CENTRIFUGIRANJE

odvajanje u polju centrifugalnih sila tekućih disperznih sustava s česticama većim od 100 nm. Koristi se za izolaciju sastavnih faza (tekuće - centrifuga ili filtrat, kruto - sediment) iz dvokomponentnih (emulzije) i trokomponentnih (emulzije koje sadrže čvrstu fazu) sustava.

Metode i oprema. Postoje dvije metode C.: centrifugalna i filtracija. C. provodi se u centrifugalnim strojevima – centrifugama i centrifugalnim separatorima tekućina. Glavni radno tijelo ovih strojeva je osnosimetrična ljuska ili rotor (bubanj), koji se okreće visokom frekvencijom c -1, zbog čega se stvara polje centrifugalnih sila do 2 x 10 4 g u industrijskim i do 35 x 10 4 g u laboratorijskim strojevima ( g- slobodno ubrzanje. pad u gravitaciji polje). Ovisno o metodi, C. se provodi u čvrstim (taložnim; slika 1, a) ili perforiranim (obloženim filtarskim materijalom; slika 1, b) rotorima.

Riža. jedan. Rotori strojeva za centrifugalnu sedimentaciju (a) i filtraciju ( b): C - suspenzija, F - centrifuga (filtrat), O - talog; objašnjenje u tekstu, r W je polumjer slobodne površine tekućine.

C. karakterizira niz tehnologija. parametri koji određuju kvalitetu procesa i njegovu kinetiku. Tu spadaju: split faktor (r RT - maks. unutarnji radijus rotora), odražava intenzitet centrifugalnog polja; centrifugalna brzina - produktivnost centrifugalnog stroja u smislu početnog tekućeg sustava ili njegovih sastavnih komponenti; entrainment - sadržaj krute faze u centratu (filtratu); zasićenje sedimenta tekućom fazom (uključujući sediment) nakon C.; finoća separacije - min. veličina čestica uhvaćenih u centrifugalnom taloženju.
Kinetika C. ovisi o mnogim. čimbenici se svrstavaju u dvije skupine. Čimbenici prve skupine određeni su fizičkim. razdvajate sustav (razlika u gustoći faza, granulometrijski sastav čvrste faze, tekuće faze, specifični otpor sedimenta tijekom filtracije). Čimbenici druge skupine, određeni konstrukcijom i brzinom vrtnje rotora centrifugalnog stroja (struktura unutarrotorskog strujanja, njegova hidrodinamika i polje brzina), odlučujuće utječu na centrifugalnu sedimentaciju i dijelom na centrifugalnu filtraciju; pak hidrodinamički. način rada ovisi o performansama stroja. Mat. opis strujanja dan je jednadžbama Navier-Stokesa i kontinuiteta (vidi. hidromehanički procesi), to-rye se izrađuju uzimajući u obzir geometriju rotora i rubne uvjete; rješenje se često nalazi metodama teorije sličnosti.
Centrifugalno taloženje uključuje zgušnjavanje, kao i taloženje C. Bistrenje - uklanjanje krute faze iz suspenzija s udjelom čestica ne većim od 5% volumena; koristi se za pročišćavanje, na primjer, naftnih ulja. Zgušnjavanje je proces u kojem se čestice disperzne faze grupiraju u relativno malom volumenu disperzijskog medija; omogućuje provedbu suspenzija (npr. vodena suspenzija kaolina). Taloženje C. - odvajanje suspenzija sa sadržajem krute faze većim od 5-10% volumena; primjenjivati ​​pretežno. za dehidrataciju čvrstih komponenti (npr. CaSO 4).
Kod centrifugalnog taloženja kretanje krutih čestica događa se pod djelovanjem centrifugalne sile ( d- promjer čestica - razlika između gustoće krute i tekuće faze; r- udaljenost od čestice do osi rotacije rotora) i sila otpora tekućeg medija S. Omjer tih sila određuje brzinu taloženja w. U laminarnom režimu, karakterističnom za bistrenje, sila S izražava se Stokesovim zakonom: a gdje dinamička. viskoznost tekuće faze. Za turbulentni režim tijekom taloženja velikih čestica, visoko koncentriran. suspenzije, sila S se nalazi iz jednadžbe: (- koeficijent otpora; p W - gustoća tekuće faze). Hidrodinamika toka određuje vrijeme zadržavanja čestica u rotoru, aw je vrijeme taloženja; usporedba ovih vrijednosti omogućuje vam da pronađete finoću odvajanja.
Centrifugalna filtracija se odvija sa ili bez stvaranja taloga na filterskoj pregradi, kao i uz istovremeno odvijanje oba procesa u njegovim zonama; max. učinkovit za dobivanje oborina s min. vlažnost. Proces se obično dijeli na tri razdoblja: stvaranje taloga, uklanjanje viška tekućine iz njega i uklanjanje tekućine zadržane intermolom. sile (krz. gaz). Prvo razdoblje obuhvaća centrifugalno taloženje i filtraciju kroz sloj nastalog taloga. Za izračunavanje kinetike procesa koristi se Darcy-Weisbachov zakon; pogonska sila (pad tlaka) određena je centrifugalnim poljem koje djeluje na ovjes: gdje je gustoća ovjesa; r w - slobodni radijus. površina tekućine (sl. 1, b). Na njega utječe klizanje tekućine iznad sloja sedimenta. Razdoblje može teći na razl. načini rada; max. načini su karakteristični pri konstantnoj i performansi ovjesa. Drugo i treće razdoblje ovise o velikom broju čimbenika povezanih sa zbijenošću sedimenta, obliku njegovih pora itd.; gradeći svoju prostirku. modela je izuzetno teško.
Zbog složenosti centrifugalnih strojeva, učinak centrifugalnih strojeva najčešće se ocjenjuje modeliranjem prema tzv. indeks učinkovitosti, što znači pod F u prvoj aproksimaciji područje bočne površine rotora. Phys. što znači da je, analogno taloženju u taložnicima, produktivnost centrifuga također proporcionalna površini radne površine, ali se zbog centrifugalnog polja povećava za faktor Fr. Ovisno o značajkama dizajna rotora za strojeve svake vrste, određuje se vlastitom jednadžbom i koristi se pri ponovnom izračunavanju performansi s jedne veličine centrifuge na drugu. Modeliranje se provodi na geom. sličnost rotora i istovjetnost definirajućih kriterija procesa.

Riža. 2. Kontinuirana centrifuga: a - svrdlo za taloženje; b - vijak filtera; u iz pulsirajuće ispuštanje mulja; g - inercijalni; d - vibracija; e - precesijski; 1 - rotor; 2 - mehanizam za istovar.

U usporedbi s drugim metodama odvajanja (filtriranja), C. omogućuje dobivanje oborina s nižim sadržajem vlage. Centrifugalnom sedimentacijom, za razliku od filtracije, moguće je odvojiti suspenzije (npr. u proizvodnji boja i lakova) s fino dispergiranom čvrstom fazom, min. veličina čestica rez je 5-10 mikrona. Važna prednost C. je mogućnost njegove implementacije u opremi relativno malih volumena; nedostatak - velika potrošnja energije.
Maturalna večer. razlikuju se centrifuge: prema principu odvajanja - taložne, filtrirajuće i kombinirane; po dizajnu - preim. prema položaju rotora i sustava za ispuštanje taloga (puž, potiskivač ili klip; korištenje sila inercije); na organizaciju procesa – periodično ili kontinuirano djelovanje.
C. u strojevima periodični. radnje se provode ciklički u rotorima s ponekad podesivim nožem ili ručnim ispuštanjem mulja.
Na sl. 2 prikazuje shematske dijagrame odvajanja suspenzija u kontinuiranim strojevima. Centrifuge s vijkom za taloženje (slika 2, a) dizajnirane su za odvajanje suspenzija s netopivom čvrstom fazom (npr. polistiren, kanalizacijski mulj), dehidraciju kristalnog. i granulirani proizvodi, klasifikacija (npr. TiO 2), zgušnjavanje (npr. aktivni mulj). Proces se odvija u čvrstom rotoru; sediment se kontinuirano ispušta pomoću puža koji se okreće frekvencijom Za ovu Fr600-3500 centrifugu.
Vijčane centrifuge za filtriranje (slika 2, b) uobičajene su u odvajanju visoko koncentriranih. suspenzije s grubom krutom tvari (veličina čestica preko 0,2 mm, npr. Glauberova sol). C. se proizvodi u okvirnom rotoru s lisnatim sitom, kroz koje se ispušta filtrat. Mulj se uklanja iz rotora pomoću pužnice pod utjecajem razlike u brzinama vrtnje. Visoke vrijednosti Fr (1200-1800) omogućuju dobivanje proizvoda s minimalnim vlažnost.
Uglavnom se koriste centrifuge za filtriranje s pulsirajućim ispuštanjem sedimenta (slika 2, c). za iste svrhe kao i filtarski vijak. Zbog prisutnosti debelog sloja sedimenta na rešetkastom situ jednostupanjskog ili višestupanjskog rotora, moguće je izvršiti dubinsko pranje proizvoda (npr. KC1, rafinirani šećer). Talog se istovaruje pomoću potiskivača koji se kreće unazad. kretanje linearnom brzinom v; 300-700 Fr.
U inercijskim centrifugama (slika 2, d), sediment se uklanja iz rotora zbog komponente centrifugalnog polja; u vibrirajućim centrifugama (slika 2, e) - zbog titranja rotora duž osi brzinom v; u precesijskim centrifugama (slika 2, f) - zbog žiroskopskih kretanja rotora s brzinama vrtnje i Strojevi svih vrsta koriste se za centrifugalnu filtraciju visokokoncentriranih. suspenzije s krupnim kristalima. čvrsta faza (npr. hidrougljen, granulirani šećer).
Variety C. odvajanje suspenzija i emulzija u centrifugalnim separatorima. Njihovi rotori opremljeni su paketom konika. ploče ugrađene jedna u odnosu na drugu s malim razmakom (0,4-1,5 mm). Visoki stupanj odvajanja postiže se njegovim protokom u tankom sloju međupločnog razmaka u laminarnom načinu rada. Fino dispergirane suspenzije (aditivi za ulje, hormonski pripravci i sl.) koje sadrže 0,5-4,0% vol. krzna. nečistoće se pročišćavaju u separatorima-pročistačima (slika 3, a). Čvrsta faza, skupljajući se u muljnom prostoru rotora, povremeno se uklanja iz njega kada se otvori dno (klip). Centrifugalno zgušnjavanje (npr. stočni i pekarski kvasac) provodi se u separatorima-zgušnjivačima (slika 3, b). Kondenzirana frakcija kontinuirano se ispušta kroz mlaznice duž periferije rotora, a pročišćena - kroz vrh. zona. Separatori se koriste za odvajanje emulzija (na primjer, uljni mulj) (slika 4), u čijim je rotorima predviđen paket ploča s rupama smještenim na granici između teških i lakih tekućina; komponente (fugate F 1 i F 2) prikazane su zasebno. Ako u emulziji postoji čvrsta faza, koriste se univerzalni rotori s istovarom sedimenta u skladu sa sl. 3, ili ručno.
Analogno centrifugama, sposobnost odvajanja separatora procjenjuje se indeksom učinka

Gdje je z - broj ploča u paketu; - polovica kuta stošca ploče na vrhu; R max, R min - vanjski i unutarnji. radijusi posude. Simulacija procesa u separatorima provodi se, kao iu centrifugama, prema indeksu učinka

Riža. 3. Separator za odvajanje suspenzija: na sl. separator-pročišćivač (a) i separator-zgušnjivač ( b); 1 - rotor; 2 - paket ploča; 3 - pomično dno.

Riža. četiri. Separator za odvajanje emulzija: 1 - rotor; 2 - paket ploča; F 1 i F 2 - centri; E - emulzija.

Za proučavanje centrifugalnih procesa u laboratoriju koriste se modeli. centrifuge i separatori promjera rotora 150-250 mm, kao i tzv. čašne centrifuge (rotor se sastoji od većeg broja epruveta – čaša). Ovi uzorci male veličine omogućuju eksperimentalno određivanje ne samo produktivnosti prom. strojeva, ali i mogućnost iskrcaja taloga iz rotora, konačne vlažnosti proizvoda, uvlačenja. Istraživanja se provode s malim količinama proizvoda na posebnim. stoji. Centrifuge s čašom koriste se za procjenu vremena taloženja čestica pri raspadu. fr.
Moderno centrifugalna tehnologija nastoji povećati brzinu vrtnje rotora, povećati produktivnost, smanjiti otkucaje. metalni i energetski intenzitet. Produktivnost strojeva povećava se zbog poboljšanja hidrodinamike rotora, povećanja njihove duljine (u centrifugama za taloženje) i visine paketa (u separatorima). Promjeri rotora u strojevima velikog kapaciteta se povećavaju; stvaraju se kombinirani. rotori, u dizajnu to-rykh su kombinirani decomp. Metode C. Uvode se mikroprocesorski upravljački sustavi i podesivi pogoni kako bi se C. osigurao u optimalnom. modovi.
C. je raširen u tehn. procesi kemijsko-šumskog kompleksa, prehrambene, tekstilne i dr. proizvodnje. C. igra važnu ulogu u rješavanju ekoloških problema. problema (pročišćavanje komunalnih i industrijskih otpadnih voda), u tehnologijama za uštedu resursa.

Lit.: Sokolov V.I., Centrifugiranje, M., 1976; Shkoropad D. E., Novikov O. P., Centrifuge i separatori za kemijsku industriju, M., 1987.

I. A. Fainerman.

Ultracentrifugiranje - metoda odvajanja i proučavanja čestica manjih od 100 nm (makromolekula životinjskih i biljnih organela, virusa i dr.) u polju centrifugalnih sila. Omogućuje vam razdvajanje smjesa čestica u frakcije ili pojedinačne komponente, kako biste pronašli pristanište. masa i MWD polimera, gustoća njihovih samotvora. Omogućuje procjenu oblika i veličine makromolekula u otopini (vidi. analiza disperzije), utjecaj statike pritisak na stabilnost čestica, parametri međudjelovanja. tip asocijacije – makromolekule međusobno ili s molekulama niske mol. komponente i ione, utjecaj prirode otapala na konformacije makromolekula itd.
To se provodi uz pomoć ultracentrifuga opremljenih šupljim rotorima, šupljine su zatvorene i protočne. Razlikovati veliku brzinu i ravnotežu. U prvom slučaju čestice se gibaju duž radijusa rotora odn. s njihovim koeficijentom sedimentacija, u prvoj aproksimaciji proporcionalna masi čestice, razlika u gustoći čestice i tekućine pri kada se čestice kreću od osi vrtnje rotora prema periferiji (talog), pri - prema osi rotacija (float). Kod ravnotežnog ultracentrifugiranja, prijenos čestica duž polumjera nastavlja se do sume kemijske. potencijalna i molarna potencijalna energija u svakoj točki sustava neće postati konstantna vrijednost, nakon čega će se raspodjela čestica prestati mijenjati.
T. naz. analit ultracentrifugiranje se primjenjuje kod analize otopina, varijanci i izrađuje se pomoću analita. ultracentrifuge opremljene rotorima s optički prozirnim zatvorenim spremnicima i optičkim. sustavi za određivanje koncentracije ili njezinog gradijenta duž polumjera rotora u vremenu; istraživani volumeni - od 0,01 do 2 ml s masom čestica od nekoliko. mcg u mg. Preparativno ultracentrifugiranje koristi se za izolaciju komponenti iz složenih smjesa; volumen tekućine i masa ispitnog uzorka m. b. na nekoliko reda više nego kod analita. ultracentrifugiranje. Centrifugalna ubrzanja u ultracentrifugama dostižu 5 x 10 5 g. Prvi analitičar. ultracentrifugu je izradio T. Svedberg (1923; 5 x 10 3 g).

Lit.: Bowen T., Uvod u ultracentrifugiranje, trans. s engleskog, M., 1973.

A. D. Morozkin.

Kemijska enciklopedija. - M.: Sovjetska enciklopedija. ur. I. L. Knunyants. 1988 .

Sinonimi:

Pogledajte što je "CENTRIFUGIRANJE" u drugim rječnicima:

Razdvajanje nehomogenih sustava (npr. tekućine) na frakcije po gustoći pomoću centrifugalnih sila. Centrifugiranje se provodi u aparatima koji se nazivaju centrifuge. Centrifugiranje se koristi za odvajanje sedimenta od ... ... Wikipedije

Razdvajanje nehomogenih sustava (npr. tekućina je čvrsto tijelo) pomoću centrifugalnih sila; koristi se za odvajanje suspenzija, bistrenje kontaminiranih tekućina, klasifikaciju mulja prema veličini krutih čestica itd.; mogucnost odvajanja..... Pojmovi nuklearne energije

centrifugiranje- Ndp. jointing jointer Razdvajanje tekućih nehomogenih sustava u rotorima pod djelovanjem centrifugalnih sila. [GOST 16887 71] [GOST R 51109 97] Nedopustivo, ne preporučuje se spajanje spojeva Teme industrijska čistoća filtracija, centrifugiranje, ... ... Tehnički prevoditeljski priručnik

centrifugiranje- - metoda oblikovanja proizvoda korištenjem centrifugalnih sila, istiskivanjem iz smjese dijela vode za miješanje i uvučenog zraka. [Terminološki rječnik za beton i armirani beton. FSUE "Istraživački centar" Izgradnja "NIIZHB i M. A. A. Gvozdev, ... ... Enciklopedija pojmova, definicija i objašnjenja građevinskih materijala

Razdvajanje nehomogenih smjesa (suspenzija, emulzija, muljeva) na sastavne dijelove pod djelovanjem centrifugalne sile. Provodi se u centrifugama. Koristi se u znanstvenim istraživanjima, kemijskoj, prehrambenoj, rudarskoj i drugim industrijama... Veliki enciklopedijski rječnik

Metoda razdvajanja nehomogenih, dispergiranih tekućih sustava u polju centrifugalnih sila (polje centrifuge). Ima veću sposobnost odvajanja od prešanja, taloženja i filtriranja. C. provodi u centrifugama, princip rada do ... ... Mikrobiološki rječnik

Postoj., broj sinonima: 1 ultracentrifugiranje (1) Rječnik sinonima ASIS. V.N. Trishin. 2013 ... Rječnik sinonima

centrifugiranje- * centrifugiranje * centrifugiranje korištenje sila koje stvara centrifuga (vidi) za odvajanje molekula u tekućem mediju. Postoji nekoliko vrsta C.: u gradijentu gustoće, diferencijalnom, u gradijentu saharoze ... Genetika. Enciklopedijski rječnik - razdvajanje nehomogenih sustava (npr. tekuće krutine) pomoću centrifugalnih sila. Koristi se za odvajanje suspenzija, bistrenje polutanata. tekućine, hidraul klasifikacija mulja prema veličini krutih čestica i sl. Provodi se u ... ... Veliki enciklopedijski politehnički rječnik

knjige

• Principles and Methods of Biochemistry and Molecular Biology, Derek Gordon, obrazovna publikacija koju su napisali autori iz Ujedinjenog Kraljevstva, postavlja temelje teorijskih koncepata biokemije i molekularne biologije primijenjenih na suvremene istraživačke metode, među ... Kategorija: Medicina Serija: Metode u biologiji (Laboratorij znanja) Izdavač: Laboratorija znanja, elektronska knjiga(fb2, fb3, epub, mobi, pdf, html, pdb, lit, doc, rtf, txt)

Tečajni rad

centrifugiranje

1. Princip metode

Odvajanje tvari centrifugiranjem temelji se na različitom ponašanju čestica u centrifugalnom polju. Suspenzija čestica smještena u epruvetu puni se u rotor montiran na pogonsku osovinu centrifuge.

U centrifugalnom polju, čestice različitih gustoća, oblika ili veličina talože se različitim brzinama. Brzina taloženja ovisi o centrifugalnom ubrzanju, koje je izravno proporcionalno kutnoj brzini rotora i udaljenosti između čestice i osi rotacije:

a centrifugalno ubrzanje će tada biti

Budući da je jedan okretaj rotora 2n radijana, kutna brzina rotora u okretajima u minuti može se napisati kao:

Centrifugalno ubrzanje obično se izražava u jedinicama g i naziva se relativno centrifugalno ubrzanje, tj.

Kod navođenja uvjeta za odvajanje čestica navesti brzinu vrtnje i radijus rotora te vrijeme centrifugiranja. Centrifugalno ubrzanje obično se izražava u jedinicama g, izračunatim iz prosječnog polumjera rotacije stupca tekućine u cijevi centrifuge. Na temelju jednadžbe Dole i Kotzias sastavili su nomogram koji izražava ovisnost GCC o brzini rotora i radijusu r.

Brzina taloženja kuglastih čestica ne ovisi samo o centrifugalnom ubrzanju, već i o gustoći i polumjeru samih čestica te o viskoznosti suspenzijskog medija. Vrijeme potrebno za taloženje kuglaste čestice u tekućem mediju od tekućeg meniskusa do dna epruvete centrifuge obrnuto je proporcionalno brzini sedimentacije i određeno je sljedećom jednadžbom:

gdje je t vrijeme taloženja u sekundama, rj je viskoznost medija, rh je radijus čestice, rf je gustoća čestice, p je gustoća medija, hm je udaljenost od osi rotacije. do meniskusa tekućine, gdje je udaljenost od osi rotacije do dna epruvete.

Kao što proizlazi iz jednadžbe, pri određenoj brzini rotora, vrijeme potrebno za taloženje homogenih kuglastih čestica obrnuto je proporcionalno kvadratu njihovih polumjera i razlici gustoće čestice i medija, a izravno je proporcionalno viskoznosti medija. . Stoga se smjesa heterogenih, približno sferičnih čestica, različitih gustoće i veličine, može razdvojiti bilo zbog različitog vremena njihovog taloženja na dno cijevi pri određenom ubrzanju, bilo zbog rasporeda taloženih čestica duž cijevi. , koji se uspostavlja nakon određenog vremena. Prilikom odvajanja tvari potrebno je uzeti u obzir tako važne čimbenike kao što su gustoća i viskoznost medija. Opisane metode mogu odvojiti stanične organele od tkivnih homogenata. Glavne komponente stanice talože se sljedećim redoslijedom: prvo cijele stanice i njihovi fragmenti, zatim jezgre, kloroplasti, mitohondriji, lizosomi, mikrosomi i na kraju ribosomi. Taloženje nesferičnih čestica ne slijedi jednadžbu, pa se čestice iste mase, ali različitih oblika talože različitim brzinama. Ova se značajka koristi u istraživanju pomoću ultracentrifugiranja konformacije makromolekula.

Preparativno centrifugiranje sastoji se u izolaciji biološkog materijala za naknadna biokemijska ispitivanja. U tom slučaju mogu se uzeti velike količine početnog biološkog materijala, na primjer, inokulacije mikrobnih stanica iz šaržnih ili kontinuiranih kultura, kao i inokulacije biljnih i životinjskih stanica iz kultura tkiva i krvne plazme. Uz pomoć preparativnog centrifugiranja izdvaja se veliki broj čestica stanica kako bi se proučila njihova morfologija, struktura i biološka aktivnost. Metoda se također koristi za izolaciju takvih bioloških makromolekula kao što su DNA i proteini iz prethodno pročišćenih pripravaka.

Analitičko centrifugiranje se uglavnom koristi za proučavanje čistih ili uglavnom čistih pripravaka makromolekula ili čestica, kao što su ribosomi. U ovom slučaju koristi se mala količina materijala, a sedimentacija proučavanih čestica kontinuirano se bilježi pomoću posebnih optičkih sustava. Metoda omogućuje dobivanje podataka o čistoći, molekularnoj težini i strukturi materijala. U dodiplomskim radionicama preparativno centrifugiranje se mnogo češće koristi nego analitičko centrifugiranje, pa ćemo se na njemu detaljnije zadržati, iako se obje metode temelje na zajedničkim principima.

2. Preparativno centrifugiranje

2.1 Diferencijalno centrifugiranje

Ova se metoda temelji na razlikama u brzinama taloženja čestica koje se međusobno razlikuju po veličini i gustoći. Materijal koji se odvaja, na primjer homogenat tkiva, centrifugira se uz postupno povećanje centrifugalnog ubrzanja, koje je odabrano tako da se u svakoj fazi određena frakcija taloži na dno epruvete. Na kraju svakog koraka, talog se odvoji od supernatanta i ispere nekoliko puta da bi se na kraju dobila čista istaložena frakcija. Nažalost, praktički je nemoguće dobiti apsolutno čisti talog; Da bismo razumjeli zašto se to događa, okrenimo se procesu koji se odvija u epruveti centrifuge na početku svakog koraka centrifugiranja.

Prvo, sve čestice homogenata ravnomjerno su raspoređene po volumenu epruvete centrifuge, pa je nemoguće dobiti čiste pripravke precipitata najtežih čestica u jednom ciklusu centrifugiranja: prvi nastali talog sadrži uglavnom najteže čestice, ali, osim toga, također i određenu količinu svih početnih komponenti. Dovoljno čisti pripravak teških čestica može se dobiti samo ponovnom suspenzijom i centrifugiranjem početnog taloga. Daljnjim centrifugiranjem supernatanta uz naknadno povećanje centrifugalnog ubrzanja dolazi do taloženja čestica srednje veličine i gustoće, a potom i do taloženja najsitnijih čestica najmanje gustoće. Na sl. 2.3 je dijagram frakcioniranja homogenata jetre štakora.

Čini se da je diferencijalno centrifugiranje najčešća metoda za izolaciju staničnih organela iz homogenata tkiva. Ova metoda se najuspješnije koristi za odvajanje takvih staničnih organela koji se međusobno značajno razlikuju po veličini i gustoći. Ali čak ni u ovom slučaju dobivene frakcije nikada nisu apsolutno homogene, te se za njihovo daljnje razdvajanje koriste druge metode, opisane u nastavku. Ove metode, temeljene na razlikama u gustoći organela, omogućuju učinkovitije odvajanje centrifugiranjem u otopinama s kontinuiranim ili stepenastim gradijentom gustoće. Nedostatak ovih metoda je što je potrebno vrijeme da se dobije gradijent gustoće otopine.

2.2 Brzina zonskog centrifugiranja

Metoda zonske brzine, ili, kako se još naziva, s-zonsko centrifugiranje, sastoji se u nanošenju ispitnog uzorka na površinu otopine s kontinuiranim gradijentom gustoće. Uzorak se zatim centrifugira sve dok se čestice ne rasporede duž gradijenta u diskretnim zonama ili trakama. Stvaranjem gradijenta gustoće moguće je izbjeći miješanje zona koje je posljedica konvekcije. Metoda brzog zonskog centrifugiranja koristi se za odvajanje RNA-DNA hibrida, podjedinica ribosoma i drugih staničnih komponenti.

2.3 Izopikničko centrifugiranje

Izopikničko centrifugiranje provodi se i u gradijentu gustoće i na uobičajeni način. Ako se centrifugiranje ne provodi u gradijentu gustoće, preparat se prvo centrifugira tako da se slegnu čestice molekulske mase veće od one čestica koje se proučavaju. Te teške čestice se odbacuju i uzorak se suspendira u mediju čija je gustoća jednaka gustoći frakcije koju treba izolirati, a zatim centrifugira dok se čestice koje se ispituju ne slegnu na dno epruvete, a čestice manje gustoće otplutaju na epruvetu. površina tekućine...

Drugi način je nanošenje slojeva uzorka na površinu otopine kontinuiranim gradijentom gustoće koji pokriva raspon gustoća svih komponenti smjese. Centrifugiranje se provodi sve dok uzgonska gustoća čestica ne bude jednaka gustoći odgovarajućih zona, tj. dok se čestice ne razdvoje u zone. Metoda se naziva zonsko izopikničko ili rezonantno centrifugiranje, jer je ovdje glavna stvar gustoća uzgona, a ne veličina ili oblik čestica. Na količinu gustoće pri kojoj čestice formiraju izopikne trake utječe priroda suspenzijskog medija; čestice mogu biti propusne za neke spojeve u otopini i nepropusne za druge, ili mogu vezati molekule otopine. Kada se koristi zonski rotor, mitohondriji, lizosomi, peroksisomi i mikrosomi koncentrirani su u trake s 42%, 47%, 47% i 27% saharoze, što odgovara gustoći od 1,18, 1,21, 1,21 odnosno 1,10 g-cm -3. Gustoća substaničnih organela također ovisi o njihovom selektivnom unosu određenih spojeva. Uvođenje štakorima deterdženta Triton WR-1339, koji ne uzrokuje hemolizu, dovodi do povećanja veličine i smanjenja gustoće lizosoma jetre; gustoća mitohondrija i peroksisoma ostaje nepromijenjena. Unatoč činjenici da se sedimentacijska svojstva lizosoma u pravilu ne mijenjaju, njihova ravnotežna gustoća u gradijentu saharoze smanjuje se s 1,21 na 1,1, što dovodi do odgovarajućeg odvajanja lizosomsko-peroksisomalne frakcije. Ova se značajka koristi u kvantitativnom odvajanju lizosoma, mitohondrija i peroksisoma, na temelju uklanjanja iz homogenog medija svih čestica s gustoćom većom od mikrosoma, i naknadnog izopiknalnog centrifugiranja istaloženih teških čestica.

2.4 Ravnotežno centrifugiranje s gradijentom gustoće

Za stvaranje gradijenta gustoće koriste se soli teških metala, poput rubidija ili cezija, kao i otopine saharoze. Uzorak, poput DNK, pomiješa se s koncentriranom otopinom cezijevog klorida. I otopljena tvar i otapalo su u početku ravnomjerno raspoređeni po volumenu. Tijekom centrifugiranja uspostavlja se ravnotežna raspodjela koncentracije, a time i gustoće CsCl, jer ioni cezija imaju veliku masu. Pod djelovanjem centrifugalnog ubrzanja dolazi do redistribucije molekula DNA, skupljajući se u obliku zasebne zone u dijelu epruvete s gustoćom koja im odgovara. Metoda se uglavnom koristi u analitičkom centrifugiranju, a koristili su je Meselson i Stahl za proučavanje mehanizma replikacije DNA E. coli. Centrifugiranje ravnotežnog gradijenta gustoće također je jedna od metoda za odvajanje i proučavanje lipoproteina ljudske plazme.

2.5 Oblikovanje i izdvajanje gradijenata

2.5.1 Priroda gradijenata

Za stvaranje gradijenata gustoće otopina najčešće se koriste otopine saharoze, ponekad s fiksnim pH. U nekim slučajevima, dobro odvajanje se postiže korištenjem D2 0 umjesto obične vode. 2.1 prikazuje svojstva nekih otopina saharoze.

Odabir gradijenta diktiraju specifični zadaci frakcioniranja. Na primjer, ficol, proizvođača Pharmacia FineChemicals, može zamijeniti saharozu u slučajevima kada je potrebno stvoriti gradijente visoke gustoće i niskog osmotskog tlaka. Još jedna prednost ficola je što ne prolazi kroz stanične membrane. Soli teških metala, poput rubidija i cezija, koriste se za stvaranje gradijenata veće gustoće, međutim, zbog korozivnog učinka CsCl, takvi gradijenti se koriste samo u rotorima izrađenim od otpornih metala, kao što je titan.

2.5.2 Tehnika gradijenta gustoće koraka

Za stvaranje gradijenta gustoće, nekoliko otopina s uzastopnim smanjenjem gustoće pažljivo se uvode u epruvetu centrifuge pomoću pipete. Zatim se na najgornji sloj, koji ima najmanju gustoću, slojevito nanosi uzorak u obliku uske zone, nakon čega se epruveta centrifugira. Glatki linearni gradijenti mogu se dobiti izravnavanjem postupnih gradijenata tijekom duljeg stajanja otopine. Proces se može ubrzati laganim miješanjem sadržaja epruvete žicom ili laganim protresanjem epruvete.

2.5.3 Tehnika stvaranja glatkog gradijenta gustoće

U većini slučajeva koristi se poseban uređaj za stvaranje glatkog gradijenta gustoće. Sastoji se od dvije cilindrične posude strogo definiranog identičnog promjera, koje međusobno komuniciraju na dnu staklenom cijevi s kontrolnim ventilom, što vam omogućuje podešavanje omjera u kojima se sadržaj obiju posuda miješa. Jedna od njih je opremljena mješalicom i ima izlaz kroz koji otopina teče u epruvete za centrifugiranje. Gušća otopina se stavlja u miješalicu; drugi cilindar se napuni otopinom manje gustoće. Visina stupca otopina u oba cilindra je postavljena tako da je hidrostatski tlak u njima jednak. Gušća otopina postupno se ispušta iz miješalice u epruvete centrifuge i istovremeno se zamjenjuje jednakim volumenom otopine manje gustoće koja ulazi u miješalicu iz drugog cilindra kroz kontrolni ventil. Homogenost otopine u miješalici osigurava se stalnim miješanjem otopine mješalicom. Kako se otopina cijedi u epruvete za centrifugiranje, njezina gustoća se smanjuje i u epruvetama se stvara linearni gradijent gustoće. Nelinearni gradijenti mogu se stvoriti pomoću sustava koji se sastoji od dva cilindra nejednakog promjera.

Za formiranje gradijenata gustoće različite strmine koristi se sustav od dvije mehanički kontrolirane štrcaljke koje se pune otopinama nejednake gustoće. Promjenom relativne brzine klipova mogu se stvoriti različiti gradijenti.

2.5.4 Ekstrakcija gradijenata iz centrifugalnih epruveta

Nakon završetka centrifugiranja i odvajanja čestica potrebno je ukloniti nastale zone. To se radi na nekoliko načina, najčešće metodom pomaka. Centrifugalna cijev se probuši u dnu iu njen donji dio polako se uvodi vrlo gusti medij, na primjer, 60-70% otopina saharoze. Gornja otopina se istiskuje i frakcije se skupljaju pomoću štrcaljke, pipete ili posebnog uređaja spojenog kroz cijev na kolektor frakcija. Ako su cijevi izrađene od celuloida ili nitroceluloze, frakcije se izdvajaju rezanjem cijevi posebnom oštricom. Da bi se to postiglo, centrifugalna epruveta učvršćena u postolju reže se izravno ispod željene zone i frakcija se usisava špricom ili pipetom. Uz prikladnu konstrukciju uređaja za rezanje, gubitak otopine bit će minimalan. Sakupljanje frakcija također se provodi probijanjem dna epruvete tankom šupljom iglom. Kapi koje teku iz cijevi kroz iglu skupljaju se u kolektor frakcija za daljnju analizu.

2.5.5 Preparativne centrifuge i njihova primjena

Preparativne centrifuge mogu se klasificirati u tri glavne skupine: centrifuge opće namjene, centrifuge velike brzine i preparativne ultracentrifuge. Centrifuge opće namjene daju maksimalnu brzinu od 6000 o/min i RCF do 6000 g. Međusobno se razlikuju samo po kapacitetu i imaju niz izmjenjivih rotora: kutni i s visećim staklima. Jedna od značajki ove vrste centrifuga je njihov veliki kapacitet - od 4 do 6 dm3, što im omogućuje punjenje ne samo centrifugalnih cijevi od 10,50 i 100 cm3, već i posuda kapaciteta do 1,25 dm3. U svim centrifugama ovog tipa rotori su kruto pričvršćeni na pogonsku osovinu, a centrifugalne epruvete, zajedno sa svojim sadržajem, moraju biti pažljivo uravnotežene i razlikuju se u težini ne više od 0,25 g. Trebaju biti postavljene simetrično, jedna naspram drugo, čime se osigurava ravnomjerna raspodjela epruveta u odnosu na os rotacije rotora.

Centrifuge velike brzine daju maksimalnu brzinu od 25.000 o/min-1 i RCF do 89.000g. Komora rotora opremljena je sustavom hlađenja koji sprječava zagrijavanje koje nastaje uslijed trenja tijekom rotacije rotora. U pravilu, centrifuge velike brzine imaju kapacitet od 1,5 dm3 i opremljene su zamjenjivim rotorima, kako kutnim tako i visećim kantama.

Preparativne ultracentrifuge daju najveću brzinu do 75.000 okretaja u minuti i maksimalno centrifugalno ubrzanje od 510.000 g. Opremljeni su i hladnjakom i vakuumskom jedinicom kako bi se spriječilo pregrijavanje rotora zbog njegovog trenja sa zrakom. Rotori takvih centrifuga izrađeni su od legura aluminija ili titana visoke čvrstoće. Uglavnom se koriste rotori od aluminijske legure, međutim, u slučajevima kada su potrebne posebno velike brzine koriste se rotori od titana. Kako bi se smanjile vibracije koje proizlaze iz neravnoteže rotora zbog neravnomjernog punjenja centrifugalnih epruveta, ultracentrifuge imaju fleksibilnu osovinu. Centrifugalne epruvete i njihov sadržaj moraju biti pažljivo uravnoteženi do najbližih 0,1 g. Slične zahtjeve treba poštovati pri punjenju rotora centrifuga za opće namjene.

2.6 Dizajn rotora

2.6.1 Kutni rotori i rotori s visećim žlicama

Rotori preparativnih centrifuga obično su dvije vrste - kutne i viseće kante. Nazivaju se kutnim jer su centrifugalne cijevi postavljene u njih uvijek pod određenim kutom u odnosu na os rotacije. U rotorima s visećim staklima, epruvete su postavljene okomito, a kada se okreću pod djelovanjem rezultirajuće centrifugalne sile, pomiču se u vodoravni položaj; kut nagiba prema osi rotacije je 90°.

U kutnim rotorima, udaljenost koju čestice prijeđu do odgovarajuće stijenke epruvete je vrlo mala, pa se taloženje događa relativno brzo. Nakon sudara sa stijenkama epruvete, čestice skliznu prema dolje i formiraju sediment na dnu. Tijekom centrifugiranja nastaju konvekcijska strujanja koja uvelike kompliciraju odvajanje čestica sličnih sedimentacijskih svojstava. Ipak, rotori sličnog dizajna uspješno se koriste za odvajanje čestica čija brzina taloženja dosta varira.

Kod rotora s visećim čašicama također se uočavaju konvekcijski fenomeni, ali oni nisu tako izraženi. Konvekcija je rezultat činjenice da se pod djelovanjem centrifugalnog ubrzanja čestice talože u smjeru koji nije strogo okomit na os rotacije, te stoga, kao u kutnim rotorima, udaraju o stijenke epruvete i klize na dno.

Učinci konvekcije i vrtloga mogu se donekle izbjeći upotrebom sektorskih cijevi u rotorima s visećim šalicama i podešavanjem brzine rotora; gore navedena, metoda centrifugiranja u gradijentu gustoće također je lišena nedostataka.

2.6.2 Kontinuirani rotori

Kontinuirani rotori dizajnirani su za brzo frakcioniranje relativno malih količina krutog materijala iz suspenzija velikog volumena, na primjer, za izolaciju stanica iz medija kulture. Tijekom centrifugiranja, suspenzija čestica se kontinuirano dodaje u rotor; kapacitet rotora ovisi o prirodi taloženog preparata i varira od 100 cm3 do 1 dm3 u minuti. Osobitost rotora je da je to izolirana komora posebnog dizajna; njegov sadržaj ne komunicira s vanjskim okolišem, stoga se ne zagađuje niti raspršuje.

2.6.3 Zonski ili Andersonovi rotori

Zonski rotori izrađeni su od aluminijskih ili titanovih legura, koje mogu izdržati vrlo značajna centrifugalna ubrzanja. Obično imaju cilindričnu šupljinu, zatvorenu poklopcem koji se može skinuti. Unutar šupljine, na osi rotacije, nalazi se aksijalna cijev na koju je navučena mlaznica s lopaticama koje dijele šupljinu rotora na četiri sektora. Lopatice ili pregrade imaju radijalne kanale kroz koje se ubrizgava gradijent od aksijalne cijevi do periferije rotora. Zahvaljujući ovakvom dizajnu lopatica, konvekcija je svedena na minimum.

Punjenje rotora se provodi kada se okreće brzinom od oko 3000 o/min. Unaprijed stvoreni gradijent upumpava se u rotor, počevši od sloja najmanje gustoće, koji je ravnomjerno raspoređen po obodu rotora i centrifugalnom silom se drži na njegovoj vanjskoj stijenci okomito na os rotacije. Naknadnim dodavanjem gradijentnih slojeva veće gustoće dolazi do kontinuiranog pomaka prema središtu slojeva manje gustoće. Nakon što se cijeli gradijent upumpa u rotor, on se puni do svog punog volumena otopinom koja se naziva "jastuk", čija je gustoća jednaka ili malo veća od najveće gustoće prethodno oblikovanog gradijenta.

Zatim se kroz aksijalnu cijev raslojava ispitni uzorak koji se otopinom manje gustoće istiskuje iz cijevi u volumen rotora, dok se isti volumen "jastuka" uklanja s periferije. Nakon svih ovih postupaka, brzina vrtnje rotora se prilagođava radnoj brzini, te se provodi zonsko-brzinsko ili zonsko-izopikničko frakcioniranje u potrebnom vremenskom razdoblju. Ekstrakcija frakcija se provodi pri brzini rotora od 3000 o/min - min-1. Sadržaj rotora istiskuje se dodavanjem "jastuka" s periferije, prije svega se istiskuju manje gusti slojevi. Zbog posebnog dizajna aksijalnog kanala Andersonovog rotora, nema miješanja zona tijekom njihovog pomicanja. Izlazni gradijent prolazi kroz uređaj za snimanje, na primjer ćeliju spektrofotometra, s kojom se sadržaj proteina može odrediti apsorpcijom na 280 nm, ili kroz poseban detektor radioaktivnosti, nakon čega se skupljaju frakcije.

Kapacitet zonskih rotora koji se koriste pri srednjim brzinama varira od 650 do 1600 cm3, što omogućuje dobivanje prilično velike količine materijala. Zonski rotori koriste se za uklanjanje kontaminanata proteina iz raznih pripravaka te za izolaciju i pročišćavanje mitohondrija, lizosoma, polisoma i proteina.

2.6.4 Analiza subcelularnih frakcija

Svojstva pripravka subcelularnih čestica dobivenih frakcioniranjem mogu se pripisati svojstvima samih čestica samo ako pripravak ne sadrži nečistoće. Stoga je uvijek potrebno procijeniti čistoću dobivenih pripravaka. Učinkovitost homogenizacije i prisutnost nečistoća u preparatu može se utvrditi mikroskopskim pregledom. Međutim, nepostojanje vidljivih nečistoća još nije pouzdan dokaz čistoće lijeka. Kako bi se kvantificirala čistoća dobivenog pripravka, podvrgava se kemijskoj analizi, koja omogućuje određivanje sadržaja proteina ili DNA u njemu, određivanje njegove enzimske aktivnosti, ako je moguće, i imunološka svojstva.

Analiza raspodjele enzima u frakcioniranim tkivima temelji se na dva opća načela. Prvi od njih je da sve čestice određene podstanične populacije sadrže isti skup enzima. Drugi pretpostavlja da je svaki enzim lokaliziran na nekom specifičnom mjestu unutar stanice. Kad bi ovo stajalište bilo točno, tada bi enzimi mogli djelovati kao markeri za odgovarajuće organele: na primjer, citokrom oksidaza i monoaminooksidaza bi služile kao enzimi mitohondrijskih markera, kisele hidrolaze kao markeri lizosoma, katalaza kao marker peroksisoma, a glukoza-6- fosfataza – marker mikrosomske membrane. Međutim, pokazalo se da su neki enzimi, na primjer malat dehidrogenaza, P-glukuronidaza, NADP-H-citokrom-c-reduktaza, lokalizirani u više od jedne frakcije. Stoga je izbor markerskih enzima substaničnih frakcija u svakoj specifičnoj slučaju treba pristupiti s velikom pažnjom. Štoviše, odsutnost enzima markera ne znači odsutnost odgovarajućih organela. Vjerojatno je da tijekom frakcioniranja organele gube enzim ili su ga inhibirali ili inaktivirali, tako da najmanje dva enzimi markeri obično se određuju za svaku frakciju.

Frakcija	Volumen, cm"	Opći uzgoj	Eksnulacija, 660 nm	Jedinice aktivnosti enzima	Prinos aktivnosti u frakcijama, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Frakcioniranje diferencijalnim centrifugiranjem

2.7.1 Prezentacija rezultata

Rezultate dobivene frakcioniranjem tkiva najprikladnije je prikazati u obliku grafikona. Dakle, kada se proučava raspodjela enzima u tkivima, podaci su najbolje prikazani u obliku histograma, koji omogućuju vizualnu procjenu rezultata pokusa.

Enzimska aktivnost sadržaja proteina u uzorku određena je kako u izvornom homogenatu tako iu svakoj izoliranoj substaničnoj frakciji zasebno. Ukupna enzimska aktivnost i sadržaj proteina u frakcijama ne bi se trebali značajno razlikovati od odgovarajućih vrijednosti u izvornom homogenatu.

Zatim se izračunava enzimska aktivnost i sadržaj proteina u svakoj frakciji u % ukupnog prinosa, na temelju čega se izrađuje histogram. Relativna količina proteina u svakoj frakciji uzastopno je ucrtana duž apscisne osi redoslijedom njihove izolacije, a relativna specifična aktivnost svake frakcije ucrtana je duž ordinatne osi. Dakle, enzimska aktivnost svake frakcije određena je iz područja šipki.

2.7.2 Analitičko ultracentrifugiranje

Za razliku od preparativnog centrifugiranja, čija je svrha odvajanje tvari i njihovo pročišćavanje, analitičko ultracentrifugiranje se uglavnom koristi za proučavanje sedimentacijskih svojstava bioloških makromolekula i drugih struktura. Stoga se u analitičkom centrifugiranju koriste rotori i sustavi za snimanje posebnog dizajna: oni vam omogućuju kontinuirano praćenje sedimentacije materijala u centrifugalnom polju.

Analitičke ultracentrifuge mogu doseći brzine do 70.000 okretaja u minuti, dok generiraju centrifugalno ubrzanje do 500.000 g. Njihov rotor, u pravilu, ima oblik elipsoida i žicom je povezan s motorom, što omogućuje promjenu brzine vrtnje rotora. Rotor se okreće u vakuumskoj komori opremljenoj rashladnim uređajem i ima dvije ćelije, analitičku i balansnu, koje su ugrađene u centrifugu strogo okomito, paralelno s osi rotacije. Ćelija za balansiranje služi za balansiranje analitičke ćelije i metalni je blok s preciznim sustavom. Također ima dvije indeksne rupe smještene na strogo određenoj udaljenosti od osi rotacije, uz pomoć kojih se određuju odgovarajuće udaljenosti u analitičkoj ćeliji. Analitička ćelija, čiji je kapacitet obično 1 cm3, ima sektorski oblik. Kada je pravilno ugrađen u rotor, unatoč tome što je uspravan, radi na istom principu kao rotor s visećim žlicama, stvarajući gotovo idealne uvjete taloženja. Na krajevima analitičke ćelije nalaze se prozori s kvarcnim staklima. Analitičke ultracentrifuge opremljene su optičkim sustavima koji omogućuju praćenje taloženja čestica tijekom cijelog perioda centrifugiranja. U unaprijed određenim vremenskim intervalima, materijal koji se taloži može se fotografirati. Kod frakcioniranja proteina i DNA sedimentacija se prati apsorpcijom u ultraljubičastom zračenju, au slučajevima kada ispitivane otopine imaju različite indekse loma, schlieren sustavom ili Rayleighovim interferencijskim sustavom. Posljednje dvije metode temelje se na činjenici da kada svjetlost prolazi kroz prozirnu otopinu koja se sastoji od zona različite gustoće, svjetlost se lomi na granici zone. Tijekom taloženja nastaje granica između zona s teškim i lakim česticama, koja djeluje kao lomna leća; u ovom slučaju se na fotografskoj ploči koja se koristi kao detektor pojavljuje vrh. Tijekom sedimentacije pomiče se granica, a time i vrh, po čijoj se brzini može suditi o brzini taloženja materijala. Interferometrijski sustavi su osjetljiviji od schlieren sustava. Analitičke ćelije su jednosektorske, koje se najčešće koriste, i dvosektorske, koje se koriste za usporedno proučavanje otapala i otopljene tvari.

U biologiji se analitičko ultracentrifugiranje koristi za određivanje molekulskih težina makromolekula, za provjeru čistoće dobivenih uzoraka i za proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama.

2.8 Primjena analitičkog ultracentrifugiranja

2.8.1 Određivanje molekulskih masa

Postoje tri glavne metode za određivanje molekulskih težina pomoću analitičkog ultracentrifugiranja: određivanje brzine sedimentacije, metoda ravnoteže sedimentacije i metoda aproksimacije ravnoteže sedimentacije.

Određivanje molekularne mase brzinom sedimentacije je najčešća metoda. Centrifugiranje se provodi velikim brzinama, tako da se čestice, u početku ravnomjerno raspoređene po volumenu, počnu redom kretati duž radijusa od središta rotacije. Između područja otapala, koje je već slobodno od čestica, i onog njegovog dijela koji ih sadrži, formira se jasno sučelje. Ta se granica pomiče tijekom centrifugiranja, što omogućuje određivanje brzine taloženja čestica pomoću jedne od navedenih metoda, bilježeći to kretanje na fotografskoj ploči.

Brzina sedimentacije određena je sljedećim odnosom:

gdje je x udaljenost od osi rotacije u cm,

t - vrijeme u s,

w je kutna brzina u rad-s-1,

s je koeficijent sedimentacije “molekule.

Koeficijent taloženja je brzina po jedinici ubrzanja i mjeri se u Seedbergovim jedinicama; 1 Swedbergova jedinica jednaka je 10_13 s. Brojčana vrijednost s ovisi o molekularnoj masi i obliku čestica i vrijednost je karakteristična za danu molekulu ili supramolekulsku strukturu. Na primjer, koeficijent sedimentacije lizozima je 2,15 S; katalaza ima sedimentacijski koeficijent od 11,35S, bakterijske ribosomske podjedinice od 30 do 50S, a eukariotske ribosomske podjedinice od 40 do 60S.

gdje je M molekularna težina molekule, R je plinska konstanta, T je apsolutna temperatura, s je koeficijent sedimentacije molekule, D je koeficijent difuzije molekule, v je parcijalni specifični volumen, koji se može smatra se volumenom koji zauzima jedan gram otopljene tvari, p je gustoća otapala.

Metoda sedimentacijske bilance. Određivanje molekulskih masa ovom metodom provodi se pri relativno niskim brzinama rotora, reda veličine 7000-8000 o/min, tako da se molekule velike molekulske mase ne talože na dno. Ultracentrifugiranje se provodi sve dok čestice ne postignu ravnotežu koja se uspostavlja pod djelovanjem centrifugalnih sila, s jedne strane, i difuzijskih sila, s druge strane, odnosno dok se čestice ne prestanu gibati. Zatim se prema dobivenom koncentracijskom gradijentu izračunava molekularna težina tvari "prema formuli

gdje je R plinska konstanta, T apsolutna temperatura, ω kutna brzina, p gustoća otapala, v parcijalni specifični volumen, cx i c2 koncentracija otopljene tvari na udaljenostima r i r2 od os rotacije.

Nedostatak ove metode je što je za postizanje sedimentacijske ravnoteže potrebno dosta vremena - od nekoliko dana do nekoliko tjedana uz kontinuirani rad centrifuge.

Metoda približavanja sedimentacijskoj ravnoteži razvijena je kako bi se uklonili nedostaci prethodne metode, povezani s velikim ulaganjem vremena potrebnog za "uspostavljanje ravnoteže. Pomoću ove metode mogu se odrediti molekularne težine kada je centrifugirana otopina u stanje približavanja ravnoteži. Prvo se makromolekule ravnomjerno raspoređuju po cijelom volumenu analitičke ćelije, zatim se, kako centrifugiranje nastavlja, molekule talože, a gustoća otopine u području meniska postupno opada. Promjena gustoće je pažljivo bilježi, a zatim se složenim izračunima koji uključuju velik broj varijabli molekularna težina danog spoja određuje formulama:

gdje je R plinska konstanta, T apsolutna temperatura, v parcijalni specifični volumen, p gustoća otapala, dcldr koncentracijski gradijent makromolekule, gm i gd udaljenost do meniska i dna epruveta, cm i sd su koncentracija makromolekula na meniskusu i y dnu epruvete, Mm i MR su vrijednosti molekulskih težina određene iz distribucije koncentracije tvari na meniskus odnosno dno cijevi.

2.8.2 Ocjena čistoće preparata

Analitičko ultracentrifugiranje naširoko se koristi za procjenu čistoće DNA, virusa i proteinskih pripravaka. Čistoća pripravaka nedvojbeno je vrlo važna u slučajevima kada je potrebno točno odrediti molekularnu masu molekule. U većini slučajeva, homogenost preparata može se procijeniti prema prirodi granice sedimentacije, koristeći metodu brzine sedimentacije: homogeni preparat obično daje jednu oštro definiranu granicu. Nečistoće prisutne u preparatu pojavljuju se kao dodatni vrh ili rame; također određuju asimetriju glavnog vrha.

2.8.3 Proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama

Drugo područje primjene analitičkog ultracentrifugiranja je proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama. Molekula DNA, na primjer, može biti jednolančana ili dvolančana, linearna ili kružna. Pod utjecajem različitih spojeva ili na povišenim temperaturama, DNA prolazi niz reverzibilnih i ireverzibilnih konformacijskih promjena, koje se mogu utvrditi promjenom brzine sedimentacije uzorka. Što je molekula kompaktnija, to je manji njen koeficijent trenja u otopini i obrnuto: što je manje kompaktna, to je veći koeficijent trenja i, posljedično, sporije će se taložiti. Dakle, razlike u brzini sedimentacije uzorka prije i nakon različitih utjecaja na njega omogućuju otkrivanje konformacijskih promjena koje se događaju u makromolekulama.

U alosteričkim proteinima, kao što je, na primjer, aspartat transkarbamoilaza, dolazi do konformacijskih promjena kao rezultat njihovog vezanja na supstrat i male ligande. Disocijacija proteina u podjedinice može se potaknuti tretiranjem sa tvarima kao što su urea ili parakloromerkuribenzoat. Sve ove promjene mogu se lako pratiti pomoću analitičkog ultracentrifugiranja.

Filtriranje je proces odvajanja suspendiranih krutih tvari u tekućinama ili plinovima. Tekućina ili plin koji sadrži krute čestice prolazi kroz porozni materijal (filtar) čija je veličina pora toliko mala da krute čestice ne prolaze kroz filtar. Veličine pora određuju sposobnost filtra da zadrži krute čestice različitih veličina, kao i njegov učinak, odnosno količinu tekućine koja se može odvojiti u jedinici vremena.

Na proces filtracije utječe viskoznost tekućine i razlika u tlaku s obje strane filtra. Što je tekućina viskoznija, to ju je teže filtrirati. Budući da viskoznost tekućine opada s porastom temperature, vruće tekućine je lakše filtrirati od hladnih. Filtriranje viskoznih tekućina često se može olakšati njihovim razrjeđivanjem otapalom koje se lako može destilirati nakon završetka filtracije. Što je veća razlika tlaka, to je veća brzina filtracije. Stoga se filtracija često provodi pri sniženom ili prekomjernom tlaku. Prilikom filtriranja pod pritiskom želatinoznih taloga, potonji su čvrsto pričvršćeni za filter, čije se pore lako začepe i filtriranje prestaje.

Ako je veličina čestica krute faze manja od veličine pora filtera, suspenzija se ne može filtrirati. Dakle, obični papirnati filteri ne zadržavaju fine čestice mnogih koloidnih otopina. U takvim slučajevima prije filtriranja koloidna otopina se zagrijava ili joj se dodaje elektrolit, što dovodi do koagulacije (uvećanje čestica i stvaranje taloga).

Kada je svrha filtracije dobiti bistri filtrat, a ne čisti talog, radi boljeg odvajanja finih čestica od tekućine, u potonju se dodaje mala količina aktivnog ugljena u prahu, protrese se i filtrira.

Filtriranje smjesa koje sadrže tvari koje začepljuju pore filtera i stvaraju viskozne slojeve na njemu često se olakšava dodatkom finog kvarcnog pijeska, dijatomejske zemlje, azbestnih vlakana, celulozne (papirne) pulpe.

Filtriranje se može provoditi na različite načine, ovisno o prirodi tekućina koje se filtriraju i svojstvima krute faze (taloga) koju treba odvojiti od tekućine ili plina.

Ako se kruta faza smjese lako taloži, tada se veći dio može prije same filtracije ukloniti dekantiranjem. Dekantacija - najjednostavnija metoda odvajanja krute i tekuće faze - temelji se na činjenici da se u nedostatku miješanja krutina taloži na dno posude, a bistra tekućina se može odvojiti odvajanjem od istaloženog taloga. Ponekad se dekantiranje također može koristiti za odvajanje dviju krutina različite gustoće. Dekantiranje u sifon često se koristi za ispiranje teško topljivih krutih tvari (slika 118). Pranje dekantacijom mnogo je učinkovitije od ispiranja filtarskog kolača, gdje tekućina obično ne prodire ravnomjerno između krutih čestica.

Filtracija pod utjecajem vlastite težine tekućine

Ova metoda filtracije obično se koristi u slučajevima kada filtrirana čvrsta faza nije potrebna (uklanjanje mehaničkih nečistoća iz otopina), ili kada se tekuća faza može potpuno ukloniti ponovnim tretmanom taloga odgovarajućim otapalom.

Konvencionalna filtracija se koristi kada se moraju filtrirati vruće koncentrirane otopine ili otopine kristalnih tvari u hlapljivim otapalima. Kad se takve otopine filtriraju u vakuumu, otapalo isparava ispod filtra, koji se brzo hladi i začepljuje istaloženim kristalima.

Kao filtarski materijal koriste se uglavnom različiti filtarski papiri, gotovi papirnati filtri bez masnoće i bez pepela.

Filtarski papir za izravnu uporabu proizvodi se u dva stupnja: FNB - brza filtracija s veličinom pora od 3,5-10 mikrona i FNS - srednje brza filtracija s veličinom pora od 1-2,5 mikrona. Sadržaj pepela u papiru ovih razreda je do 0,2%.

Za izradu bezpepelnih i bezmasnih papirnatih filtara proizvodi se filtarski papir triju razreda: FOB - brza filtracija; FOS - srednja filtracija; POF - spora filtracija.

Gotovi papirnati filtri okruglog oblika, bezmasni (sa žutom trakom) i bez pepela, proizvode se u različitim promjerima u pakiranjima od 100 kom. Odabir veličine filtra ovisi o masi čvrstih tvari koje treba odvojiti, a ne o volumenu tekućine koju treba filtrirati.

Filtri bez pepela za laboratorijski rad razlikuju se po svojstvu odvajanja (zadržavanja). Ova razlika je određena bojom papirne trake, koja je zalijepljena preko paketa.

Prihvaćene su sljedeće oznake: bijela traka - brzo filtriranje, crvena - srednje filtriranje, plava - sporo filtriranje, dizajnirano za filtriranje sitnozrnatih sedimenata (tip BaSO4).

Izbor marke filtera u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o svojstvima izdvojene krutine. Vrlo guste filtere treba koristiti samo kada je to apsolutno neophodno.

Za filtriranje koncentriranih otopina jakih kiselina ili lužina ne mogu se koristiti filtar papir i gotovi filtri jer se time smanjuje mehanička čvrstoća filtara.

Papirnati filteri su jednostavni i presavijeni (obični). Za izradu jednostavnog glatkog filtra, okrugli komad filter papira određene veličine presavije se četiri puta i izreže škarama tako da se dobije sektor kruga. Ovisnost promjera filtra o promjeru staklenog lijevka za filtriranje prikazana je u nastavku:

Glatki filtar trebao bi dobro pristajati uz stijenke lijevka, posebno na vrhu. Da biste to učinili, pri savijanju filtra preporuča se savijati polukrug ne duž srednje linije, već duž paralelne linije blizu nje.

Presavijeni filtar se stavi u lijevak (možete ga napuniti sedimentom najviše 1/3 ili 1/2), navlažite ga destiliranom vodom i napunite izljev (cijev) vodom. Da biste to učinili, filtar se podiže i brzo spušta. Rubovi filtra trebaju biti 5-10 mm ispod ruba lijevka. Mokri filtar lagano se pritisne na lijevak. Filtriranje počinje odmah kako bi se izljev lijevka zadržao ispunjen tekućinom. Nemojte puniti lijevak otopinom više od 3/4 volumena. Vrh grlića treba dodirivati ​​unutarnju stijenku čaše za filtrat kako bi se spriječilo prskanje.

Jednostavni glatki filtri obično se koriste u analitičkim laboratorijima za filtriranje razrijeđenih otopina.

Filtriranje se znatno ubrzava korištenjem nabranih filtara. Ovi filtri se lako izrađuju (slika 119). Nabori filtra ne bi se smjeli približiti njegovom središtu, inače bi papir u središtu filtra mogao probiti. Gotovi filtar umetne se u lijevak tako da je uz njegove zidove. Ako lijevak ima kut veći ili manji od 60°, filtar se tome prilagođava promjenom položaja drugog nabora. Potrebno je da filtar ima dovoljno oštar kraj, filtar papir nije oštećen ponovnim savijanjem.

Prije stavljanja pripremljenog filtera u lijevak, on se rasklopi i savije tako da vanjska strana filter papira bude na unutarnjoj strani filtera. Filter ispravno postavljen u lijevak navlaži se filtriranom tekućinom ili destiliranom vodom.

Prilikom filtriranja vrućih otopina i korištenja lijevka velikog promjera, vrh filtra može probiti. Da bi se ova opasnost otklonila, u veliki lijevak umetne se mali ili poseban rupičasti porculanski umetak, a najbolje je filtrirati kroz dva nabrana filtera složena zajedno.

Oprema za filtriranje pri atmosferskom tlaku i sobnoj temperaturi je jednostavna i sastoji se od lijevka, filtera, prijemnika i stalka. Za filtriranje vrućih zasićenih otopina krutih tvari koriste se široki skraćeni lijevci, a za brzo filtriranje velikih volumena tekućina koriste se valoviti lijevci čije neravne stijenke u kombinaciji s glatkim filtrima povećavaju efektivnu površinu filtriranja. Lijevak se učvrsti u prstenu pričvršćenom za laboratorijsko postolje, ili se umetne izravno u grlo tikvice - primatelja filtrata. U potonjem slučaju potrebno je ispod lijevka staviti traku filter papira kako bi zrak istisnut filtratom mogao izaći iz tikvice.

Filtriranje je često teško ako se između papirnatog filtra i stijenke lijevka stvori zračni raspor (zračni džep). Kako bi se to izbjeglo, unutar lijevka se stvara lagani višak tlaka: lijevak se prekrije komadom filtar papira navlaženog duž rubova i okrenutim lijevkom istog promjera. Zrak se gumenim balonom potiskuje kroz cijev gornjeg lijevka i time uklanja zračni džep.

Kako bi se ubrzala filtracija, cijev lijevka se produžuje: staklena cijev istog (ili nešto manjeg) unutarnjeg promjera spojena je gumenom cijevi na izljev. Nakon nekog vremena, cijela cijev se napuni kolonom filtrata, stvarajući vakuum.

Jako alkalne otopine i otopine fluorovodične kiseline preporuča se filtrirati kroz lijevak od poroznog polietilena. Za izradu takvog lijevka (sl. 120) koriste se dva staklena lijevka, od kojih se vanjski zatvara na mjestu suženja čepom, a unutarnji se na istom mjestu topi. Smjesa polietilenskog praha i fino mljevenog natrijevog klorida u masenom omjeru 1:4 stavlja se između stijenki lijevka i drži u pećnici na 130-150 °C. S vremena na vrijeme, unutarnji lijevak se okreće pod pritiskom kako bi se polutekuća masa ravnomjerno nanijela na unutarnju površinu vanjskog lijevka. Nakon hlađenja uklanja se unutarnji lijevak, uklanja se čep s cijevi vanjskog lijevka, a sinterirana masa se ispere toplom vodom da se ukloni natrijev klorid.

Brzina filtracije izravno je proporcionalna hidrostatskom tlaku tekućine koja se filtrira, stoga je pri filtriranju velikih količina tekućina korisno održavati stalnu razinu tekućine na filtru. Na sl. 121 prikazuje jednostavne domaće uređaje za automatsko dodavanje tekućine u filtar. Spremnik s tekućinom zatvoren je čistim gumenim čepom opremljenim cijevi za dovod tekućine i cijevi za dovod zraka. Razina donjeg kraja cijevi za dovod zraka određuje razinu tekućine na filtru. Ako razina padne, tada zrak ulazi u posudu i istiskuje tekućinu na filter. Kao rezultat toga, razina tekućine na filteru raste, a pristup zraku unutar posude je zatvoren.

Filtriranje tijekom zagrijavanja ili hlađenja

Filtriranje grijanjem provodi se kada je potrebno pročistiti vruće koncentrirane otopine od nečistoća, filtrirati viskozne otopine, kao i otopine koje sadrže tvari koje lako kristaliziraju na normalnoj temperaturi.

Prije svega potrebno je pažljivo odabrati kvalitet filter papira, veličinu filtera i lijevka kako bi se proces ubrzao. Prije izlijevanja vruće otopine na filtar, lijevak s umetnutim filtrom zagrijava se propuštanjem kroz filtar vrućeg čistog otapala ili pare otapala ako se zagrijava u kupelji do vrenja. U potonjem slučaju, lijevak je prekriven satnim staklom. Prije filtriranja otapalo iz spremnika se izlije tako da ne razrijedi filtrat. Održavajte visoku razinu tekućine na filtru kako biste ubrzali filtraciju.

Lijevak s filtrom također se može grijati metalnim lijevkom za vruću filtraciju (slika 122, a) ili lijevkom, između čijih dvostrukih stijenki prolazi vruća voda, para ili vrući zrak (slika 122, b). Zagrijavanje se također može izvesti uranjanjem električnog grijača u filtriranu otopinu, ako potonja ne sadrži tvari koje reagiraju s metalom.

Za ravnomjerno zagrijavanje staklenog laboratorijskog posuđa koriste se i pleteni poklopci (kape) s električnim grijanjem. Obično su izrađeni od tanke staklene niti i sadrže savitljivi grijaći element u obliku tanke žice ili zavojnice.

Ohlađena filtracija može se provesti u lijevku hlađenom ledom ili u lijevku s ohlađenom slanom vodom koja teče između dvostrukih stijenki.

Filtracija pod sniženim tlakom

Filtriranje pod sniženim tlakom omogućuje postizanje potpunijeg odvajanja krutine od tekućine i povećanje brzine procesa.

Aparat za vakuumsku filtraciju sastoji se od uređaja za filtriranje, prijemnika, vodene mlazne pumpe i sigurnosne boce.

Kod filtriranja većih količina tvari najčešće se koriste perforirani porculanski ili stakleni cilindrični Buchnerovi lijevci u obliku proreza, umetnuti u konusne tikvice za filtriranje pod vakuumom s cjevčicom; potonji su povezani s vodenom mlaznom pumpom kroz sigurnosnu bocu. Potrebno je da veličina lijevka odgovara količini filtrirane krutine, koja mora u potpunosti prekriti površinu filtera. Međutim, predebeli sloj taloga otežava usisavanje i naknadno pranje.

Filter za Buchnerove lijevke je okrugli list filter papira postavljen na perforiranu pregradu lijevka. Promjer filtra trebao bi biti nešto manji od promjera pregrade. Veliki Buchnerovi lijevci obično imaju dva filtra naslagana jedan na drugi. Kako bi postavljeni papirnati filtar dovoljno čvrsto pristajao na perforiranu pregradu lijevka, prethodno se navlaži na lijevku otapalom i ravnomjerno pritisne na njega. Zatim, nakon uklanjanja otapala, smjesa koju treba filtrirati se ulije u lijevak i usisava.

U slučaju vodenih otopina, male količine vode korištene za vlaženje filtra nisu važne. U onim slučajevima kada je prisutnost vode neprihvatljiva, mokri filtar, nakon što je dobro prianjao, ispere se etilnim alkoholom ili acetonom, a zatim otapalom čija je prisutnost u filtratu prihvatljiva. Filter papir namočen organskim otapalom ne lijepi se za lijevak tako dobro kao kada je namočen vodom.

Buechnerovi lijevci pričvršćeni su u konusne tikvice s gumenim čepovima ili debelim ravnim komadima gume koji pokrivaju vrat tikvice odozgo; potonji su prikladni jer se ne mogu usisati u tikvicu tijekom filtracije.

Da bi se matična otopina potpuno odvojila, talog na filtru se istiskuje ravnom površinom staklenog čepa ili cilindrom debelih stijenki s ravnim dnom, sve dok tekućina ne prestane kapati. U tom slučaju potrebno je osigurati da se na površini debelog sloja sedimenta ne formiraju pukotine, jer to dovodi do nepotpunog usisavanja matične tekućine i onečišćenja sedimenta. Da bi se uklonila zaostala matična tekućina, talog se ispere na filtru malim obrocima otapala pri atmosferskom tlaku. Kada je filtarski kolač zasićen otapalom, ponovno se primjenjuje usisni vakuum.

Pri filtriranju s usisavanjem, filtri od sintetičkih vlakana koriste se kao filtarski materijal uz konvencionalne papirnate filtre. Dakle, filtri od PVC-a ili poliesterskih vlakana otporni su na kiseline i lužine, ali ih uništavaju organska otapala.

Za odvajanje teško filtrirajućih ljepljivih taloga često se koristi azbestna masa koja se može zbijati na usisnom lijevku ili Gooch tiglu. Azbestna masa priprema se na sljedeći način: azbest se melje u porculanskom tarioniku sa konc. HCl, pretočiti masu u čašu i kuhati 20-30 minuta u komori. Zatim se masa razrijedi 20-30 puta volumenom destilirane vode, filtrira na Buchnerovom lijevku i ispire vodom dok ne nestane kisela reakcija u filtratu. Zatim se masa suši na 100-120 °C i kalcinira u muflu. Kalcinirani azbest se mućka s vodom dok se ne dobije homogena masa, prenosi na filtarsku ploču lijevka ili Gooch lončića, odsisava i zbija.

Lijevci, lonci i plinski filtri s zalemljenom pločom od sinteriranog staklenog praha izuzetno su prikladni za filtriranje. Stakleni filtri koriste se za odvajanje krutih tvari od tekućina tijekom filtracije i ekstrakcije, za uklanjanje čestica magle iz plinova, za mjehuriće (distribuciju) plinova u tekućinama. Stakleni filteri su, međutim, nezgodni u slučajevima kada je potrebno kvantitativno taloženje, jer je teško potpuno ukloniti talog iz filtera. Nisu prikladni za filtriranje vrlo koncentriranih vrućih otopina lužina i karbonata alkalnih metala.

Poroznost staklenih filtarskih ploča i njihove oznake često su se mijenjale. Prema GOST 9775-69, klasa filtra ovisi o veličini pora (tablica 8).

Vrste staklenih lijevaka i lonaca s poroznim filterima prikazane su na sl. 123.

Osim staklenih proizvoda s filtrima za tekućine, proizvode se i proizvodi s filtrima za filtriranje i pranje plinova.

Dostupni su i filterski lijevci s temperaturno kontroliranom cijevi i temperaturno kontroliranim plaštom (Sl. 124). Lijevci s električnim grijanjem namijenjeni su za filtriranje u zagrijanom stanju kristalizirajućih i viskoznih otopina i suspenzija na sobnoj temperaturi. Zagrijavanjem lijevka filtera do 130°C eliminira se skrućivanje otopine, a filtracija se odvija brzo.

Glavni element filterskog lijevka s električnim grijanjem i temperaturno reguliranom cijevi je stakleni filter promjera 40 mm sa zalemljenom staklenom cijevi tankih stijenki, koji sadrži električni grijač od 30 W. Lijevci su dostupni s filterima veličine 40, 100, 160 mikrona.

U grijanom lijevku filtra, kontrola temperature je osigurana tekućim nosačem topline. Volumen lijevka iznad filtra s cijevi s kontroliranom temperaturom je 80 ml, s plaštom s kontroliranom temperaturom - 58 ml.

Za odvajanje tekućine od krutine koristi se obrnuti potopni filtarski lijevak (Sl. 123, d). Filter se uranja u tekućinu i filtrat ulazi u prijemnik na koji je filter spojen. S ovim uređajem prikladno je provoditi filtraciju na nižoj temperaturi, održavajući nisku temperaturu smjese koju treba filtrirati pomoću kupelji za hlađenje.

Za odvajanje manjih količina tvari koristi se lijevak sa staklenim "čepkom" koji se obloži okruglim komadom filter papira. Da biste to učinili, kraj staklene šipke omekša se u plamenu plamenika, a zatim se spljošti, pritišćući ga na ravnu vodoravnu površinu metalne ploče. Potrebno je da filtar dobro prianja uz "karanfil", a rubovi filtra su savijeni za 1-2 mm duž stijenke lijevka. Prihvatnik filtrata je cijev za filtriranje (s bočnim izlazom).

Za filtriranje tvari s niskim talištem ili visoko topljivih na sobnoj temperaturi, tijekom hlađenja koristi se vakuum. U slučaju manjih količina taloga, lijevak i otopina se prethodno ohlade u hladnjaku. U drugim slučajevima, Buchnerov lijevak se ugrađuje u bocu s odrezanim dnom, ispunjavajući potonju ledom ili rashladnom smjesom.

Pri filtriranju u atmosferi inertnog plina, instalacije prikazane na sl. 125.

Analitički aerosol filteri AFA

AFA filtri se koriste za proučavanje i kontrolu aerosola sadržanih u zraku ili drugim plinovima. AFA filteri se sastoje od filterskog elementa odvojenog ili zalijepljenog na noseći prsten i zaštitnih papirnatih prstenova s ​​izbočinama.

Kao filtarski element koristi se filtarski materijal FP (Petryanov filter) izrađen od ultratankih polimernih vlakana (celulozni acetat, perklorovinil, polistiren). Radna površina okruglog presjeka filtera 3, 10, 20 i 160 cm2.

centrifugiranje

Centrifugiranje je jedna od metoda razdvajanja heterogenih sustava (tekućina - tekućina, tekućina - krute čestice); u rotorima pod djelovanjem centrifugalnih sila. Centrifugiranje je korisno koristiti ako filtrirane tvari začepe pore filtra, kvare se u dodiru s materijalom filtra ili su fino raspršene.

Centrifugiranje se provodi u posebnim aparatima koji se nazivaju centrifuge. Glavni dio centrifuge je rotor koji se vrti velikom brzinom.

Vrste centrifuga su brojne; dijele se prvenstveno prema veličini faktora razdvajanja. Jednaka je omjeru ubrzanja centrifugalnog polja koje se razvija u centrifugi i ubrzanja sile teže. Faktor razdvajanja je bezdimenzijska veličina. Učinak odvajanja centrifuge raste proporcionalno faktoru odvajanja.

Faktor razdvajanja za električne centrifuge domaće industrije varira od 1.600 do 300.000, a brzina rotora varira od 1.000 do 50.000 o/min.

Heterogeni sustavi u centrifugama odvajaju se sedimentacijom ili filtracijom. Ovisno o tome, centrifuge dolaze s čvrstim rotorom ili s perforiranim, prekrivenim filtarskim materijalom.

Centrifugiranje taloženjem provodi se kako bi se razbistrila tekućina koja sadrži suspendirane krutine ili kako bi se taložila čvrsta faza. Sastoji se od taloženja krute faze, zbijanja taloga i oslobađanja supernatanta.

U laboratorijskoj praksi koriste se različite vrste centrifuga: s ručnim ili električnim pogonom, stolne (prijenosne), mobilne i stacionarne. Prema veličini faktora razdvajanja centrifuge se dijele na obične (s faktorom razdvajanja manjim od 3500), supercentrifuge i ultracentrifuge (s faktorom razdvajanja najmanje 3500). Konvencionalne centrifuge se uglavnom koriste za odvajanje suspenzija niske disperzije (veće od 10-50 mikrona) različitih koncentracija. Supercentrifuge se uglavnom koriste za odvajanje emulzija i finih suspenzija (veličine manje od 10 mikrona). Za razdvajanje i proučavanje visoko disperznih sustava i makromolekularnih spojeva uobičajene su analitičke i preparativne ultracentrifuge s faktorom razdvajanja većim od 100 000. Analitičke centrifuge koriste se za određivanje molekulske mase i stupnja polimerizacije makromolekulskih spojeva, preparativne centrifuge koriste se za izolirati tvari iz otopina koje su inače u koloidnom stanju ili u obliku neodvojivih suspenzija (proteini, nukleinske kiseline, polisaharidi).

Rotor ultracentrifuge okreće se, u pravilu, u vakuumskoj komori tijekom hlađenja (hladne centrifuge).Brzina i vrijeme vrtnje rotora, kao i temperaturni režim centrifugiranja, kontroliraju se elektroničkim uređajima.

Obrađena otopina se stavlja u posebnu posudu, koja se zatim velikom brzinom okreće na rotoru centrifuge. U ovom slučaju, komponente smjese pod djelovanjem centrifugalne sile raspoređuju se u slojevima na različite dubine (u skladu s masama čestica); najteže se čestice pritišću na dno posude.

Kada se koriste male prijenosne centrifuge s epruvetama s ručnim ili električnim pogonom, suspenzija se postavlja u staklene ili plastične epruvete koje se okreću oko glavne osi, obješene na osovine. Cijevne centrifuge za periodično odvajanje malih količina tvari mogu biti dvije vrste. U nekima, cijevi se drže zavojnicama na rotoru i zauzimaju vodoravni položaj tijekom rotacije, u drugima su kruto pričvršćene pod određenim kutom u odnosu na os rotacije (kutni rotori).

Na sl. 126 prikazuje položaj epruveta tijekom centrifugiranja u kutnom rotoru i u rotoru s oscilirajućim staklima.

Nakon zaustavljanja centrifuge bistra tekuća faza (centrifuga) se ocijedi ili uzme pipetom. Talog se ispere i ponovno centrifugira. Ako je potrebno izdvojiti maksimalnu količinu sedimenta iz epruvete, tada se centrifuga baci, a talog se osuši u vakuumskom eksikatoru bez vađenja iz staklene cijevi centrifuge.

Kod korištenja centrifuga s epruvetama, epruvete izrađene od stakla debelih stijenki ili sintetičkog materijala stavljaju se u zaštitne metalne posude. Dno staklenih epruveta zaštićeno je gumenim brtvama. Staklene epruvete mogu se napuniti do polovice volumena, a epruvete od umjetnih materijala pri velikim brzinama rotora (5000 o/min) treba napuniti gotovo do vrha kako se ne bi deformirale pod djelovanjem centrifugalne sile. Kako bi se osigurala sigurnost rada, potrebno je vrlo precizno uravnotežiti cijevi s centrifugiranom suspenzijom. Neravnoteža pri velikim brzinama može oštetiti rotor. S obzirom da hlapljiva otapala mogu ispariti tijekom centrifugiranja, bolje je zatvoriti epruvete čepovima.

Rotori laboratorijskih centrifuga s epruvetama, osim ručnih centrifuga, smješteni su u zaštitne metalne poklopce (poklopce) tako da nema opasnosti za radnike ako epruveta sa staklom padne s vješalica.

Potrebno je strogo poštivati ​​upute navedene u uputama proizvođača za ovu centrifugu, ne smije se prekoračiti brzina rotora navedena u uputama. Centrifuga se može pokrenuti samo sa zatvorenim sigurnosnim poklopcem; Poklopac se smije otvoriti tek nakon potpunog zaustavljanja centrifuge.

Ručna centrifuga RTs-4. Ova centrifuga je dizajnirana za odvajanje tekućina različitih gustoća ili odvajanje suspendiranih ili uzburkanih čestica od tekućina. Glavni dijelovi centrifuge: tijelo od lijevanog željeza, unutar kojeg su montirani zupčanici (pužni prijenos), držač epruvete, ručka i stezaljka. Na zglobnim ovjesima držača epruvete nalaze se četiri rukavca od karbolita. Tekućine i čvrste čestice različite gustoće raspoređene su na različitim mjestima epruvete tijekom rotacije. Razdvajanje se može provesti istovremeno u četiri epruvete. Za jedan okret ručke, držač cijevi napravi osam okretaja. Za rad, centrifuga je pričvršćena stezaljkom na poklopcu laboratorijskog stola ili na posebnom stalku.

Laboratorijska stolna centrifuga TsLN-2. Centrifuga TsLN-2 radi s rotorom kutnog tipa RU 6x10. Maksimalni volumen materijala koji se centrifugira je 60 cm3. Brzina rotora 3000-8000 o/min; interval frekvencije vrtnje reguliran prekidačem jednak je 1000 okretaja. Faktor razdvajanja doseže 5500. Vrijeme ubrzanja rotora do maksimalne brzine je 10 minuta; vrijeme kočenja ne više od 8 min. Vrijeme neprekidnog rada 60 min; minimalna obavezna pauza je 15 minuta. Radna komora centrifuge zatvorena je poklopcem sa samozatvaračem. Težina centrifuge 8 kg.

Pri radu s centrifugom TsLN-2 zabranjeno je: raditi bez uzemljenja; povećati brzinu vrtnje iznad 8000 o / min; rad s otvorenim poklopcima rotora i centrifuge; rad sa staklenim epruvetama pri brzini rotora preko 4000 o/min; postavljanje epruveta napunjenih centrifugiranim materijalom nije dijametralno suprotno.

Razlika u masi dijametralno postavljenih epruveta napunjenih centrifugiranim materijalom ne smije biti veća od 0,5 g. Gustoća tekućine odvojene u epruvetama od polimernih materijala ne smije biti veća od 2 g/cm3, u staklenim epruvetama - ne više od 1,5 g/cm3.

Kutna mala centrifuga TsUM-1. Centrifuga ima križni rotor za istovremeno centrifugiranje tekućina u četiri epruvete od 25 ml, četiri epruvete od 10 ml i osam epruveta od 5 ml. Brzina rotora je podesiva od 2000 do 8000 okretaja u minuti u koracima. Faktor razdvajanja doseže 6000. Vrijeme ubrzanja rotora je 8-10 minuta. Centrifuga je opremljena električnim satom koji omogućuje podešavanje vremena centrifugiranja od 0 do 60 minuta, nakon čega slijedi automatsko kočenje. Težina centrifuge 16 kg.

Metoda centrifugiranja temelji se na različitom ponašanju čestica u centrifugalnom polju koje stvara centrifuga. Uzorak u posudi za centrifugu stavlja se u rotor koji pokreće pogon centrifuge. Za odvajanje smjese čestica mora se odabrati niz uvjeta, kao što su brzina rotacije, vrijeme centrifugiranja i radijus rotora. Za kuglaste čestice brzina taloženja (sedimentacije) ne ovisi samo o ubrzanju, već i o polumjeru i gustoći čestica, kao i o viskoznosti medija u koji se taloži uzorak.

Centrifugiranje se može podijeliti u dvije vrste: preparativno i analitičko. Preparativno centrifugiranje koristi se kada je potrebno izdvojiti dio uzorka za daljnje istraživanje. Ova metoda se koristi za izolaciju stanica iz suspenzije, bioloških makromolekula itd.

Analitičko centrifugiranje koristi se za proučavanje ponašanja bioloških makromolekula u centrifugalnom polju. Ova metoda omogućuje dobivanje podataka o masi, obliku i veličini molekula u relativno malim volumenima uzoraka. Preparativno centrifugiranje najčešće se susreće u svakodnevnoj laboratorijskoj praksi.

Preparativne laboratorijske centrifuge se pak prema namjeni dijele u skupine: preparativne ultracentrifuge, centrifuge opće namjene i centrifuge velike brzine. Centrifuge opće namjene imaju najveću praktičnu primjenu u medicinskim laboratorijima, s maksimalnom brzinom do 6000 okretaja u minuti. Glavna značajka ove vrste uređaja je njihov relativno veliki kapacitet - do 6 litara, što omogućuje korištenje ne samo centrifugalnih epruveta do 100 ml, već i spremnika do 1,25 litara za centrifugiranje. U svim centrifugama opće namjene, rotori su kruto montirani na pogonsku osovinu, tako da centrifugirani spremnici moraju biti prilično precizno uravnoteženi. Kako bi se izbjeglo lomljenje, u rotor se ne smije stavljati neparan broj epruveta; u slučaju nepotpunog punjenja, spremnik treba staviti jedan nasuprot drugog.

Centrifuge velike brzine imaju najveću brzinu od 25 tisuća okretaja u minuti i ubrzanje do 89 tisuća g. Komora koja sadrži rotor i centrifugirane uzorke opremljena je sustavom za hlađenje kako bi se spriječila toplina koja se stvara trenjem kada se rotor vrti velikom brzinom. Obično ove centrifuge mogu podnijeti volumene do 1,5 litara i opremljene su kutnim ili zamjenjivim rotorima s zdjelom.

Preparativne ultracentrifuge ubrzavaju do 75 000 okretaja u minuti i imaju maksimalno centrifugalno ubrzanje od 510 tisuća g. Opremljeni su rashladnim i vakuumskim jedinicama kako bi se spriječilo pregrijavanje rotora od trenja sa zrakom. Rotori za ove centrifuge izrađeni su od legura titana ili aluminija visoke čvrstoće. Osovina ultracentrifuga, za razliku od brzohodnih i preparativnih, napravljena je fleksibilno kako bi se smanjile vibracije kada je rotor u disbalansu. Kapaciteti u rotoru moraju biti pažljivo uravnoteženi do najbliže desetinke grama.

2.5.1 Priroda gradijenata

Za stvaranje gradijenata gustoće otopina najčešće se koriste otopine saharoze, ponekad s fiksnim pH. U nekim slučajevima, dobro odvajanje se postiže korištenjem D 2 0 umjesto obične vode. 2.1 prikazuje svojstva nekih otopina saharoze.

Odabir gradijenta diktiraju specifični zadaci frakcioniranja. Na primjer, ficol, proizvođača Pharmacia Fine Chemicals, može zamijeniti saharozu u slučajevima kada je potrebno stvoriti gradijente visoke gustoće i niskog osmotskog tlaka. Još jedna prednost ficola je što ne prolazi kroz stanične membrane. Soli teških metala, poput rubidija i cezija, koriste se za stvaranje gradijenata veće gustoće, međutim, zbog korozivnog učinka CsCl, takvi gradijenti se koriste samo u rotorima izrađenim od otpornih metala, kao što je titan.

2.5.2 Tehnika gradijenta gustoće koraka

Za stvaranje gradijenta gustoće, nekoliko otopina s uzastopnim smanjenjem gustoće pažljivo se uvode u epruvetu centrifuge pomoću pipete. Zatim se na najgornji sloj, koji ima najmanju gustoću, slojevito nanosi uzorak u obliku uske zone, nakon čega se epruveta centrifugira. Glatki linearni gradijenti mogu se dobiti izravnavanjem postupnih gradijenata tijekom duljeg stajanja otopine. Proces se može ubrzati laganim miješanjem sadržaja epruvete žicom ili laganim protresanjem epruvete.

2.5.3 Tehnika stvaranja glatkog gradijenta gustoće

U većini slučajeva koristi se poseban uređaj za stvaranje glatkog gradijenta gustoće. Sastoji se od dvije cilindrične posude strogo definiranog identičnog promjera, koje međusobno komuniciraju na dnu staklenom cijevi s kontrolnim ventilom, što vam omogućuje podešavanje omjera u kojima se sadržaj obiju posuda miješa. Jedna od njih je opremljena mješalicom i ima izlaz kroz koji otopina teče u epruvete za centrifugiranje. Gušća otopina se stavlja u miješalicu; drugi cilindar se napuni otopinom manje gustoće. Visina stupca otopina u oba cilindra je postavljena tako da je hidrostatski tlak u njima jednak. Gušća otopina postupno se ispušta iz miješalice u epruvete centrifuge i istovremeno se zamjenjuje jednakim volumenom otopine manje gustoće koja ulazi u miješalicu iz drugog cilindra kroz kontrolni ventil. Homogenost otopine u miješalici osigurava se stalnim miješanjem otopine mješalicom. Kako se otopina cijedi u epruvete za centrifugiranje, njezina gustoća se smanjuje i u epruvetama se stvara linearni gradijent gustoće. Nelinearni gradijenti mogu se stvoriti pomoću sustava koji se sastoji od dva cilindra nejednakog promjera.

Za formiranje gradijenata gustoće različite strmine koristi se sustav od dvije mehanički kontrolirane štrcaljke koje se pune otopinama nejednake gustoće. Promjenom relativne brzine klipova mogu se stvoriti različiti gradijenti.

2.5.4 Ekstrakcija gradijenata iz centrifugalnih epruveta

Nakon završetka centrifugiranja i odvajanja čestica potrebno je ukloniti nastale zone. To se radi na nekoliko načina, najčešće metodom pomaka. Centrifugalna cijev se probuši u dnu iu njen donji dio polako se uvodi vrlo gusti medij, na primjer, 60-70% otopina saharoze. Gornja otopina se istiskuje i frakcije se skupljaju pomoću štrcaljke, pipete ili posebnog uređaja spojenog kroz cijev na kolektor frakcija. Ako su cijevi izrađene od celuloida ili nitroceluloze, frakcije se izdvajaju rezanjem cijevi posebnom oštricom. Da bi se to postiglo, centrifugalna epruveta učvršćena u postolju reže se izravno ispod željene zone i frakcija se usisava špricom ili pipetom. Uz prikladnu konstrukciju uređaja za rezanje, gubitak otopine bit će minimalan. Sakupljanje frakcija također se provodi probijanjem dna epruvete tankom šupljom iglom. Kapi koje teku iz cijevi kroz iglu skupljaju se u kolektor frakcija za daljnju analizu.

2.5.5 Preparativne centrifuge i njihova primjena

Preparativne centrifuge mogu se klasificirati u tri glavne skupine: centrifuge opće namjene, centrifuge velike brzine i preparativne ultracentrifuge. Centrifuge opće namjene dati maksimalnu brzinu od 6000 o/min -1 i OCU do 6000 g . Međusobno se razlikuju samo po kapacitetu i imaju niz izmjenjivih rotora: kutni i s visećim staklima. Jedna od značajki ove vrste centrifuga je njihov veliki kapacitet - od 4 do 6 dm 3 , što im omogućuje punjenje ne samo centrifugalnih cijevi od 10,50 i 100 cm 3 , već i posudama kapaciteta do 1,25 dm 3 . dm 3 . U svim centrifugama ovog tipa rotori su kruto pričvršćeni na pogonsku osovinu, a centrifugalne epruvete, zajedno sa svojim sadržajem, moraju biti pažljivo uravnotežene i razlikuju se u težini ne više od 0,25 g. Trebaju biti postavljene simetrično, jedna naspram drugo, čime se osigurava ravnomjerna raspodjela epruveta u odnosu na os rotacije rotora.

Centrifuge velike brzine daju najveću brzinu od 25.000 o/min -1 i OCU do 89.000g. Komora rotora opremljena je sustavom hlađenja koji sprječava zagrijavanje koje nastaje uslijed trenja tijekom rotacije rotora. U pravilu, centrifuge velike brzine imaju kapacitet od 1,5 dm 3 i opremljene su zamjenjivim rotorima, pod kutom i s visećim staklima.

Preparativne ultracentrifuge daju najveću brzinu do 75.000 o/min -1 i maksimalno centrifugalno ubrzanje od 510.000 g . Opremljeni su i hladnjakom i vakuumskom jedinicom kako bi se spriječilo pregrijavanje rotora zbog njegovog trenja sa zrakom. Rotori takvih centrifuga izrađeni su od legura aluminija ili titana visoke čvrstoće. Uglavnom se koriste rotori od aluminijske legure, međutim, u slučajevima kada su potrebne posebno velike brzine koriste se rotori od titana. Kako bi se smanjile vibracije koje proizlaze iz neravnoteže rotora zbog neravnomjernog punjenja centrifugalnih epruveta, ultracentrifuge imaju fleksibilnu osovinu. Centrifugalne epruvete i njihov sadržaj moraju biti pažljivo uravnoteženi do najbližih 0,1 g. Slične zahtjeve treba poštovati pri punjenju rotora centrifuga za opće namjene.

2.6 Dizajn rotora

2.6.1 Kutni rotori i rotori s visećim žlicama

Rotori preparativnih centrifuga obično su dvije vrste - kutne i viseće kante. Nazivaju se kutnim jer su centrifugalne cijevi postavljene u njih uvijek pod određenim kutom u odnosu na os rotacije. U rotorima s visećim staklima, epruvete su postavljene okomito, a kada se okreću pod djelovanjem rezultirajuće centrifugalne sile, pomiču se u vodoravni položaj; kut nagiba prema osi rotacije je 90°.

U kutnim rotorima, udaljenost koju čestice prijeđu do odgovarajuće stijenke epruvete je vrlo mala, pa se taloženje događa relativno brzo. Nakon sudara sa stijenkama epruvete, čestice skliznu prema dolje i formiraju sediment na dnu. Tijekom centrifugiranja nastaju konvekcijska strujanja koja uvelike kompliciraju odvajanje čestica sličnih sedimentacijskih svojstava. Ipak, rotori sličnog dizajna uspješno se koriste za odvajanje čestica čija brzina taloženja dosta varira.

Kod rotora s visećim čašicama također se uočavaju konvekcijski fenomeni, ali oni nisu tako izraženi. Konvekcija je rezultat činjenice da se pod djelovanjem centrifugalnog ubrzanja čestice talože u smjeru koji nije strogo okomit na os rotacije, te stoga, kao u kutnim rotorima, udaraju o stijenke epruvete i klize na dno.

Učinci konvekcije i vrtloga mogu se donekle izbjeći upotrebom sektorskih cijevi u rotorima s visećim šalicama i podešavanjem brzine rotora; gore navedena, metoda centrifugiranja u gradijentu gustoće također je lišena nedostataka.

2.6.2 Kontinuirani rotori

Kontinuirani rotori dizajnirani su za brzo frakcioniranje relativno malih količina krutog materijala iz suspenzija velikog volumena, na primjer, za izolaciju stanica iz medija kulture. Tijekom centrifugiranja, suspenzija čestica se kontinuirano dodaje u rotor; propusna moć rotora ovisi o prirodi deponovanog preparata i varira od 100 cm 3 do 1 dm 3 po 1 min. Osobitost rotora je da je to izolirana komora posebnog dizajna; njegov sadržaj ne komunicira s vanjskim okolišem, stoga se ne zagađuje niti raspršuje.

2.6.3 Zonski ili Andersonovi rotori

Zonski rotori izrađeni su od aluminijskih ili titanovih legura, koje mogu izdržati vrlo značajna centrifugalna ubrzanja. Obično imaju cilindričnu šupljinu, zatvorenu poklopcem koji se može skinuti. Unutar šupljine, na osi rotacije, nalazi se aksijalna cijev na koju je navučena mlaznica s lopaticama koje dijele šupljinu rotora na četiri sektora. Lopatice ili pregrade imaju radijalne kanale kroz koje se ubrizgava gradijent od aksijalne cijevi do periferije rotora. Zahvaljujući ovakvom dizajnu lopatica, konvekcija je svedena na minimum.

Punjenje rotora odvija se tijekom njegove vrtnje pri brzini od oko 3000 o/min -1 . Unaprijed stvoreni gradijent upumpava se u rotor, počevši od sloja najmanje gustoće, koji je ravnomjerno raspoređen po obodu rotora i drži se na njegovoj vanjskoj stijenci okomito na os rotacije zahvaljujući centrifugalnoj sili . Naknadnim dodavanjem gradijentnih slojeva veće gustoće dolazi do kontinuiranog pomaka prema središtu slojeva manje gustoće. Nakon što se cijeli gradijent upumpa u rotor, on se puni do svog punog volumena otopinom koja se naziva "jastuk", čija je gustoća jednaka ili malo veća od najveće gustoće prethodno oblikovanog gradijenta.

Zatim se kroz aksijalnu cijev slojevito postavlja ispitni uzorak , koji se otopinom manje gustoće istiskuje iz cijevi u volumen rotora, dok se isti volumen "jastuka" uklanja s periferije. Nakon svih ovih postupaka, brzina vrtnje rotora se dovodi na radnu brzinu i provodi se zonsko-brzinsko ili zonsko-izopikničko frakcioniranje u potrebnom vremenskom razdoblju. . Ekstrakcija frakcija se provodi pri brzini rotora od 3000 o/min -1. Sadržaj rotora se istiskuje dodavanjem “jastuka” s periferije, prije svega istiskuju se manje gusti slojevi . Zbog posebnog dizajna aksijalnog kanala Andersonovog rotora, nema miješanja zona tijekom njihovog pomicanja. Izlazni gradijent prolazi kroz uređaj za snimanje, na primjer ćeliju spektrofotometra, s kojom se sadržaj proteina može odrediti apsorpcijom na 280 nm, ili kroz poseban detektor radioaktivnosti, nakon čega se skupljaju frakcije.

Kapacitet zonskih rotora koji se koriste pri srednjim brzinama varira od 650 do 1600 cm 3, što omogućuje dobivanje prilično velike količine materijala. Zonski rotori koriste se za uklanjanje kontaminanata proteina iz raznih pripravaka te za izolaciju i pročišćavanje mitohondrija, lizosoma, polisoma i proteina.

2.6.4 Analiza subcelularnih frakcija

Svojstva pripravka subcelularnih čestica dobivenih frakcioniranjem mogu se pripisati svojstvima samih čestica samo ako pripravak ne sadrži nečistoće. Stoga je uvijek potrebno procijeniti čistoću dobivenih pripravaka. Učinkovitost homogenizacije i prisutnost nečistoća u preparatu može se utvrditi mikroskopskim pregledom. Međutim, nepostojanje vidljivih nečistoća još nije pouzdan dokaz čistoće lijeka. Kako bi se kvantificirala čistoća dobivenog pripravka, podvrgava se kemijskoj analizi, koja omogućuje određivanje sadržaja proteina ili DNA u njemu, određivanje njegove enzimske aktivnosti, ako je moguće, i imunološka svojstva.

Analiza raspodjele enzima u frakcioniranim tkivima temelji se na dva opća načela. Prvi od njih je da sve čestice određene podstanične populacije sadrže isti skup enzima. Drugi pretpostavlja da je svaki enzim lokaliziran na nekom specifičnom mjestu unutar stanice. Kad bi ovo stajalište bilo točno, tada bi enzimi mogli djelovati kao markeri za odgovarajuće organele: na primjer, citokrom oksidaza i monoaminooksidaza bi služile kao enzimi mitohondrijskih markera, kisele hidrolaze kao markeri lizosoma, katalaza kao marker peroksisoma, a glukoza-6- fosfataza – marker mikrosomske membrane. Međutim, pokazalo se da neki enzimi, poput malat dehidrogenaze, R-glukuronidaze, NADP "H-citokrom-c-reduktaze, lokalizirane su u više od jedne frakcije. Stoga izboru enzimskih markera subcelularnih frakcija u svakom konkretnom slučaju treba pristupiti s velikom pažnjom. Štoviše, nepostojanje markerskog enzima ne znači odsutnost odgovarajućih organela. Vjerojatno je da organele gube enzim tijekom frakcioniranja, ili da je inhibiran ili inaktiviran, pa se za svaku frakciju obično određuju najmanje dva enzima markera.

Frakcija	Volumen, cm"	Opći uzgoj	Eksnulacija, 660 nm	Jedinice aktivnosti enzima	Prinos aktivnosti u frakcijama,%

2.7 Frakcioniranje diferencijalnim centrifugiranjem

2.7.1 Prezentacija rezultata

Rezultate dobivene frakcioniranjem tkiva najprikladnije je prikazati u obliku grafikona. Dakle, kada se proučava raspodjela enzima u tkivima, podaci su najbolje prikazani u obliku histograma, koji omogućuju vizualnu procjenu rezultata pokusa.

Enzimska aktivnost sadržaja proteina u uzorku određena je kako u izvornom homogenatu tako iu svakoj izoliranoj substaničnoj frakciji zasebno. Ukupna enzimska aktivnost i sadržaj proteina u frakcijama ne bi se trebali značajno razlikovati od odgovarajućih vrijednosti u izvornom homogenatu.

Zatim se izračunava enzimska aktivnost i sadržaj proteina u svakoj frakciji u % ukupnog prinosa, na temelju čega se izrađuje histogram. Relativna količina proteina u svakoj frakciji uzastopno je ucrtana duž apscisne osi redoslijedom njihove izolacije, a relativna specifična aktivnost svake frakcije ucrtana je duž ordinatne osi. Dakle, enzimska aktivnost svake frakcije određena je iz područja šipki.

2.7.2 Analitičko ultracentrifugiranje

Za razliku od preparativnog centrifugiranja, čija je svrha odvajanje tvari i njihovo pročišćavanje, analitičko ultracentrifugiranje se uglavnom koristi za proučavanje sedimentacijskih svojstava bioloških makromolekula i drugih struktura. Stoga se u analitičkom centrifugiranju koriste rotori i sustavi za snimanje posebnog dizajna: oni vam omogućuju kontinuirano praćenje sedimentacije materijala. u centrifugalno polje.

Analitičke ultracentrifuge mogu postići brzine do 70.000 okretaja u minuti -1, dok generiraju centrifugalno ubrzanje do 500.000 g . Njihov rotor, u pravilu, ima oblik elipsoida i žicom je povezan s motorom, što omogućuje promjenu brzine vrtnje rotora. Rotor se okreće u vakuumskoj komori opremljenoj rashladnim uređajem i ima dvije ćelije, analitičku i balansnu, koje su ugrađene u centrifugu strogo okomito, paralelno s osi rotacije. Ćelija za balansiranje služi za balansiranje analitičke ćelije i metalni je blok s preciznim sustavom. Također ima dvije indeksne rupe smještene na strogo određenoj udaljenosti od osi rotacije, uz pomoć kojih se određuju odgovarajuće udaljenosti u analitičkoj ćeliji. Analitička ćelija, čiji je kapacitet obično 1 cm 3, ima sektorski oblik. Kada je pravilno ugrađen u rotor, unatoč tome što je uspravan, radi na istom principu kao rotor s visećim žlicama, stvarajući gotovo idealne uvjete taloženja. Na krajevima analitičke ćelije nalaze se prozori s kvarcnim staklima. Analitičke ultracentrifuge opremljene su optičkim sustavima koji omogućuju praćenje taloženja čestica tijekom cijelog perioda centrifugiranja. U unaprijed određenim vremenskim intervalima, materijal koji se taloži može se fotografirati. Kod frakcioniranja proteina i DNA sedimentacija se prati apsorpcijom u ultraljubičastom zračenju, au slučajevima kada ispitivane otopine imaju različite indekse loma, schlieren sustavom ili Rayleighovim interferencijskim sustavom. Posljednje dvije metode temelje se na činjenici da kada svjetlost prolazi kroz prozirnu otopinu koja se sastoji od zona različite gustoće, svjetlost se lomi na granici zone. Tijekom taloženja nastaje granica između zona s teškim i lakim česticama, koja djeluje kao lomna leća; u ovom slučaju se na fotografskoj ploči koja se koristi kao detektor pojavljuje vrh. Tijekom sedimentacije pomiče se granica, a time i vrh, po čijoj se brzini može suditi o brzini taloženja materijala. Interferometrijski sustavi su osjetljiviji od schlieren sustava. Analitičke ćelije su jednosektorske, koje se najčešće koriste, i dvosektorske, koje se koriste za usporedno proučavanje otapala i otopljene tvari.

U biologiji se analitičko ultracentrifugiranje koristi za određivanje molekulskih težina makromolekula, za provjeru čistoće dobivenih uzoraka i za proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama.

2.8 Primjena analitičkog ultracentrifugiranja

2.8.1 Određivanje molekulskih masa

Postoje tri glavne metode za određivanje molekulskih težina pomoću analitičkog ultracentrifugiranja: određivanje brzine sedimentacije, metoda ravnoteže sedimentacije i metoda aproksimacije ravnoteže sedimentacije.

Određivanje molekularne težine brzinom sedimentacije - ovo je najčešća metoda. Centrifugiranje se provodi velikim brzinama, tako da se čestice, u početku ravnomjerno raspoređene po volumenu, počnu redom kretati duž radijusa od središta rotacije. Između područja otapala, koje je već slobodno od čestica, i onog njegovog dijela koji ih sadrži, formira se jasno sučelje. Ta se granica pomiče tijekom centrifugiranja, što omogućuje određivanje brzine taloženja čestica pomoću jedne od navedenih metoda, bilježeći to kretanje na fotografskoj ploči.

Brzina sedimentacije određena je sljedećim odnosom:

gdje x - udaljenost od osi rotacije u cm,

t - vrijeme u s,

w je kutna brzina u rad-s -1 ,

s - koeficijent sedimentacije "molekula.

Koeficijent taloženja je brzina po jedinici ubrzanja, a mjeri se u Seedberg jedinice ; 1 Swedbergova jedinica jednaka je 10 _13 s. Brojčana vrijednost s ovisi o molekularnoj masi i obliku čestica i vrijednost je karakteristična za danu molekulu ili supramolekulsku strukturu. Na primjer, koeficijent sedimentacije lizozima je 2,15 S; katalaza ima sedimentacijski koeficijent od 11,35S, bakterijske ribosomske podjedinice od 30 do 50S, a eukariotske ribosomske podjedinice od 40 do 60S.

gdje M je molekularna težina molekule, R je plinska konstanta, T - apsolutna temperatura, s - koeficijent sedimentacije molekule, D je koeficijent difuzije molekule, v - parcijalni specifični volumen, koji se može smatrati volumenom koji zauzima jedan gram otopljene tvari, p - gustoća otapala.

Metoda sedimentacijske bilance. Određivanje molekulskih masa ovom metodom provodi se pri relativno malim brzinama rotora, reda veličine 7000-8000 o/min -1, tako da se molekule velike molekulske mase ne talože na dno. Ultracentrifugiranje se provodi sve dok čestice ne postignu ravnotežu koja se uspostavlja pod djelovanjem centrifugalnih sila, s jedne strane, i difuzijskih sila, s druge strane, odnosno dok se čestice ne prestanu gibati. Zatim se prema dobivenom koncentracijskom gradijentu izračunava molekularna težina tvari "prema formuli

gdje R je plinska konstanta, T - apsolutna temperatura, o - kutna brzina, p - gustoća otapala, v - djelomični specifični volumen, S x i S 2 je koncentracija otopljene tvari na udaljenostima G G a r 2 od osi rotacije.

Nedostatak ove metode je što je za postizanje sedimentacijske ravnoteže potrebno dosta vremena - od nekoliko dana do nekoliko tjedana uz kontinuirani rad centrifuge.

Metoda približavanja sedimentacijskoj ravnoteži razvijena je kako bi se uklonili nedostaci prethodne metode, povezani s velikim ulaganjem vremena potrebnog za "uspostavljanje ravnoteže. Pomoću ove metode mogu se odrediti molekularne težine kada je centrifugirana otopina u stanje približavanja ravnoteži. Prvo se makromolekule ravnomjerno raspoređuju po cijelom volumenu analitičke ćelije, zatim se, kako centrifugiranje nastavlja, molekule talože, a gustoća otopine u području meniska postupno opada. Promjena gustoće je pažljivo bilježi, a zatim se složenim izračunima koji uključuju velik broj varijabli molekularna težina danog spoja određuje formulama:

gdje R je plinska konstanta, T je apsolutna temperatura, v - parcijalni specifični volumen, p - gustoća otapala, dcldr - koncentracijski gradijent makromolekule, g m i g d - udaljenost do meniskusa, odnosno dna epruvete, c m i s d - koncentracija makromolekula na meniskusu, odnosno na dnu epruvete, M m i M R -vrijednosti molekulskih težina, određene raspodjelom koncentracije tvari na meniskusu, odnosno dnu epruvete.

2.8.2 Ocjena čistoće preparata

Analitičko ultracentrifugiranje naširoko se koristi za procjenu čistoće DNA, virusa i proteinskih pripravaka. Čistoća pripravaka nedvojbeno je vrlo važna u slučajevima kada je potrebno točno odrediti molekularnu masu molekule. U većini slučajeva, homogenost preparata može se procijeniti prema prirodi granice sedimentacije, koristeći metodu brzine sedimentacije: homogeni preparat obično daje jednu oštro definiranu granicu. Nečistoće prisutne u preparatu pojavljuju se kao dodatni vrh ili rame; također određuju asimetriju glavnog vrha.

2.8.3 Proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama

Drugo područje primjene analitičkog ultracentrifugiranja je proučavanje konformacijskih promjena u makromolekulama. Molekula DNA, na primjer, može biti jednolančana ili dvolančana, linearna ili kružna. Pod utjecajem različitih spojeva ili na povišenim temperaturama, DNA prolazi niz reverzibilnih i ireverzibilnih konformacijskih promjena, koje se mogu utvrditi promjenom brzine sedimentacije uzorka. Što je molekula kompaktnija, to je manji njen koeficijent trenja u otopini i obrnuto: što je manje kompaktna, to je veći koeficijent trenja i, posljedično, sporije će se taložiti. Dakle, razlike u brzini sedimentacije uzorka prije i nakon različitih utjecaja na njega omogućuju otkrivanje konformacijskih promjena koje se događaju u makromolekulama.

U alosteričkim proteinima, kao što je, na primjer, aspartat transkarbamoilaza, dolazi do konformacijskih promjena kao rezultat njihovog vezanja na supstrat i male ligande. Disocijacija proteina u podjedinice može se potaknuti tretiranjem sa tvarima kao što su urea ili parakloromerkuribenzoat. Sve ove promjene mogu se lako pratiti pomoću analitičkog ultracentrifugiranja.

Prešanje cjevastih proizvoda metodom centrifugiranje. Pod, ispod centrifugiranje u industriji građevinskih materijala ... koji se takav utjecaj provodi nazivaju se centrifugiranje. U industriji Republike Bjelorusije koriste se horizontalne centrifuge ...

Taloženje čestica

Laboratorijski rad >> Kemija

Stanice su već oslobođene malom brzinom centrifugiranje iz jezgre, mitohondrija i... ultracentrifugiranje Značajke ove vrste centrifugiranje ogleda se u vrlo... za nas slučajevima upotrebe centrifugiranje u gradijentu gustoće saharoze, ...

Korištenje centrifuge

Predmet >> Industrija, proizvodnja

U šaržnim centrifugama, razne operacije centrifugiranje- utovar, odvajanje, istovar - javljaju se... razlikuju se preparativna i analitička centrifugiranje. S preparativnim centrifugiranje uzima se izvorni biološki materijal ...