La genotossicità, cioè l'effetto dannoso di un particolare composto sul genoma, e la cancerogenicità sono fenomeni correlati. Il metodo della cometa del DNA consente di valutare il grado di danno al DNA genomico sia nell'esperimento che in scopi scientifici, e nella risoluzione di problemi pratici: valutare l'impatto ambiente o condizioni di lavoro, controllo del materiale trapiantato durante lo scongelamento, in ingegneria tissutale. Il danno al DNA rilevato da un test della cometa del DNA può indicare sia una predisposizione all'oncologia che i cambiamenti ad essa associati. Un aumento del danno al DNA rilevato dalle comete del DNA è caratteristico delle cellule tumorali. E, sebbene nei decenni trascorsi dal suo sviluppo, il metodo si sia diffuso solo in ambiti specializzati, può trovare applicazione nella diagnosi e nel monitoraggio della cura di diverse patologie. I vantaggi delle comete a DNA sono la sensibilità, i bassi requisiti per la quantità di materiale, il protocollo di lavoro veloce, la relativa semplicità e il basso costo.

Per lo studio viene utilizzato il metodo della cometa del DNA vari tipi cellule, sia in coltura che in campioni di fluidi e tessuti biologici. Il requisito principale per l'analisi delle comete del DNA è il trasferimento di cellule tissutali in una sospensione, pertanto, durante la dissezione di animali da laboratorio, i frammenti di organi rimossi devono essere sottoposti a un'adeguata elaborazione e le cellule contenute nel sangue o nello sperma possono essere esaminate direttamente. L'80% delle neoplasie maligne è di origine epiteliale. Epitelio esposto a influenze sia esterne che esterne ambiente interno gli organismi sono più adatti per la valutazione della genotossicità con il metodo della cometa del DNA. Un metodo non invasivo per ottenere cellule epiteliali umane è uno striscio dell'epitelio della cavità orale e la selezione di materiale esfoliativo dall'epitelio del canale lacrimale. Le cellule epiteliali orali vivono per 10-14 giorni e la presenza di DNA danneggiato in esse indica una recente esposizione a un composto genotossico. Gli studi sull'integrità del DNA dell'epitelio orale possono aiutare a monitorare gli effetti delle sostanze associate attività professionale e prodotti alimentari.

Le cellule poste in agarosio su vetro vengono trattate con una soluzione di lisi e, se necessario, con enzimi specifici per determinati disturbi. La separazione avviene in tampone alcalino. Il DNA esce dalla cellula e viaggia verso l'anodo, formando un pennacchio che può essere visto usando un microscopio a fluorescenza. Più rotture si verificano nel DNA, più pronunciato è il movimento dei suoi frammenti. Dopo la procedura, i vetrini vengono neutralizzati e colorati con coloranti intercalanti per la visualizzazione del DNA. La mobilità elettroforetica del DNA viene valutata utilizzando un microscopio a fluorescenza. Quando praticamente tutto il DNA di una cellula è frammentato, di solito è una cellula morta. Se singole cellule hanno questo grado di danno genomico, vengono escluse dall'analisi.

Il protocollo della cometa del DNA alcalino più comunemente utilizzato (separazione a pH > 13) consente il rilevamento di rotture a filamento singolo, legami incrociati nel DNA e tra DNA e proteine. L'uso del trattamento alcalino durante la preparazione del campione aumenta la suscettibilità del metodo, poiché la maggior parte degli agenti genotossici non introduce una rottura a doppio filamento nella catena del DNA, ma forma rotture a filamento singolo o regioni con ipersensibilità agli alcali. Inoltre, vengono utilizzati enzimi che introducono rotture nelle regioni del DNA con danni specifici. La formamidopirimidina DNA glicosilasi taglia le catene del DNA nella regione dei nucleotidi ossidati, delle pirimidine della formammide (adenina e guanina con un anello aperto) e di altri derivati ​​della guanina; OGG1 rileva le purine ossidate e le formamidopirimidine, l'endonucleasi III rileva le pirimidine ossidate, l'endonucleasi T4 V riconosce i dimeri della pirimidina, la 3-metiladenina DNA glicosilasi II (AlkA) è specifica per la 3-metiladenina; e la glicosilasi del DNA dell'uracile rileva l'uracile inserito erroneamente nel DNA. Tali protocolli di elaborazione del materiale possono essere richiesti per risolvere problemi specifici, ad esempio, il contenuto di pirimidine ossidate e i siti T4 dell'endonucleasi V aumenta nei tessuti congelati, mentre non si osservano altri disturbi. Il metodo della cometa del DNA con il trattamento enzimatico appropriato può essere utilizzato per valutare lo stato dell'innesto prima del trapianto.

Una delle aree della diagnostica clinica in cui viene utilizzata la tecnologia della cometa del DNA è la diagnosi dell'infertilità maschile. A causa della struttura dello spermatozoo, aumenta il rischio di danni alla struttura del DNA in queste cellule e i sistemi di riparazione non compensano completamente le violazioni che si verificano. Nell'infertilità maschile si osserva un aumento del grado di danno al DNA degli spermatozoi. Il numero di rotture del DNA negli spermatozoi normalmente raggiunge ~ 10 6 - 10 7 per genoma, sia nell'uomo che nei topi di laboratorio, che è molto più alto del numero di rotture del genoma nei linfociti o nei globuli rossi del midollo osseo. La fecondazione con uno spermatozoo contenente danni al DNA attiva processi di riparazione nell'ovocita che ripristinano questi danni, ma aumenta il rischio di mutazioni e malattie congenite nel bambino. La frequenza dell'aborto è correlata al grado di danno al DNA spermatico. Ciò è associato a una maggiore incidenza di malattie congenite e disturbi dello sviluppo nei bambini con ICSI.

Il metodo della cometa del DNA viene utilizzato non solo per valutare lo stato del DNA, ma anche per studiare i processi di riparazione nelle cellule. In questo caso, le cellule in studio vengono distrutte e l'omogenato risultante viene elaborato dal DNA, in cui viene precedentemente introdotto un danno di un certo tipo, alla miscela vengono aggiunti i nucleotidi e l'ATP necessari per la riparazione. La capacità dell'omogeneizzato di ripristinare determinati danni viene utilizzata per giudicare l'attività dei sistemi di riparazione nelle cellule. Il tipo di danno che viene introdotto nel DNA dipende dal meccanismo di riparazione allo studio. Ad esempio, il DNA danneggiato dalla luce contenente 8-ossoguanina viene utilizzato per valutare la riparazione dell'escissione della base e il DNA irradiato con raggi UV contenente dimeri di pirimidina viene utilizzato per la riparazione dell'escissione del nucleotide. Le rotture a filamento singolo vengono introdotte mediante trattamento con perossido di idrogeno, irradiazione di raggi X o raggi gamma, l'alchilazione del DNA viene effettuata mediante trattamento con metil metansolfonato. Per studiare la riparazione dell'escissione del nucleotide, viene utilizzata una valutazione dell'accumulo di rotture del DNA quando si bloccano le polimerasi coinvolte in questo processo utilizzando l'afidocolina o la citosina arabinoside in combinazione con l'idrossiurea.

Un'analisi dell'espressione dei geni associati alla riparazione potrebbe non essere sempre un indicatore oggettivo dello stato del DNA nelle cellule; pertanto, il metodo della cometa del DNA consente di ottenere un prezioso Informazioni aggiuntive. L'aumentata attività dei sistemi di riparazione indica non solo che le cellule sono più resistenti al danno del genoma, ma anche che sono esposte a un agente genotossico, a seguito del quale viene attivata la sintesi delle proteine ​​coinvolte nella riparazione. L'integrazione alimentare con Q10, vitamina C in capsule a lenta dissoluzione, aumenta l'attività riparativa dell'escissione della base. Un effetto simile si osserva se si utilizzano frutta e verdura ricche di antiossidanti al posto dei farmaci. Ciò riduce l'attività del sistema di riparazione dell'escissione del nucleotide, poiché non è più necessario.

Il test del micronucleo è un indicatore diretto di cancerogenicità, le linee guida ICH ne raccomandano l'uso in combinazione con il DNA della cometa. Il metodo della cometa del DNA può essere combinato con ibridazione fluorescente FISH per determinare se i cambiamenti interessano determinate regioni del genoma. Per l'analisi di un gran numero di pennacchi di DNA ottenuti come risultato della procedura della cometa del DNA. si consigliano soluzioni automatizzate. Ciò ridurrà la soggettività della valutazione e valuterà in modo più accurato le dimensioni e la forma dei pennacchi risultanti, il che è particolarmente importante data la necessità di raccogliere dati su un gran numero di pennacchi in ciascuna preparazione. Il DNA della cometa può essere utilizzato come metodo per la diagnostica clinica e per scopi di ricerca, per valutare la genotossicità di un particolare composto.

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Il metodo dell'elettroforesi su gel unicellulare o il metodo della cometa del DNA è altamente sensibile e fornisce un'elevata affidabilità dei risultati ottenuti, allo stesso tempo è relativamente semplice e veloce da eseguire ed è anche standardizzato a livello internazionale (OCSE n. 489). Questo metodo è il più promettente per risolvere i seguenti problemi:

Biomonitoraggio dell'uomo e dell'ambiente, ovvero l'identificazione delle conseguenze della mutagenesi indotta quando una persona viene a contatto con xenobiotici (farmaci, additivi alimentari, pesticidi, profumi e cosmetici, prodotti chimici per la casa, nonché i più comuni acqua, aria e pericoli, nanomateriali);

Ricerca nel campo dell'oncologia;

Studi di sistemi di riparazione del DNA;

Il metodo si basa sulla registrazione della diversa mobilità in un campo elettrico costante di DNA danneggiato e/o frammenti di DNA di singole cellule lisate, racchiuse in un sottile gel di agarosio su un vetrino standard. Allo stesso tempo, il DNA cellulare migra, formando una traccia elettroforetica visivamente simile a una "coda di cometa", i cui parametri dipendono dal grado di danno al DNA. Dopo il completamento dell'elettroforesi, i vetrini vengono colorati e analizzati mediante microscopia a fluorescenza.

L'acquisizione delle immagini e l'elaborazione dei dati vengono eseguite utilizzando un complesso hardware-software, che include una fotocamera altamente sensibile combinata con un microscopio e un software specializzato.

Il software intelligente universale incluso in questo complesso fornisce:

L'analisi automatizzata dell'immagine delle comete del DNA "one keystroke", include tutti i parametri di misurazione di base inclusi % di DNA nella coda della cometa;

- alta riproducibilità;

L'analisi dei parametri delle comete del DNA viene effettuata sia in modalità "tempo reale" che da immagini digitali memorizzate;

Il programma elabora i dati e li visualizza sotto forma di protocollo conforme ai requisiti internazionali della GLP;

Analisi e confronto dei dati;

Il programma è completamente convalidato ed è conforme ai requisiti GLP internazionali. Ha accesso gerarchico e sistema di protezione dei dati.

Il kit comprende:

1. Microscopio biomedico luminescente Nikon Eclipse Ni-E.

2. Sistema di illuminazione epi-fluorescente da 50 W, kit filtro-filtro a specchio dicroico per coloranti DAPI, FITC, TRITC.

3. CCD monocromatico IEEE1394 Telecamera FireWire per luminescenza. Basler Scout scA1300-32fm. Dimensione pixel: 3,75 µm x 3,75 µm. Risoluzione: 1296 px x 966 px. Dimensioni del sensore 1/3 di pollice. Matrix - Sony. Trasferimento dati tramite porta ad alta velocità - 1394 BUS. Frame rate alla massima risoluzione - 32 frame/sec. Fornisce il lavoro con gli oggetti in tempo reale

4. Comet Assay IV - un pacchetto software per Windows con un generatore di fogli di calcolo per Microsoft Excel, per lavorare con una videocamera FireWire CCD monocromatica IEEE1394 in tempo reale (le misurazioni e l'analisi sono possibili sia su un flusso video che su fotografie), un'istruzione manuale e un CD per installare e convalidare il programma.

5. Licenza di un anno per quattro utenti.

6. Insegnamento a distanza attraverso la rete Internet di quattro utenti.

Inoltre offerto:

1. Operatore di dati per utilizzare Comet Assay IV nelle versioni XML dei database per la ricerca, il filtraggio e l'estrazione di dati e l'auditing attraverso un database Oracle protetto salvato in formato foglio di calcolo MS Excel. Include la possibilità di visualizzare immagini salvate automaticamente, firme, dati archiviati e dati di controllo automatico. Include inoltre la possibilità di esportare dati non firmati e con firma digitale in formato XML. Include solo Crypto-Key-Prove per visualizzare i dati con firma digitale in vari formati.

2. Accesso del gestore al sistema GLP. Access Manager è un programma per controllare e gestire l'accesso dei dipendenti ai database. Sistema unificato per la tossicologia genetica PI. Include un audit di sistema completo. Verifica esterna. Amministrazione degli account utente e delle attività degli utenti relative a programmi, accessi, password, revisioni, ecc. Utilizza Oracle per proteggere in modo sicuro gli utenti e controllare i dati. Piena conformità con le regole finali della FDA 21 CFR Part 11 per i record elettronici e le firme elettroniche.

3. Formazione per singolo utente basata sugli strumenti percettivi nel Regno Unito

Il metodo consiste nel fatto che un'immagine con oggetti simili a comete - "comete", che sono un insieme di punti fluorescenti uniti e separati di diversa luminosità, viene inserita in un computer da una preparazione biologica montata su un microscopio fluorescente con una videocamera. Quindi, queste "comete" vengono cercate nell'immagine, il loro contorno viene distinto con la definizione dei confini della "testa" e della "coda" e viene eseguita la morfometria microscopica. Prima di cercare le "comete" nell'immagine, i livelli di luminosità dell'immagine vengono ottimizzati e viene eseguito il filtraggio passa basso per combinare i singoli punti delle "comete" in aree sfocate. Quindi viene eseguita la segmentazione dell'immagine risultante in base alla soglia di luminosità, definita come un offset dallo sfondo, trovando i contorni delle "comete" riempiendo un'area limitata "con un seme", dove il seme è un punto arbitrario appartenente al "cometa", trovando il centro della testa di ogni "cometa", determinando il baricentro dei punti con un'intensità luminosa vicina al massimo. La definizione del confine virtuale della "testa" e della "coda" è effettuata da riflesso speculare la distribuzione delle intensità del bagliore delle punte della parte anteriore della testa della cometa, quindi la morfometria microscopica delle "comete" si effettua misurando: la lunghezza della "cometa", la "coda", il diametro della "testa". Quindi vengono calcolate la percentuale di DNA nell'intera "cometa", nella "coda" e le misure del danno al DNA. Queste operazioni vengono eseguite automaticamente, contemporaneamente su tutte le "comete" in una serie di immagini. Il risultato tecnico è quello di aumentare la precisione e la velocità di elaborazione e analisi delle immagini delle "comete".

Il metodo per l'elaborazione e l'analisi di immagini di oggetti simili a comete ottenute con il metodo "DNA-comets" (test della cometa o elettroforesi su gel a cellula singola - SCGE), in preparazioni biologiche, si riferisce al campo dell'elaborazione e dell'analisi di immagini di oggetti - "comete", ed è destinato ai processi di informatizzazione (automazione) degli studi morfometrici nel campo della biomedicina, effettuati per determinare il grado di danno alle molecole di DNA causato da vari agenti ambientali, per studiare la riparazione delle molecole di DNA a livello di singole cellule, per valutare l'integrità integrale del genoma, per determinare la radiosensibilità individuale dei pazienti oncologici sottoposti a radioterapia, per la bioindicazione delle acque marine costiere, in altre parole, per monitorare un'ampia gamma di danni al DNA causati da fattori ambientali mutageni.

Le immagini delle "comete" sono un insieme di punti fluorescenti fusi e separati di diversa luminosità, ottenuti mediante elettroforesi su gel di singole cellule lisate (metodo "DNA-comete"), pertanto non è possibile elaborarle e analizzarle utilizzando metodi destinati a immagini di oggetti ordinari (solidi).

Attualmente, le immagini delle "comete del DNA" vengono analizzate mediante osservazione visiva al microscopio a fluorescenza e la loro differenziazione in base al grado di danno al DNA, oppure utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini del computer.

In analisi visiva (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for the determinazione della fotogenotossicità in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), p.44-57) Le "comete del DNA" sono classificate in cinque tipi condizionali con il corrispondente valore numerico da 0 a 4. Il grado di danno al DNA è espresso come l'indice "Comete del DNA" (I dna), determinato dalla formula

E dna =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

dove n 0 -n 4 è il numero di "comete di DNA" di ciascun tipo, è la somma delle "comete di DNA" contate.

Questo metodo di elaborazione e analisi è molto dispendioso in termini di tempo, soggettivo, ha solo cinque livelli di gradazione di differenziazione "DNA-comete" e quindi ha una bassa precisione, e quindi la bassa affidabilità dei risultati.

Il più vicino alla soluzione tecnica proposta è il metodo di analisi computerizzata delle immagini "DNA comete", implementato in Software SCGE-Pro (vedi Chaubery RC Computerized Image analysis software for the comet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106) preso come prototipo. Questo metodo di analisi delle "comete" è meno laborioso ed è soprattutto necessario per una valutazione oggettiva dei loro parametri (ad esempio la lunghezza della "cometa", la lunghezza della "coda", il diametro della "testa", percentuale DNA nella "testa" o "coda", ecc.), che vengono utilizzati come indicatori che caratterizzano il livello di danno al DNA nelle cellule studiate. Il metodo consente di trovare "comete" nell'immagine e calcolarne i parametri sia manualmente che automaticamente.

Lo svantaggio del metodo noto è il metodo per determinare i confini della "cometa" utilizzando un'area rettangolare, che riduce l'accuratezza del calcolo dei parametri necessari per valutare il danno (soprattutto se il danno è lieve) del DNA, poiché in questo caso, l'interferenza che è vicina può anche essere attribuita alla cometa. . Inoltre, con questo metodo di analisi, il confine della “testa” e della “coda” è definito come una retta, perpendicolare all'asse della “cometa” e che divide la cometa in una “testa” e una “coda”, che riduce notevolmente l'accuratezza del calcolo della lunghezza della “coda di cometa” e la percentuale di DNA nella “testa” e nella “coda”.

Il risultato tecnico dell'invenzione è quello di aumentare la precisione e la velocità di elaborazione e analisi delle immagini di "comete" ottenute con il metodo "DNA-comete", compreso il filtraggio, la segmentazione delle "comete", evidenziandone il contorno con la definizione delle confine della "testa" e della "coda", che consente di aumentare l'affidabilità dei risultati della morfometria microscopica necessari per l'informatizzazione dei processi di ricerca biometrica effettuati nel monitoraggio di un'ampia gamma di danni al DNA causati da vari fattori ambientali mutageni.

Il risultato tecnico è ottenuto dal fatto che il metodo di elaborazione e analisi delle immagini di oggetti simili a comete ottenuto con il metodo "DNA-comete", che consiste nel fatto che viene inserita un'immagine con oggetti simili a comete - "comete" in un computer da un preparato biologico installato su un microscopio a fluorescenza con una videocamera, che rappresenta un insieme di punti fluorescenti uniti e separati di diversa luminosità, cercano queste "comete" nell'immagine, selezionano il loro contorno con la definizione del bordo della “testa” e della “coda”, si esegue la morfometria microscopica, mentre prima di ricercare le “comete” nell'immagine, si esegue l'ottimizzazione dei livelli di luminosità dell'immagine e il filtraggio passa-basso in modo da combinare i singoli punti delle “comete” in aree sfocate , si esegue quindi la segmentazione dell'immagine risultante in base alla soglia di luminosità, definita come offset dallo sfondo, trovando i contorni delle "comete" riempiendo un'area limitata "con un seme", trovando il centro "testa" di ciascuna " cometa", definendo divisione del baricentro di punti con intensità di bagliore prossima al massimo, determinazione del confine virtuale della “testa” e della “coda”, rispecchiando la distribuzione delle intensità di bagliore dei punti della parte anteriore del “ testa di cometa”, quindi si effettua la morfometria microscopica delle “comete”, misurando: cometa”, “coda”, diametro della “testa” e calcolo della percentuale di DNA nell'intera “cometa”, “nella coda” ", misure del danno al DNA e molti altri parametri che caratterizzano il grado di danno al DNA a seconda del problema da risolvere, e le operazioni elencate vengono eseguite automaticamente, contemporaneamente su tutte le "comete" nell'immagine o nella serie di immagini.

Il metodo viene eseguito eseguendo una sequenza delle seguenti procedure:

1. Entrando in un computer da un campione biologico montato su un microscopio fluorescente con una videocamera, immagini con oggetti simili a comete - "comete", che sono un insieme di punti fluorescenti uniti e separati di diversa luminosità.

2. Ottimizzazione dei livelli di luminosità dell'immagine. La luminosità zero è lo sfondo, la luminosità massima è il centro della testa della "cometa".

3. Il filtraggio passa-basso gaussiano (sfocatura) con un raggio ampio pari a 1/10 del raggio medio della "cometa" viene eseguito per combinare singoli punti di "comete" in aree sfocate. Per evitare la fusione di "comete" vicine l'una all'altra, la regolazione del raggio di sfocatura viene utilizzata in modo interattivo.

4. La segmentazione delle aree sfocate risultanti viene eseguita in base alla soglia di luminosità. La soglia viene determinata automaticamente come offset dallo sfondo (non ci sono inclusioni estranee e altri oggetti nell'immagine ad eccezione delle "comete"), ma la soglia può essere corretta in modo interattivo.

5. Trovare i contorni delle "comete" riempiendo un'area limitata "con un seme", dove il seme è un punto arbitrario appartenente alla "cometa".

Trovare il centro della testa della cometa. Si possono utilizzare due metodi per determinare: dalla distribuzione massima dell'intensità del bagliore dei punti “cometa” lungo l'asse orizzontale o dal baricentro dei punti con un'intensità del bagliore superiore all'80% del massimo.

Determinazione del confine virtuale della "testa" e della "coda", rispecchiando la distribuzione delle intensità di bagliore delle punte della parte anteriore della "testa di cometa" (la parte anteriore è la parte fino al bordo anteriore della "testa di cometa" "testa di cometa").

Eseguire la morfometria microscopica delle "comete" misurando: la lunghezza della "cometa", la lunghezza della "coda", il diametro della "testa" e calcolando la percentuale di DNA nell'intera "cometa", "nella coda" ", misure del danno al DNA e molti altri parametri che caratterizzano il grado di danno al DNA, a seconda del compito da risolvere.

9. L'output dei valori dei parametri ottenuti di ciascuna cometa viene eseguito nella tabella MS EXCEL per implementare la dichiarazione dell'attività dell'utente, ad esempio, per ulteriori analisi statistica o classificazione delle "comete" in base al grado di danno alla struttura del DNA.

Pertanto, nel metodo proposto, ciascuna area della cometa è determinata dal loro contorno complesso, che aumenta la precisione del calcolo dei parametri, in contrasto con il metodo noto, in cui i confini delle "comete" sono determinati utilizzando un'area rettangolare, che riduce l'accuratezza del calcolo dei parametri necessari per valutare il danno (soprattutto se il danno è debolmente espresso) "DNA-comete", poiché in questo caso l'interferenza che è vicina può essere attribuita anche alla "cometa". Inoltre, nel metodo noto, il confine della "testa" e della "coda" è definito come una linea retta, perpendicolare all'asse della cometa e che separa la cometa in una "testa" e una "coda". Il metodo proposto utilizza un bordo virtuale, determinato calcolando il centro della "testa di cometa" e rispecchiando la distribuzione dell'intensità del bagliore dei punti della parte anteriore della "testa di cometa". Ciò migliora notevolmente l'accuratezza del calcolo della lunghezza della coda della cometa e la percentuale di DNA nella testa e nella coda.

Va notato che tutte le operazioni elencate vengono eseguite automaticamente contemporaneamente su tutte le "comete" su un'immagine o su una serie di immagini.

RECLAMO

Un metodo per elaborare e analizzare le immagini di oggetti simili a comete ottenuto con il metodo "DNA-comets", che consiste nell'introdurre un'immagine con oggetti simili a comete - "comete", che sono un insieme di punti fluorescenti uniti e separati di diversi luminosità, ricercare queste "comete" nell'immagine, evidenziarne il contorno con la definizione del bordo della "testa" e della "coda", eseguire la morfometria microscopica, caratterizzata dal fatto che prima di cercare le "comete" nell'immagine, luminosità dell'immagine vengono ottimizzati i livelli e il filtraggio a bassa frequenza per combinare i singoli punti delle "comete" in aree sfocate, quindi viene eseguita la segmentazione dell'immagine risultante in base alla soglia di luminosità, definita come un offset dallo sfondo, trovando i contorni delle "comete" da riempiendo un'area limitata "con un seme", dove il seme è un punto arbitrario, appartenente alla "cometa", ritrovamento il centro della testa di ciascuna "cometa" determinando il baricentro dei punti con intensità luminosa prossima al massimo, determinando il confine virtuale della "testa" e della "coda" rispecchiando la distribuzione delle intensità luminose della punti della parte anteriore della testa della cometa, quindi si effettua la morfometria microscopica delle "comete" misurando la lunghezza della "cometa", "coda", il diametro della "testa" e il calcolo della percentuale di DNA nell'intera "cometa", nella "coda" e le misure del danno al DNA, e le operazioni di cui sopra vengono eseguite automaticamente, contemporaneamente su tutte le "comete" in una serie di immagini.

Articolo per il concorso "bio/mol/text": Sai che le comete sono studiate non solo dagli astronomi, ma anche dai biologi molecolari? Il loro lavoro è connesso con lo spazio solo indirettamente. Guardano le comete attraverso un microscopio. Serve come un cielo stellato scivolo di gel- vetrino microscopico rivestito con agarosio con le cellule in studio. Ciò è stato reso possibile dalla scoperta nel 1984 di un metodo di analisi del DNA chiamato metodo della cometa del DNA.

Sulla popolarità in numeri

Figura 2. Esempi di danno al DNA risultante dall'azione di fattori di diversa natura

Come puoi vedere, i "rapinatori" possono commettere una vasta gamma di "crimini" e causare danni significativi all'integrità del DNA. Tuttavia, nella cellula, la sicurezza del DNA è protetta da sistemi di riparazione, "guaritori" che correggono i danni alla molecola con l'aiuto di speciali "farmaci" - enzimi che possono "rattoppare le ferite" causate da genotossici. Ci sono molti enzimi di riparazione. Al momento, è noto che riparazione dell'escissione Danno al DNA, cioè nelle operazioni, quando il sito viene prima tagliato e poi rimontato, prendono parte 13 enzimi!

Tuttavia, non tutto è così liscio come sembra a prima vista. Le operazioni nel "reparto riparazioni" non sempre si concludono con successo, ad es. ripristino della molecola di DNA originale. Il risultato del lavoro dei sistemi di recupero potrebbe essere un nuovo danno. La ragione di ciò è l'imballaggio molto denso di filamenti di DNA nel nucleo.

Ma che dire degli scienziati? Agiscono come "poliziotti" che hanno bisogno di identificare le "componenti del crimine", cioè trovare il "criminale" ei suoi "complici" (determinare i genotossici, le loro dosi e concentrazioni) e stabilire la gravità del "reato" (identificare il grado di danno al DNA). È in tali situazioni che il metodo della cometa del DNA aiuta.

Originario della Svezia

Già negli anni '80 sono stati effettuati tentativi volti allo studio delle strutture nucleari della cellula e alla determinazione quantitativa del danno del filamento di DNA in singole cellule di organismi. XX secolo da scienziati come Cook e Brazell, Rydberg e Johanson. Tuttavia, è stato solo nel 1984 che i ricercatori svedesi Ostling e Johanson hanno sviluppato un nuovo metodo per rilevare i danni al DNA. Furono loro a notare che le immagini dei frammenti di DNA che migravano in un campo elettrico assomigliavano a comete astronomiche. C'era una somiglianza. Le "comete" ottenute dagli scienziati svedesi avevano le principali caratteristiche di "fratelli" spaziali: avevano una "testa" e una "coda". Ecco da dove viene un nome così romantico: il metodo della cometa del DNA.

Il metodo ha una serie di altri nomi - elettroforesi su gel di cellule singole (isolate). e elettroforesi in microgel . Il nome riflette in modo errato l'essenza dell'analisi. L'elettroforesi non viene eseguita in singole cellule, ma in un gel di agarosio, dove il DNA isolato da queste stesse cellule si sposta da un polo all'altro. Il secondo è corretto, perché l'elettroforesi viene effettuata in gel di agarosio applicato su vetrini. Ma questo termine non ha preso piede. Questi nomi non sono molto popolari e sono usati raramente, in contrasto con il "metodo della cometa del DNA".

Incantesimo per ottenere "comete"

Figura 3. La struttura della "cometa".

Le "comete" di laboratorio sono oggetti interessanti. Il loro aspetto dipende direttamente dai fattori di influenza, dalla loro forza e dalle condizioni dell'analisi. Le informazioni sulle "comete" non sono un segreto, avvolte nell'oscurità, quindi si sa quasi tutto sulla loro composizione, struttura e formazione.

In una pubblicazione del 1984, gli svedesi Ostling e Johanson chiamarono il DNA migrato "coda" e il DNA rimasto nella cavità "centro". Ora, praticamente non è cambiato nulla: la “cometa” è convenzionalmente distinta dalla “testa” e dalla “coda” (Fig. 3).

Deve essere chiaro che una "cometa" non è formata da una cellula di un organismo vivente, ma dal suo DNA. incorporato in uno strato di agarosio sospensione cellulare forma cavità, che nel processo lisi occupa il DNA di queste cellule. Tutte le ulteriori manipolazioni nel metodo della cometa del DNA vengono eseguite con il DNA.

Le "comete" si formano nel processo di migrazione (movimento) del DNA in un campo elettrico (quando c'è corrente e tensione). Cosa succede durante lisi e elettroforesi? Le biomolecole più piccole che compongono la cellula "fuggono" nella soluzione di lisi durante la diffusione, contrariamente al DNA che, per la sua estrema grande taglia non posso muovermi. Quando i vetrini con DNA vengono sottoposti a elettroforesi, il DNA intatto forma una "testa di cometa" e le parti danneggiate delle molecole iniziano a "correre" verso una fonte di corrente caricata positivamente - l'anodo (perché il DNA è caricato negativamente), formando una "coda ". Per vedere le "comete" risultanti, vengono colorate con coloranti fluorescenti (bromuro di etidio, arancio di acridina, ecc.) E quindi visualizzate utilizzando un microscopio fluorescente ad alto ingrandimento (Fig. 4).

Ostling e Johanson scrivono quanto segue: “Quando una cellula è incorporata in un gel, forma una depressione al suo interno. Dopo la lisi cellulare, il suo DNA occupa questa depressione. La maggior parte delle altre biomolecole si diffondono facilmente attraverso il gel di agarosio. Pertanto, quasi tutti escono dalla cavità lasciata dalla cellula nella soluzione di lisi. L'unica eccezione è il DNA, che, a causa delle sue dimensioni peso molecolare rimane nel gel. - ed.

Figura 4. La sequenza dei passaggi del metodo della cometa del DNA(partendo in senso orario dall'alto). * - Il passaggio è necessario solo nella versione alcalina del metodo (pH > 13,0) per neutralizzare l'alcali con NaOH.

Più forte è il danno al DNA (e il grado di danno dipende dalla dose del mutageno), più pronunciata è la "coda di cometa". Come hai già capito, una lunga "coda" non va molto bene.

soldato universale

Il metodo della cometa del DNA è uno strumento ad ampio raggio. Con il suo aiuto, gli scienziati "risolvono crimini" legati a un tentativo di salute umana e sicurezza ambientale (ovviamente tutto questo attraverso lo studio del DNA danneggiato). Il metodo ha guadagnato tale popolarità grazie alle sue caratteristiche interessanti: semplicità, velocità, economia e sensibilità sufficientemente elevata, che consente di rilevare il danno al DNA causato anche da fattori di bassa intensità (ad esempio basse dosi di radiazioni). Tra i tanti metodi per valutare il danno al DNA, il metodo della cometa del DNA è uno dei più adatti in quest'area. Oltre ai vantaggi di cui sopra, supera, ad esempio, il noto metodi citogenetici (ana-telofasico, analisi metafase, test del micronucleo), e per altri buoni motivi.

Il metodo della cometa del DNA consente di lavorare con qualsiasi cellula contenente DNA, contrariamente al test del micronucleo, che molto spesso coinvolge le cellule del sangue o del midollo osseo. Se i metodi ana-telofase e metafase sono limitati nell'elenco dei determinati aberrazioni cromosomiche, quindi il metodo della cometa del DNA fornisce un'ampia gamma di sue modifiche, grazie alle quali il ricercatore può identificare una varietà di danni al DNA: singolo, doppio danno, siti alcalino-labili, apoptosi e altri. Sono queste opportunità che lo rendono un "soldato universale" e aprono la strada al metodo in diverse aree. ricerca scientifica , :

• monitoraggio ambientale- valutazione dello stato dell'ambiente per grado di danno al DNA degli organismi che vivono nell'area di studio (di norma vengono confrontati i livelli di danno al DNA degli individui provenienti dalle aree contaminate e di controllo);
• monitoraggio biologico- studio dell'influenza della nutrizione e di altri fattori ambientali esterni sul corpo in termini di grado di danno al DNA, accumulo di danno e riparazione;
• studi genotossici preparati farmacologici, prodotti chimici nuovi ed esistenti (prodotti chimici domestici, pesticidi, ecc.);
• ricerche cliniche finalizzato alla diagnosi prenatale nella fase dello sviluppo intrauterino, identificando la predisposizione alle malattie;
• marchio di efficienza Terapia del cancro e suo controllo.

Il cambiamento si impara per confronto

Osservazione dello stato dell'ambiente, cd. monitoraggio ambientale, aiuta i ricercatori a identificare i cambiamenti nell'ambiente ea dare l'allarme in tempo (soprattutto in situazioni di emergenza, ad esempio alla centrale nucleare di Chernobyl nel 1986 o alla centrale nucleare di Fukushima Daiichi nel 2011). Quando l'ambiente è inquinato, il metodo DNA-cometa in combinazione con organismi indicatori torna utile. Elenchi di organismi caratteristici di ambienti diversi gli habitat più sensibili ai cambiamenti dello stato dell'ambiente, sono piuttosto estesi e comprendono specie che vanno dai batteri Escherichia coli e alghe del genere Clamidomona e termina con piante superiori ( Lemna minore, Pinus sylvestris), mammiferi ( Microtus oeconomus) e, naturalmente, una persona (Fig. 5). Nel metodo della cometa del DNA, di norma, non sono coinvolti organismi interi, ma le loro "parti componenti" - cellule particolarmente sensibili ai cambiamenti dei fattori ambientali o tessuti da cui queste cellule possono essere ottenute. Le cellule del sangue sono generalmente prelevate da animali: eritrociti e linfociti, emociti(analoghi degli eritrociti negli invertebrati), celomociti(cellule che svolgono una funzione immunitaria nei lombrichi); nelle piante - cellule del meristema, che dividono intensivamente il tessuto.

Nota: Nell'analisi del danno al DNA possono essere utilizzati anche interi individui se rappresentati da una singola cellula, come, ad esempio, Clorella volgare.

Figura 5. Esempi di organismi indicatori utilizzati per valutare lo stato dell'ambiente utilizzando il metodo della cometa del DNA.

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Come funziona il metodo della cometa del DNA in questo caso? Gli scienziati confrontano il grado di danno al DNA degli organismi indicatori che vivono nei territori studiati (contaminati) e di controllo (non contaminati): esposti a suolo, acqua, ecc. contaminati, e lo stesso, ma che vivono in normali condizioni di controllo, ad es. quando non c'è influenza del fattore studiato o è insignificante. La valutazione del grado di danno al DNA viene effettuata anche in laboratorio, in condizioni rigorosamente controllate, quando è presente un campione di organismi esposti al fattore o gruppo di fattori studiato (radiazioni, metalli, pesticidi), e necessariamente un gruppo di controllo ( non sperimentando questo effetto).

Esempio: L'11 marzo 2011, a seguito del più forte terremoto in Giappone e dello tsunami che ne è seguito, si è verificato un grave incidente radioattivo presso la centrale nucleare di Fukushima Daiichi. Nel 2014, scienziati giapponesi hanno condotto uno studio. Sono stati selezionati come controlli due siti colpiti dall'incidente, uno con un livello di radiazioni elevato (2,85 µSv/h) e uno con un livello basso (0,28 µSv/h). Nei lombrichi della famiglia Megascolecidae da questi siti è stato analizzato il grado di danno al DNA. Si è scoperto che questo indicatore è significativamente più alto negli individui esposti a livelli elevati di radiazioni rispetto agli individui nell'area con un basso livello di esposizione.

Gli scenari possono variare. Il grado di danno al DNA nelle cellule può aumentare, diminuire o rimanere invariato. Un maggiore grado di danno al DNA negli organismi provenienti da un'area contaminata può indicare cambiamenti interni nel funzionamento delle cellule, che portano a numerose "rotture" del DNA.

Esempi: Alcuni metalli, entrando nel corpo, inducono specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando danni al DNA; le radiazioni ionizzanti contribuiscono alla formazione dei radicali liberi, che sono anche "trasgressori" del DNA. L'azione dei raggi ultravioletti può portare alla formazione dimeri nel DNA, rompendo il legame delle sue due catene e modificando così la conformazione della molecola.

La riduzione del danno al DNA o l'assenza di differenze suggeriscono che gli organismi hanno affrontato "l'oppressione" genotossici e adattato alla vita in questi condizioni avverse. Questo adattamento è chiamato adattamento. Ma questa è una storia completamente diversa.

L'ereditarietà è una forza terribile

Hai sentito parlare di malattie come la sindrome da rottura cromosomica (sindrome da danno di Nimega), lo xeroderma pigmentoso e la tricotiodistrofia? Appaiono solo quando entrambi i genitori sono portatori del gene difettoso (Fig. 6).

Ci sono dati in letteratura sulla possibilità di utilizzare il metodo della cometa del DNA nella diagnosi di queste malattie ereditarie, che è particolarmente importante nella fase prenatale, cioè durante la gravidanza.

Sindrome del danno di Nimega (Sindrome da rottura di Nimega, NBS) è una malattia associata a violazioni permanenti dell'integrità del DNA. Il problema è che il gene NBS1 si verifica una mutazione che "si spegne" nibrina- una proteina che controlla la riparazione delle rotture accoppiate del DNA indotte dalle radiazioni. Ecco perché le persone che soffrono di questa sindrome sono estremamente radiosensibili. Bozena Novotna dell'Istituto di Medicina Sperimentale di Praga nel suo studio sostiene che il metodo della cometa del DNA è eccellente per identificare i portatori eterozigoti del gene NBS1 in modo anomalo alto livello danno ai filamenti di DNA nelle "comete" dei linfociti.

Non sono meno pericolosi xeroderma pigmentoso e tricotiodistrofia. Queste sono gravi malattie umane che vengono ereditate. Nel primo caso, con una breve esposizione al sole nei bambini su aree aperte della pelle (mani, collo, viso), compaiono prima delle macchie rosse, che successivamente si trasformano in una pigmentazione pronunciata fino alla formazione di tumori. La seconda malattia si esprime in capelli e unghie fragili, ritardo mentale e anomalie nella struttura del cranio.

Queste malattie sono unite da una violazione nel lavoro di riparazione dell'escissione del nucleotide. Sulla base del successo della riparazione dell'escissione del nucleotide nelle cellule fetali utilizzando il metodo della cometa del DNA, è possibile determinare se il bambino soffrirà di queste malattie. I casi di tale diagnosi sono descritti in letteratura.

I ricercatori hanno dovuto affrontare il compito di scoprire prima della nascita se i bambini avrebbero sofferto di xeroderma pigmentosa e tricotiodistrofia. Gli esperimenti sono stati condotti in famiglie in cui i genitori sono portatori di geni xeroderma pigmentoso ( famiglia X) e tricotiodistrofia ( Y famiglia) e hanno già figli con queste malattie .

Famiglia X: gravidanza 15 settimane, la madre è portatrice del gene xeroderma pigmentosa, c'è un bambino di 3 anni con questa malattia.

Famiglia Y: gravidanza 10 settimane, padre e madre - portatori del gene della tricotiodistrofia, due bambini con tricotiodistrofia sono morti all'età di 22 mesi e 6 anni, uno in più - a seguito di aborto spontaneo (aborto spontaneo).

Tutte le cellule sono state esposte a radiazioni ultraviolette per 45 minuti.

X Studio Familiare: Il livello di danno al DNA nelle cellule del feto, determinato usando il metodo della cometa del DNA, era vicino al livello di danno al DNA nei fibroblasti della madre portatrice, cioè corrispondeva al livello di danno del filamento in normali condizioni di riparazione dell'escissione del DNA. Conclusione: il feto è sano. Questa conclusione è stata confermata dopo la nascita di un bambino normale.

Studio in famiglia Y: nelle cellule del feto, rispetto ai fibroblasti del padre e della madre, è stato rilevato un difetto nel lavoro di riparazione escissionale, confermato anche da un altro metodo non basato sullo studio della riparazione. Viene rivelato che il feto è malato. Dopo aver parlato con la famiglia, si è deciso di abortire.

L'industria è nemica della salute umana

La salute delle persone che lavorano in stabilimenti industriali o che vivono in aree non rispettose dell'ambiente è ogni giorno a rischio. Il pericolo risiede non solo nello stretto contatto quotidiano del corpo con genotossici (radiazioni ionizzanti, metalli pesanti e altri prodotti chimici), ma anche nella probabilità di situazioni di emergenza (vedi esempi sopra), le cui conseguenze possono essere catastrofiche per gli organismi. I cambiamenti nello stato del corpo possono essere molto diversi, da lievi disturbi come il mal di testa al cancro.

Il metodo della cometa del DNA può essere utilizzato come strumento promettente valutazione iniziale lo stato del genoma delle persone che lavorano o vivono in condizioni ambientali sfavorevoli. Ciò significa che le comete del DNA possono essere utilizzate non solo in queste aree di ricerca, ma anche in altre aree in futuro, ampliando le opzioni per l'utilizzo del metodo nella ricerca clinica, nella medicina e molto altro.

Esempi: In Polonia, un incidente in una fabbrica di batterie ha esposto i lavoratori a livelli elevati di piombo e cadmio, il che ha provocato un piccolo ma significativo aumento del danno al DNA rispetto a un gruppo di persone che non ha subito tale stress. L'effetto genotossico degli aerosol per saldatura a gas contenenti metalli pesanti - manganese, cromo, nichel, cadmio, cobalto, piombo, molibdeno, ferro - sul DNA dei leucociti è stato rivelato per le persone il cui lavoro è stato associato per molto tempo alla saldatura.

Ci sono alcune difficoltà

Per utilizzare correttamente il metodo della cometa del DNA, è necessario "conoscere di vista" non solo le sue capacità e vantaggi rispetto ad altri metodi, ma anche, naturalmente, gli svantaggi, i limiti e le difficoltà a cui prestare attenzione. Il metodo richiede ottimizzazione lisi, elettroforesi e altre condizioni a seconda del tipo di cellule utilizzate dallo scienziato e degli obiettivi dello studio.

Spiegazione: Le cellule vegetali e animali richiedono condizioni diverse per il rilascio del DNA, ad es. lisi. A causa della presenza di una parete cellulare di cellulosa, le cellule vegetali impiegano più tempo a lisare rispetto alle cellule animali.

Dalla prima difficoltà segue il secondo inconveniente: l'adattamento del metodo ai problemi di analisi può essere molto difficile. processo laborioso(sebbene la tecnica in sé sia ​​semplice e comprensibile), soprattutto se nessuno ha lavorato con l'oggetto del tuo studio usando il metodo della cometa del DNA. Succede che la "messa a punto" della metodologia in questo caso richieda molto tempo.

A volte ci sono difficoltà nell'interpretazione risultati ottenuti dal grado di danno al DNA, poiché il grado di danno non può essere sempre correlato alla dose del fattore influenzante.

Spiegazione: Un tale problema può essere associato a un'ottimizzazione insufficiente del metodo, quando alcuni tipi di danno si mescolano ad altri e quindi distorcono i risultati. I sistemi di riparazione, che correggono parte delle violazioni risultanti, possono anche "disturbare" l'effettivo grado di danno al DNA.

Una delle maggiori difficoltà può essere confronto dei risultati ottenuto utilizzando il metodo della cometa del DNA da diversi scienziati in diversi laboratori e istituti di ricerca. Per valutare il danno al DNA vengono utilizzati metodi con modifiche e indicatori completamente diversi (ad esempio la percentuale di DNA nella "coda di cometa" o la lunghezza della "coda").

Spiegazione: La lunghezza della "coda di cometa" è la distanza che il DNA ha migrato dalla "testa" della coda. La percentuale di DNA nella coda della cometa è la quantità di DNA che è migrata nella coda, espressa in percentuale. DA elenco completo I punteggi dei danni al DNA sono disponibili su www.cometassayindia.org.

Sono in corso sforzi per standardizzare l'uso del metodo della cometa del DNA, che aiuterà gli scienziati a confrontare i risultati. Ad esempio, protocolli e linee guida sono stati sviluppati in studi genotossici.

Spiegazione: Le linee guida del Centro federale per l'igiene e l'epidemiologia di Rospotrebnadzor definiscono chiaramente gli oggetti del test (cellule umane) e descrivono in dettaglio tutte le fasi dell'analisi. Secondo queste raccomandazioni, utilizzando il metodo della cometa del DNA, i prodotti chimici domestici e i prodotti realizzati con materiali polimerici possono essere testati per la genotossicità.

Conclusione

"Chi è armato è protetto" - questo è il motto di lavorare con il metodo della cometa del DNA. Conoscenza dei vantaggi e svantaggi dell'utilizzo questo metodo valutare il danno al DNA consente di manipolare magistralmente il corso del lavoro, evitare "insidie" e ottenere risultati corretti.

Il metodo della cometa del DNA svolge il ruolo di una "bacchetta magica" nel valutare le condizioni generali del corpo, di regola, su fasi iniziali impatto fattori avversi ambiente. Sul stato inizialeè il danno al DNA che è la risposta più veloce e quindi l'unica misurabile dell'organismo agli effetti avversi molto prima della comparsa dei cambiamenti a livello fisiologico.

Ora sai come i biologi ottengono le "comete" nei laboratori e perché ne hanno tanto bisogno.

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