Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Cvičenie: Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia polutantov v prírodných a odpadových vodách. Pozrite sa, čo je „“ v iných slovníkoch

Kvapalinová chromatografia

Kvapalinová chromatografia je typ chromatografie, v ktorej mobilná fáza, nazývaný eluent, je kvapalina. Stacionárna fáza Možno pevný sorbent, pevný nosič s kvapalinou usadenou na jeho povrchu alebo gél.

Rozlišovať stĺpovitý A tenká vrstva kvapalinovou chromatografiou. V kolónovej verzii časť separovanej zmesi látok prechádza cez kolónu naplnenú stacionárnou fázou v prúde eluentu, ktorý sa pohybuje pod tlakom alebo vplyvom gravitácie. Pri chromatografii na tenkej vrstve sa eluent pohybuje pôsobením kapilárnych síl po plochej vrstve sorbentu nanesenej na sklenenej doske alebo kovovej fólii, po poréznom polymérnom filme alebo po páse špeciálneho chromatografického papiera. Bola vyvinutá aj metóda tenkovrstvovej kvapalinovej chromatografie pod tlakom, pri ktorej sa eluent čerpá cez vrstvu sorbentu vloženú medzi platne.

Existujú také typy kvapalinovej chromatografie ako napr analytické(na analýzu zmesí látok) a prípravný(na izoláciu čistých zložiek).

Rozlišovať kvapalinovou chromatografiou (LC) vo svojej klasickej verzii, vykonávané s atmosferický tlak, A vysoká rýchlosť), vykonávané o vysoký krvný tlak. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) využíva kolóny s priemerom do 5 mm, tesne naplnené sorbentom s malými časticami (3-10 µm). Ak chcete prečerpať eluent cez kolónu, použite tlak až do 3,107 Pa. Tento typ chromatografie sa nazýva vysokotlaková chromatografia. Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožňuje výrazne zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne rozptýleného sorbentu.

Možnosti HPLC sú mikrokolónová chromatografia na kolónach malého priemeru naplnených sorbentom a kapilárna chromatografia na dutých a sorbentom naplnených kapilárnych kolónach. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izoláciu, kvantitatívnu a kvalitatívnu analýzu komplexných zmesí organických zlúčenín.

Kvapalinová chromatografia je najdôležitejšou fyzikálnou a chemickou výskumnou metódou v chémii, biológii, biochémii, medicíne a biotechnológii. Používa sa na:

· štúdium metabolických procesov v živých organizmoch liečiv;

· diagnostika v medicíne;

· analýza produktov chemickej a petrochemickej syntézy, medziproduktov, farbív, palív, mazív, ropy, odpadových vôd;

· štúdium sorpčných izoterm z roztoku, kinetiky a selektivity chemických procesov;

· výtok

· analýza a separácia zmesí, ich čistenie a izolácia mnohých biologických látok z nich, ako sú aminokyseliny, bielkoviny, enzýmy, vírusy, nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy, hormóny.

V chémii makromolekulových zlúčenín a pri výrobe polymérov sa kvapalinová chromatografia používa na analýzu kvality monomérov, štúdium distribúcie molekulovej hmotnosti a distribúcie podľa typu funkčnosti oligomérov a polymérov, čo je nevyhnutné pre kontrolu produktu.

Kvapalinová chromatografia sa používa aj v parfumérii, potravinárskom priemysle, na analýzu znečistenia životného prostredia a vo forenznej vede.

Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) bola vyvinutá a zavedená v polovici 70. rokov 20. storočia. Potom sa objavili prvé kvapalinové chromatografy.

Kvapalinová chromatografia je optimálna metóda na analýzu chemicky a tepelne nestabilných molekúl, látok s vysokou molekulovou hmotnosťou so zníženou prchavosťou. To možno vysvetliť špeciálnou úlohou mobilnej fázy v LC, na rozdiel od plynovej chromatografie: eluent neplní len transportnú funkciu.

2. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie.

Autor: mechanizmus retencie separovaných látok stacionárnou fázou LC rozlišovať:

sedimentačná chromatografia

· adsorpčná chromatografia , v ktorom sa separácia uskutočňuje ako výsledok interakcie látky, s ktorou sa separuje adsorbent ako je oxid hlinitý alebo silikagél, majúci na povrchu aktívne polárne centrá. Solventný(eluent) - nepolárna kvapalina.

Ryža. Schéma delenia zmesi látok pomocou adsorpčnej chromatografie

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Mechanizmus sorpcie pozostáva zo špecifickej interakcie medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (resp. schopnými polarizácie) úsekmi molekúl analyzovanej zložky (obr.). K interakcii dochádza v dôsledku interakcie donor-akceptor alebo tvorby vodíkových väzieb.

Ryža. Schéma adsorpčnej kvapalinovej chromatografie

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Ryža. . Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s normálnou fázou).

http://www. chemnet. ru/rus/učenie/olej/spezprakt-chr. html

O normálna fáza Vo verzii deliacej kvapalinovej chromatografie sa ako povrchové modifikátory silikagélu (očkované fázy) používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupina atď. Použitie očkovaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) naočkované na povrch sorbentu (obr.). Menej používaný je variant kvapalinovej chromatografie s deponovanými fázami, kedy je kvapalná stacionárna fáza deponovaná na stacionárnom nosiči.

Ryža. . Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s obrátenými fázami). http://www. chemnet. ru/rus/učenie/olej/spezprakt-chr. html

Deliaca kvapalinová chromatografia tiež zahŕňa extrakčná kvapalina chromatografia, v ktorom je stacionárnou fázou organický extraktant nanesený na pevnom nosiči a mobilnou fázou je vodný roztok separovaných zlúčenín. Ako extrakčné činidlá sa používajú napríklad fenoly, trialkylfosfáty, amíny, kvartérne amóniové zásady, ako aj organofosforové zlúčeniny obsahujúce síru. Extrakčná kvapalinová chromatografia sa používa na separáciu a koncentráciu anorganických zlúčenín, napríklad iónov alkalických kovov, aktinoidov a iných prvkov s podobnými vlastnosťami, v procesoch spracovania vyhoreného jadrového paliva.

iónomeničová chromatografia,

ionity.

katiónové výmenníky

aniónomeniče.

amfotérne iónomeniče

amfolyty

Ionit

katión

Výmenníky aniónov

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (výmena katiónov)

R-OH + Na+ + Cl - → R-Cl + Na+ + OH - (výmena aniónov)

Iónomeniče musia spĺňať nasledovné požiadavky: byť chemicky stabilné v rôznych prostrediach, mechanicky pevné v suchom a najmä napučanom stave, majú vysokú absorpčnú schopnosť a schopnosť dobre sa regenerovať.

Pri iónomeničovej (iónovej) chromatografii sa separované anióny (katióny) detegujú ako kyseliny (zodpovedajúce zásady) vysoko citlivým konduktometrickým detektorom, kde sú vysokoúčinné kolóny naplnené iónovou živicou povrchovo aktívnej látky s nízkou kapacitou.

iónová párová chromatografia

chromatografia na výmenu ligandov

rôzne schopnosti separovaných zlúčenín vytvárať komplexy s katiónmi prechodných kovov

veľkostnou vylučovacou chromatografiou

rozdiely vo veľkostiach molekúl

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Ryža. Schéma gélovej permeačnej chromatografie

afinitná chromatografia

Ryža. Schéma afinitnej chromatografie

http://www. chemnet. ru/rus/učenie/olej/spezprakt-chr. html

Potom sa z polyméru odstráni prechodom roztoku zlúčeniny, ktorá má ešte väčšiu afinitu k makromolekule. Takáto chromatografia je obzvlášť účinná v biotechnológii a biomedicíne na izoláciu enzýmov, proteínov a hormónov.

V závislosti o spôsobe pohybu hmoty Rozlišujú sa tieto typy kvapalinovej chromatografie: vývojový, frontálny A represívne.
Najčastejšie používané prejavný variant, v ktorom sa časť zmesi, ktorá sa má oddeliť, zavádza do kolóny v prúde eluentu. Výstup zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme vo forme píkov. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Ryža. Schéma vývoja variantu chromatografie

Výška alebo oblasť vrcholu charakterizuje koncentrácia komponentov, A držané zväzkov – kvalitné zloženie zmesi. Identifikácia komponentov sa zvyčajne uskutočňuje zhodou retenčných časov so štandardnými látkami, používajú sa aj chemické alebo fyzikálno-chemické metódy.

O čelný Vo variante (obr.) kolónou kontinuálne prechádza zmes separovaných látok, ktorá plní úlohu mobilnej fázy. V dôsledku toho je možné získať v čistej forme len látku, ktorá je najmenej sorbovaná v kolóne.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Ryža. Schéma možnosti frontálnej chromatografie

Chromatogram v tomto prípade predstavuje stupne, ktorých výšky sú úmerné koncentráciám zložiek; zadržané objemy sú určené retenčným časom zložiek. Pri diferenciácii takéhoto chromatogramu sa získa obraz podobný tomu, ktorý sa získal vo vyvolávacej verzii.

IN represívne V tomto prípade sú zložky zmesi zavedené do kolóny vytesnené eluentom, ktorý je adsorbovaný silnejšie ako ktorákoľvek zložka. V dôsledku toho sa získajú frakcie oddelených látok vedľa seba.Poradie uvoľňovania zložiek je určené silou ich interakcie s povrchom sorbentu (obr.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Ryža. Schéma vytesňovacej chromatografie

3. Základné chromatografické veličiny a ich stanovenie.

Pri separácii látok pomocou kvapalinovej chromatografie je možné použiť vývojové, čelné a vytesňovacie možnosti, ako je uvedené vyššie. Najčastejšie sa používa vyvolávacia možnosť, pri ktorej sa časť zmesi, ktorá sa má separovať, zavedie do kolóny v prúde eluentu. Výstup zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme vo forme píkov. Z chromatogramu (obr.) určte:

retenčné časy nesorbujúcich (to), separovaných zložiek (tR1, tR2, tR3 atď.); šírka základne vrcholov (tw1, tw2 atď.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) korigovaný retenčný objem komponentov ,

Kde t"R - korigovaný retenčný čas komponentu;

c) koeficient kapacity stĺpca vo vzťahu k danému komponentu ;

d) účinnosť kolóny charakterizovaný počet ekvivalentných teoretických etáp

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) povolenie https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Kapacitný faktor k" má významný vplyv na hodnotu R S: pri zmene k" od 0 do 10 (optimálne limity) R S sa výrazne zvyšuje. Význam k" je určená zdvojeným povrchom sorbentu a jeho množstvom v kolóne, ako aj adsorpčnou rovnovážnou konštantou (Henryho konštanta).

Koeficient selektivity α je určená rozdielom v adsorpčných rovnovážnych konštantách dvoch oddelených zložiek. Ako sa α zvyšuje (z 1 na ~5) R S sa prudko zvyšuje, s ďalším zvýšením α - sa mení len málo. Selektivita kolóny závisí od faktorov, ako je chemická štruktúra povrchu sorbentu, zloženie eluentu, teplota kolóny a štruktúra separovaných zlúčenín. Keďže sorpcia chromatografovaných látok v kvapalinovej chromatografii je určená párovou interakciou troch hlavných zložiek systému - sorbentu, separovaných látok a eluentu, je zmena zloženia eluentu vhodným spôsobom optimalizácie separačného procesu. .

Účinnosť stĺpca závisí od veľkosti častíc a štruktúry pórov adsorbentu, od rovnomernosti náplne kolóny, viskozity eluentu a rýchlosti prenosu hmoty. Predĺženie kolóny nevedie vždy k zlepšeniu separácie, pretože odpor kolóny sa zvyšuje, tlak eluentu na vstupe a čas experimentu sa zvyšujú a citlivosť a presnosť analýzy klesá v dôsledku rozšírenia píku analyzovaný komponent. Ak , potom sú píky týchto dvoch látok v chromatograme takmer úplne oddelené. S rastom R S separačný čas sa zvyšuje. O R S < 1 - oddelenie je neuspokojivé. Pri preparatívnej chromatografii v dôsledku zavedenia relatívne veľkého množstva separovaných látok kolóna pracuje s preťažením. V tomto prípade klesá kapacitný koeficient, zvyšuje sa výška ekvivalentná teoretickej doske, čo vedie k zníženiu rozlíšenia.

4. Adsorbenty

Chromatografická separácia zmesi bude účinná, ak sa správne vyberie adsorbent a rozpúšťadlo (eluent).

Adsorbent by nemal chemicky interagovať s oddelenými zložkami alebo vykazovať katalytický účinok na rozpúšťadlo. Je tiež potrebné, aby bol adsorbent selektívny vzhľadom na zložky zmesi. Správne zvolený adsorbent by mal mať maximálnu absorpčnú kapacitu.

Rozlišovať polárny (hydrofilný) A nepolárne (hydrofóbne) adsorbenty. Malo by sa pamätať na to, že adsorpčná afinita polárnych látok pre polárne sorbenty je oveľa vyššia ako pre nepolárne.

Ako adsorbenty sa používajú oxid hlinitý, aktívne uhlie, silikagél, zeolity, celulóza a niektoré minerály.

Oxid hlinitýAl2O3 – amfotérny adsorbent.(obr.) Na ňom zmesi je možné oddeliť látky v pol, takže v nepolárnych rozpúšťadlách. Neutrálny oxid hlinitý sa zvyčajne používa na chromatografiu z nevodných roztokov nasýtených uhľovodíkov, aldehydov, alkoholov, fenolov, ketónov a éterov.

Ryža. Oxid hlinitý pre chromatografiu

http://obrázky. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktivita Al2O3 závisí od jeho vlhkosti. Najvyššiu aktivitu má bezvodý oxid hlinitý. Bežne sa berie ako jeden. V prípade potreby možno pripraviť oxid hlinitý s rôznym obsahom vlhkosti zmiešaním čerstvo pripraveného oxidu hlinitého s vodou (Brockmanova stupnica).

Závislosť aktivity oxidu hlinitého od obsahu vlhkosti

Napríklad Al2O3 s aktivitou 1,5-2 sa používa na separáciu uhľovodíkov; na separáciu alkoholov a ketónov – 2-3.5.

Špecifický povrch oxidu hlinitého je 230-380 m2/g.

Silikagél(hydroxylovaný alebo chemicky modifikovaný) je sušený želatínový oxid kremičitý, ktorý sa získava z presýtených roztokov kyselín kremičitých ( n Si02 m H20) pri pH > 5-6. (obr.) Pevný hydrofilný sorbent.

Ryža. Silikagél

http://www. silikagél. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Veľkosť častíc silikagélu v analytických kolónach je 3-10 mikrónov, v preparatívnych kolónach - 20-70 mikrónov. Malá veľkosť častíc zvyšuje rýchlosť prenosu hmoty a zlepšuje účinnosť kolóny. Moderné analytické kolóny majú dĺžku 10-25 cm. Sú naplnené silikagélom s veľkosťou častíc 5 mikrónov a umožňujú separovať zložité zmesi 20-30 zložiek. Keď sa veľkosť častíc zmenšuje na 3-5 mikrónov, zvyšuje sa účinnosť kolóny, ale zvyšuje sa aj jej odpor. Takže na dosiahnutie prietoku eluentu 0,5-2,0 ml/min je potrebný tlak (1-3)·107 Pa. Silikagél znesie takýto tlakový rozdiel, pričom granule polymérnych sorbentov sú pružnejšie a deformovateľnejšie. Nedávno boli vyvinuté mechanicky pevné polymérne sorbenty s makroporéznou štruktúrou s hustou sieťou, ktoré sa svojou účinnosťou približujú silikagélom. Tvar častíc sorbentu s veľkosťou 10 µm a viac nemá veľký vplyv na účinnosť kolóny, uprednostňujú sa však guľovité sorbenty, ktoré poskytujú priepustnejší obal (obr.

Ryža. Sférický silikagél

http://obrázky. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Vnútornou štruktúrou častice silikagélu je systém komunikačných kanálov. Pre kvapalinovú chromatografiu sa používajú sorbenty s priemerom pórov 6-25 nm. Separácia kvapalinovou chromatografiou sa uskutočňuje najmä na silikagéloch modifikovaných reakciou alkyl a arylchlórsilánov alebo alkyletoxysilánov so silanolovými skupinami na povrchu. Pomocou takýchto reakcií sa navrúbľujú skupiny C8H17-, C18H37- alebo C6H5- (na získanie sorbentov s hydrofobizovaným povrchom), nitrilové, hydroxylové skupiny atď. (obr.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Ryža. Štruktúra modifikovaného silikagélu

Silikagély používané v chromatografii na oddeľovanie zmesí ropných produktov, vyš mastné kyseliny, ich estery, aromatické amíny, nitroderiváty Organické zlúčeniny. Silikagél – hydrofilný sorbent, ľahko zmáčateľné vodou. Preto sa nemôže použiť na sorpciu z vodných roztokov. Aktivita silikagélu závisí od obsahu vody v ňom: čím menej vody obsahuje, tým väčšia je aktivita (Brockmannova stupnica).

Závislosť aktivity silikagélu od obsahu vlhkosti

Špecifický povrch silikagélu je 500-600 m2/g.

Aktívne uhlie sú formou uhlíka, ktorý sa po spracovaní stáva extrémne poréznym a získava veľmi veľký povrch dostupný pre adsorpciu alebo chemické reakcie (obr.) Majú špecifický povrch 1300-1700 m2/g.

Ryža. Aktívne uhlie

http://e-katalóg. rusbiznis. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Hlavný vplyv na štruktúru pórov aktívneho uhlia majú východiskové materiály na ich výrobu. Aktívne uhlie na báze kokosových škrupín sa vyznačujú väčším podielom mikropórov (do 2 nm), zatiaľ čo tie na báze uhlia sa vyznačujú väčším podielom mezopórov (2-50 nm). Veľký podiel makropórov je charakteristický pre aktívne uhlie na báze dreva (viac ako 50 nm). Mikropóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu molekúl s malou veľkosťou, zatiaľ čo mezopóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu väčších organických molekúl.

Zeolity (molekulárne sitá)– porézne kryštalické hlinitokremičitany alkalických kovov a kovov alkalických zemín prírodného a syntetického pôvodu. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Ryža. zeolity

http://www. zeolit spb. ru/_img/_36 mm. jpg

http://kntgroup. ru/palec. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Sú známe štyri typy zeolitov (A, X, Y, M), ktoré majú rôzne kryštálové štruktúry. V závislosti od katiónu sú zeolity označené nasledovne: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Vlastnosti zeolitov je to? póry kryštálov majú veľkosť rádovo 0,4-1 nm, čo je porovnateľné s veľkosťou molekúl veľa kvapalných alebo plynných látok. Ak sú molekuly látky schopné preniknúť do týchto pórov, dochádza k adsorpcii v póroch kryštálov zeolitu. Väčšie molekuly látky sa neadsorbujú. Výberom zeolitov s rôznou veľkosťou pórov možno jasne oddeliť zmesi rôznych látok.

Špecifický povrch zeolitov je 750-800 m2/g.

Pri výbere adsorbenta je potrebné vziať do úvahy štruktúru látok a ich rozpustnosť. Napríklad nasýtené uhľovodíky sa zle adsorbujú, zatiaľ čo nenasýtené uhľovodíky (majú dvojité väzby) sa adsorbujú lepšie. Funkčné skupiny zvyšujú adsorpčnú schopnosť látky.

5. Eluenty

Pri výbere rozpúšťadla (eluentu) musíte vziať do úvahy povahu adsorbenta a vlastnosti látok v zmesi, ktorá sa má oddeliť. Eluenty musia dobre rozpúšťať všetky zložky chromatografovanej zmesi, mať nízku viskozitu, poskytovať požadovanú úroveň selektivity, byť lacné, netoxické, inertné a kompatibilné s detekčnými metódami (napríklad benzén nemožno použiť ako eluent s UV detektor).

Pri chromatografii na normálnej fáze sa zvyčajne používajú uhľovodíky (hexán, heptán, izooktán, cyklohexán) s prídavkom malého množstva chloroformu CHCl3, izopropanol izo-C3H7OH, diizopropyléter; v chromatografii na reverznej fáze - zmes vody s acetonitrilom CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxán, tetrahydrofurán, dimetylformamid. Aby sa izolovali jednotlivé zložky zmesi oddelené počas chromatografie, často sa vymývajú (eluujú) postupne. Na tento účel sa používajú rozpúšťadlá s rôznymi desorpčnými schopnosťami. Rozpúšťadlá sú v polárnych adsorbentoch usporiadané v zostupnom poradí podľa desorbčnej schopnosti - eluotropná séria Trappe. Ak zložky separovanej zmesi majú podobné hodnoty k" ( koeficient kapacity kolóny vzhľadom na danú zložku), potom chromatografujte s jedným eluentom. Ak sú jednotlivé zložky zmesi silne zadržané sorbentom, použije sa séria eluentov so zvyšujúcou sa silou.

Eluotropný rad rozpúšťadiel

6. Zariadenie na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú prístroje rôzneho stupňa zložitosti – od najjednoduchších systémov až po chromatografy vysokej triedy.
Moderný kvapalinový chromatograf zahŕňa: nádoby na eluenty, vysokotlakové čerpadlá, dávkovač, chromatografickú kolónu, detektor, záznamové zariadenie, riadiaci systém a matematické spracovanie výsledkov.

Na obr. je prezentovaná bloková schéma kvapalinového chromatografu, ktorá obsahuje minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Ryža. Schéma kvapalinového chromatografu: 1 - zásobník na mobilnú fázu, 2 - čerpadlo, 3 - injektor, 4 - kolóna, 5 - termostat, 6 - detektory, 7 - záznamový systém, 8 - počítač.

Zásobník pre mobilnú fázu, musí mať dostatočnú kapacitu na analýzu a zariadenie na odplyňovanie rozpúšťadla aby sa zabránilo tvorbe bublín plynov rozpustených v eluente v kolóne a detektore.

Pumpa zamýšľané aby sa vytvoril konštantný tok rozpúšťadla. Jeho dizajn je určený predovšetkým prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú piestové čerpadlá (striekačky). Ich nevýhodou je nutnosť pravidelných prestávok na plnenie eluentom. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa používajú lacné peristaltické čerpadlá. Eluenty vstupujú do čerpadla cez filter, ktorý zadržiava prachové častice (viac ako 0,2 mikrónu). Niekedy cez eluenty prechádza malý prúd hélia, aby sa odstránil rozpustený vzduch a zabránilo sa tvorbe bublín v detektore (najmä v prípade vodných a polárnych eluentov). V analytických chromatografoch sa na dodávanie eluentu do kolóny používajú piestové čerpadlá so spätnoväzbovým systémom, čo umožňuje vyhladenie pulzácií prietoku v rozmedzí 1-2 % a poskytuje objemové prietoky od 0,1 do 25 ml/min pri tlakoch do ~ 3,107 Pa. Pri mikrokolónovej chromatografii sú objemové prietoky eluentu oveľa nižšie - 10-1000 ul/min. V prípade gradientovej elúcie sa používa niekoľko čerpadiel, ktoré sú riadené programátorom a dodávajú 2-3 zložky eluentu do zmiešavacej komory, pričom celkový prietok zostáva konštantný. Na zavedenie vzorky do kolóny pod vysokým tlakom bez zastavenia prietoku sa používajú špeciálne mikrodávkovacie kohútiky, ktoré sú pripojené k slučke známeho objemu pre skúmanú vzorku roztoku. Boli vyvinuté dávkovacie systémy s automatickým odberom vzoriek a vstrekovaním vzoriek pomocou mikrodávkovacích kohútikov alebo striekačiek.

Injektor poskytuje vstrekovanie vzorky zmesi oddelené zložky do kolóny s pomerne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché systémy vstrekovania vzoriek „stop-flow“ vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako slučkové pipety vyvinuté spoločnosťou Reodyne.

Stĺpce pre HPLC sa najčastejšie vyrábajú z nerezovej leštenej rúrky s dĺžkou 10-25 cm a vnútorným priemerom 3-5 mm.

Ryža. Chromatografické kolóny pre kvapalinovú chromatografiu

Tiež používané sklenené reproduktory, umiestnený v kovovom obale; v mikrostĺpcovej chromatografii - zabalené kovové reproduktory s vnútorným priemerom 1,0-1,5 mm, balené sklenené mikrokolóny s priemerom 70-150 mikrónov a duté kapilárne stĺpce priemer 10-100 mikrónov; v preparatívnej chromatografii - kolóny s priemerom 2 až 10 cm alebo viac. Na rovnomerné a husté naplnenie kolón sorbentom sa používa metóda suspenzného balenia. Zo sorbentu a vhodnej organickej kvapaliny sa pripraví suspenzia, ktorá sa privádza pod tlakom do 5,107 Pa do kolóny. Na určenie oddelených zložiek opúšťajúcich kolónu použitie detektory. Konzistencia teploty poskytnuté termostat.

Detektory pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej prebieha kontinuálne meranie niektorej vlastnosti prúdiaceho eluentu. Musia byť veľmi citlivé. Na zvýšenie citlivosti detektora sa niekedy používa derivatizácia zložiek zmesi za kolónou. Na tento účel sa prúdom eluentu zavádzajú činidlá, ktoré pri interakcii s oddelenými látkami tvoria deriváty s výraznejšími vlastnosťami, napríklad silnejšie absorbujú v UV alebo viditeľnej oblasti spektra alebo majú väčšiu fluorescenčnú schopnosť. Niekedy sa derivatizácia uskutočňuje pred chromatografickou analýzou a skôr sa oddeľujú deriváty ako východiskové materiály. Najobľúbenejšie typy detektory všeobecné účely sú refraktometre, meranie index lomu, A spektrofotometrické detektory, definovanie optická hustota rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). TO výhody refraktometrov(A nevýhody spektrofotometrov) treba pripísať nízka citlivosť na určený typ spojenia, ktoré nemusia obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla je v tomto prípade nemožné.

Diferenciálny "href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">diferenciálny zosilňovač a rekordér. Je tiež žiaduce mať integrátor, ktorý umožňuje vypočítať relatívne plochy výsledných píkov. Používa sa v zložitých chromatografických systémoch blok rozhrania, pripojenie chromatografu k osobný počítač, ktorá nielen zbiera a spracováva informácie, ale aj riadi zariadenie, vypočítava kvantitatívne charakteristiky a v niektorých prípadoch aj kvalitatívne zloženie zmesí. Mikroprocesor poskytuje automatické vstrekovanie vzorky, zmeniť podľa špecifikovaný program zloženia eluentov s gradientovou elúciou, udržiavanie teplota kolóny.

Bruker“. Ryža. Kvapalinový chromatograf Jasco

Samotestovacie otázky

Čo je kvapalinová chromatografia? Vymenujte jeho typy a oblasti použitia. Zoznam o základné chromatografické veličiny a ich definícia Aké typy kvapalinovej chromatografie existujú v závislosti od mechanizmu retencie separovaných látok stacionárnou fázou LC? Aké typy chromatografie existujú v závislosti od spôsobu pohybu látky? Aké látky sa používajú ako adsorbenty? V čom je rozdiel? Čo slúži ako tekutá mobilná fáza – eluent? Požiadavky na rozpúšťadlá. Aký je rozdiel medzi deliacou chromatografiou a adsorpčnou chromatografiou? Uveďte hlavné časti obvodu kvapalinového chromatografu a ich účel.

Zoznam použitej literatúry

1 "Kvapalinová chromatografia v medicíne"

http://časopis. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 „Úvod do metód vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie“

http://www. chemnet. ru/rus/učenie/olej/spezprakt-chr. html

3 "Kvapalinová chromatografia"

http://e-science. ru/index/?id=1540

4 "Chromatografia"

http://belchem. ľudí ru/chromatography1.html

(OFS 42-0096-09)

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je metóda stĺpcovej chromatografie, pri ktorej je mobilná fáza (MP) kvapalina.

kosť pohybujúca sa cez chromatografickú kolónu naplnenú neprístupným

vizuálna fáza (sorbent). HPLC kolóny sa vyznačujú vysokým hydraulickým tlakom na vstupe kolóny, preto sa niekedy nazýva aj HPLC

nazývaná "vysokotlaková kvapalinová chromatografia".

V závislosti od mechanizmu separácie látok sa rozlišujú:

súčasné možnosti HPLC: adsorpcia, distribúcia, iónová výmena,

exkluzívne, chirálne a pod.

Pri adsorpčnej chromatografii dochádza k separácii látok v dôsledku ich rôznych schopností adsorbovať a desorbovať

povrch adsorbenta s rozvinutým povrchom, napríklad silikagél.

Pri distribučnej HPLC dochádza k separácii v dôsledku rozdielov v distribučných koeficientoch separovaných látok medzi stacionárnymi

(zvyčajne chemicky vrúbľované na povrch stacionárneho nosiča) a

mobilné fázy.

Podľa polarity sa PF a NP HPLC delia na normálnu fázu a ob-

predĺžená fáza.

Normálna fáza je variant chromatografie, v ktorej

použite polárny sorbent (napríklad silikagél alebo silikagél s

skrútené NH2 - alebo CN skupiny) a nepolárne PF (napríklad hexán s di-

osobné doplnky). Vo verzii chromatografie s reverznou fázou

používať nepolárne chemicky modifikované sorbenty (napr.

nepolárny alkylový radikál C18) a polárne mobilné fázy (napr.

metanol, acetonitril).

Pri iónomeničovej chromatografii molekuly látok v zmesi disociujú

v roztoku sa pri prechode oddeľujú na katióny a anióny

sorbent (katiónový výmenník alebo aniónový výmenník) v dôsledku ich rôznych rýchlostí výmeny s iónovými

mi skupiny sorbentu.

Pri vylúčení (sieto, gélová filtrácia, gélová filtrácia)

chromatografiou sa molekuly látok oddeľujú podľa veľkosti v dôsledku ich rozdielnej schopnosti prenikať do pórov stacionárnej fázy. Zároveň prvý zo spolu-

Kolóny poskytujú najväčšie molekuly (s najvyššou molekulovou hmotnosťou) schopné preniknúť do minimálneho počtu pórov stacionárnej fázy,

a ako posledné sa objavujú látky s malými molekulovými rozmermi.

K oddeleniu často dochádza nie jedným, ale niekoľkými mechanizmami súčasne.

Metódu HPLC možno použiť na kontrolu kvality akýchkoľvek

zooformné analyty. Na vykonanie analýzy sa používajú vhodné prístroje - kvapalinové chromatografy.

Zloženie kvapalinového chromatografu zvyčajne obsahuje tieto základné prvky:

Uzly:

– Jednotka na prípravu PF vrátane nádoby s mobilnou fázou (alebo kapacitnou

väzby s jednotlivými rozpúšťadlami obsiahnutými v mobilnej fáze

3) a odplyňovací systém PF;

– čerpací systém;

– mixér mobilnej fázy (ak je to potrebné);

– systém zavádzania vzorky (injektor);

– chromatografická kolóna (môže byť inštalovaná v termostate);

- detektor;

– systém zberu a spracovania údajov.

Čerpací systém

Čerpadlá dodávajú PF do kolóny pri danej konštantnej rýchlosti. Zloženie mobilnej fázy môže byť konštantné alebo variabilné.

počas analýzy. V prvom prípade sa proces nazýva izokratický,

a v druhom - gradient. Niekedy sú inštalované pred čerpacím systémom

filtre s priemerom pórov 0,45 mikrónu na filtráciu mobilnej fázy. Moderné

Čerpadlový systém kvapalinového chromatografu pozostáva z jedného alebo viacerých počítačom riadených čerpadiel. To vám umožní zmeniť

stáva sa PF podľa určitého programu s gradientovou elúciou. Sme-

Zmes zložiek PF v mixéri sa môže vyskytovať pri nízkom tlaku

tlaku (pred čerpadlami) a pri vysokom tlaku (za čerpadlami). Miešač je možné použiť na prípravu PF a izokratickej elúcie,

presnejší pomer komponentov sa však dosiahne pred-

dôkladné premiešanie zložiek PF pre izokratický proces. Čerpadlá pre analytickú HPLC umožňujú udržiavať konštantný prietok PF do kolóny v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na vstupe kolóny do 50 MPa. Je však vhodné, aby táto hodnota neprekročila

má 20 MPa. Tlakové pulzácie sú minimalizované špeciálnymi tlmičmi

železné systémy zahrnuté v konštrukcii čerpadla. Pracovné diely na-

Čerpadlá sú vyrobené z materiálov odolných voči korózii, čo umožňuje použitie agresívnych komponentov v zložení PF.

Faucety

Podľa návrhu môžu byť mixéry statické alebo dynamické

mic.

V mixéri sa vytvorí jedna mobilná fáza z

účinné rozpúšťadlá dodávané čerpadlami, ak požadovaná zmes nebola vopred pripravená. Miešanie rozpúšťadiel zvyčajne prebieha spontánne, ale niekedy sa používajú systémy s núteným miešaním.

šitie.

Injektory

Injektory môžu byť univerzálne na zavádzanie vzoriek z

1 µl až 2 ml alebo diskrétne na vloženie vzorky len určitého objemu

ema. Oba typy vstrekovačov môžu byť automatické („autoinjektory“ alebo „autosamplery“). Je umiestnený injektor na zavedenie vzorky (roztoku).

priamo pred chromatografickou kolónou. Konštrukcia injektora umožňuje zmeniť smer toku PF a predbežne zaviesť vzorku do slučky určitého objemu (zvyčajne od 10 do 100 μl).

Tento objem je uvedený na štítku slučky. Konštrukcia injektora umožňuje výmenu slučky. Zavedenie testovacieho roztoku do neautomatického

Injektor Tomatic využíva ručnú mikrostriekačku s objemom výrazne

výrazne prevyšuje objem slučky. Nadbytok injekčného roztoku, nie

umiestnený v slučke sa vynuluje a do kolóny sa vstrekne presný a vždy rovnaký objem vzorky. Manuálne neúplné vyplnenie slučky znižuje presnosť

presnosť a reprodukovateľnosť dávkovania, a preto zhoršuje presnosť

presnosť a reprodukovateľnosť chromatografickej analýzy.

Chromatografický stĺpec

Chromatografické kolóny sú zvyčajne trubice vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, skla alebo plastu, naplnené sorbentom a uzavreté.

obojstranne lemované filtrami s priemerom pórov 2–5 mikrónov. Analytická dĺžka

Hrúbka kolóny v závislosti od chromatografického separačného mechanizmu môže byť v rozsahu od 5 do 60 cm alebo viac (zvyčajne je

10–25 cm), vnútorný priemer – od 2 do 10 mm (zvyčajne 4,6 mm). V mikrokolóne chrómu sa používajú kolóny s vnútorným priemerom menším ako 2 mm

tografia. Kapilárne kolóny s vnútorným priemerom

rum asi 0,3-0,7 mm. Kolóny pre preparatívnu chromatografiu majú vnútorný priemer do 50 mm alebo viac.

Krátke rúrky môžu byť inštalované pred analytickou kolónou.

stĺpce (predstĺpce) vykonávajúce rôzne pomocné funkcie

(častejšie – ochrana analytickej kolóny). Zvyčajne sa analýza vykonáva s

pri normálnej teplote, aby sa však zvýšila účinnosť separácie a kon-

Na skrátenie doby trvania analýzy je možné použiť termostaty.

testovanie kolón pri teplotách nie vyšších ako 60 C. Pri vyšších teplotách je možná deštrukcia sorbentu a zmeny v zložení PF.

Stacionárna fáza (sorbent)

Ako sorbenty sa zvyčajne používajú:

1. V normálnom prípade sa používa silikagél, oxid hlinitý, porézny grafit

malofázová chromatografia. Retenčný mechanizmus v tomto prípade je

čaj - zvyčajne adsorpcia;

2. Živice alebo polyméry s kyslými alebo zásaditými skupinami. Oblasť použitia: iónomeničová chromatografia;

3. porézny silikagél alebo polyméry (vylučovacia chromatografia);

4. Chemicky modifikované sorbenty (sorbenty s očkovaným fa-

zami), pripravované najčastejšie na báze silikagélu. Retenčný mechanizmus je vo väčšine prípadov distribúcia medzi pohyblivými

nové a stacionárne fázy;

5. Chemicky modifikované chirálne sorbenty, napríklad vyrobené

vodné celulózy a amylózy, proteíny a peptidy, cyklodextríny,

používa sa na separáciu enantiomérov (chirálna chromatografia

Sorbenty s navrúbľovanými fázami môžu mať rôzne stupne chemického zloženia

ical modifikácia. Častice sorbentu môžu byť sférické alebo nesférické

správny tvar a rôzna pórovitosť.

Najčastejšie používané vrúbľované fázy sú:

– oktylových skupín(oktylsilán alebo C8 sorbent);

– oktadecylové skupiny(sorbent oktadecylsilán

(ODS) alebo C18);

– fenylové skupiny(fenylsilánový sorbent);

– kyanopropylové skupiny(CN sorbent);

– aminopropylové skupiny(sorbent NH2);

– diolové skupiny (sorbent diol).

Najčastejšie sa analýza vykonáva na nepolárnych vrúbľovaných fázach v

režim reverznej fázy s použitím sorbentu C18.

V niektorých prípadoch je vhodnejšie použiť normálne

fázová chromatografia. V tomto prípade sa používajú silikagélové alebo polárne očkované fázy („CN“, „NH2“, „diol“) v kombinácii s nepolárnymi roztokmi.

Sorbenty s navrúbľovanými fázami sú chemicky stabilné pri hodnotách pH od 2,0 do 8,0, pokiaľ nie je výrobcom výslovne uvedené inak.

Častice sorbentu môžu mať guľovitý alebo nepravidelný tvar a rôznu pórovitosť. Veľkosť častíc sorbentu pri analytickej HPLC je zvyčajne 3–10 µm, pri preparatívnej HPLC – do 50 µm alebo viac.

Používajú sa aj monolitické sorbenty.

Vysoká separačná účinnosť je zabezpečená veľkým povrchom častíc sorbentu (čo je dôsledok ich mikroskopickosti

veľkosť a prítomnosť pórov), ako aj jednotnosť zloženia sorbentu a jeho husté a rovnomerné balenie.

Detektory

Používajú sa rôzne metódy detekcie. Vo všeobecnom prípade PF so zložkami rozpustenými v ňom po chromatografickej kolóne

ki vstupuje do detektorovej cely, kde sa kontinuálne meria jedna alebo druhá jeho vlastnosť (absorpcia v UV alebo viditeľnej oblasti spektra, fluorescencia,

index lomu, elektrická vodivosť atď.). Výsledný chromatogram je graf závislosti nejakého fyzikálneho

logický alebo fyzikálno-chemický parameter PF ako funkcia času.

Najbežnejšie sú spektrofotometrické de-

tektory (vrátane diódovej matrice), ktoré zaznamenávajú zmeny v optike

hustota v ultrafialovom, viditeľnom a často v blízkej infračervenej oblasti

n oblasti spektra od 190 do 800 alebo 900 nm. V tomto prípade chromatogram

čaj predstavuje závislosť optickej hustoty PF od času.

Tradične používaný spektrofotometrický detektor umožňuje

umožňuje detekciu pri akejkoľvek vlnovej dĺžke v jej prevádzkovom rozsahu

zónu. Používajú sa aj viacvlnové detektory, ktoré umožňujú

Vykonajte detekciu na niekoľkých vlnových dĺžkach súčasne.

Pomocou detektora diódového poľa môžete nielen detekovať niekoľko vlnových dĺžok naraz, ale aj takmer okamžite

Optické spektrum PF je možné kedykoľvek získať priamo (bez skenovania), čo značne zjednodušuje kvalitatívnu analýzu separovaných zložiek.

komponentov.

Citlivosť fluorescenčných detektorov je približne 1000-krát vyššia ako citlivosť spektrofotometrických. V tomto prípade sa použije buď vlastná fluorescencia alebo fluorescencia zodpovedajúcich derivátov, ak samotná stanovovaná látka nefluoreskuje. Moderné

variabilné fluorescenčné detektory umožňujú nielen získať chromato-

gramov, ale aj na zaznamenávanie excitačných a fluorescenčných spektier analytickej látky

zirovateľné spojenia.

Na analýzu vzoriek, ktoré neabsorbujú v UV a viditeľnej oblasti spektra (napríklad uhľohydráty), sa používajú refraktometrické detektory

(refraktometre). Nevýhodou týchto detektorov je ich nízka (v porovnaní so spektrofotometrickými detektormi) citlivosť a výrazná teplotná závislosť intenzity signálu (detektor musí byť termostatovaný).

Používajú sa aj elektrochemické detektory (konduktometrické

lyžiarska, amperometrická atď.), hmotnostná spektrometria a Fourierova IČ

detektory, detektory rozptylu svetla, detektory rádioaktivity a niektoré ďalšie

Mobilná fáza

IN Ako PF je možné použiť rôzne rozpúšťadlá - ako jednotlivé, tak aj ich zmesi.

IN normálna fáza chromatografia zvyčajne používa kvapalný uhlík

hydrochloridy (hexán, cyklohexán, heptán) a iné relatívne nepolárne

rozpúšťadlá s malými prídavkami polárnych organických zlúčenín,

ktoré regulujú elučnú silu PF.

V chromatografii s reverznou fázou obsahuje zloženie PF polárne alebo

organické rozpúšťadlá (zvyčajne acetonitril a metanol) a voda. Pre optické

separačné systémy často využívajú vodné roztoky s určitým

zmeny pH, najmä tlmivé roztoky. Používajú sa anorganické prísady

chemické a organické kyseliny, zásady a soli a iné zlúčeniny (napr.

napríklad chirálne modifikátory na separáciu enantiomérov na achirálne

nom sorbentu).

Hodnota pH sa musí sledovať oddelene pre vodnú zložku, a nie pre jej zmes s organickým rozpúšťadlom.

PF môže pozostávať z jedného rozpúšťadla, v prípade potreby často z dvoch

rozsah - tri alebo viac. Zloženie PF je uvedené ako objemový pomer rozpúšťadiel, ktoré tvoria jeho zložky. V niektorých prípadoch môže byť uvedená hmotnosť

sovy pomer, ktorý by mal byť špeciálne stanovený.

Pri použití UV spektrofotometrického detektora by PF nemal mať výraznú absorpciu pri vlnovej dĺžke zvolenej na detekciu. Limit priehľadnosti alebo optická hustota, ak je stanovená

Často sa uvádza špecifická vlnová dĺžka rozpúšťadla od konkrétneho výrobcu

je na obale.

Chromatografická analýza je značne ovplyvnená stupňom čistoty PF, preto je výhodné použiť vyrobené rozpúšťadlá

špeciálne navrhnuté pre kvapalinovú chromatografiu (vrátane vodnej).

PF a analyzované roztoky by nemali obsahovať nerozpustené

častíc a plynových bublín. Voda získaná v laboratórnych podmienkach

vodné roztoky, organické roztoky vopred zmiešané s vodou

Médiá, ako aj analyzované roztoky, musia byť podrobené jemnej filtrácii a odplyneniu. Na tieto účely sa zvyčajne používa filtrácia.

vo vákuu cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm, inertný voči danému rozpúšťadlu alebo roztoku.

Systém zberu a spracovania údajov

Je pripojený moderný systém spracovania dát

osobný počítač pripojený k chromatografu s nainštalovaným softvérom

softvér, ktorý vám umožňuje registrovať a spracovávať chro-

matogram, ako aj ovládať činnosť chromatografu a monitorovať hl

parametre chromatografického systému.

Zoznam chromatografických podmienok, ktoré sa majú špecifikovať

V súkromnej liekopisnej monografii musia byť uvedené rozmery ko-

kolóny, typ sorbentu označujúci veľkosť častíc, teplotu kolóny (ak je potrebné termostatovať), objem vstrekovanej vzorky (objem slučky),

stáva PF a spôsob jeho prípravy, rýchlosť dodávky PF, podmienky detektora a detekcie, popis gradientového režimu (ak sa používa), čas chromatografie.

iónová výmena a iónová HPLC

Na analýzu oboch organických látok sa používa iónomeničová chromatografia

obidva (heterocyklické zásady, aminokyseliny, proteíny atď.) a ne

ganické (rôzne katióny a anióny) zlúčeniny. Kompozitné oddelenie

Obsah analyzovanej zmesi v ionexovej chromatografii je založený na reverzibilnej interakcii iónov analyzovaných látok s iónovými skupinami

pamäť sorbentu. Ako sorbenty sa používajú aniónomeniče alebo katexy.

vy. Tieto sorbenty sú prevažne buď polymérne iónové

výmenné živice (zvyčajne kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s

iónové skupiny) alebo silikagély s naočkovanými iónomeničovými skupinami. Na separáciu aniónov sa používajú sorbenty so skupinami -(CH2)3N+ X– a na separáciu katiónov sorbenty so skupinami -(CH2)SO3 – H+.

Typicky sa polymérne živice používajú na separáciu aniónov a na separáciu

odstránenie katiónov – modifikované silikagély.

Vodné roztoky kyselín, zásad a solí sa používajú ako PF v iónomeničovej chromatografii. Zvyčajne sa používajú pufre

roztoky, ktoré umožňujú udržiavať určité hodnoty pH. Je tiež možné použiť malé organické prísady, ktoré sa zmiešajú s vodou.

lyžiarske rozpúšťadlá - acetonitril, metanol, etanol, tetrahydrofurán.

Iónová chromatografia- variant iónomeničovej chromatografie, v

v ktorom na stanovenie koncentrácie iónov analytu používame

používa konduktometrický detektor. Pre vysoko citlivé operácie

Na určenie zmien v elektrickej vodivosti prechádzajúcej cez detektor PF by mala byť elektrická vodivosť pozadia PF nízka.

Existujú dva hlavné varianty iónovej chromatografie.

Prvý z nich je založený na potlačení elektrickej vodivosti elektrolytu

PF pomocou druhej iónomeničovej kolóny umiestnenej medzi

lytický stĺpec a detektor. V tomto stĺpci dochádza k neutralizácii

PF a analyzované zlúčeniny vstupujú do deionizačnej bunky

destilovaná voda. Detegované ióny sú jediné ióny

zabezpečenie vodivosti PF. Nevýhodou supresnej kolóny je potreba jej regenerácie po pomerne krátkych časových úsekoch.

ja. Potlačovací stĺpik je možné priebežne vymieňať

bežný membránový supresor, v ktorom je zloženie membrány kontinuálne

sa obnovuje prúdením regeneračného roztoku pohybujúcim sa v smere

proti smeru toku PF.

Druhou verziou iónovej chromatografie je jednostĺpcová iónová chromatografia.

matografia. V tomto uskutočnení sa používa PF s veľmi nízkou elektrickou vodivosťou.

obsah vody. Slabé organické zlúčeniny sa široko používajú ako elektrolyty.

Čínske kyseliny – benzoová, salicylová alebo izoftalová.

BEZPEČNÁ HPLC

Veľkostná vylučovacia chromatografia (gélová chromatografia) je špeciálna verzia HPLC založená na separácii molekúl podľa ich veľkosti. Distribúcia

molekúl medzi stacionárnou a mobilnou fázou je založený na veľkosti mo-

molekulách a čiastočne na ich tvare a polarite. Na oddelenie použite

porézne sorbenty – polyméry, silikagél, porézne sklá a polysacharidy.

Veľkosť častíc sorbentov je 5-10 mikrónov.

Výhodou poréznych skiel a silikagélu je rýchla difúzia PF a molekúl analyzovanej látky do pórov, stabilita v rôznych podmienkach (aj pri vysokých teplotách). polymérny sorbén -

ste kopolyméry styrénu a divinylbenzénu (to je hydro-

fobické sorbenty používané s nepolárnymi mobilnými fázami) a

hydrofilné gély získané zo sulfónovaných divinylbenzénových alebo polyakrylamidových živíc.

Sú možné dva limitujúce typy interakcie molekúl s poréznou stacionárnou fázou. Molekuly, ktorých veľkosť je väčšia ako stredný priemer pórov, vôbec neprenikajú do sorbentu a sú eluované spolu s mobilnou fázou.

najprv zoy. Molekuly s priemerom výrazne menším ako je veľkosť pórov sorbentu

benta do nej voľne prenikajú, zostávajú najdlhšie v stacionárnej fáze a eluujú sa ako posledné. Stredne veľké molekuly prenikajú do pórov sorbentu v závislosti od ich veľkosti a čiastočne v závislosti od ich tvaru. Eluujú s rôznymi retenčnými časmi medzi nimi

naše najväčšie a najmenšie molekuly. K separácii zložiek chromatografovanej vzorky dochádza v dôsledku opakovania

difúzia zložiek vzorky do pórov sorbentu a naopak.

Pri vylučovacej chromatografii na charakterizáciu retencie,

Používa sa retenčný objem rovný súčinu prietoku PF a retenčného času.

Mobilná fáza. Výber PF závisí od typu sorbentu. Vylúčenie-

Chromatografia sa všeobecne delí na gélovú filtráciu a gélovú chromatografiu.

permeačnej chromatografie.

Na separáciu sa používa metóda gélovej filtračnej chromatografie

výskum vo vode rozpustných zlúčenín na hydrofilných sorbentoch. Mobilné fázy sú vodné tlmivé roztoky s danou hodnotou pH.

Pri gélovej permeačnej chromatografii sa používajú hydrofóbne sorby.

ohyby a nepolárne organické rozpúšťadlá (toluén, dichlórmetán, te-

ragidofurán). Táto metóda sa používa na analýzu zlúčenín, ktoré sú zle rozpustné

ráfiky vo vode.

Detektory. Diferenciálne refraktometrické detektory, ako aj spektrofotometrické detektory (vrátane detektorov v IR spektrálnej oblasti) sa používajú ako detektory pri vylučovacej chromatografii.

Používajú sa aj viskozimetrické a prietokové laserové detektory.

Tieto detektory v kombinácii s refraktometrom alebo inou koncentráciou

detektor umožňujú kontinuálne určovať molekulovú hmotnosť

vápno v PF.

ULTRA VÝKONNÁ KVAPALNÁ CHROMATOGRAFIA

Ultravýkonná kvapalinová chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, ktorý je efektívnejší

v porovnaní s klasickou HPLC.

Znakom ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie je

Je možné použiť sorbenty s veľkosťou častíc od 1,5 do 2 mikrónov. Rozmery chróm

matematické stĺpce majú zvyčajne dĺžku od 50 do 150 mm a od 1

do priemeru 4 mm. Objem vstreknutej vzorky sa môže pohybovať od 1 do 50 µl.

Chromatografické zariadenia používané v klasických va-

riant HPLC, zvyčajne špeciálne upravená pre tento typ chromatografie

Zariadenie určené pre ultravýkonnú kvapalinovú chromatografiu je možné použiť aj v klasickej verzii HPLC.