvencie otáčania regulovaný spínačom sa rovná 1000 otáčkam. Separačný faktor dosahuje 5 500. Čas zrýchlenia rotora na maximálnu rýchlosť je 10 minút; čas brzdenia nie viac ako 8 min. Čas nepretržitej práce 60 min; minimálna povinná prestávka je 15 minút. Pracovná komora odstredivky je uzavretá vekom so samozatváračom. Hmotnosť odstredivky 8 kg.

Pri práci s odstredivkou TsLN-2 je zakázané: pracovať bez uzemnenia; zvýšiť rýchlosť otáčania nad 8000 ot / min; práca s otvorenými krytmi rotora a odstredivky; pracovať so sklenenými skúmavkami pri rýchlosti rotora nad 4000 ot./min.; umiestnenie skúmaviek naplnených odstredeným materiálom nie je diametrálne odlišné.

Rozdiel v hmotnosti diametrálne umiestnených skúmaviek naplnených odstredeným materiálom by nemal presiahnuť 0,5 g Hustota kvapaliny oddelenej v skúmavkách vyrobených z polymérnych materiálov by nemala presiahnuť 2 g / cm3, v sklenených skúmavkách - nie viac ako 1,5 g/cm3.

Rohová malá odstredivka TsUM-1. Centrifúga má krížový rotor na súčasné odstreďovanie kvapalín v štyroch 25 ml skúmavkách, štyroch 10 ml skúmavkách a ôsmich 5 ml skúmavkách. Otáčky rotora sú nastaviteľné od 2000 do 8000 ot./min. Separačný faktor dosahuje 6000. Čas zrýchlenia rotora je 8-10 minút. Odstredivka je vybavená elektrickými hodinami, ktoré umožňujú nastaviť dobu odstreďovania od 0 do 60 minút s následným automatickým brzdením. Hmotnosť odstredivky 16 kg.

Metóda odstreďovania je založená na rozdielnom správaní častíc v odstredivom poli vytvorenom odstredivkou. Vzorka v nádobe odstredivky je umiestnená v rotore poháňanom pohonom odstredivky. Na oddelenie zmesi častíc je potrebné zvoliť súbor podmienok, ako je rýchlosť otáčania, čas odstreďovania a polomer rotora. U guľovitých častíc rýchlosť usadzovania (sedimentácie) závisí nielen od zrýchlenia, ale aj od polomeru a hustoty častíc, ako aj od viskozity média, v ktorom je vzorka uložená.

Centrifugáciu možno rozdeliť na dva typy: preparatívnu a analytickú. Preparatívna centrifugácia sa používa vtedy, keď je potrebné izolovať časť vzorky na ďalšiu analýzu. Táto metóda sa používa na izoláciu buniek zo suspenzie, biologických makromolekúl atď.

Analytická centrifugácia sa používa na štúdium správania sa biologických makromolekúl v odstredivom poli. Táto metóda umožňuje získať údaje o hmotnosti, tvare a veľkosti molekúl prítomných v relatívne malých objemoch vzoriek. Preparatívna centrifugácia je najčastejšie používanou technikou v každodennej laboratórnej praxi.

Preparatívne laboratórne centrifúgy sa zase delia do skupín podľa účelu: preparatívne ultracentrifúgy, centrifúgy na všeobecné použitie a vysokorýchlostné centrifúgy. Univerzálne centrifúgy majú najväčšie praktické uplatnenie v lekárskych laboratóriách, majú maximálnu rýchlosť až 6 tisíc otáčok za minútu. Hlavnou črtou tohto typu prístrojov je ich pomerne veľká kapacita - až 6 litrov, čo umožňuje použiť na odstreďovanie nielen centrifugačné skúmavky do 100 ml, ale aj nádoby do 1,25 l. Vo všetkých odstredivkách na všeobecné použitie sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli, takže odstredené nádoby musia byť pomerne presne vyvážené. Aby sa predišlo rozbitiu, do rotora by sa nemal vkladať nepárny počet skúmaviek, v prípade neúplného naplnenia by mala byť nádoba umiestnená oproti sebe.

Vysokorýchlostné odstredivky majú maximálnu rýchlosť 25 tisíc otáčok za minútu a zrýchlenie až 89 tisíc g. Komora obsahujúca rotor a odstredené vzorky je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje teplu generovanému trením, keď sa rotor otáča vysokou rýchlosťou. Typicky tieto odstredivky zvládajú objemy do 1,5 litra a sú vybavené šikmými alebo vymeniteľnými rotormi misy.

Preparatívne ultracentrifúgy zrýchľujú na 75 000 ot./min a majú maximálne odstredivé zrýchlenie 510 tisíc g. Sú vybavené chladiacimi a vákuovými jednotkami, aby sa zabránilo prehriatiu rotora trením vzduchu. Rotory pre tieto odstredivky sú vyrobené z vysokopevnostného titánu alebo zliatin hliníka. Hriadeľ ultracentrifúg je na rozdiel od vysokorýchlostných a preparatívnych vyrobených flexibilne, aby sa znížili vibrácie, keď je rotor nevyvážený. Kapacity v rotore musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na desatinu gramu.

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov roztokov sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dobrá separácia dosiahne použitím D20 namiesto obyčajnej vody. 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Voľba gradientu je daná špecifickými úlohami frakcionácie. Napríklad fikol vyrábaný spoločnosťou Pharmacia Fine Chemicals môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou ficol je, že neprechádza cez bunkové membrány. Soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, sa používajú na vytváranie gradientov vyššej hustoty, avšak v dôsledku korozívneho účinku CsCl sa takéto gradienty používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán.

2.5.2 Technika stupňovitého gradientu hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa niekoľko roztokov s postupne klesajúcou hustotou opatrne zavedie do centrifugačnej skúmavky pomocou pipety. Potom sa na najvrchnejšiu vrstvu, ktorá má najnižšiu hustotu, navrství vzorka vo forme úzkej zóny, po ktorej sa skúmavka odstredí. Hladké lineárne gradienty možno získať vyhladzovaním postupných gradientov počas dlhšieho státia roztoku. Proces je možné urýchliť jemným miešaním obsahu skúmavky drôtom alebo jemným potrasením skúmavky.

2.5.3 Technika vytvárania hladkého gradientu hustoty

Vo väčšine prípadov sa na vytvorenie hladkého gradientu hustoty používa špeciálne zariadenie. Skladá sa z dvoch valcových nádob presne definovaného identického priemeru, navzájom komunikujúcich na dne sklenenou trubicou s regulačným ventilom, čo umožňuje nastaviť pomery, v ktorých sa obsah oboch nádob mieša. Jedna z nich je vybavená miešadlom a má výstup, ktorým roztok prúdi do centrifugačných skúmaviek. Hustší roztok sa umiestni do mixéra; druhý valec je naplnený roztokom nižšej hustoty. Výška stĺpca roztokov v oboch valcoch je nastavená tak, aby hydrostatický tlak v nich bol rovnaký. Hustší roztok sa postupne vypúšťa z mixéra do skúmaviek odstredivky a súčasne sa nahrádza rovnakým objemom roztoku s nižšou hustotou vstupujúceho do mixéra z druhého valca cez riadiaci ventil. Homogenita roztoku v miešačke je zabezpečená neustálym miešaním roztoku pomocou miešadla. Keď je roztok odvádzaný do centrifugačných skúmaviek, jeho hustota klesá a v skúmavkách sa vytvára lineárny gradient hustoty. Nelineárne gradienty môžu byť vytvorené pomocou systému pozostávajúceho z dvoch valcov nerovnakého priemeru.

Na vytváranie hustotných gradientov rôznej strmosti sa používa systém dvoch mechanicky ovládaných striekačiek, ktoré sú naplnené roztokmi s nerovnakou hustotou. Zmenou relatívnej rýchlosti piestov možno vytvoriť rôzne gradienty.

2.5.4 Extrakcia gradientov z centrifugačných skúmaviek

Po dokončení odstreďovania a oddelení častíc musia byť vytvorené zóny odstránené. Robí sa to niekoľkými spôsobmi, najčastejšie metódou posunu. Na dne sa prepichne centrifugačná skúmavka a do jej spodnej časti sa pomaly zavedie veľmi husté médium, napríklad 60-70% roztok sacharózy. Horný roztok sa vytlačí a frakcie sa odoberú pomocou injekčnej striekačky, pipety alebo špeciálneho zariadenia pripojeného cez hadičku k zberaču frakcií. Ak sú rúrky vyrobené z celuloidu alebo nitrocelulózy, frakcie sa extrahujú rezaním rúrky špeciálnou čepeľou. Za týmto účelom sa centrifugačná skúmavka upevnená v stojane nareže priamo pod želanou zónou a frakcia sa odsaje injekčnou striekačkou alebo pipetou. Pri vhodnej konštrukcii rezacieho zariadenia bude strata roztoku minimálna. Zber frakcií sa tiež uskutočňuje prepichnutím dna skúmavky tenkou dutou ihlou. Kvapky vytekajúce zo skúmavky cez ihlu sa zachytávajú v zberači frakcií na ďalšiu analýzu.

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich aplikácie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy. Odstredivky na všeobecné použitie daj maximálne otáčky 6000 ot/min -1 a OCU až 6000 g . Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranaté a so závesnými okuliarmi. Jednou z vlastností tohto typu centrifúg je ich veľká kapacita - od 4 do 6 dm 3 , čo umožňuje ich nakladanie nielen centrifúgami s objemom 10,50 a 100 cm 3 , ale aj nádobami s objemom až 1,25 dm3. Vo všetkých centrifúgach tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a rúrky centrifúgy spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a musia sa líšiť v hmotnosti nie viac ako 0,25 g, mali by byť umiestnené symetricky, jedna proti sebe. iné, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie skúmaviek vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky poskytujú maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min -1 a OCU až 89 000 g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje zahrievaniu, ku ktorému dochádza v dôsledku trenia počas otáčania rotora. Rýchlobežné odstredivky majú spravidla objem 1,5 dm 3 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, ako uhlovými, tak aj so závesnými sklami.

Preparatívne ultracentrifúgy poskytujú maximálnu rýchlosť až 75 000 ot./min -1 a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000 g . Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby nedochádzalo k prehrievaniu rotora v dôsledku jeho trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory z hliníkovej zliatiny, avšak v prípadoch, kde sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia centrifugačných skúmaviek majú ultracentrifúgy ohybný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g Podobné požiadavky by sa mali dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné účely.

2.6 Konštrukcia rotorov

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so závesnými vedrami

Rotory preparatívnych centrifúg sú zvyčajne dvojakého typu - uhlové a závesné vedrá. Nazývajú sa uhlové, pretože odstredivkové trubice v nich umiestnené sú vždy v určitom uhle k osi otáčania. V rotoroch so závesnými okuliarmi sú skúmavky inštalované vertikálne a pri otáčaní pôsobením výslednej odstredivej sily sa pohybujú do horizontálnej polohy; uhol sklonu k osi otáčania je 90°.

V uhlových rotoroch je vzdialenosť, ktorú prejdú častice k zodpovedajúcej stene skúmavky, veľmi malá, a preto k sedimentácii dochádza pomerne rýchlo. Po zrážke so stenami skúmavky častice skĺznu dolu a na dne vytvoria sediment. Pri odstreďovaní vznikajú konvekčné prúdy, ktoré značne komplikujú separáciu častíc s podobnými sedimentačnými vlastnosťami. Napriek tomu sa rotory podobnej konštrukcie úspešne používajú na separáciu častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie sa značne líši.

V rotoroch s visiacimi pohármi sa tiež pozorujú konvekčné javy, ale nie sú také výrazné. Konvekcia je výsledkom skutočnosti, že pri pôsobení odstredivého zrýchlenia sa častice usadzujú v smere, ktorý nie je striktne kolmý na os rotácie, a preto, ako pri uhlových rotoroch, narážajú na steny skúmavky a skĺznu do dno.

Efektom konvekcie a vírenia je možné do určitej miery zabrániť použitím sektorovo tvarovaných rúrok v rotoroch so závesnými miskami a nastavením rýchlosti rotora; vyššie uvedené, je spôsob odstreďovania v hustotnom gradiente tiež zbavený nevýhod.

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; priepustnosť rotora závisí od charakteru ukladaného prípravku a pohybuje sa od 100 cm 3 do 1 dm 3 za 1 min. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto nie je znečistený ani postriekaný.

2.6.3 Zonálne alebo Andersonove rotory

Zonálne rotory sú vyrobené z hliníka alebo zliatin titánu, ktoré sú schopné odolávať veľmi výrazným odstredivým zrýchleniam. Zvyčajne majú valcovú dutinu uzavretú odnímateľným krytom. Vo vnútri dutiny je na osi otáčania axiálna rúrka, na ktorú je nasadená tryska s lopatkami, ktorá rozdeľuje dutinu rotora na štyri sektory. Lopatky alebo usmerňovače majú radiálne kanály, cez ktoré je gradient vstrekovaný z axiálnej rúrky k obvodu rotora. Vďaka tomuto dizajnu lopatiek je konvekcia znížená na minimum.

Plnenie rotora prebieha počas jeho otáčania rýchlosťou cca 3000 ot/min -1. Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počnúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je udržiavaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily. . S následným pridávaním vrstiev s vyšším hustotným gradientom nastáva kontinuálny posun smerom k stredu menej hustých vrstiev. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota je rovnaká alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka , ktorý je vytlačený z rúrky do objemu rotora pomocou roztoku s nižšou hustotou, pričom rovnaký objem "vankúše" je odstránený z obvodu. Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora uvedie na pracovnú rýchlosť a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknická frakcionácia. . Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot./min. Obsah rotora sa premiestňuje pridaním „vankúše“ z periférie, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy . Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestňovaní. Odchádzajúci gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad spektrofotometrickú celu, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorpciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa zbierajú frakcie.

Kapacita zonálnych rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm3, čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zonálne rotory sa používajú na odstránenie proteínových kontaminantov z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Vlastnosti prípravku subcelulárnych častíc získaných frakcionáciou možno pripísať vlastnostiam samotných častíc iba vtedy, ak prípravok neobsahuje nečistoty. Preto je vždy potrebné hodnotiť čistotu získaných prípravkov. Účinnosť homogenizácie a prítomnosť nečistôt v prípravku možno určiť mikroskopickým vyšetrením. Neprítomnosť viditeľných nečistôt však zatiaľ nie je spoľahlivým dôkazom čistoty drogy. Aby sa kvantifikovala čistota získaného prípravku, je podrobený chemickej analýze, ktorá umožňuje určiť obsah proteínov alebo DNA v ňom, určiť jeho enzymatickú aktivitu, ak je to možné, a imunologické vlastnosti.

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na nejakom špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako mitochondriálne markerové enzýmy, kyslé hydrolázy ako lyzozómové markery, kataláza ako peroxizómový marker a glukóza-6- fosfatáza - marker mikrozomálnej membrány. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, ako je malátdehydrogenáza, R-glukuronidáza, NADP "H-cytochróm-c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii. Preto by sa k výberu enzýmových markerov subcelulárnych frakcií v každom konkrétnom prípade malo pristupovať veľmi opatrne. Navyše absencia markerového enzýmu neznamená absenciu vhodných organel Je pravdepodobné, že enzým sa organelami počas frakcionácie stratí, alebo je inhibovaný či inaktivovaný, preto sa pre každú frakciu zvyčajne stanovujú aspoň dva markerové enzýmy.

Zlomok	Objem, cm"	Všeobecný chov	Exnulácia, 660 nm	Jednotky aktivity enzýmov	Výťažok aktivity vo frakciách,%

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

Výsledky získané z frakcionácie tkaniva sú najvhodnejšie prezentované vo forme grafov. Pri štúdiu distribúcie enzýmov v tkanivách sa teda údaje najlepšie prezentujú vo forme histogramov, ktoré umožňujú vizuálne vyhodnotiť výsledky experimentov.

Enzymatická aktivita obsahu bielkovín vo vzorke sa zisťuje ako v pôvodnom homogenáte, tak aj v každej izolovanej subcelulárnej frakcii samostatne. Celková enzymatická aktivita a obsah bielkovín vo frakciách by sa nemali výrazne líšiť od zodpovedajúcich hodnôt v pôvodnom homogenáte.

Potom sa vypočíta enzymatická aktivita a obsah proteínu v každej frakcii v % z celkového výťažku, na základe čoho sa urobí histogram. Relatívne množstvo proteínu v každej frakcii je postupne vynesené pozdĺž osi x v poradí ich izolácie a relatívna špecifická aktivita každej frakcie je vynesená pozdĺž osi y. Enzymatická aktivita každej frakcie sa teda určuje z plochy tyčí.

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separovať látky a čistiť ich, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickej centrifugácii používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržite monitorovať sedimentáciu materiálu. v odstredivé pole.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosiahnuť rýchlosť až 70 000 ot./min., pričom generujú odstredivé zrýchlenie až 500 000 ot./min. g . Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je pomocou struny spojený s motorom, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú inštalované v centrifúge striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, ktorej kapacita je zvyčajne 1 cm3, má sektorový tvar. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že je vzpriamený, funguje na rovnakom princípe ako rotor so zavesenými vedrami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú sledovať sedimentáciu častíc počas celej doby centrifugácie. Vo vopred stanovených časových intervaloch je možné sedimentujúci materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia sleduje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď majú študované roztoky rôzne indexy lomu, pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou sa svetlo láme na hranici zóny. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. V priebehu sedimentácie sa pohybuje hranica a následne vrchol, ktorého rýchlosť môže byť použitá na posúdenie rýchlosti sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako Schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

V biológii sa analytická ultracentrifugácia používa na stanovenie molekulových hmotností makromolekúl, na kontrolu čistoty získaných vzoriek a na štúdium konformačných zmien makromolekúl.

2.8 Aplikácia analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Existujú tri hlavné metódy na stanovenie molekulových hmotností pomocou analytickej ultracentrifugácie: stanovenie rýchlosti sedimentácie, metóda sedimentačnej rovnováhy a metóda aproximácie sedimentačnej rovnováhy.

Stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou - toto je najbežnejšia metóda. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú pohybovať v poradí pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a tou jeho časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pohybuje počas odstreďovania, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou jednej z vyššie uvedených metód, pričom sa tento pohyb zaznamená na fotografickej platni.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

kde X - vzdialenosť od osi otáčania v cm,

t - čas v s,

w je uhlová rýchlosť v rad-s-1,

s - sedimentačný koeficient „molekul.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia, meria sa v Seedbergove jednotky ; 1 Swedbergova jednotka sa rovná 10 _13 s. Číselná hodnota s závisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15 S; kataláza má sedimentačný koeficient 11,35S, bakteriálne ribozómové podjednotky od 30 do 50S a eukaryotické ribozómové podjednotky od 40 do 60S.

kde M je molekulová hmotnosť molekuly, R je plyn konštantný, T - absolútna teplota, s - sedimentačný koeficient molekuly, D je difúzny koeficient molekuly, v - čiastočný špecifický objem, ktorý možno považovať za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p - hustota rozpúšťadla.

Metóda sedimentačnej bilancie. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa uskutočňuje pri relatívne nízkych otáčkach rotora, rádovo 7 000-8 000 ot./min.-1, takže molekuly s veľkou molekulovou hmotnosťou sa neusadzujú na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa nastaví pôsobením odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, to znamená, kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa podľa výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky „podľa vzorca

kde R je plyn konštantný, T - absolútna teplota, o - uhlová rýchlosť, p - hustota rozpúšťadla, v - čiastočný špecifický objem, s X a s 2 je koncentrácia rozpustenej látky na vzdialenosť G G a r2 od osi otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho – od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda približovania sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinutá s cieľom zbaviť sa nevýhod predchádzajúcej metódy spojenej s veľkou investíciou času potrebného na "ustanovenie rovnováhy. Pomocou tejto metódy možno určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok v stav priblíženia k rovnováhe. Najprv sa makromolekuly rovnomerne rozložia po celom objeme analytickej kyvety, potom sa pri postupujúcej centrifugácii molekuly usadzujú a hustota roztoku v oblasti menisku sa postupne znižuje. starostlivo zaznamenané a potom zložitými výpočtami zahŕňajúcimi veľký počet premenných sa molekulová hmotnosť danej zlúčeniny určí podľa vzorcov:

kde R je plyn konštantný, T je absolútna teplota, v - čiastočný špecifický objem, p - hustota rozpúšťadla, dcldr - koncentračný gradient makromolekuly g m a g d - vzdialenosť k menisku a dnu skúmavky, c m a s d - koncentrácia makromolekúl v menisku a na dne skúmavky, v tomto poradí, M m a M R - hodnoty molekulových hmotností, určené distribúciou koncentrácie látky v menisku a na dne skúmavky.

2.8.2 Hodnotenie čistoty prípravkov

Analytická ultracentrifugácia sa široko používa na hodnotenie čistoty DNA, vírusov a proteínových prípravkov. Čistota prípravkov je nepochybne veľmi dôležitá v prípadoch, keď je potrebné presne určiť molekulovú hmotnosť molekuly. Vo väčšine prípadov možno homogenitu prípravku posúdiť podľa povahy sedimentačnej hranice, pričom sa použije metóda rýchlosti sedimentácie: homogénny prípravok zvyčajne poskytuje jednu ostro definovanú hranicu. Nečistoty prítomné v prípravku sa javia ako ďalší vrchol alebo rameno; určujú aj asymetriu hlavného vrcholu.

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách

Ďalšou oblasťou použitia analytickej ultracentrifugácie je štúdium konformačných zmien v makromolekulách. Molekula DNA môže byť napríklad jednovláknová alebo dvojvláknová, lineárna alebo kruhová. Vplyvom rôznych zlúčenín alebo pri zvýšených teplotách dochádza v DNA k množstvu reverzibilných a ireverzibilných konformačných zmien, ktoré možno určiť zmenou rýchlosti sedimentácie vzorky. Čím je molekula kompaktnejšia, tým je jej koeficient trenia v roztoku nižší a naopak: čím je menej kompaktná, tým je koeficient trenia väčší a tým pomalšie sedimentuje. Rozdiely v rýchlosti sedimentácie vzorky pred a po rôznych dopadoch na ňu teda umožňujú odhaliť konformačné zmeny vyskytujúce sa v makromolekulách.

V alosterických proteínoch, ako je napríklad aspartáttranskarbamoyláza, dochádza ku konformačným zmenám v dôsledku ich väzby na substrát a malé ligandy. Disociácia proteínu na podjednotky môže byť vyvolaná pôsobením látok, ako je močovina alebo parachlórortuťibenzoát. Všetky tieto zmeny možno ľahko monitorovať pomocou analytickej ultracentrifugácie.

Lisovanie rúrových výrobkov metódou odstreďovanie. Pod odstreďovanie v priemysle stavebných hmôt ... ktoré sa takýto dopad vykonáva sa nazývajú odstreďovanie. V priemysle Bieloruskej republiky sa používajú horizontálne odstredivky ...

Ukladanie častíc

Laboratórne práce >> Chémia

Bunky sú už uvoľnené nízkou rýchlosťou odstreďovanie z jadra, mitochondrií a... ultracentrifugácia Vlastnosti tohto typu odstreďovanie odráža v jeho veľmi... pre nás prípadov použitia odstreďovanie v hustotnom gradiente sacharózy, ...

Pomocou centrifúgy

Kurz >> Priemysel, výroba

V dávkových odstredivkách rôzne operácie odstreďovanie- nakladanie, separácia, vykladanie - vyskytujú sa ... rozlišovať medzi prípravnými a analytickými odstreďovanie. S prípravným odstreďovanie odoberá sa zdrojový biologický materiál...