Tepinėlių dažymas pagal gramo metodą Dažniausias bakterijų dažymo būdas, leidžiantis ląsteles klasifikuoti pagal sienelės dažymo tipą į gracilicutes (gramneigiamas) arba firmicutes (gramteigiamas).

Ant fiksuoto tepinėlio uždedamas filtravimo popieriaus gabalas, ant jo 30-50 sekundžių pilamas gencijonų violetinės karbolinis tirpalas. Dažai nusausinami, popierius nuimamas, Lugolio tirpalas tepamas 60 sekundžių. Išmeskite Lugolio tirpalą. Skalaukite vaistą 95 ° etanoliu 30-50 sekundžių, kol dažai nustos išeiti, o tai priklauso nuo tepinėlio storio. Preparatas plaunamas vandeniu, 30-60 sekundžių dažomas Pfeiffer fuchsin, plaunamas vandeniu, džiovinamas ir mikroskopuojamas. Mikroskopinis vaizdas: gramteigiamos bakterijos – violetinės spalvos, gramneigiamos – raudonos.

Praktika rodo, kad švaresni preparatai, nepažeidžiantys diferenciacijos, gaunami, jei po dažymo gencijonine violetine tepinėlis šiek tiek nuplaunamas vandeniu, kurio likučiai nukratomi ir tik tada tepamas Lugolio tirpalas.

Modifikacija pagal A.P. Sineva. Ant fiksuoto tepinėlio uždedama popieriaus juostelė su dažais, užpilama 2-3 lašais vandens ir 2 minutes dažoma. Tada tęskite, kaip aprašyta aukščiau.

Kerio modifikacija. Tepinėlis 1-2 minutes dažomas alkoholio gencijonų violetiniu tirpalu, 1-2 minutes apdorojamas jodo tirpalu, po to 30-40 sekundžių etanoliu. Išskalbtas. Pakartotinai 1 minutę apdorojama jodo tirpalu, plaunama, 1-2 minutes dažoma fuksinu arba safranino mišiniu su briliantine žaluma.

Burke'o modifikacija. A tirpalas: 1% kristalinės violetinės spalvos tirpalas distiliuotame vandenyje.

Mordantas: kristalinis jodas - 1 g, kalio jodidas - 2 g, distiliuotas vanduo - 100 ml.

Spalvos pakitimo tirpiklis: etilo eteris - 1 tūris, acetonas - 3 tūriai.

Papildomi dažai: 2% safranino tirpalas distiliuotame vandenyje.

Metodika. Kaitinant fiksuotas tepinėlis panardinamas į tirpalą A. Tepinėlis perplaunamas jodo kandiklyje ir 2 minutes uždengiamas šviežiu kremu. Skalaukite vandeniu, o po to spalvą mažinančiu tirpikliu, kol nuotekose nebeliks dažų. Po džiovinimo 5-10 sekundžių nudažykite papildomais dažais, nuplaukite vandeniu ir nuplaukite mikroskopu.

Hookerio modifikacija

A tirpalas: krištolinis violetinis - 2 g, 95% etanolis - 20 ml.

B tirpalas: amonio oksalatas - 0,8 g, distiliuotas vanduo - 80 ml.

Paruošti tirpalai A ir B sumaišomi tamsiame buteliuke ir paliekami kambario temperatūroje 24 valandas.

B tirpalas: 2,5% safranino tirpalas (96% etanolyje) - 10 ml, distiliuotas vanduo - 100 ml.

Metodika. Šildant fiksuotas tepinėlis panardinamas į A ir B tirpalų mišinį 1 min., po to preparatas plaunamas vandeniu ir 1 min veikiamas Lugolio tirpalu, po to vėl perplaunamas vandeniu ir džiovinamas; 30 s užtepamas 96 % etanolis, preparatas kruopščiai nuplaunamas vandeniu, išdžiovinamas, dedamas į B tirpalą 10 sekundžių, šiek tiek nuplaunamas vandeniu, išdžiovinamas, mikroskopuojamas.

Kalio hidroksido testas, skirtas stebėti bakterijų Gramo dėmių rezultatus. Jei Gramo dėmė nėra aiški, šis metodas leidžia patikslinti rezultatą.

Testo nustatymas. 1-2 lašai 3% KOH tirpalo užlašinami ant stiklelio. Agaro kultūra bakteriologine kilpa įvedama į KOH, sumaišoma, o tada kilpa pakeliama. Jei kultūra „siūlo“ pavidalu siekia kilpą – gramneigiama, nesant šio reiškinio – gramteigiama bakterija.

Rūgščiai atsparių bakterijų dažymo metodai

Ziehl-Nielsen dažymas. Paruošiami karbolio fuksino dažai: bazinis fuksinas - 0,3 g, 95% etanolis - 10 ml, fenolis (kristalai ištirpsta kaitinant) - 5 ml, distiliuotas vanduo - 95 ml.

Bazinis fuksinas ištirpinamas etanolyje, įpilama vandenyje ištirpusio fenolio, sumaišoma, inkubuojama 5-7 paras kambario temperatūroje; prieš naudojimą filtruojamas per filtravimo popierių.

Spalvos keitimo tirpiklis (druskos alkoholis): etanolis 95% - 97 ml, koncentruota druskos rūgštis - 3 ml. Papildomi dažikliai: metileno mėlynasis - 0,3 g, distiliuotas vanduo - 100 ml.

Metodika. Karbolio-fuksino dažai pilami ant tepinėlio, fiksuoto kaitinant, kaitinami tol, kol pasišalins garai (bet neužvirinkite!). Po 5 minučių nuplauti vandeniu. Tada tepinėlis 30-50 sekundžių apdorojamas balinančiu tirpikliu, nuplaunamas vandeniu, o po to bakterijų plėvelė ant tepinėlio tampa šviesiai rausva.

Tepinėlis 3-5 minutes nudažomas papildomais dažais (metileno mėlynuoju ir kt.), nuplaunamas vandeniu ir džiovinamas.

Rūgščiai atsparūs mikroorganizmai tepinėlyje yra raudoni, kiti – mėlyni.

Auramino dėmė. A tirpalas: auraminas - 1,5 g, rodaminas B - 0,75 g, glicerinas - 75 ml, lydytas fenolis - 10 ml, distiliuotas vanduo - 50 ml.

Dažikliai: fenolis ir glicerinas ištirpinami 25-30 ml vandens, įpilamas likęs vandens tūris ir filtruojamas per stiklo vatą.

B tirpalas: 70% etanolis - 99,5 ml, koncentruota druskos rūgštis - 0,5 ml.

B tirpalas: kalio permanganatas - 0,5 g, distiliuotas vanduo - 99,5 ml.

Metodika. Ant degiklio liepsnos pritvirtintas tepinėlis 15 minučių nudažomas A tirpalu kambario temperatūroje arba 37-38 °C temperatūroje. Plaunamas po tekančiu vandeniu, kol pasikeičia spalva. Tirpalas B pilamas ant tepinėlio 3-5 minutes, plaunamas ir dar 2-4 minutes dažomas tirpalu C. Nuplaunamas, išdžiovintas, mikroskopiškai panardinamas į fluorescencinį mikroskopą (žadinantis šviesos filtras BG-12, blokuojantis OG-1) .

Rūgštims atsparios bakterijos geltonai oranžinės spalvos tamsiame fone.

Musės dažymas. Vaistas išlaiko 24 valandas metilo violetinio tirpale (10 ml metilo violetinio prisotinto alkoholio tirpalo, 100 ml 2% karbolio rūgšties vandeninio tirpalo). Lugolio tirpalas tepamas 1-2 minutes, po to 1 minutę tepamas 5% tirpalas azoto rūgštis ir 10 sekundžių 3% tirpalo druskos rūgšties. Tada ant preparato užtepamas etanolio ir acetono mišinys (1:1), kol dažai nustos slinkti, nuplauti vandeniu, išdžiovinti ir mikroskopuoti.

Sporų dažymo metodai

Aujeskio metodas. Oru išdžiovintas tepinėlis be fiksacijos 2-3 minutes (kaitinamas) apdorojamas 0,5% sieros rūgštimi, nuplaunamas ir fiksuojamas ant liepsnos. Kaitinamas 7-8 minutes dažomas Zielio karboliniu fuksinu, dažai nusausinami. Tepinėlis 5-7 sekundes apdorojamas 5% sieros rūgšties tirpalu, plaunamas ir 4-5 minutes dažomas metileno mėlynu. Mikroskopuojant ląstelės vegetatyvinė dalis yra mėlyna, sporos – raudonos.

Mellerio metodas. Ant liepsnos pritvirtintas tepinėlis 2–3 minutes ėsdinamas 5 % chromo rūgštimi, nuplaunamas ir nudažomas Zielio karboliniu fuksinu. Balinkite ir beicuokite taip pat, kaip Aujeskio metodu.

Peškovo metodas. Fiksuotas tepinėlis nudažomas iki virimo pakaitintu metileno mėlynu. Dažai nuplaunami ir 10 sekundžių dažomi 1% neutralumo vandeniniu tirpalu. Išplauti, išdžiovinti. Sporos mėlynos, vegetatyvinės ląstelės raudonos.

Schaeffer-Fulton metodas. Ant tepinėlio, fiksuoto kaitinant, uždengto filtravimo popieriumi, pilamas 0,5 % vandeninis malachito žalumos tirpalas. Tepinėlis 5 minutėms uždedamas virš verdančio vandens. Išplautas ir priešdažytas 30 sekundžių 2% safranino vandeniniu tirpalu. Išplauti, išdžiovinti. Sporos ryškiai žalios, vegetatyvinės ląstelės raudonai rudos.

Trujillo metodas. Tepinėlis fiksuojamas virš degiklio liepsnos, uždengiamas prisotintu vandeniniu malachito žalios spalvos tirpalu, kaitinamas, kol pasirodys garai, ir 3 minutes nusidažo. Dažai nuplaunami vandeniu, o tepinėlis 1 min. nudažomas 0,25 % vandeniniu bazinio fuksino tirpalu. Išplauti, išdžiovinti. Sporos žalios, vegetatyvinės ląstelės raudonos.

Dornerio metodas. Ant degiklio liepsnos pritvirtintas tepinėlis kaitinamas 5-10 minučių dažomas karboliniu fuksinu, 1 minutę keičia spalvą druskos rūgšties alkoholiu (3 ml koncentruotos druskos rūgšties ir 97 ml 96 % etanolio). Vaistas nuplaunamas, išdžiovinamas filtravimo popieriumi ir plonu sluoksniu 10% nigrozino tirpalo 0,5% formalino tirpale užpilamas ant tepinėlio. Neplaunant tepinėlis džiovinamas ore ir mikroskopuojamas. Sporos raudonos, vegetatyvinės ląstelės bespalvės juodame fone.

Waldmano metodas. Lefleur blue (šarminis) tepamas ant fiksuoto preparato ir kaitinamas iki virimo, po to atvėsinamas ir nuplaunamas vandeniu. Dažykite 1% neutraliu tirpalu 30 sekundžių. Mikroskopinis vaizdas: sporos – mėlynos, vegetatyvinės ląstelės – raudonos.

Ožeškos metodas. 0,5% HC1 tirpalas pilamas ant nefiksuoto tepinėlio ir kaitinamas 1-2 minutes. Rūgštis nupilama, preparatas nuplaunamas vandeniu, išdžiovinamas, fiksuojamas ant liepsnos ir nudažomas Ziehl-Neelsen metodu. Mikroskopinis vaizdas: sporos – raudonos, vegetatyvinės ląstelės – mėlynos.

Kapsulių dažymo metodai

Romanovskio-Giemsos metodas. Etanolyje arba Nikiforovo skystyje fiksuotas tepinėlis dedamas į Romanovsky-Giemsa dažus (15-20 lašų dažų 10 ml distiliuoto vandens) 15-20 minučių. Išplauti, išdžiovinti. Bakterijų kūnas nudažytas tamsiai mėlyna spalva, kapsulės rausvos spalvos.

Olto metodas. Fiksuoti tepinėliai virš degiklio liepsnos dažomi 1-3 minutes 2% vandeniniu safranino tirpalu (safraninas ištirpinamas karštas vanduo, filtruokite, užtepkite ką tik paruošto tirpalo). Bakterijos kūnas nusidažęs rudai, kapsulė šviesiai geltona.

Rebiger metodas. Nefiksuotas tepinėlis 15-20 sekundžių nudažomas gencijoninės žibuoklės tirpalu formaline (15-20 g gencijonų žibuoklių ištirpinama 100 ml 40 % formalino, nusodinama, filtruojama), nuplaunama vandeniu. Bakterijų kūnas yra tamsiai violetinės spalvos, kapsulė yra rausvai violetinė.

Antano keliu. Tepinėlis 2 minutes dažomas 1 % vandeniniu krištolo violetinės spalvos tirpalu. Dažai nuplaunami 20 % vandeniniu vario sulfato tirpalu (CuSO 4 ·5H 2 O), tirpalo perteklius nukratomas ir tepinėlis džiovinamas filtravimo popieriumi, neplaunant vandeniu. Mikrobai – tamsiai violetinė, kapsulė – šviesiai mėlyna.

Džinso metodas. Lašas juodo rašalo, praskiesto 1:3 distiliuotu vandeniu, užlašinamas ant stiklelio ir centrifuguojamas 3000 aps./min. greičiu 15 minučių. Skerdenos laše kultūra pakabinama kilpa ir padaromas tepinėlis (panašus į kraujo tepinėlį). Išdžiovinkite, pritvirtinkite virš degiklio liepsnos, nudažykite Ziel karbolio fuksinu, praskiestu santykiu 1:3. Bakterijų kūnai yra raudoni. Kapsulė tamsiame fone matoma kaip šviesi aureolė aplink bakterijas.

Michino metodas. Tepinėlis 3-5 minutes dažomas Leffleur's blue (tinka tik ne trumpiau kaip 20-30 dienų laikyti dažai, nes laikant juose susidaro žydros spalvos, suteikiančios metachromatiškumo). Bakterijų kūnai mėlyni, kapsulė rausva.

Giss metodas. Lašelis normalaus galvijų ar arklių kraujo serumo (arba lašas nugriebto pieno) užlašinamas ant stiklelio, į jį su kilpa įvedama kultūra, suspenduojama ir paruošiamas tepinėlis. Bakterijų suspensijos plėvelė džiovinama ore, fiksuojama ant degiklio liepsnos ir 1 min. dažoma 0,1 % vandeniniu kristaliniu violetiniu tirpalu. Tepinėlis nuplaunamas 20 % vandeniniu vario sulfato tirpalu, išdžiovinamas filtravimo popieriumi. Kapsulės tepinėlyje yra šviesiai mėlynos, bakterijų kūnai tamsiai violetiniai.

Dugido metodas. Lašas juodo rašalo uždedamas ant stiklelio, o kultūra joje pakabinama. Lašas uždengiamas dengiamuoju stiklu, rašalo perteklius pašalinamas filtravimo popieriumi. Rudai juodame fone matomos šviesą laužančios bakterijos, apsuptos skaidrios zonos pavidalo kapsule.

Jono keliu. Ant vieno stiklelio paviršiaus galo užlašinamas rašalo lašas, praskiestas distiliuotu vandeniu santykiu 1:2–1:4. Bakterijos suspenduojamos lašelyje ir paruošiamas tepinėlis (kaip kraujo tepinėlis). Preparatas džiovinamas ore, fiksuojamas ant degiklio liepsnos ir 2 minutes nudažomas 2 % vandeniniu gencijonų violetinės spalvos tirpalu arba 1 % fuksino tirpalu. Nuplaunama vandeniu, 8-10 sekundžių veikiama 2% acto rūgšties tirpalu ir vėl išplaunama. Tepinėlyje aplink intensyviai nudažytas bakterijas matoma nedažyta kapsulė.

žvynelių dažymo metodas

Žvynelių buvimas bakterijose vertinamas pagal netiesioginius požymius, pavyzdžiui, pagal ląstelių mobilumą preparatuose „sutraiškytas lašas“, „pakabintas lašas“, taip pat pagal tiriamosios kultūros augimo pusiau skystoje aplinkoje pobūdį. agaro (0,15-0,3%). Pastaruoju atveju tiriamoji kultūra pasėjama dūriu į kasą ir inkubuojama 18-24 valandas. Augimo procese judrios bakterijos migruoja iš įpurškimo linijos, sukeldamos terpės drumstumą, o nejudrios bakterijos auga tik palei injekciją.

Kai kuriais atvejais bus naudojami dažymo metodai, leidžiantys tiesiogiai stebėti žvynelius

Visiems dažymo metodams stikleliai turi būti ruošiami iš jaunų agaro kultūrų (14–20 augimo valandų). 0,5 % vandeninis peptono tirpalas įpilamas į mėgintuvėlius su kultūra ant pasvirusio agaro 30-40 minučių. Skystis nusodinamas, į jį patekusiems mikrobams nusodinti, centrifuguojamas. Nuosėdos užpilamos fiziologiniu tirpalu ir vėl centrifuguojamos. Siekiant išvengti žvynelių praradimo, išplautos nuosėdos resuspenduojamos 10 % formalino tirpale, kad gautųsi šiek tiek drumsta suspensija.

Flagela nudažyta osmo rūgštimi. Ant švaraus nuriebalinto daikto ar laikrodžio stiklo lašelis bakterijų suspensijos sumaišomas su lašeliu 2% osminės rūgšties tirpalo. Gautas mišinio lašas plonu Pasteur pipetės kapiliaru užlašinamas ant švaraus, neriebaus stiklelio. Išdžiovinkite oru ir pritvirtinkite ant liepsnos (venkite perkaitimo!).

Ant fiksuoto preparato (1 ml sočiojo alkoholinio fuksino tirpalo, 10 ml 20 % tanino vandeninio tirpalo ir 5,5 ml sotaus vandeninio amoniako geležies sulfato tirpalo) pilamas per kelias dienas paruoštas kandiklis. Po 15 minučių kandiklis nuplaunamas vandeniu, 4 minutes dažomas fuksinu, nuplaunamas ir mikroskopuojamas.

Žvynelių dažymas sidabru. Iš suspensijos paruošiamas plonas tepinėlis, džiovinamas ir fiksuojamas 2-3 minutes 2% osminės rūgšties tirpalu. Vaistas plaunamas 2-3 s panardinant į 0,5% vandeninį sidabro nitrato tirpalą ir neplaunant panardinamas 2-3 s į marinatą (pirogalolis arba galo rūgštis - 2,0 g, taninas - 1,2 g, natrio acetatas - 4,0 g, distiliuotas vanduo - 150 ml). Išimamas iš kandiklio ir vėl panardinamas į sidabro nitrato tirpalą, palaikomas, kol preparatas pajuoduoja. Po plovimo atliekama mikroskopija.

Žvynelių spalva pagal Plimmerį. Paruošiami dažai: taninas - 5,0 g, cinko chloridas - 5,0 g, aliuminio chloridas - 10,0 g, fuksino milteliai - 0,75 g išvardytų komponentų mėginio sumalami grūstuvėje, palaipsniui įpilant 40 ml 60% etanolio, kol visiškai ištirps. . Prieš naudojimą dažai praskiedžiami vandeniu (1:5).

Ant išdžiovinto plono tepinėlio uždedama filtravimo popieriaus juostelė ir užpildoma paruoštais dažais. Po 2 minučių dažai nuplaunami vandeniu ir papildomai nudažomi Ziehl karbolfuksinu. Bakterijos ir žvyneliai yra raudoni.

Žvynelių spalva pagal Benichetti. Iš anksto paruošiami 3 sprendimai. 1 tirpalas: cinko sulfatas - 0,5 g, taninas - 8,0 g, distiliuotas vanduo - 50 ml. 2 tirpalas: prisotintas kalio alūno tirpalas. 3 tirpalas: sotus gencijonų violetinės arba krištolo violetinės spalvos tirpalas. Prieš naudojimą tirpalai sumaišomi (5:5:3). Tirpalų mišinys pilamas ant išdžiovinto tepinėlio ir kaitinamas, kol pasirodys garai. Nuplaukite po 3 minučių ir mikroskopuokite. Violetinė-juoda vėliavėlė.

Dažymas pagal Valenti. Kaitinamas tepinėlis 3 minutes apdorojamas 20 % tanino tirpalu, išplaunamas, kaitinant 10 minučių dažomas karboliniu fuksinu. Skalbtas, mikroskopinis. Bakterijos ir žvyneliai yra raudoni.

Pilka spalva. A tirpalas: tanino 20% vandeninė rūgštis - 2 ml, prisotintas vandeninis kalio alūno tirpalas - 5 ml, gyvsidabrio chloridas, prisotintas vandeninis tirpalas - 2 ml, bazinis fuksinas 3% 96% etanolyje - 0,4 ml. Dažiklis (rausvai raudonas) pridedamas prie likusių ingredientų prieš pat naudojimą, o jam ištirpus, gautas tirpalas filtruojamas per filtravimo popierių. B tirpalas: Zielio karbolinis fuksinas (bazinis fuksinas 3% 95% etanolyje - 10 ml, fenolis - 5 ml, distiliuotas vanduo - 95 ml).

Metodika. Ant stiklo užlašinamas lašelis bakterijų (suspensijos) formaline ir leidžiama nutekėti. Išdžiuvęs. Uždedama filtravimo popieriaus juostelė ir 4-6 minutes pilamas tirpalas A. Perplaunamas vandeniu ir per filtravimo popierių 3 minutes dažomas tirpalu B. Išplaunamas, išdžiovinamas mikroskopu. Flagella ir bakterijos yra raudonos.

Dažymas pagal Lifeson. Paruoškite 3 tirpalus. 1 tirpalas: 1,5% natrio chlorido tirpalas distiliuotame vandenyje. 2 tirpalas: 3% tanino rūgšties tirpalas distiliuotame vandenyje. 3 tirpalas: acto rūgštis rozanilinas - 0,9 g, druskos rūgštis prozanilinas - 0,3 g, 96% etanolis - 100 ml. 1 ir 2 tirpalai sumaišomi vienodai ir po to 2 tūriai šio mišinio supilami į 1 tūrį tirpalo 3. Mišinys laikomas šaldytuve iki 3 mėnesių.

Metodika. Lašelis srutų užlašinamas ant gerai nuriebalinto stiklo ir leidžiama nuvarvėti. Po džiovinimo ant stiklo pieštuku nubrėžiamos bakterijų plėvelės ribos, plotas užpildomas dažais 7-15 minučių. Laikyti tol, kol dažų paviršius įgaus auksinę spalvą, o bakterijų plėvelė nepasidengs nuosėdomis. Išplauti, išdžiovinti. Bakterijos ir žvyneliai yra raudoni.

Ląstelių sienelių dažymo metodai

Ląstelių sienelių dažymas turi diagnostinę reikšmę atskiriant mikoplazmas nuo bakterijų.

Gutsteino metodas. Vaistas fiksuojamas 1-2 valandas Bouin skystyje, 2-3 minutes palaikomas 5-10% tanino vandeniniame tirpale, nuplaunamas vandeniu ir mikroskopuojamas lašeliu 0,01% krištolo violetinio vandeninio tirpalo.

Peškovo metodas. Vaistas fiksuojamas 15 minučių tokios sudėties skystyje: 90% etanolis - 60 ml, chloroformas - 30 ml, acto esencija - 10 ml. Toliau preparatas 2-5 minutes laikomas 10% vandeniniame tanino tirpale, plaunamas vandeniu, 30-60 sekundžių dažomas Pfeiffer purpurine spalva ir nemaišant džiovinamas ir mikroskopuojamas.

Metodas) Robinow. Tiriamas mikroorganizmas auginamas ant agaro terpės Petri lėkštelėje, išpjaunamas agaro blokas ir jo paviršiumi dedamas ant dengiamojo stiklelio, per naktį dedamas į Bouin skystį. Kitą dieną agaras pašalinamas, stiklinė 20-30 minučių dedama puse žemyn ant 5-10% vandeninio tanino rūgšties tirpalo paviršiaus. Tada preparatas nuplaunamas vandeniu, ant 0,02% krištolo violetinio vandeninio tirpalo paviršiaus 5-10 sekundžių uždedamas dengiantis stiklas su bakterijų ląstelėmis. Dėl to ląstelių membranos ir pertvaros nusidažo tamsiai mėlyna arba juoda spalva, o citoplazma lieka nenuspalvinta.

Citoplazminių intarpų dažymo metodai

Identifikuojant mikroorganizmus, ypač svarbūs duomenys apie inkliuzų buvimą ląstelėse, atspindintys konstruktyvaus metabolizmo tipą ir kryptį. Citoplazminiai intarpai apima poli-β-hidroksisviesto rūgštį, metachromatino (volutino) grūdelius ir polisacharidus.

Poli-β-hidroksisviesto rūgštis yra beta-hidroksisviesto rūgšties poliesteris, kuris kaupiasi ląstelių citoplazmoje apvalių arba ovalių 200-800 nm dydžio granulių pavidalu. Metachromatinas yra polifosfatai, o polisacharidai yra iki 200 nm dydžio gliukanai, susidedantys iš D-gliukozės. Išvardyti intarpai veikia kaip savotiškos ląstelių medžiagų atsargos ir gali būti aptikti specialiais dažymo metodais.

Poli-beta-hidroksisviesto rūgšties aptikimas

Virš degiklio liepsnos pritvirtintas tepinėlis 5-15 minučių nudažomas 0,3 % Sudano juodojo B tirpalu etilenglikole. Dažai nusausinami ir, išdžiūvus ore, neplaunant vandeniu, nuplaunami ksilene. Tepinėliui išdžiūvus, jis 5-10 sekundžių nuleidžiamas į 0,5 % vandeninį safranino tirpalą. Nuplauti vandeniu, išdžiovinti ir mikroskopuoti. Poli-β-hidroksisviesto rūgšties intarpai matomi rausvame citoplazmos fone kaip juodai mėlyni dariniai.

Metachromatino (volutino) aptikimas

Neisserio metodas. Paruoškite 4 tirpalus. A tirpalas: metileno mėlynasis - 0,1 g, 95% etanolis - 2 ml, ledinė acto rūgštis - 6 ml, distiliuotas vanduo - 100 ml. B tirpalas: krištolinis violetinis - 1 g, 95% etanolis - 100 ml, distiliuotas vanduo - 300 ml. B tirpalas kristalinis jodas - 1 g, kalio jodidas - 2,0 g, distiliuotas vanduo - 300 ml. D tirpalas: chrizoidinas - 1 g, distiliuotas vanduo - 300 ml (chrizoidinas ištirpinamas karštame vandenyje). A ir B tirpalų mišinys santykiu 2:1 pilamas ant tepinėlio, fiksuoto ant degiklio liepsnos 1 min. (mišinys ruošiamas prieš dažymą). Dažai nusausinami, 1 min apdorojami B tirpalu (Lugolio tirpalu) ir nuplaunami vandeniu, džiovinami mikroskopu. Bakterijų ląstelės yra šviesiai geltonos, volutino grūdeliai yra tamsiai mėlyni.

Ruskino metodas. Paruoškite šios sudėties dažus: Tsilya karbolinis fuksinas - 4 ml, prisotintas alkoholio tirpalas metileno mėlyna- 4 ml, ledinė acto rūgštis - 5 ml, etanolis 96% - 95 ml, distiliuotas vanduo - 92 ml. Dažai užpilami ant tepinėlio, pritvirtinto virš degiklio liepsnos, kaitinami virš degiklio, kol sudegs alkoholis, nuplaunami vandeniu, išdžiovinami ir mikroskopuojami. Bakterijų ląstelės nusidažo šviesiai raudonai, volutino grūdeliai nudažomi juodai ir mėlynai.

Polisacharidų aptikimas

Dažytas Schiff reagentu. Paruoškite 4 tirpalus. A tirpalas (periodato tirpalas): 4% jodo rūgšties tirpalas 20 ml, 0,2 M vandeninis natrio acetato tirpalas 10 ml, 96% etanolis 70 ml. Tirpalas jautrus šviesai, todėl jį reikia laikyti tamsiame buteliuke tamsoje.

Atskirkite paprastus ir sudėtingus dažymo būdus.

Paprasti dažymo būdai vadinamas išankstiniu dažymu

paraty bet kokius dažus. Kai kurie mikroorganizmai (spirochetai), kuriuos sunku aptikti naudojant teigiamas dėmes, lengvai aptinkami, kai dažomi neigiamomis dėmėmis.

Virimo technika narkotikų yra taip. Fiksuotas preparatas dedamas ant lygiagrečių stiklinių lentjuosčių (tilto), esančių virš kiuvetės. Ant tepinėlio lašintuvu užtepamas 1 % vandeninis fuksino arba metileno mėlynojo tirpalas 1-2 minutes. Įsitikinkite, kad dažymo metu dažų tirpalas neišdžiūtų. Užbaigus dažymą, dažai nusausinami. Vaistas plaunamas vandeniu, kol tekantis vanduo tampa bespalvis. Tada vaistas džiovinamas. Norėdami tai padaryti, apatinė preparato pusė nuvaloma filtravimo popieriumi, o viršutinė pusė atsargiai išdžiovinama iš šonų, neliečiant tepinėlio. Vaistas galiausiai išdžiovinamas ore arba aukštai virš alkoholio lempos liepsnos. Norint gauti daugiau grynų preparatų, dažai tepami ant tepinėlio, padengto filtravimo popieriumi. Dažymo metodas Sineva modifikacijoje leidžia vietoj dažų tirpalo naudoti iš anksto juo impregnuotą filtravimo popierių. Teisingai nudažytame ir gerai išplautame preparate regėjimo laukas yra ryškus ir švarus, nudažytos tik ląstelės. Mikroskopiniai preparatai su panardinimo sistema.

At kompleksiniai (diferencijuojantys) metodai to paties preparato dažymui įtakos turi kelios dažančios medžiagos, iš kurių viena vadinama pagrindine, kitos – papildomos. Be dažiklių, naudojamos įvairios balinimo medžiagos: alkoholiai, rūgštys, acetonas ir kt. Taikant sudėtingus dažymo metodus, atskleidžiamos mikroorganizmų ląstelių citologinės ypatybės (ląstelinės struktūros, inkliuzai ir kt.).

Gramo dėmė yra universaliausias iš sudėtingų dažymo būdų. Dažymas yra bakterijų diferenciacijos pagrindas ir atspindi ląstelių gebėjimą suvokti ir išlaikyti ląstelėje esantį gencijoninės violetinės ir jodo spalvinį kompleksą arba jį prarasti po gydymo alkoholiu. Atitinkamai, gramteigiamas ( bacila, Clostridium, Stafilokokas, Streptokokas, Laktobacilos, Sarcina, ir tt.) ir gramneigiamas (Escherichia, Pseudomonas, Ervinija, Neisseria, Riketsija, ir tt.) formų.

Norint gauti patikimus rezultatus, reikia paruošti gramų dažymo tepinėlius iš jaunų, aktyviai augančių (dažniausiai vienos dienos) kultūrų, nes senų kultūrų ląstelės kartais sukelia nestabilią Gramo reakciją. Gramneigiamos bakterijos gali pasirodyti kaip gramteigiamos, jei bakterijų plėvelė (tepinėlis) yra per stora ir alkoholio spalva nėra visiškai pakitusi. Gramteigiamos bakterijos gali pasirodyti kaip gramneigiamos, jei tepinėlis pakeičiamas alkoholiu.

Metodo esmė . Gramteigiamų mikroorganizmų ląstelės citoplazmos paviršiuje yra baltymų ir magnio ribonukleato kompleksas, kurio nėra gramneigiamose bakterijose. Gramteigiamų ląstelių paviršiuje nudažant gramais susidaro stiprus baltymų, magnio ribonukleato, gencijonų violetinės ir jodo kompleksas, kurio nesunaikina alkoholiu. Tokios bakterijos lieka mėlynos spalvos. violetinė. Gramneigiamos bakterijos nesugeba sulaikyti dažų ir pakisti spalvos, kai jos yra apdorojamos alkoholiu. Norint juos identifikuoti, preparatas nudažomas fuksinu. Gramneigiamos bakterijos nusidažo raudonai.

Diferencijuoto gramo dažymo etapai:

Fiksuotas tepinėlis padengiamas filtravimo popieriaus gabalėliu (1,5 x 1,5 cm) ir ant jo užtepamas gencijoninės violetinės arba krištolinės violetinės karbolinis tirpalas, kol jis visiškai sušlaps (dažniau naudojama Sinev modifikacija). Dažymas atliekamas 1-2 minutes.

Popierius nuimamas, dažai nusausinami ir, preparato neplaunant vandeniu, Lugolio tirpalas tepamas ant preparato 1-2 minutes, kol tepinėlis pajuoduoja.

Lugolio tirpalas nusausinamas, nudažytas tepinėlis nuspalvinamas 96º etilo alkoholiu. Norėdami tai padaryti, vaistas 2–3 kartus dedamas į stiklinę su alkoholiu, kol nustos išeiti purpurinės srovelės (spalvos pakitimo laikas ne ilgesnis kaip 30 s), arba ant tepinėlio užpilama 2–4 ​​lašai alkoholio 30–30 45 s.

Vaistas greitai nuplaunamas vandeniu (kaip aprašyta aukščiau).

Tepinėlis papildomai 1-2 minutes dažomas vandeniniu fuksino (Pfeiffer's fuksino) tirpalu.

Dažai nusausinami, preparatas nuplaunamas vandeniu, išdžiovinamas filtravimo popieriumi.

mikroskopu su panardinimo sistema.

Gramteigiamos bakterijos nusidažo purpurine spalva, gramneigiamos rožine spalva.

Nukleoidas. Sunku aptikti nukleoidą bakterijos ląstelėje naudojant šviesos mikroskopą. Selektyviam nukleoidų dažymui fiksuotos ląstelės iš anksto apdorojamos ribonukleaze arba praskiesta druskos rūgštimi, kad suskaidytų ribosomų RNR. Vėlesnis dažymas pagrindiniu dažikliu leidžia atskleisti nukleoidą tankių kūnų pavidalu su netaisyklingais kontūrais, esančiais ląstelės centre arba poliuose.

Ziehl-Neelsen rūgštims atsparių bakterijų dažymas atspindi mikobakterijų ir nokardijos ypatybes.

Metodo principas. Šių bakterijų atsparumas rūgštims yra susijęs su didelis kiekis lipidai ląstelės sienelėje. Rūgštims atsparios bakterijos nusidažo Ziehl karboliniu fuksinu preparatą kaitinant raudonai ir išlaiko šią spalvą po balinimo sieros rūgštimi. Neatsparios rūgštims bakterijos nuspalvinamos rūgštimi ir vėliau nudažomos mėlynai metileno mėlynu.

Dėl kapsulių aptikimas naudojant įvairius metodus, įskaitant Burri metodas ir Burri Guinsa . Metodas pagrįstas neigiamu kontrastu. Kadangi mikrobinės ląstelės kapsulė ar korpusas dažų nesuvokia, rašalu nudažomas tik mikropreparato fonas. Tamsiame rašalo dėmių fone kapsulė matoma kaip nesutepta vieta. Pagal Burri-Gins metodą mikrobų ląstelių kūnai papildomai nudažomi raudonai fuksinu.

Dėl žvynelių dažymas Buvo pasiūlyti keli metodai, kurių bendras etapas yra preparato ėsdinimas (dažniausiai tanino, KAl(SO 4) 2, HgCl 2 tirpalais) ir vėlesnis dažymas (dažnai karboliniu fuksino tirpalu). Dėl to dažai nusėda ant žvynelių, dėl kurių tuo pačiu metu padidėja jų storis ir sumažėja skaidrumas. Vienas iš siūlomų žvynelių dažymo būdų yra Leifsono metodas. Preparatas mikroskopuojamas panardinimo sistema. Bakterijų ląstelės parausta, žievės įgauna storų gijų, besitęsiančių iš ląstelės, pavidalą.

Klausimai savikontrolei

1 Išvardykite pagrindinius mikroorganizmų morfologinius ląstelių tipus.

2 Apibūdinkite bakterinės ląstelės scheminę struktūrą.

3 Išvardykite fiksuotų mikroorganizmų preparatų ruošimo etapus, apibūdinkite juos.

5 Klasifikuokite mikrobiologijoje naudojamus dažus, apibūdinkite juos.

4 praktika

Tikslas: supažindinimas su fiksuotų preparatų paruošimo būdais, paprastais ir sudėtingais dažymo būdais; susipažinimas su įvairių mikroorganizmų morfologija ir citologija.

Medžiagos ir įranga: biologiniai mikroskopai, mikroskopo stikleliai ir dengiamieji stikleliai, spiritinės lempos, bakterijų kilpos, panardinamasis aliejus, sterilios pipetės, pincetai, filtravimo popierius, degtukai, higieniniai vatos tamponai, žymekliai, sterilios Petri lėkštelės, kiekvienai grupei – 50 ml kolboje sterilus vandentiekio vanduo, distiliuotas vanduo plovimams, poveržlėms, kiuvetėms, tiltams, paruoštų dažų tirpalų rinkinys stove, spiritas 96 0, pipetės, užpilai iš natūralių medžiagų: mėsos, žirnių ir kt.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="(!LANG:> BŪDŲ PARUOŠIMO TECHNIKA. DAŽYMO METODAI.">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="(!LANG:> Sauga mikrobiologijos kabinete (laboratorijoje) Taisyklės"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="(!LANG:> Darbo su gyva kultūra taisyklės. 1. Svarbiausia, kai sėti gyvą kultūrą – tai yra"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="(!LANG:> Akinių paruošimo ir laikymo taisyklės (tema, dangteliai) Tema ir viršeliai"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="(!LANG:> išsaugoti"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в !} šarminis tirpalas stiklinės nuplaunamos tekančiu vandeniu iš čiaupo, 10-15 minučių panardinamos į 5-10% druskos rūgšties tirpalą ir po to nuplaunamos tekančiu vandeniu. Panaudoti stikleliai ir dengiamieji stikleliai, užtepti dažais ir imersine alyva, apdorojami taip: 2 valandoms panardinami į koncentruotą. sieros rūgšties arba chromo mišiniu, po to kruopščiai nuplaunamas tekančiu vandeniu iš čiaupo; užpilkite 5% natrio bikarbonato arba šarmo (kaustinio kalio arba kaustinės sodos) tirpalu, uždėkite ant silpnos ugnies ir virkite 30-40

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="(!LANG:> PARUOŠIMO ŽINGSNIAI. 1. 2. Sriegimo paruošimas 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="(!LANG:> Karbolinių dažų gaminimo receptai"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="(!LANG:>"> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В !} kairiarankis paimkite mėgintuvėlį su steriliu fiziniu tirpalu (distiliuotu vandeniu) ir padėkite jį tarp 1 ir 2 pirštų taip, kad delnas būtų po mėgintuvėliu, o mėgintuvėlio kaklelis būtų nukreiptas į alkoholio lempos zoną. Bakterinė kilpa dešinėje, kaip pieštukas. Kilpa flambiruojama iki raudonumo, pirmiausia horizontaliai, paskui vertikaliai. Atleidžiamos kilpos, mažasis pirštas dešinė ranka paspauskite kamštį fizinis. tirpalo ant delno ir atsargiai išimkite jį iš mėgintuvėlio. Judesiai turi būti sklandūs. Mėgintuvėlio gerklė deginama liepsnoje ir įkišama kilpa.Jie imami su fizine išleidimo kilpa. tirpalo ir užlašinkite porą lašų ant stiklo tepinėlio ribose. Uždarykite kamštelį, prieš tai per spiritinės lempos liepsną perleidę kamštį ir mėgintuvėlio kaklelį tuo pačiu metu Įdėkite mėgintuvėlį į trikojį.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="(!LANG:> Paimkite kultūros mėgintuvėlį į kairę ranką ir padėkite kaip vamzdis"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="(!LANG:>"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt="(!LANG:>Tepinėlio paruošimo schema">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="(!LANG:> Tvirtinimo tipai q Fizinis - alkoholio lempos liepsnoje q Cheminė medžiaga"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="(!LANG:> Dažymo metodai: paprastas kompleksas (Gram, Ziehl-Niel , Buri-Gins).">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="(!LANG:> PAPRASTI METODAI DAŽYTI Anilicino, spalvingų TEPILIŲ"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt="(!LANG:> Naudojant paprastą dažymo metodą, keli lašai bet kokio alkoholio arba vandens"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt="(!LANG:>Naudojant paprastą dažymą, mikrobų kūnai suvokia užteptų dažų spalvą taip intensyviai kaip ir kaip"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из !} grynoji kultūra) yra nudažyti ta pačia spalva, bet kiek blankesne. Purpurinė ir gencijoninė violetinė yra intensyviau dažantys dažai; metileno mėlynos dėmės daug blankesnės. Spalvos suvokimas priklauso ne tik nuo spalvų savybių, bet ir nuo dažomų mikrobų savybių. Dauguma mikrobų lengvai ir greitai nusidažo vandeniu arba alkoholio-vandens dažų tirpalais. Kad padidėtų dažymas, dažai veikiami aukštoje temperatūroje (kaitinami), kol atsiranda garų (iki virimo). Keičiant kaitinimo laipsnį, galima išgauti skirtingus spalvos stiprumo laipsnius. Pailginus spalvinimo tirpalo ekspozicijos laiką iki objekto, taip pat galima tam tikru mastu padidinti spalvos laipsnį.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="(!LANG:> KOMPLEKSINIAI dažymo metodai, pagrįsti fizikinės cheminės struktūros ypatumais mikrobų ląstelė.Šių metodų esmė"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="(!LANG:> GRAMOS METODAS v Užtepkite gencijono violetinę spalvą ant fiksuoto tampono"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt="(!LANG:>Bakterijų ir Gramo dėmių santykį lemia jų gebėjimas išlaikyti suformuotą"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="(!LANG:> GRAMINIAI IR GRAMTEIGIAI"> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt="(!LANG:>Streptococci Gr+ Cocci staccoccaliscocco pilocogenesus Streppo Strepto"> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="(!LANG:> Vibrio Gr- Vibrio cholerae"> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="(!LANG:> PLAUČIŲ TUBERKULIOSOPIJOS MEDŽIAGOS DIAGNOSTIKA"> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt="(!LANG:>DAVYMAS a) Uždenkite tepinėlį filtravimo popieriumi ir užtepkite ant viso popieriaus karbolinio fuksino paviršiaus"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="(!LANG:> ZIEHL-NIELSEN METODAS (INSTRUKCIJA 1999 m.)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="(!LANG:> ZIEHL-NIELSEN METODAS"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="(!LANG:> KAPSULIŲ NUSTATYMAS BAKTERIJOSE Kai kurie mikrobai"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="(!LANG:>"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt="(!LANG:>BURRI IR BURRI-GINS dėmių kapsulė nuo klebsi pneumonijos">!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="(!LANG:>"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="(!LANG:> OZZHZKO DĖMĖ Ant išdžiūvusio tepinėlio (nefiksuota!) +"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="(!LANG:> Mikroorganizmų judrumo tyrimas."> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="(!LANG:> SUTRAUKTO LAŠO METODAS Lašas užlašinamas ant stiklelio pipete arba kilpa"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="(!LANG:> Vėliavos būna įvairaus ilgio. Jų skersmuo toks mažas, kad jos yra nematomi"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt="(!LANG:>Bakterijų judrumo nustatymas "kabančio lašo" metodu. Young lašas (18 -20 val.) sultinio"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые!}

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="(!LANG:> KABANČIOJO KRAIŠO METODAS"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля!}

Mes gyvename bakterijų pasaulyje. Jie yra aplink mus ir mūsų kūno viduje. Nenuostabu, kad norime apie juos sužinoti kuo daugiau. Bet kaip apsvarstyti ir juo labiau ištirti kažką tokio mažo? Atrodytų, mikroskopas turėtų išspręsti šią problemą. Tačiau ne viskas taip paprasta – natūralioje būsenoje mikroorganizmai yra skaidrūs kaip stiklas. Įvairūs bakterijų dažymo būdai padeda „parodyti“ vaizdą, padeda ištirti išorinę ir vidinę mikrobų struktūrą.

Devynioliktojo amžiaus pabaigoje danų biologas Christianas Gramas pasiūlė šios problemos sprendimą. Jei kažkas nematoma, tai reikia nudažyti ir pažiūrėti, kas atsitiks. Gramo pasiūlytas bakterijų dažymo būdas buvo toks įtikinamas, kad iki šiol mikroorganizmai skirstomi į gramteigiamus (išlaiko spalvą) ir gramneigiamus (pakeitus spalvą po apdorojimo alkoholiu).

Kaip paaiškėjo, ląstelės yra padengtos membrana, panašia į susipynusius siūlus. Ir nors ląstelei reikalingos maistinės medžiagos laisvai patenka į tarpus tarp siūlų, apvalkalas patikimai apsaugo „vidinį pasaulį“ nuo išorinių agresyvių veiksnių. Skirtingų tipų bakterijų išorinė ląstelės sienelė yra skirtingo storio, tankio ir cheminė sudėtis. Būtent šia ląstelių membranų savybe yra pagrįstas Gramo dažymo metodas.

Remdamiesi Christiano Gramo darbais, biologai sukūrė naujus metodus, kurie leidžia ne tik nustatyti ląstelių formą ir dydį, bet ir atsižvelgti į kai kurias jų struktūros detales. Kartais visiškai identiški mikroorganizmai į dažus reaguoja skirtingai. Gauta informacija leidžia greitai ir tiksliai nustatyti bakterijų tipą.

Senas nereiškia blogas

Bene praktiškiausias ir plačiausiai naudojamas mikroorganizmų dažymo metodas yra Gramo metodas. Ugnies fiksuotas tepinėlis padengiamas metilo violetiniais dažais, fiksuojamas jodu, išdžiovinamas ir nuplaunamas spiritu. Šiame etape, priklausomai nuo ląstelės membranos savybių, bakterijos tampa:

• ryškiai mėlyna (gramteigiama);
• bespalvis (gramneigiamas).

Ląstelių, kurios lieka bespalvės, apvalkalo storis neleidžia dažams prasiskverbti į vidų, be to, jis lengvai nuplaunamas nuo bakterijų paviršiaus. Paskutinis Gramo dažymo etapas yra raudonų dažų naudojimas, kuris lieka ant ląstelės membranos paviršiaus ir suteikia jai rausvą arba raudoną atspalvį.

Gramteigiamos bakterijos paprastai yra pavojingos žmonėms. Šiai kategorijai priklauso streptokokai, stafilokokai, bacilos, klostridijos ir tt Gramneigiamos nėra tokios pavojingos. Jie taip pat gali sukelti ligas ir uždegimus, tačiau tik tam tikromis sąlygomis. Taigi, tiesiog paruošus spalvotą preparatą, galima susidaryti supratimą apie tiriamų mikroorganizmų pavojingumo laipsnį.

Svarbūs dažymo būdai

Pagal tiriamų organizmų būklę mikrobiologijoje yra:

• gyvybiškai svarbus metodas, t.y. darbas su gyvomis bakterijomis (pavojinga, reikalauja griežtai laikytis saugos priemonių);
• postvitalinis metodas – darbas su fiksuotomis (žuvusiomis) ląstelėmis;
• neigiamas, gali būti gyvybiškai svarbus ir po gyvybinės, patogus dirbant su kapsulėmis.

Gyvybiškai svarbus metodas yra pats pavojingiausias, nes mokslininkams tenka susidurti su gyvomis ląstelėmis, kartais mirtinomis. Tačiau būtent šis metodas leidžia ištirti ne tik ląstelės sandarą, bet ir visą jos gyvavimo ciklą bei sąveiką su aplinka.

Daugeliui mikrobiologinių tyrimų svarbu išlaikyti bakterijas gyvas. Tai reiškia, kad būtina naudoti specialius netoksiškus arba mažai toksiškus dažus, kurie, be to, per išorinį apvalkalą lengvai prasiskverbia į ląstelės struktūrą. Tai yra vadinamieji gyvybiškai svarbūs dažai, jie gali būti skirti matoma šviesa arba fluorescencinis. Pagal cheminę sudėtį dažai skirstomi į:

• bazinis (akridino oranžinis, metileno mėlynasis);
• rūgštis arba rūgštus (indigokarminas, rūgštus fuksinas);
• neutralus (rodaminas B).

Darbas su fiksuotais vaistais

Pagal darbo sudėtingumą fiksuotų (negyvų) ląstelių dažymo metodai skirstomi į:

1. Paprasti metodai. Šiuo atveju naudojami tik vieni dažai, dažniausiai raudoni (rausvai raudoni) arba mėlyni (metileno mėlyni). Skirtumas tarp šių dažų yra poveikio greitis. Fuchsin duoda rezultatą po 1-2 minučių, o mėlynų dažų rezultato reikia palaukti 3-5 minutes. Taip pat patogu naudoti fuksino tirpalą karbolio rūgštyje (vadinamąjį Zielio fuksiną), nes paruoštas preparatas nepraranda dažančių savybių kelis mėnesius. Metileno mėlynojo dažo taip pat galima paruošti iš anksto stipriame alkoholio tirpale.
2. Kompleksiniai (diferencialiniai) metodai. Tam reikės kelių dažų (mažiausiai dviejų). skirtinga spalva. Tai leis ne tik pamatyti bakterijas, bet ir išsamiau ištirti jų vidinę struktūrą, nes skirtingos ląstelės dalys gali skirtingai suvokti dažus. Sudėtingi yra Gram, Ziehl-Nielsen metodai (rūgštims atsparioms bakterijoms), Benignetti (bakterijų žiuželių dažymas), Gins (kapsulių identifikavimas), Romanovsky-Giemsa diferenciacijos metodas (sporų dažymas) ir kai kurie kiti.

Infekcinėms ligoms diagnozuoti ypač svarbūs kompleksiniai metodai, pavyzdžiui, Neissero dėmių metodas padeda atskirti difterijos bacilą nuo netikros difterijos.

Romanovsky - Giemsa diferencijavimo metodas pagrįstas specialių paruoštų miltelių, kurių pagrindu laboratorijos paruošia norimos koncentracijos dažų tirpalą, naudojimu. Šio metodo privalumas yra tas, kad citoplazma ir ląstelės branduolys įgauna skirtingą spalvą, o tai palengvina mikroorganizmų identifikavimą ir tyrimą.

Neisserio metodas medicinoje naudojamas difterijos sukėlėjų vulutino grūdams (granules, aprūpinančias maistu daugeliui prokariotinių ląstelių) aptikti. Dėl dažymo bakterija įgyja geltona, o volutino granulės yra mėlynos spalvos.

Balta ant juodo

Kitas bakterijų dažymo būdas grindžiamas negatyvo savybėmis, t.y. tamsiame preparato fone aiškiai matomos bespalvės bakterijos, kitaip tariant, dažoma aplinka, o ne pats organizmas.

Kartais bakterijos, patekusios į tam tikras sąlygas, sudaro kapsules. Tai gleivinės dariniai, dengiantys ląstelę, šiek tiek panašūs į gelį. Kapsulės yra skaidrios, jų cheminė sudėtis gali labai skirtis skirtingų tipų bakterijose, t.y. tiesiog dažykite ir įvertinkite rezultatą pagal gautą spalvą, nepavyks.

Be to, kapsulės yra minkštos ir trapios, dažytos gali prarasti formą. Dažikliai blogai sąveikauja su želė panašia kapsulių struktūra ir lengvai išplaunamos apdorojimo metu. Norint aptikti, bet nepažeisti kapsulių, naudingas neigiamo dažymo metodas.

Vienas iš kapsulių aptikimo būdų yra Guinso dažymo metodas. Ant stiklelio krašto užlašinamas juodo rašalo lašas, į jį įpilama tiriamoji medžiaga, išmaišoma ir paskirstoma po visą paviršių. Tepinėlis išdžiovinamas ore, fiksuojamas ir nudažomas Ziehl purpurine spalva. Po 2-3 minučių nuplaukite vandeniu ir išdžiovinkite. Dėl to mikroskopu bendrame tamsiame fone aiškiai matomos rausvos ląstelės, apsuptos skaidriomis kapsulėmis.

Sporas formuojančių bakterijų dažymas

Jei kalbame apie ląstelių membranas, negalime neprisiminti sporas formuojančių bakterijų. Sporos susidaro ląstelei nepalankiomis sąlygomis ir gana ilgai gali egzistuoti agresyvioje aplinkoje. Kas naudinga ląstelei išsaugoti, blogai ją tirti. Sporos labai tankios ir beveik nepralaidžios skysčiams, be to, atsparios rūgštims. Todėl paprastas beicavimas arba Gramo metodas paliks sporas bespalves.

Prieš dažant, būtina chemiškai apdoroti sporų paviršių, kad jis šiek tiek pakeistų savo struktūrą ir leistų dažams prasiskverbti į vidų. Tokiu atveju nudažoma ir visa ląstelės citoplazma. Norint pakeisti citoplazmos spalvą, preparatas nuplaunamas ir išdžiovinamas. Sporose esantys dažai dėl tankesnės sandaros išsilaiko geriau nei citoplazmoje.

Sporų dažymo metodai gali būti skirtingi, pavyzdžiui, Orzeshko arba Ziehl-Nielsen, tačiau jie visi susiję su ta pačia schema:

• sporų paviršiaus atsipalaidavimas chemikalai(rūgštys, amoniakas, kaustinė soda);
• ląstelės dažymas sporomis (dažniausiai kaitinant);
• citoplazmos spalvos pasikeitimas.

Dėl to gauname puikiai matomą ryškiaspalvę sporą ir blyškią, beveik skaidrią citoplazmą.

Kaip ištirti bakterijų žvynelius

Kita sudėtinga užduotis yra bakterijų dažymas žiuželiais. Tai yra spirališkai susukti labai ploni siūlai, kuriuos mikroorganizmai naudoja judėjimui. Žvyneliai yra neįprastai ploni, nusidažę lengvai atsiskiria nuo ląstelės. Todėl prieš dažymą žvyneliai išgraviruojami, dirbtinai padidinant tūrį.

Ruošiant mikroorganizmus tyrimui, bakterijų kultūra keletą dienų subkultūruojama šviežioje maistinėje terpėje. Tada bakterijos su žvyneliais perkeliamos į mėgintuvėlį su steriliu vandeniu (t 37⁰С). Atlikite tai labai atsargiai, nemaišydami skysčio, kad nepažeistumėte žvynelių.

Mėgintuvėlio turinys paliekamas maždaug valandą, kad bakterijos tolygiai pasiskirstytų visame tūryje. Prieš pradedant tyrimą, patikrinamas ląstelių judrumas kabančiame laše. Jei nėra judėjimo, vamzdelis paliekamas dar kurį laiką.

Kai tirpalas užtepamas ant stiklelio, ląstelės gali lengvai prarasti savo žiuželius. Todėl stiklo paviršius turi būti visiškai švarus ir be riebalų. Prieš lašinant tirpalo lašus, ant karštos degiklio liepsnos dalies uždedamas stiklinis stiklelis, kad ant paviršiaus nukritę lašeliai pasklistų ir greitai išdžiūtų.

Po džiovinimo tepinėlis išgraviruojamas, po 15 minučių cheminė medžiaga nuplaunama. Kitas etapas - dažymas fuksinu - atliekamas panardinant stiklą į dažų tirpalą, kad tepant dažus nepažeistumėte žvynelių.

Palaikius tinkamą laiką, tepinėlis nuplaunamas vandeniu ir išdžiovinamas. Dabar galite pereiti prie gauto rezultato tyrimo.

Dažymo technika

Norint gauti spalvotą preparatą, negalima tiesiog paimti teptuko, dažų ir pagauti bakteriją. Yra tam tikra darbo su mikroorganizmais schema:

1. Tepinėlio paruošimas. Lašas vandens užlašinamas ant stiklelio (sterilaus), į kurį bakteriologine kilpa įvedama laboratorinė medžiaga ir paskirstoma po paviršių.
2. Džiovinimas. Skysčio perteklius arba natūraliai išdžiovinamas kambario temperatūroje, arba tepinėlis šiek tiek pašildomas aukštai virš degiklio liepsnos.
3. Fiksavimas. Neužtenka tik pašalinti vandenį, reikia pataisyti bakterijas ant stiklelio. Norėdami tai padaryti, galite naudoti ugnį (kelis leidimus per karščiausią liepsnos vietą) arba skystį (alkoholį, acetoną). Po tokio apdorojimo mikroorganizmai greičiau sugeria dažus.
4. Tiesioginis dažymas. Dažai turi visiškai padengti visą tepinėlio paviršių. Išlaikius reikiamą laiką (kiekvienam dažui savo), dažai nuvalomi ir preparatas nuplaunamas vandeniu.

Po džiovinimo (dažniausiai natūraliai) rezultatas gali būti naudojamas pagal paskirtį.

Mikroorganizmų dažymas yra visa metodų, metodų, schemų sistema, skirta aptikti ir atpažinti ląsteles naudojant mikroskopą. Jokių medicininių tyrimų ar mokslinis darbas mikrobiologijoje jie neapsieina be išankstinio tiriamos medžiagos paruošimo ir spalvinimo.

Mikroorganizmų dažymas (mikrobų dažymas) yra metodų ir metodų rinkinys išoriniam ir. vidinė struktūra mikroorganizmai, mikrobiologinės technologijos metodas, leidžiantis atskirti mikroorganizmų rūšis. Metodas plačiai taikomas taikomojoje bakteriologijoje nustatant mikrobų formą, dydį, struktūrą, lokalizaciją, santykinę padėtį, jų organelių struktūrą. Be dažymo, mikrobai, išskyrus kai kuriuos grybus, dėl mažo kontrasto šviesos mikroskopu praktiškai nematomi. Po apdorojimo mikrobų membranos ir (arba) organelės įgauna spalvą, kontrastuojančią su fonu.

// Bendra informacija apie metodą

Mikrobų preparatai veikiami cheminiais reagentais, dažniausiai dažais arba osmio tetroksidu. Dėl fizikinio ir cheminio dažiklio sąveikos proceso su cheminiai junginiai objektus, norint dirbtinai suteikti jam tam tikrą spalvą, tampa įmanoma nustatyti mikroorganizmo tipą arba bent jau jo membranos tipą (žr. Gramo dėmė).

Dažymo būdai skirstomi į gyvybinius, povitalinius ir neigiamus, pastarieji gali būti gyvybiniai ir povitaliniai.

Gyvybinis dažymo metodas

Gyvybiniam (gyvybiniam) dažymui naudojami 0,2-0,001 % vandeniniai metileno ir toluoidino mėlynojo, neutraliojo ir Kongo raudonojo tirpalai, kurie dedami į spaudžiamą arba pakabinamą kultūros lašą. Šiuo metodu atskleidžiamos spirochetos, pirmuonys, nustatomas bakterijų mobilumas, imuninis kapsulės pabrinkimas, tačiau naudojant jį reikia griežtai laikytis taisyklių, neleidžiančių laboratorinei infekcijai.

Postvitalinio dažymo metodai

Fiksuotų preparatų dažymo metodai (post-vitaliniai) skirstomi į paprastus ir sudėtingus. Paprastais metodais ant fiksuoto preparato užtepami Pfeiffer fuksino (ekspozicija 1-2 min.), šarminio metileno mėlynojo (3-5 min.) dažymo tirpalai, kad jis visiškai padengtų tepinėlį, dažai nusausinami, preparatas nuplaunamas vandens srove, suplakama, išdžiovinta ir mikroskopuota .
Paprasti būdai leidžia spręsti apie atskirų ląstelių dydį, formą, lokalizaciją, tarpusavio išsidėstymą, tačiau jų pagalba neįmanoma nustatyti mikrobų struktūros ir dažnai jų diferencijuoto santykio su dažikliais.
Iš sudėtingų bakterijų dažymo metodų diferencijuotas Gramo metodas, atsparumo rūgštims nustatymas pagal Ziehl-Nelson, volutino grūdelių nustatymas pagal Leffler arba Neisser, diferencijavimo metodas Romanovsky-Giemsa, neigiamas teigiamas nustatymo metodas. kapsulė pagal Gins-Burri, sporų aptikimas pagal Peshkov arba Ziel - Nelson ir kt.
Pirmuonių dažymui naudojamas Romanovskio-Giemsa metodas ir dažymas hematoksilinu-eozinu.
Grybai tiriami nedažyti arba Gramo, Ziel-Nelson, Leffler, Romanovsky-Giemsa metodais, taip pat Lugolio tirpalu, laktofuksinu ir kt.

Gramo metodas – mikroorganizmų dažymo tyrimams metodas, leidžiantis diferencijuoti bakterijas pagal jų ląstelės sienelės biochemines savybes. 1884 m. pasiūlė danų gydytojas G. K. Gramas.

Anot Gramo, bakterijos nudažomos pagrindiniais dažais – gencijonu ar metilo violetiniu ir pan., vėliau dažai fiksuojami jodo tirpalu. Vėliau nuplaunant nudažytą preparatą alkoholiu, tos bakterijų rūšys, kurios pasirodo stipriai nudažytos, vadinamos gramteigiamosiomis bakterijomis – priešingai nei gramneigiamos (Gram (-)), kurios plaunant nusidažo.

// Naudojimas diagnostikoje

Gramo dėmės turi didelę reikšmę bakterijų taksonomijoje, taip pat mikrobiologinei infekcinių ligų diagnostikai.

Gramteigiamos kokos ir sporinės bakterijų formos, taip pat mielės, nudažytos mėlyna-juoda (tamsiai mėlyna) spalva.

Daugelis sporų neturinčių bakterijų yra gramneigiamos, jos nusidažo raudonai, ląstelių branduoliai tampa ryškiai raudoni, citoplazma tampa rausva arba tamsiai raudona.

Dažymo technika

Gramo dažymas reiškia sudėtingą dažymo būdą, kai tepinėlis yra veikiamas dviem dažais, iš kurių vienas yra pagrindinis, o kitas yra papildomas. Be dažiklių, sudėtingiems dažymo metodams naudojamos balinimo medžiagos: alkoholis, rūgštys ir kt.

Gramo dažymui dažniausiai naudojami trifenilmetano grupės dažai: gencijonas, metilo violetinis arba krištolo violetinis. Gramteigiami Gram (+) mikroorganizmai suteikia tvirtą ryšį su nurodytais dažais ir jodu. Tuo pačiu metu jie nepakeičia spalvos, kai yra veikiami alkoholio, todėl, papildomai dažant fuksino gramu (+), mikroorganizmai nepakeičia iš pradžių pasirinktos violetinės spalvos.

Gramneigiami gram (-) mikroorganizmai sudaro junginį, kurį lengvai sunaikina alkoholis su pagrindiniais dažais ir jodu. Dėl to mikrobai pakinta spalva, o vėliau nusidažo rausvai raudona spalva.

Medžiagos paruošimas dažymui

Bandomoji medžiaga plonu sluoksniu paskirstoma ant gerai nuriebalinto stiklelio paviršiaus. Paruoštas tepinėlis džiovinamas ore ir fiksuojamas visiškai išdžiūvus. Histologiniai pjūviai ruošiami įprastine technika, fiksuojant audinių gabalus formalinu ir įterpiant į parafiną.

Fiksavimas

Fiksuojant tepinėlis fiksuojamas ant stiklelio paviršiaus, todėl vėlesnio preparato dažymo metu mikrobų ląstelės nenuplaunamos. Be to, nužudytos mikrobų ląstelės dažosi geriau nei gyvos.

Skiriamas fizinis fiksavimo metodas, pagrįstas aukštos temperatūros poveikiu mikrobų ląstelei, ir cheminiai metodai, kurių metu naudojamos cheminės medžiagos, sukeliančios citoplazmos baltymų koaguliaciją.

Fizinis tvirtinimo būdas

Stiklinė stiklelė su preparatu paimama pincetu arba I ir II dešinės rankos pirštais už šonkaulių tepinėliu į viršų ir sklandžiu judesiu 2-3 kartus perkeliama virš viršutinės degiklio liepsnos dalies. Visas fiksavimo procesas turi trukti ne ilgiau kaip 2 s.

Tvirtinimo patikimumas tikrinamas tokiu būdu: ant užpakalinio kairės rankos paviršiaus užtepamas stiklo stiklelio paviršius, kuriame nėra tepinėlio. Tinkamai užfiksavus tepinėlį, stiklas turi būti karštas, bet nesukelti nudegimo pojūčio.

Cheminis metodasįsipareigoja

Tepinėliams tvirtinti metilo alkoholis, acetonas, Nikiforovo mišinys (etilo alkoholio 96% ir anestezijos eterio mišinys santykiu 1:1), Carnoy skystis (etilo alkoholis 96% - 60%, chloroformas 30%, ledinis acto rūgštis 10%), alkoholis -formolis (40% formalinas 5 ml, etilo alkoholis 96 ° - 95 ml). Objektinis stiklelis su išdžiovintu tepinėliu panardinamas į buteliuką su fiksavimo priemone 10-15 minučių ir džiovinamas ore. Taip pat naudojamas kelių sekundžių fiksavimas 40% formalino garuose.

Dažymo procesas

Vienas iš pagrindinių dažų užpilamas ant fiksuoto tepinėlio 2-3 minutes. Kad nesusidarytų nuosėdų, dažykite per filtravimo popierių.

Nusausinkite dažus, atsargiai nuimkite filtravimo popierių. Tepinėlis pilamas Lugolio arba Gramo jodido tirpalu (vandeninis kalio jodido ir kristalinio jodo tirpalas santykiu 2:1) 1-2 minutes, kol preparatas pajuoduoja.

Tirpalas nupilamas, tepinėlis išskalaujamas 96° etilo alkoholiu arba acetonu, pilant ir nusausinant, kol tepinėlis pasikeičia, o tekantis skystis tampa skaidrus (apie 20-40-60 sekundžių).

Kruopščiai nuplaukite stiklelius tekančiu arba distiliuotu vandeniu 1-2 minutes.

Norint nustatyti gramneigiamą bakterijų grupę, preparatai papildomai dažomi fuksinu arba safraninu (2-5 min.).

Nuplaukite tekančiu vandeniu ir nusausinkite filtravimo popieriumi.

Bakterijų dažymo histologiniuose pjūviuose technika pagal Gram-Weigert

Deparafinuotos sekcijos patenka į vandenį.

Dažyta 20 minučių 1 % pararosanilino arba bazinio fuksino 1 % tirpale acto rūgštis(dažų tirpalas kaitinamas iki virimo, atšaldomas ir filtruojamas).

Skalbiamas 3 kartus pakeitus distiliuotą vandenį.

Dažykite 5 minutes 1% krištolinio violetinio tirpalo distiliuotame vandenyje.

Greitai nuplaukite 1% natrio chlorido tirpalu.

Apdorojama 30 sekundžių mišinyje: 1 dalis jodo + 2 dalys kalio jodido + 100 dalių distiliuoto vandens.

Sudrėkinkite filtravimo popieriumi.

Atskirkite, tepdami mišinį ant pjūvio vienodos apimties anilino ir ksileno (1 - 2 ml); tirpalai nusausinami tol, kol dažų debesys nustoja tolti nuo pjūvio.

Pereikite per 3 ksileno pamainas

Uždengtas balzame arba bet kokia derva, ištirpinta ksilene.

Rezultatas: gramteigiamos bakterijos yra mėlynai juodos, fibrinas yra violetinės spalvos, branduoliai yra raudoni.

Bakterijų endosporoms dažyti naudojamas Peškovo metodas.

Dažymo technika

Išdžiovintas preparatas iš gramteigiamų bakterijų kultūros 15 minučių fiksuojamas Carnoy skystyje, po to plaunamas vandeniu, pilamas metileno mėlynasis pagal Lefflerį ir kaitinamas, kol atsiras garų, virinamas 15-20 min., atvėsus preparatas išplauti ir nudažyti 0,5 % vandeniniu neutralios raudonos arba purpurinės spalvos tirpalu pagal Pfeifer 30-60 sekundžių. Išdžiovinkite filtravimo popieriumi ir mikroskopu.

Dažymo rezultatas

Dėl to subrendusios endosporos nusidažo mėlynai, jaunos – tamsiai mėlynai, citoplazma – raudona, o chromatino grūdeliai nusidažo purpurine spalva.

Ziehl-Nelsen dažymo metodas – tai mikroorganizmų dažymo metodas, skirtas aptikti rūgštims atsparias mikobakterijas (tuberkuliozės, mikobakteriozės, raupsų sukėlėjus), aktinomicetus ir kitus rūgštims atsparius mikroorganizmus. Mikroorganizmų atsparumas rūgštims atsiranda dėl to, kad jų ląstelėse yra lipidų, vaško ir hidroksi rūgščių. Tokie mikroorganizmai prastai nusidažo praskiestais dažų tirpalais. Siekiant palengvinti dažų prasiskverbimą į mikroorganizmų ląsteles, preparatui užteptas Tsilya fenolio fuksinas kaitinamas virš degiklio liepsnos. Spalvotų mikroorganizmų spalvos nepakeičia silpni mineralinių rūgščių ir alkoholio tirpalai.

Metodas pavadintas vokiečių gydytojų – mikrobiologo Franzo Zielio (1857-1926) ir patologo Friedricho Nelseno (1854-1898), sukūrusių jį 1882-1883 m., vardu.

Dažymo žingsniai

1. Fiksuotas tepinėlis padengiamas plokščiu filtravimo popieriumi ir ant jo užpilamas Ziehl fenolio fuksinas. Tepinėlis kaitinamas virš degiklio liepsnos, kol atsiranda garų, tada nuimamas atvėsinti ir įpilama nauja dažų dalis. Šildymas kartojamas 2-3 kartus. Atvėsus, nuimkite filtravimo popierių ir preparatą nuplaukite vandeniu.

2. Vaistas nuspalvinamas panardinant arba užtepus 5% sieros rūgšties tirpalu arba 3% druskos alkoholiu ir kelis kartus plaunamas vandeniu.

3. Preparatus 3-5 minutes nudažykite metileno mėlynojo vandens-alkoholio tirpalu, nuplaukite vandeniu ir nusausinkite.

Dažant Ziehl-Nelsen metodu, rūgštims atsparios bakterijos intensyviai raudonuoja, likusi mikrofloros dalis nusidažo šviesiai mėlyna spalva.

Romanovsky-Giemsa dažymas yra citologinis metodas, skirtas dažyti pirmuonis, bakterijas, ląstelių struktūras ir įvairių tipų audinius (įskaitant kraują), naudojant šviesos mikroskopiją. Jis nudažo acidofilinius darinius įvairiais raudonos spalvos atspalviais, bazofilinius darinius spalvomis nuo violetinės iki mėlynos.

// Dažų paruošimas

Prieš dažant tepinėlius, gatavi skysti dažai praskiedžiami 1-2 lašais dažų 1 ml distiliuoto vandens. Tepinėliai dažomi 20 - 25 minutes 37°C temperatūroje drėgnoje kameroje (uždara Petri lėkštelė su sudrėkintu filtru apačioje). Po dažymo tepinėliai nuplaunami tekančiu vandeniu, džiovinami ore ir tiriami panardinant į aliejų.

Romanovsky-Giemsa dažiklis, pagamintas iš Romanovsky Wright dažų, miltelių pavidalo (komercinis dažiklis) ištirpinamas vienodo tūrio metilo alkoholio ir glicerino mišinyje (800 mg dažų 100 ml. tirpiklis). Dažai blogai tirpsta, todėl geriau juos sumalti su tirpikliu, kurio kiekis yra 300 mg 100 ml, o tada maišant įpilti dažų, kol gaunama norima koncentracija. Dažų paruošimas dažnai trunka keletą dienų. Svarbu kaip tirpiklius naudoti chemiškai gryną metilo alkoholį ir gliceriną, nes priemaišos pablogina dažų savybes. Vietoj metilo alkoholio galima naudoti 100 % etilo alkoholį. Paruoštas dažymo mišinys laikomas vėsioje sausoje vietoje sandariai uždarytame inde.

dažymo technika

Metilo alkoholyje fiksuoti tepinėliai dažomi tirpalu (1 ml gatavų skystų dažų + 2 ml bazinio buferinio tirpalo + 47 ml distiliuoto vandens) 40-120 minučių (dažymo trukmė parenkama empiriškai). Jie naudoja fosfatinį buferį, tačiau buferio pH priklauso nuo tepinėlio tipo: kaulų čiulpų tepinėliui - 5,8 - 6,0, kraujo tepinėliui - 6,4 - 6,5, pirmuonių aptikimui - 6,8, maliarinio plazmodio - 7 , 0 - 7,2.

Nuplaukite distiliuotu vandeniu, išdžiovinkite ir patikrinkite panardindami.

Spalvotas rezultatas

Bakterijos nusidažo purpuriškai raudonai, ląstelės citoplazma – mėlyna, branduoliai – raudonai. Dažant pirmuonis, jų citoplazma tampa mėlyna, o branduoliai tampa raudonai violetiniai.