Cromatografia lichidă
Cromatografia lichidă este un tip de cromatografie în care Faza mobila, numit eluent, este lichid. Faza stationara Pot fi sorbent solid, purtător solid cu lichid depus pe suprafața sa sau gel.
Distinge coloanăȘi strat subțire cromatografie lichidă. În varianta cu coloană, o porțiune din amestecul separat de substanțe este trecută printr-o coloană umplută cu o fază staționară într-un curent de eluant care se mișcă sub presiune sau sub influența gravitației. În cromatografia în strat subțire, eluantul se deplasează sub acțiunea forțelor capilare de-a lungul unui strat plat de sorbant depus pe o placă de sticlă sau o folie metalică, de-a lungul unei pelicule polimerice poroase sau de-a lungul unei benzi de hârtie specială pentru cromatografie. De asemenea, a fost dezvoltată o metodă de cromatografie lichidă în strat subțire sub presiune, în care eluentul este pompat printr-un strat de sorbent plasat între plăci.
Există astfel de tipuri de cromatografie lichidă precum analitic(pentru analiza amestecurilor de substanțe) și pregătitoare(pentru a izola componentele pure).
Distinge cromatografie lichidă (LC)în varianta sa clasică, realizată cu presiune atmosferică, Și de mare viteză), efectuat la tensiune arterială crescută. Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) utilizează coloane cu un diametru de până la 5 mm, etanș împachetate cu un sorbant cu particule mici (3-10 µm). Pentru a pompa eluentul prin coloană, aplicați o presiune de până la 3,107 Pa. Acest tip de cromatografie se numește cromatografia la presiune înaltă. Trecerea eluentului printr-o coloană sub presiune înaltă vă permite să creșteți dramatic viteza de analiză și să creșteți semnificativ eficiența separării datorită utilizării sorbantului fin dispersat.
Opțiuni HPLC sunt cromatografia pe microcoloană pe coloane de diametru mic umplute cu sorbant şi cromatografia capilară pe coloane capilare goale şi umplute cu absorbant. Metoda HPLC permite în prezent izolarea, analiza cantitativă și calitativă a amestecurilor complexe de compuși organici.
Cromatografia lichidă este cea mai importantă metodă de cercetare fizică și chimică în chimie, biologie, biochimie, medicină și biotehnologie. Este folosit pentru:
· studiul proceselor metabolice în organismele vii ale medicamentelor;
· diagnostic în medicină;
· analiza produselor de sinteza chimica si petrochimica, intermediari, coloranti, combustibili, lubrifianti, uleiuri, ape uzate;
· studiul izotermelor de sorbtie din solutie, cinetica si selectivitatea proceselor chimice;
· deversare
· analiza și separarea amestecurilor, purificarea lor și izolarea multor substanțe biologice din acestea, precum aminoacizi, proteine, enzime, virusuri, acizi nucleici, carbohidrați, lipide, hormoni.
În chimia compușilor macromoleculari și în producția de polimeri, cromatografia lichidă este utilizată pentru a analiza calitatea monomerilor, a studia distribuția și distribuția greutății moleculare după tipul de funcționalitate a oligomerilor și polimerilor, ceea ce este necesar pentru controlul produsului.
Cromatografia lichidă este folosită și în parfumerie, industria alimentară, pentru analiza poluării mediului și în criminalistică.
Metoda cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) a fost dezvoltată și introdusă la mijlocul anilor '70 ai secolului XX. Apoi au apărut primele cromatografe lichide.
Cromatografia de lichide este metoda optima pentru analiza moleculelor instabile chimic si termic, substante cu greutate moleculara mare cu volatilitate redusa. Acest lucru poate fi explicat prin rolul special al fazei mobile în LC, spre deosebire de cromatografia gazoasă: eluentul îndeplinește nu numai o funcție de transport.
2. Concepte de bază și clasificare a metodelor de cromatografie lichidă.
De mecanism de reținere a substanțelor separate de către faza staționară LC distinge:
- cromatografia de sedimente, pe baza solubilității diferite a precipitatelor care se formează în timpul interacțiunii componentelor amestecului analizat cu precipitantul. Avantajul metodei este că zonele rezultate de-a lungul sorbentului au granițe ascuțite, conțin sedimente dintr-o singură substanță și sunt adesea separate de zone de sorbent pur. Cu toate acestea, această metodă nu a găsit încă o utilizare pe scară largă.
· cromatografia de adsorbție , în care separarea se realizează ca urmare a interacţiunii substanţei cu care se separă adsorbant cum ar fi oxid de aluminiu sau silicagel, având la suprafaţă centri polari activi. Solvent(eluent) - lichid nepolar.
Orez. Schema de separare a unui amestec de substanțe folosind cromatografia de adsorbție
http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg
Mecanismul de sorbție constă într-o interacțiune specifică între suprafața polară a sorbantului și secțiunile polare (sau capabile de polarizare) ale moleculelor componentei analizate (Fig.). Interacțiunea are loc datorită interacțiunii donor-acceptor sau formării legăturilor de hidrogen.
Orez. Schema cromatografiei lichide de adsorbție
https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">
Orez. . Cromatografia de partiție cu fază grefată (versiunea în fază normală).
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
La faza normalaÎn versiunea cu cromatografie lichidă de partiție, alchilclorosilanii substituiți care conțin grupări polare, cum ar fi nitril, grupare amino, etc., sunt utilizați ca modificatori de suprafață a gelului de silice (faze grefate) (Fig.). Utilizarea fazelor altoite face posibilă controlul fin al proprietăților de sorbție ale suprafeței fazei staționare și obținerea unei eficiențe ridicate de separare.
Faza inversata cromatografia lichidă se bazează pe distribuția componentelor amestecului între un eluent polar și grupări nepolare (lanțuri lungi de alchil) grefate pe suprafața sorbantului (Fig.). Mai puțin folosită este o variantă de cromatografie lichidă cu faze depuse, când o fază staționară lichidă este depusă pe un purtător staționar.
Orez. . Cromatografia de partiție cu fază grefată (versiunea cu fază inversă). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
Cromatografia lichidă de partiție include, de asemenea lichid de extracție cromatografia, în care faza staționară este un extractant organic depus pe un purtător solid, iar faza mobilă este o soluție apoasă a compușilor care se separă. Ca agenți de extracție, de exemplu, sunt utilizați fenoli, trialchil fosfați, amine, baze de amoniu cuaternar, precum și compuși organofosforici care conțin sulf. Cromatografia lichidă de extracție este utilizată pentru a separa și concentra compuși anorganici, de exemplu, ionii de metale alcaline, actinide și alte elemente cu proprietăți similare, în procesele de prelucrare a combustibilului nuclear uzat.
- cromatografia cu schimb de ioni, care se bazează pe schimbul stoechiometric reversibil al ionilor conținuti în soluția analizată cu ionii mobili incluși în compoziție ioniți.În funcție de semnul sarcinii grupărilor ionizante, schimbătoarele de ioni se împart în schimbătoare de cationiȘi schimbătoare de anioni. Există, de asemenea schimbători de ioni amfoteri –amfoliti, care poate schimba simultan atât cationi, cât și anioni. Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată numai pentru separarea particulelor încărcate. Separarea se bazează pe capacitatea rășinii schimbătoare de ioni de a reține diferiți ioni cu diferite forțe. ionit constă dintr-o matrice polimerică și grupări active asociate cu aceasta, care sunt capabile de schimb ionic. Cationit are proprietăți acide sau ușor acide, deoarece conține grupe: - SO3H, –CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 și altele în care ionii de hidrogen sunt mobili. Schimbătoare de anioni au proprietăţi bazice sau slab bazice şi conţin grupe: = NH2, - NH2, –NR3+, -OH şi altele. Separarea ionilor este reglată prin selectarea valorilor optime ale pH-ului eluentului și a tăriei ionice a acestuia. Schematic, schimbul de ioni poate fi reprezentat prin reacțiile:
R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (schimb de cationi)
R-OH + Na+ + Cl - → R-Cl + Na+ + OH - (schimb anionic)
Schimbatoarele de ioni trebuie sa indeplineasca urmatoarele cerinte: sa fie stabile chimic in diverse medii, puternice mecanic in stare uscata si mai ales umflate, sa aiba capacitate mare de absorbtie si capacitatea de a se regenera bine.
În cromatografia cu schimb de ioni (ioni), anionii (cationii) separați sunt detectați ca acizi (baze corespunzătoare) de un detector conductometric foarte sensibil, în care coloanele de înaltă eficiență sunt împachetate cu o rășină ionică surfactant de capacitate redusă.
- cromatografia cu perechi de ioni, care poate fi considerată o combinație de cromatografia de adsorbție și schimb de ioni. Metoda se bazează pe extracția substanțelor ionice - transferul lor din faza apoasă în faza organică sub formă de perechi de ioni. Pentru a face acest lucru, la faza mobilă se adaugă un contraion, care este capabil să reacționeze selectiv cu componentele analizate, transformându-le în compuși complecși cu formarea unei perechi de ioni. Principalele avantaje ale acestei opțiuni sunt că substanțele acide, bazice și neutre pot fi analizate simultan.
- cromatografia de schimb de liganzi bazat pe abilități diferite ale compușilor separați de a forma complecși cu cationii metalelor tranziționale– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 etc. - și grupele de fixare (liganzi) ale fazei staționare. O parte a sferei de coordonare a ionilor metalici este ocupată de molecule de apă sau alți liganzi slabi, care pot fi înlocuiți de moleculele compușilor separați. Acest tip de cromatografie este utilizat pentru a separa izomerii optici.
- cromatografia de excludere dimensională(sită, permeație în gel, filtrare pe gel), în care se bazează separarea diferențe de dimensiuni moleculare.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">
Orez. Schema cromatografiei de penetrare a gelului
- cromatografia de afinitate(biospecific), pe baza faptului că multe macromolecule active biologic, de exemplu, enzimele, se pot lega în mod specific la un anumit reactiv. Reactivul se fixează pe un purtător (adesea agaroză), apoi se spală cu amestecul de analizat. Doar macromolecula dorită este reținută pe polimer (Fig.).
Orez. Schema cromatografiei de afinitate
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
Este apoi îndepărtat din polimer prin trecerea unei soluții dintr-un compus care are o afinitate și mai mare pentru macromoleculă. O astfel de cromatografie este eficientă în special în biotehnologie și biomedicină pentru izolarea enzimelor, proteinelor și hormonilor.
Depinde asupra metodei de mișcare a materiei Se disting următoarele tipuri de cromatografie lichidă: de dezvoltare, frontalăȘi represiv.
Cel mai des folosit manifestă o variantă în care o porţiune din amestecul de separat este introdusă în coloană în fluxul de eluant. Ieșirea componentelor amestecului din coloană este înregistrată pe cromatogramă sub formă de vârfuri. (orez.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">
Orez. Schema de dezvoltare a variantei cromatografiei
Înălţime sau zona de vârf caracterizează concentrația componentelor, A ținută volumele – compoziție de amestec de înaltă calitate. Identificarea componentelor se realizează de obicei prin coincidența timpilor de retenție cu substanțele standard; se folosesc și metode chimice sau fizico-chimice.
La frontalÎn varianta (Fig.), se trece continuu prin coloană un amestec al substanțelor de separat, care joacă rolul unei faze mobile. Ca urmare, este posibil să se obțină în formă pură doar substanța care este cel mai puțin absorbită în coloană.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">
Orez. Schema opțiunii de cromatografie frontală
Cromatograma în acest caz reprezintă trepte, ale căror înălțimi sunt proporționale cu concentrațiile componentelor; volumele reţinute sunt determinate de timpul de retenţie al componentelor. La diferențierea unei astfel de cromatograme, se obține o imagine similară cu cea obținută în versiunea de dezvoltare.
ÎN represivÎn acest caz, componentele amestecului introduse în coloană sunt deplasate de eluant, care este adsorbit mai puternic decât orice componentă. Ca urmare, se obțin fracții din substanțele separate adiacente între ele.Ordinea de eliberare a componentelor este determinată de puterea interacțiunii lor cu suprafața sorbantului (Fig.).
https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">
Orez. Schema cromatografiei de deplasare
3. Mărimi cromatografice de bază și determinarea lor.
La separarea substanțelor folosind cromatografia lichidă, pot fi utilizate opțiuni de dezvoltare, frontale și de deplasare, așa cum este indicat mai sus. Cel mai adesea, se utilizează o opțiune de dezvoltare, în care o porțiune din amestecul de separat este introdusă în coloană în fluxul de eluent. Ieșirea componentelor amestecului din coloană este înregistrată pe cromatogramă sub formă de vârfuri. Din cromatogramă (fig.) determinați:
- timpii de retenție ai componentelor nesorbante (t0), separate (tR1, tR2, tR3 etc.); lățimea bazelor vârfurilor (tw1, tw2 etc.).
https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;
b) volumul de retenție al componentelor corectat ,
Unde t"R - timp de retenție a componentelor corectat;
c) coeficientul capacităţii coloanei în raport cu o componentă dată 
;
d) eficienta coloanei caracterizat numărul de plăci teoretice echivalente
https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;
f) permisiune https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">
Factorul de capacitate k" are un impact semnificativ asupra valorii R S: la schimbare k" de la 0 la 10 (limite optime) R S crește foarte mult. Sens k" este determinată de suprafața dublată a sorbantului și cantitatea acestuia din coloană, precum și de constanta de echilibru de adsorbție (constanta lui Henry).
Coeficientul de selectivitate α este determinată de diferența dintre constantele de echilibru de adsorbție ale celor două componente separate. Pe măsură ce α crește (de la 1 la ~5) R S crește brusc, cu o creștere suplimentară a α - se modifică puțin. Selectivitatea unei coloane depinde de factori precum structura chimică a suprafeței sorbantului, compoziția eluentului, temperatura coloanei și structura compușilor care sunt separați. Deoarece sorbția substanțelor cromatografiate în cromatografia lichidă este determinată de interacțiunea în perechi a celor trei componente principale ale sistemului - sorbantul, substanțele care sunt separate și eluentul, modificarea compoziției eluentului este o modalitate convenabilă de a optimiza procesul de separare. .
Eficiența coloanei depinde de dimensiunea particulelor și de structura porilor adsorbantului, de uniformitatea umpluturii coloanei, de vâscozitatea eluentului și de viteza de transfer de masă. Alungirea coloanei nu duce întotdeauna la o separare îmbunătățită, deoarece rezistența coloanei crește, presiunea eluantului la intrare și timpul experimentului cresc, iar sensibilitatea și acuratețea analizei scad datorită lărgirii vârfului de componenta analizata. Dacă , atunci vârfurile celor două substanțe din cromatogramă sunt separate aproape complet. Odată cu creșterea R S timpul de separare crește. La R S < 1 - separarea este nesatisfăcătoare. În cromatografia preparativă, datorită introducerii unor cantități relativ mari de substanțe separate, coloana funcționează cu suprasarcină. În acest caz, coeficientul de capacitate scade, înălțimea echivalentă cu placa teoretică crește, ceea ce duce la o scădere a rezoluției.
4. Adsorbanți
Separarea cromatografică a unui amestec va fi eficientă dacă adsorbantul și solventul (eluentul) sunt selectați corect.
Adsorbantul nu trebuie să interacționeze chimic cu componentele separate sau să prezinte un efect catalitic asupra solventului. De asemenea, este necesar ca adsorbantul să fie selectiv în raport cu componentele amestecului. Un adsorbant selectat corect ar trebui să aibă o capacitate maximă de absorbție.
Distinge polar (hidrofil)Și adsorbanți nepolari (hidrofobi).. Trebuie amintit că afinitatea de adsorbție a substanțelor polare pentru absorbanții polari este mult mai mare decât pentru cei nepolari.
Ca adsorbanți se folosesc oxid de aluminiu, cărbuni activi, silicagel, zeoliți, celuloză și unele minerale.
Oxid de aluminiuAl2O3 – adsorbant amfoter.(Fig.) Pe el amestecurile pot fi separate substanțe în polar, asa de în solvenţi nepolari. Oxidul de aluminiu neutru este de obicei utilizat pentru cromatografia din soluții neapoase de hidrocarburi saturate, aldehide, alcooli, fenoli, cetone și eteri.
Orez. Oxid de aluminiu pentru cromatografie
http://imagini. /542857_w200_h200_product5.jpg
Activitatea Al2O3 depinde de conținutul său de umiditate. Oxidul de aluminiu anhidru are cea mai mare activitate. Este convențional luată ca una. Dacă este necesar, alumina cu conținut diferit de umiditate poate fi preparată prin amestecarea aluminei proaspăt preparate cu apă (scara Brockman).
Dependența activității oxidului de aluminiu de conținutul de umiditate
De exemplu, Al2O3 cu o activitate de 1,5-2 este utilizat pentru separarea hidrocarburilor; pentru separarea alcoolilor și cetonelor – 2-3,5.
Suprafața specifică a oxidului de aluminiu este de 230-380 m2/g.
Gel de silice(hidroxilat sau modificat chimic) este un dioxid de siliciu gelatinos uscat, care se obține din soluții suprasaturate de acizi silicici ( n SiO2 m H2O) la pH > 5-6. (fig.) Sorbant hidrofil solid.
Orez. Gel de silice
http://www. gel de silice. /
http://silikagel. ru/images/askg. gif
Dimensiunea particulelor de silicagel în coloanele analitice este de 3-10 microni, în coloanele preparative - 20-70 microni. Dimensiunea mică a particulelor mărește rata de transfer de masă și îmbunătățește eficiența coloanei. Coloanele analitice moderne au 10-25 cm lungime. Sunt umplute cu silicagel cu o dimensiune a particulelor de 5 microni și vă permit să separați amestecuri complexe de 20-30 de componente. Pe măsură ce dimensiunea particulelor scade la 3-5 microni, eficiența coloanei crește, dar crește și rezistența acesteia. Deci, pentru a obține un debit de eluant de 0,5-2,0 ml/min, este necesară o presiune de (1-3)·107 Pa. Silicagelul poate rezista la o astfel de diferență de presiune, în timp ce granulele de adsorbanți polimerici sunt mai elastice și mai deformabile. Recent, au fost dezvoltați adsorbanți polimerici puternici din punct de vedere mecanic, cu o structură macroporoasă, cu o rețea densă, care în eficacitatea lor sunt apropiate de gelurile de silice. Forma particulelor de absorbant cu o dimensiune de 10 µm și mai mult nu are un impact mare asupra eficienței coloanei, totuși, sunt preferați adsorbanții sferici, care asigură un ambalaj mai permeabil. (Fig.)
Orez. Silicagel sferic
http://imagini. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif
http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg
Structura internă a unei particule de gel de silice este un sistem de canale comunicante. Pentru cromatografia lichidă se folosesc adsorbanți cu diametrul porilor de 6-25 nm. Separarea prin cromatografie lichidă se efectuează în principal pe silicageluri modificate prin reacția alchil și arii clorosilani sau alchil etoxi silani cu grupări silanol de la suprafață. Folosind astfel de reacții, se grefează grupări C8H17-, C18H37- sau C6H5- (pentru a obține sorbanți cu suprafață hidrofobizată), nitril, grupări hidroxil etc. (Fig.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">
Orez. Structura gelului de silice modificat
Geluri de silice folosit în cromatografie pentru separarea amestecurilor de produse petroliere, mai mare acizi grași, esterii lor, amine aromatice, nitro derivați compusi organici. Gel de silice – sorbent hidrofil, ușor de umezit cu apă. Prin urmare, nu poate fi utilizat pentru sorbția din soluții apoase. Activitatea gelului de silice depinde de conținutul de apă din acesta: cu cât conține mai puțină apă, cu atât activitatea este mai mare (scara Brockmann).
Dependența activității gelului de silice de conținutul de umiditate
Suprafața specifică a gelurilor de silice este de 500-600 m2/g.
Cărbuni activați sunt o formă de carbon care, la procesare, devine extrem de poroasă și capătă o suprafață foarte mare disponibilă pentru adsorbție sau reacții chimice.(Fig.) Au o suprafață specifică de 1300-1700 m2/g.
Orez. Cărbune activ
http://e-catalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg
Influența principală asupra structurii porilor cărbunelui activ este exercitată de materiile prime pentru producerea lor. Carbonii activați pe bază de coji de nucă de cocos se caracterizează printr-o proporție mai mare de micropori (până la 2 nm), în timp ce cei pe bază de cărbune se caracterizează printr-o proporție mai mare de mezopori (2-50 nm). O proporție mare de macropori este caracteristică cărbunelui activ pe bază de lemn (mai mult de 50 nm). Microporii sunt deosebit de potriviți pentru adsorbția moleculelor de dimensiuni mici, în timp ce mezoporii sunt deosebit de potriviți pentru adsorbția de molecule organice mai mari.
Zeoliți (site moleculare)– aluminosilicati cristalini porosi de metale alcaline si alcalino-pamantoase de origine naturala si sintetica. (orez.)
https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">
Orez. Zeoliți
http://www. zeolit spb. ru/_img/_36mm. jpg
http://kntgroup. ru/degetul mare. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250
Există patru tipuri cunoscute de zeoliți (A, X, Y, M), având structuri cristaline diferite. În funcție de cation, zeoliții sunt desemnați astfel: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Caracteristica zeoliților este asta porii cristalelor au dimensiuni de ordinul a 0,4-1 nm, comparabile cu dimensiunea moleculelor multe substanțe lichide sau gazoase. Dacă moleculele unei substanțe sunt capabile să pătrundă în acești pori, atunci are loc adsorbția în porii cristalelor de zeolit. Moleculele mai mari ale substanței nu sunt adsorbite. Prin selectarea zeoliților cu dimensiuni diferite ale porilor, amestecurile de substanțe diferite pot fi separate clar.
Suprafața specifică a zeoliților este de 750-800 m2/g.
Atunci când alegeți un adsorbant, este necesar să se țină cont de structura substanțelor și de solubilitatea acestora. De exemplu, hidrocarburile saturate sunt slab adsorbite, în timp ce hidrocarburile nesaturate (au legături duble) sunt adsorbite mai bine. Grupurile funcționale sporesc capacitatea de adsorbție a unei substanțe.
5. Eluanţi
Atunci când alegeți un solvent (eluent), trebuie să țineți cont de natura adsorbantului și de proprietățile substanțelor din amestecul de separat. Eluanții trebuie să dizolve bine toate componentele amestecului cromatografiat, să aibă vâscozitate scăzută, să ofere nivelul necesar de selectivitate, să fie ieftini, netoxici, inerți și compatibili cu metodele de detectare (de exemplu, benzenul nu poate fi utilizat ca eluant cu UV. detector).
În cromatografia în fază normală, hidrocarburile (hexan, heptan, izooctan, ciclohexan) sunt de obicei utilizate cu adăugarea de cantități mici de cloroform CHCI3, izo-propanol izo-C3H7OH, eter diizopropilic; în cromatografia în fază inversă - un amestec de apă cu acetonitril CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxan, tetrahidrofuran, dimetilformamidă. Pentru a izola componentele individuale ale unui amestec separat în timpul cromatografiei, acestea sunt adesea spălate (eluate) succesiv. În acest scop, se folosesc solvenți cu capacități de desorbție diferite. Solvenții sunt aranjați în ordinea descrescătoare a capacității de desorbție în adsorbanții polari - seria eluotropă Trappe. Dacă componentele amestecului care se separă au valori similare k" ( coeficientul capacității coloanei în raport cu o componentă dată), apoi se cromatografiază cu un eluant. Dacă componentele individuale ale amestecului sunt reținute puternic de absorbant, se utilizează o serie de eluanți cu rezistență crescândă.
Seria eluotropică de solvenți
6. Echipamente pentru cromatografie lichidă
În cromatografia lichidă modernă, sunt utilizate instrumente de diferite grade de complexitate - de la cele mai simple sisteme până la cromatografele de înaltă clasă.
Un cromatograf lichid modern include: recipiente pentru eluanți, pompe de înaltă presiune, un dozator, o coloană cromatografică, un detector, un dispozitiv de înregistrare, un sistem de control și prelucrare matematică a rezultatelor.
În fig. este prezentată o diagramă bloc a unui cromatograf lichid, care conține setul minim necesar de componente, într-o formă sau alta, prezente în orice sistem cromatografic.
https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">
Orez. Schema unui cromatograf lichid: 1 - rezervor pentru faza mobilă, 2 - pompă, 3 - injector, 4 - coloană, 5 - termostat, 6 - detectoare, 7 - sistem de înregistrare, 8 - computer.
Rezervor de stocare pentru faza mobila, trebuie sa aiba capacitate suficienta de analiza si dispozitiv de degazare a solventului pentru a preveni formarea de bule de gaze dizolvate în eluent în coloană și detector.
Pompa destinat pentru a crea un flux constant de solvent. Designul său este determinat în primul rând de presiunea de funcționare din sistem. Pentru a funcționa în intervalul 10-500 MPa, se folosesc pompe de tip piston (seringă). Dezavantajul lor este necesitatea opririlor periodice pentru umplere cu eluent. Pentru sistemele simple cu presiuni scăzute de funcționare de 1-5 MPa se folosesc pompe peristaltice ieftine. Eluanții intră în pompă printr-un filtru care reține particulele de praf (mai mult de 0,2 microni). Uneori, un mic curent de heliu este trecut prin eluanți pentru a îndepărta aerul dizolvat și pentru a preveni formarea de bule în detector (mai ales în cazul eluenților apoși și polari). În cromatografele analitice, pompele cu piston cu un sistem de feedback sunt utilizate pentru a furniza eluent în coloană, făcând posibilă netezirea pulsațiilor debitului cu 1-2% și oferind debite volumetrice de la 0,1 la 25 ml/min la presiuni de până la ~ 3.107 Pa. În cromatografia pe microcoloană, debitele volumetrice ale eluentului sunt mult mai mici - 10-1000 µl/min. În cazul eluării în gradient, se folosesc mai multe pompe, care sunt controlate de un programator și furnizează 2-3 componente de eluent în camera de amestec, lăsând constant debitul total. Pentru a introduce o probă într-o coloană sub presiune mare fără a opri curgerea, se folosesc robinete speciale de microdozare, conectate la o buclă de volum cunoscut pentru proba de soluție studiată. Au fost dezvoltate sisteme de dozare cu prelevare automată și injectare a probelor folosind robinete de microdozare sau seringi.
Injector prevede injectarea probei de amestec componente separate într-o coloană cu reproductibilitate destul de mare. Sistemele simple de injectare a probei „stop-flow” necesită oprirea pompei și, prin urmare, sunt mai puțin convenabile decât pipetele cu buclă dezvoltate de Reodyne.
Coloane pentru HPLC sunt realizate cel mai adesea dintr-un tub lustruit din oțel inoxidabil de 10-25 cm lungime și un diametru interior de 3-5 mm.
Orez. Coloane de cromatografie pentru cromatografie lichidă
De asemenea, folosit difuzoare din sticlă, plasat într-o carcasă metalică; în cromatografia pe microcoloană - difuzoare metalice ambalate cu un diametru interior de 1,0-1,5 mm, microcoloane de sticlă ambalate cu diametrul de 70-150 microni şi coloane capilare goale diametru 10-100 microni; în cromatografia preparativă - coloane cu un diametru de 2 până la 10 cm sau mai mult. Pentru a umple uniform și dens coloanele cu sorbant, se folosește metoda de ambalare în suspensie. Se prepară o suspensie dintr-un sorbant și un lichid organic adecvat, care este furnizat sub presiune până la 5,107 Pa în coloană. Pentru a determina componentele separate care părăsesc o coloană utilizare detectoare. Consistența temperaturii furnizate termostat.
Detectoare pentru cromatografia lichidă au o celulă de flux în care are loc o măsurare continuă a unei proprietăți a eluentului care curge. Trebuie să fie foarte sensibili. Pentru a crește sensibilitatea detectorului, se folosește uneori derivatizarea componentelor amestecului după coloană. Pentru a face acest lucru, se introduc reactivi cu fluxul de eluent care, interacționând cu substanțele separate, formează derivați cu proprietăți mai pronunțate, de exemplu, absorb mai puternic în regiunea UV sau vizibilă a spectrului sau au o capacitate de fluorescentă mai mare. Uneori, derivatizarea este efectuată înainte de analiza cromatografică, iar derivații sunt separați mai degrabă decât materiile prime. Cele mai populare tipuri detectoare scop general sunt refractometre, măsurând indicele de refracție, Și detectoare spectrofotometrice, definind densitatea optică a solventului la o lungime de undă fixă (de obicei în regiunea ultravioletă). LA Avantajele refractometrelor(Și dezavantajele spectrofotometrelor) ar trebui atribuită sensibilitate scăzută la tipul care se determină conexiuni, care poate să nu conțină grupări cromofore. Pe de altă parte, utilizarea refractometrelor este limitată la sisteme izocratice (cu o compoziție de eluent constantă), astfel încât utilizarea unui gradient de solvent în acest caz este imposibilă.
Diferențial "href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">amplificator și recorder diferențial. De asemenea, este de dorit să aveți integrator, care vă permite să calculați ariile relative ale vârfurilor rezultate. În sistemele cromatografice complexe se utilizează bloc de interfață, conectând cromatograful la calculator personal, care nu numai că colectează și prelucrează informații, ci și controlează dispozitivul, calculează caracteristicile cantitative și, în unele cazuri, compoziția calitativă a amestecurilor. Microprocesor prevede injectarea automată a probei, schimba prin programul specificat de compoziție a eluanților cu gradient de eluție, mentine temperatura coloanei.
Bruker”. Orez. Cromatograf lichid Jasco
Întrebări de autotest
Ce este cromatografia lichidă? Denumiți-i tipurile și domeniile de aplicare. Lista despre mărimi cromatografice de bază și definirea lor Ce tipuri de cromatografie lichidă există în funcție de mecanismul de reținere a substanțelor separate prin faza staționară a LC? Ce tipuri de cromatografie există în funcție de metoda de deplasare a substanței? Ce substanțe sunt folosite ca adsorbanți? Care este diferența? Ce servește ca fază mobilă lichidă - eluent? Cerințe pentru solvenți. Care este diferența dintre cromatografia de partiție și cromatografia de adsorbție? Enumerați părțile principale ale unui circuit cromatograf lichid și scopul lor.Lista literaturii folosite
1 „Cromatografia lichidă în medicină”
http://jurnal. isep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf
2 „Introducere în metodele de cromatografie lichidă de înaltă performanță”
http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html
3 „Cromatografie lichidă”
http://e-science. ru/index/?id=1540
4 „Cromatografie”
http://belchem. oameni ru/chromatography1.html
(OFS 42-0096-09)
Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este o metodă de cromatografie pe coloană în care faza mobilă (MP) este lichidă.
os care se deplasează printr-o coloană de cromatografie umplută cu inaccesibile
faza vizuală (sorbent). Coloanele HPLC sunt caracterizate de o presiune hidraulică ridicată la intrarea coloanei, de aceea HPLC este uneori numită
numită „cromatografie lichidă de înaltă presiune”.
În funcție de mecanismul de separare a substanțelor, se disting următoarele:
opțiuni HPLC actuale: adsorbție, distribuție, schimb ionic,
exclusivist, chiral etc.
În cromatografia de adsorbție, separarea substanțelor are loc datorită abilităților diferite ale acestora de a fi adsorbite și desorbite cu
suprafața unui adsorbant cu o suprafață dezvoltată, de exemplu, silicagel.
În HPLC de distribuție, separarea are loc datorită diferențelor în coeficienții de distribuție ai substanțelor care sunt separate între staționari.
(de obicei grefat chimic pe suprafața unui purtător staționar) și
fazele mobile.
După polaritate, HPLC PF și NP sunt împărțite în fază normală și ob-
fază extinsă.
Faza normală este o variantă de cromatografie în care
utilizați un sorbent polar (de exemplu, silicagel sau silicagel cu
grupări NH2 sau CN răsucite) și PF nepolar (de exemplu, hexan cu di-
suplimente personale). În versiunea cu fază inversă a cromatografiei,
utilizați adsorbanți nepolari modificați chimic (de exemplu,
radicalul alchil nepolar C18) și fazele mobile polare (de ex.
metanol, acetonitril).
În cromatografia cu schimb de ioni, moleculele de substanțe dintr-un amestec se disociază
în soluție în cationi și anioni sunt separați la trecerea prin
sorbent (schimbător de cationi sau schimbător de anioni) datorită ratelor lor diferite de schimb cu ionii
mi grupuri de sorbant.
În excludere (sită, gel-permeating, gel filtrare)
cromatografia, moleculele de substanțe sunt separate după dimensiune datorită capacității lor diferite de a pătrunde în porii fazei staționare. În același timp, primul dintre co-
Coloanele produc cele mai mari molecule (cu cea mai mare greutate moleculară) capabile să pătrundă în numărul minim de pori ai fazei staționare,
iar ultimele care au apărut sunt substanțele cu dimensiuni moleculare mici.
Adesea, separarea are loc nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan.
Metoda HPLC poate fi utilizată pentru a controla calitatea oricăror non-
analiți zooformi. Pentru efectuarea analizei se folosesc instrumente adecvate - cromatografe lichide.
Compoziția unui cromatograf lichid include de obicei următoarele elemente de bază:
Noduri:
– Unitate de pregătire PF, inclusiv un container cu fază mobilă (sau capacitiv
legături cu solvenți individuali incluși în faza mobilă
3) și sistemul de degazare PF;
– sistem de pompare;
– mixer de fază mobilă (dacă este necesar);
– sistem de introducere a probei (injector);
– coloană cromatografică (poate fi instalată într-un termostat);
– detector;
– sistem de colectare și prelucrare a datelor.
Sistem de pompare
Pompele furnizează PF coloanei la o viteză constantă dată. Compoziția fazei mobile poate fi constantă sau variabilă.
în timpul analizei. În primul caz, procesul se numește izocratic,
iar în al doilea - gradient. Uneori sunt instalate în fața sistemului de pompare
filtre cu diametrul porilor de 0,45 microni pentru filtrarea fazei mobile. Modern
Un sistem de pompe pentru cromatograf lichid este format din una sau mai multe pompe controlate de computer. Acest lucru vă permite să schimbați
devenind PF conform unui anumit program cu gradient de eluare. Sme-
Amestecul de componente PF în mixer poate apărea atât la presiune joasă
presiune (inainte de pompe) si la presiune mare (dupa pompe). Mixerul poate fi utilizat pentru prepararea PF și eluție izocratică,
cu toate acestea, un raport mai precis al componentelor este obținut prin pre-
amestecarea temeinică a componentelor PF pentru un proces izocratic. Pompele pentru HPLC analitică fac posibilă menținerea unui debit constant de PF în coloană în intervalul de la 0,1 la 10 ml/min la o presiune la intrarea în coloană de până la 50 MPa. Este recomandabil, totuși, ca această valoare să nu depășească
trebuie să fie de 20 MPa. Pulsațiile de presiune sunt minimizate de amortizoare speciale
sisteme feroase incluse în proiectarea pompei. Piese de lucru pe-
Pompele sunt fabricate din materiale rezistente la coroziune, ceea ce permite utilizarea componentelor agresive în compoziția PF.
robinete
Prin proiectare, mixerele pot fi statice sau dinamice
microfon.
În mixer, se formează o singură fază mobilă din
solvenți eficienti furnizați de pompe dacă amestecul necesar nu a fost pregătit în prealabil. Amestecarea solvenților are loc de obicei spontan, dar uneori se folosesc sisteme cu amestecare forțată.
cusut.
Injectoare
Injectoarele pot fi universale pentru introducerea probelor din
1 µl până la 2 ml sau discret pentru introducerea unei probe de doar un anumit volum
ema. Ambele tipuri de injectoare pot fi automate ("autoinjectoare" sau "autosamplere"). Este amplasat injectorul pentru introducerea probei (soluție).
direct în fața coloanei de cromatografie. Designul injectorului vă permite să schimbați direcția fluxului PF și să preintroduceți o probă într-o buclă de un anumit volum (de obicei, de la 10 la 100 μl).
Acest volum este indicat pe eticheta buclei. Designul injectorului permite înlocuirea buclei. Pentru a introduce soluția de testare într-un sistem neautomat
Injectorul Tomatic folosește o microseringă manuală cu un volum semnificativ
depășind semnificativ volumul buclei. Exces de soluție injectată, nu
situat în buclă este resetat și un volum exact și întotdeauna egal de probă este injectat în coloană. Umplerea manuală incompletă a buclei reduce precizia
acuratețea și reproductibilitatea dozării și, prin urmare, afectează acuratețea
acuratețea și reproductibilitatea analizei cromatografice.
Coloana cromatografică
Coloanele cromatografice sunt de obicei tuburi din oțel inoxidabil, sticlă sau plastic, umplute cu un sorbant și închise.
căptușite pe ambele părți cu filtre cu diametrul porilor de 2–5 microni. Lungimea analitică
Grosimea coloanei, în funcție de mecanismul de separare cromatografic, poate fi în intervalul de la 5 la 60 cm sau mai mult (de obicei este
10–25 cm), diametrul intern – de la 2 la 10 mm (de obicei 4,6 mm). Coloanele cu un diametru interior mai mic de 2 mm sunt utilizate în crom microcoloană
toografie. Coloane capilare cu un diametru interior de
rom aproximativ 0,3-0,7 mm. Coloanele pentru cromatografie preparativă au un diametru interior de până la 50 mm sau mai mult.
Tuburile scurte pot fi instalate în fața coloanei analitice.
coloane (precoloane) care îndeplinesc diverse funcţii auxiliare
(mai des – protecția coloanei analitice). De obicei analiza se face cu
la temperatura normală, totuși, pentru a crește eficiența separării și a con-
Pentru a scurta durata analizei, pot fi folosite termostate.
testarea coloanelor la temperaturi nu mai mari de 60 C. La temperaturi mai ridicate, sunt posibile distrugerea sorbantului și modificări ale compoziției PF.
Faza staționară (sorbant)
Următoarele sunt de obicei utilizate ca absorbanți:
1. În mod normal se folosesc silicagel, oxid de aluminiu, grafit poros
cromatografia în fază mică. Mecanismul de reținere în acest caz este
ceai - de obicei adsorbție;
2. Rășini sau polimeri cu grupări acide sau bazice. Domeniul de aplicare: cromatografia cu schimb ionic;
3. Silicagel poros sau polimeri (cromatografie cu excludere dimensională);
4. Sorbitori modificați chimic (sorbanți cu faze altoite)
zami), preparată cel mai adesea pe bază de silicagel. Mecanismul de reținere este în majoritatea cazurilor distribuția între elementele mobile
faze noi și staționare;
5. Sorbanți chirali modificați chimic, de exemplu cei produși
celuloze și amiloze apoase, proteine și peptide, ciclodextrine,
utilizat pentru separarea enantiomerilor (cromatografie chirală
Sorbenții cu faze altoite pot avea diferite grade de substanță chimică
modificare ică. Particulele absorbante pot fi sferice sau nesferice
forma corecta si porozitate variata.
Cele mai frecvent utilizate faze de altoit sunt:
– grupări octil(octilsilan sau sorbent C8);
– grupări octadecil(sorbent octadecilsilan
(ODS) sau C18);
– grupări fenil(sorbent de fenilsilan);
– grupări cianopropil(sorbent CN);
– grupări aminopropil(sorbent de NH2);
– grupări diol (diol absorbant).
Cel mai adesea, analiza se efectuează pe faze grefate nepolare în
modul de fază inversă folosind sorbent C18.
În unele cazuri, este mai potrivit să folosiți normal
cromatografia de fază. În acest caz, gelul de silice sau fazele grefate polare („CN”, „NH2”, „diol”) sunt utilizate în combinație cu soluții nepolare.
Sorbenții cu faze altoite sunt stabili din punct de vedere chimic la valori ale pH-ului de la 2,0 la 8,0, dacă nu se specifică altfel de către producător.
Particulele absorbante pot avea forme sferice sau neregulate și porozitate variată. Dimensiunea particulelor sorbantului în HPLC analitică este de obicei de 3–10 µm, în HPLC preparativă – până la 50 µm sau mai mult.
Se folosesc și adsorbanți monolitici.
Eficiența ridicată a separării este asigurată de suprafața mare a particulelor absorbante (care este o consecință a microscopiei lor).
mărimea și prezența porilor), precum și uniformitatea compoziției sorbantului și împachetarea sa densă și uniformă.
Detectoare
Sunt utilizate diferite metode de detectare. În cazul general, PF cu componente dizolvate în el după o coloană cromatografică
ki intră în celula detectorului, unde una sau alta dintre proprietățile sale este măsurată în mod continuu (absorbție în regiunea UV sau vizibilă a spectrului, fluorescență,
indicele de refracție, conductivitatea electrică etc.). Cromatograma rezultată este un grafic al dependenței unor elemente fizice
parametrul logic sau fizico-chimic al PF în funcție de timp.
Cele mai frecvente sunt depistarea spectrofotometrică.
tectori (inclusiv diode-matrice) care înregistrează modificările optice
densitate în ultraviolet, vizibil și adesea în infraroșu apropiat
n zone ale spectrului de la 190 la 800 sau 900 nm. Cromatograma în acest caz
ceaiul reprezintă dependența densității optice a PF de timp.
Detectorul spectrofotometric utilizat în mod tradițional permite
permite detectarea la orice lungime de undă din domeniul său de operare
zona. De asemenea, sunt utilizați detectoare cu mai multe unde, permițând
Efectuați detectarea la mai multe lungimi de undă simultan.
Folosind un detector cu matrice de diode, nu numai că puteți detecta mai multe lungimi de undă simultan, ci și aproape instantaneu
Este posibil să se obțină în orice moment spectrul optic al PF direct (fără scanare), ceea ce simplifică foarte mult analiza calitativă a componentelor separate.
componente.
Sensibilitatea detectorilor cu fluorescență este de aproximativ 1000 de ori mai mare decât sensibilitatea celor spectrofotometrice. În acest caz, se utilizează fie propria sa fluorescență, fie fluorescența derivaților corespunzători dacă substanța care este determinată în sine nu are fluorescență. Modern
detectoarele fluorescente variabile permit nu numai obținerea cromato-
grame, dar și pentru a înregistra spectrele de excitație și fluorescență ale analiticului
conexiuni zirovabile.
Pentru a analiza probe care nu absorb în UV și regiunile vizibile ale spectrului (de exemplu, carbohidrați), se folosesc detectoare refractometrice.
(refractometre). Dezavantajele acestor detectoare sunt sensibilitatea lor scăzută (comparativ cu detectoarele spectrofotometrice) și dependența semnificativă de temperatură a intensității semnalului (detectorul trebuie să fie termostat).
Se folosesc și detectoare electrochimice (conductometrice
schi, amperometric etc.), spectrometric de masă și Fourier-IR
detectoare, detectoare de împrăștiere a luminii, detectoare de radioactivitate și altele
Faza mobila
ÎN O varietate de solvenți pot fi utilizați ca PF - atât individuali, cât și amestecuri ale acestora.
ÎN fază normală cromatografia folosește de obicei carbon lichid
clorhidrati (hexan, ciclohexan, heptan) si altele relativ nepolare
solvenți cu mici adaosuri de compuși organici polari,
care reglează rezistența de eluție a PF.
În cromatografia în fază inversă, compoziția PF include polar sau-
solvenți organici (de obicei acetonitril și metanol) și apă. Pentru optic
sistemele de separare folosesc adesea soluții apoase cu un anumit
Modificări ale pH-ului, în special soluții tampon. Se folosesc aditivi anorganici
acizi chimici și organici, baze și săruri și alți compuși (de exemplu,
de exemplu, modificatori chirali pentru separarea enantiomerii în achirali-
nom sorbent).
Valoarea pH-ului trebuie monitorizată separat pentru componenta apoasă, și nu pentru amestecul acesteia cu un solvent organic.
PF poate consta dintr-un singur solvent, adesea doi, dacă este necesar
interval - trei sau mai multe. Compoziția PF este indicată ca raportul de volum al solvenților săi constituenți. În unele cazuri, masa poate fi indicată
raportul bufniței, care ar trebui să fie stipulat în mod special.
Când utilizați un detector spectrofotometric UV, PF nu ar trebui să aibă o absorbție pronunțată la lungimea de undă selectată pentru detectare. Limită de transparență sau densitate optică atunci când este determinată
Lungimea de undă specifică a unui solvent de la un anumit producător este adesea indicată
este pe ambalaj.
Analiza cromatografică este foarte influențată de gradul de puritate al PF, de aceea este de preferat să se utilizeze solvenți produși
special conceput pentru cromatografie lichidă (inclusiv apă).
PF și soluțiile analizate nu trebuie să conțină nedizolvate
de particule și bule de gaz. Apa obtinuta in conditii de laborator
soluții apoase, soluții organice preamestecate cu apă
Mediile, precum si solutiile analizate, trebuie supuse la filtrare si degazare fina. Filtrarea este de obicei folosită în aceste scopuri.
sub vid printr-un filtru cu membrană cu o dimensiune a porilor de 0,45 μm, inert față de un anumit solvent sau soluție.
Sistem de colectare și prelucrare a datelor
Un sistem modern de procesare a datelor este conectat
un computer personal conectat la un cromatograf cu software instalat
software care vă permite să înregistrați și să procesați cro-
matograma, precum și controlul funcționării cromatografului și monitorizarea principalului
parametrii sistemului cromatografic.
Lista condițiilor cromatografice care trebuie specificate
Monografia farmacopeei private trebuie să indice dimensiunile co-
coloane, tipul de sorbant care indică dimensiunea particulelor, temperatura coloanei (dacă este necesară termostatarea), volumul probei injectate (volumul buclei),
devenirea PF și metoda de preparare a acestuia, rata de alimentare cu PF, detectorul și condițiile de detectare, descrierea modului de gradient (dacă este utilizat), timpul de cromatografie.
SCHIMB DE IONI ȘI HPLC DE IONI
Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pentru analiza ambelor substanțe organice
atât (baze heterociclice, aminoacizi, proteine etc.), cât și non-sau-
compuși ganici (diverși cationi și anioni). Separare compozită
Componentele amestecului analizat în cromatografia cu schimb ionic se bazează pe interacțiunea reversibilă a ionilor substanțelor analizate cu grupările ionice.
memoria sorbantului. Schimbătoarele de anioni sau schimbătoarele de cationi sunt utilizate ca absorbanți.
Tu. Acești adsorbanți sunt în principal fie ioni polimerici
rășini schimbătoare (de obicei copolimeri de stiren și divinilbenzen cu
grupări ionice) sau silicagel cu grupări schimbătoare de ioni grefate. Pentru separarea anioniilor se folosesc sorbanti cu grupari -(CH2)3 N+ X–, iar sorbantii cu grupari -(CH2)SO3 – H+ sunt folositi pentru separarea cationilor.
De obicei, rășinile polimerice sunt folosite pentru a separa anionii și pentru a separa
îndepărtarea cationilor – silicageluri modificate.
Soluțiile apoase de acizi, baze și săruri sunt utilizate ca PF în cromatografia cu schimb ionic. De obicei sunt folosite tampoane
soluții care vă permit să mențineți anumite valori ale pH-ului. De asemenea, este posibil să folosiți aditivi organici mici care se amestecă cu apă.
solvenți pentru schi - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.
Cromatografia ionică- o variantă de cromatografie cu schimb ionic, în
în care, pentru a determina concentrația ionilor analitului, folosim
folosește un detector conductometric. Pentru opțiuni extrem de sensibile
Pentru a determina modificări ale conductivității electrice care trece prin detectorul PF, conductivitatea electrică de fundal a PF ar trebui să fie scăzută.
Există două variante principale de cromatografie ionică.
Prima dintre ele se bazează pe suprimarea conductivității electrice a electroliticului
PF folosind o a doua coloană schimbătoare de ioni situată între
coloană litică și detector. Neutralizarea are loc în această coloană
PF și compușii analizați intră în celula detector în deionizare
apa distilata. Ionii detectați sunt singurii ioni
asigurarea conductivității PF. Dezavantajul coloanei de suprimare este necesitatea regenerării acesteia după perioade de timp destul de scurte.
pe mine. Coloana de suprimare poate fi înlocuită continuu
un supresor de membrană comun în care compoziția membranei este continuă
este reînnoită de fluxul de soluție regenerantă care se deplasează în direcția
opus sensului curgerii PF.
A doua versiune a cromatografiei ionice este cromatografia ionică pe o singură coloană.
matografia. în acest exemplu de realizare, este utilizat un PF cu o conductivitate electrică foarte scăzută.
continut de apa. Compușii organici slabi sunt utilizați pe scară largă ca electroliți.
Acizi chinezi - benzoici, salicilici sau izoftalici.
HPLC SECURĂ
Cromatografia de excludere a mărimii (cromatografia pe gel) este o versiune specială a HPLC bazată pe separarea moleculelor după dimensiunea lor. Distributie
moleculele dintre fazele staționare și mobile se bazează pe dimensiunea moleculelor.
molecule și parțial pe forma și polaritatea lor. Pentru separare, folosiți
adsorbanți poroși – polimeri, silicagel, sticle poroase și polizaharide.
Dimensiunea particulelor absorbanților este de 5-10 microni.
Avantajele sticlelor poroase și a gelului de silice sunt difuzia rapidă a PF și a moleculelor substanței analizate în pori, stabilitatea în diferite condiții (chiar și la temperaturi ridicate). Sorben polimeric-
sunteți copolimeri de stiren și divinilbenzen (acesta este hidro-
sorbenti fobi folositi cu fazele mobile nepolare) si
geluri hidrofile obţinute din răşini sulfonate de divinilbenzen sau poliacrilamidă.
Sunt posibile două tipuri limitative de interacțiune a moleculelor cu o fază staționară poroasă. Moleculele a căror dimensiune este mai mare decât diametrul mediu al porilor nu pătrund deloc în sorbent și sunt eluate împreună cu faza mobilă.
zoy mai întâi. Molecule cu un diametru semnificativ mai mic decât dimensiunea porilor sorbantului
benta pătrunde liber în el, rămân în faza staționară pentru cel mai mult timp și sunt ultimii care eluează. Moleculele de dimensiuni medii pătrund în porii sorbantului în funcție de dimensiunea lor și parțial în funcție de forma lor. Eluează cu timpi de retenție diferiți între
moleculele noastre cele mai mari și cele mai mici. Separarea componentelor probei cromatografiate are loc ca urmare a repetării
difuzia componentelor probei în porii sorbantului și invers.
În cromatografia de excludere prin mărime, pentru a caracteriza retenția,
Se utilizează un volum de retenție egal cu produsul dintre debitul PF și timpul de retenție.
Faza mobila. Alegerea PF depinde de tipul de absorbant. Excludere-
Cromatografia este în general împărțită în filtrare pe gel și cromatografia pe gel.
cromatografia de permeabilitate.
Pentru separare se folosește metoda cromatografiei prin filtrare pe gel
cercetarea compuşilor solubili în apă pe adsorbanţi hidrofili. Fazele mobile sunt soluții tampon apoase cu o valoare dată de pH.
În cromatografia de permeabilitate cu gel, se folosesc sorbi hidrofobi.
solvenți organici nepolari (toluen, diclormetan, te-
ragidofuran). Această metodă este utilizată pentru analiza compușilor care sunt slab solubili
jante în apă.
Detectoare. Detectoarele refractometrice diferențiale, precum și detectoarele spectrofotometrice (inclusiv în regiunea spectrală IR) sunt utilizate ca detectoare în cromatografia de excludere a mărimii.
De asemenea, sunt utilizate viscozimetru și detectoare cu laser de flux.
Aceste detectoare, în combinație cu un refractometru sau altă concentrație
detector fac posibilă determinarea continuă a masei moleculare
limer în PF.
CROMATOGRAFIE LICHIDĂ ULTRA PERFORMANȚĂ
Cromatografia lichidă ultraperformanță este o variantă a cromatografia lichidă care este mai eficientă
comparație cu HPLC clasică.
O caracteristică a cromatografiei lichide de ultra-performanță este
Este posibilă utilizarea absorbanților cu dimensiuni ale particulelor de la 1,5 la 2 microni. Dimensiuni crom
coloanele matografice au de obicei de la 50 la 150 mm lungime și de la 1
până la 4 mm în diametru. Volumul probei injectate poate varia de la 1 la 50 µl.
Echipamente cromatografice utilizate în va-
HPLC riant, de obicei special adaptat pentru acest tip de cromatografie.
Echipamentele concepute pentru cromatografie lichidă ultra-performanță pot fi utilizate și în versiunea clasică a HPLC.
(OFS 42-0096-09)
Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este o metodă de cromatografie pe coloană în care faza mobilă (MP) este lichidă.
os care se deplasează printr-o coloană de cromatografie umplută cu inaccesibile
faza vizuală (sorbent). Coloanele HPLC sunt caracterizate de o presiune hidraulică ridicată la intrarea coloanei, de aceea HPLC este uneori numită
numită „cromatografie lichidă de înaltă presiune”.
În funcție de mecanismul de separare a substanțelor, se disting următoarele:
opțiuni HPLC actuale: adsorbție, distribuție, schimb ionic,
exclusivist, chiral etc.
În cromatografia de adsorbție, separarea substanțelor are loc datorită abilităților diferite ale acestora de a fi adsorbite și desorbite cu
suprafața unui adsorbant cu o suprafață dezvoltată, de exemplu, silicagel.
În HPLC de distribuție, separarea are loc datorită diferențelor în coeficienții de distribuție ai substanțelor care sunt separate între staționari.
(de obicei grefat chimic pe suprafața unui purtător staționar) și
fazele mobile.
După polaritate, HPLC PF și NP sunt împărțite în fază normală și ob-
fază extinsă.
Faza normală este o variantă de cromatografie în care
utilizați un sorbent polar (de exemplu, silicagel sau silicagel cu
grupări NH2 sau CN răsucite) și PF nepolar (de exemplu, hexan cu di-
suplimente personale). În versiunea cu fază inversă a cromatografiei,
utilizați adsorbanți nepolari modificați chimic (de exemplu,
radicalul alchil nepolar C18) și fazele mobile polare (de ex.
metanol, acetonitril).
În cromatografia cu schimb de ioni, moleculele de substanțe dintr-un amestec se disociază
în soluție în cationi și anioni sunt separați la trecerea prin
sorbent (schimbător de cationi sau schimbător de anioni) datorită ratelor lor diferite de schimb cu ionii
mi grupuri de sorbant.
În excludere (sită, gel-permeating, gel filtrare)
cromatografia, moleculele de substanțe sunt separate după dimensiune datorită capacității lor diferite de a pătrunde în porii fazei staționare. În același timp, primul dintre co-
Coloanele produc cele mai mari molecule (cu cea mai mare greutate moleculară) capabile să pătrundă în numărul minim de pori ai fazei staționare,
iar ultimele care au apărut sunt substanțele cu dimensiuni moleculare mici.
Adesea, separarea are loc nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan.
Metoda HPLC poate fi utilizată pentru a controla calitatea oricăror non-
analiți zooformi. Pentru efectuarea analizei se folosesc instrumente adecvate - cromatografe lichide.
Compoziția unui cromatograf lichid include de obicei următoarele elemente de bază:
Noduri:
– Unitate de pregătire PF, inclusiv un container cu fază mobilă (sau capacitiv
legături cu solvenți individuali incluși în faza mobilă
3) și sistemul de degazare PF;
– sistem de pompare;
– mixer de fază mobilă (dacă este necesar);
– sistem de introducere a probei (injector);
– coloană cromatografică (poate fi instalată într-un termostat);
– detector;
– sistem de colectare și prelucrare a datelor.
Sistem de pompare
Pompele furnizează PF coloanei la o viteză constantă dată. Compoziția fazei mobile poate fi constantă sau variabilă.
în timpul analizei. În primul caz, procesul se numește izocratic,
iar în al doilea - gradient. Uneori sunt instalate în fața sistemului de pompare
filtre cu diametrul porilor de 0,45 microni pentru filtrarea fazei mobile. Modern
Un sistem de pompe pentru cromatograf lichid este format din una sau mai multe pompe controlate de computer. Acest lucru vă permite să schimbați
devenind PF conform unui anumit program cu gradient de eluare. Sme-
Amestecul de componente PF în mixer poate apărea atât la presiune joasă
presiune (inainte de pompe) si la presiune mare (dupa pompe). Mixerul poate fi utilizat pentru prepararea PF și eluție izocratică,
cu toate acestea, un raport mai precis al componentelor este obținut prin pre-
amestecarea temeinică a componentelor PF pentru un proces izocratic. Pompele pentru HPLC analitică fac posibilă menținerea unui debit constant de PF în coloană în intervalul de la 0,1 la 10 ml/min la o presiune la intrarea în coloană de până la 50 MPa. Este recomandabil, totuși, ca această valoare să nu depășească
trebuie să fie de 20 MPa. Pulsațiile de presiune sunt minimizate de amortizoare speciale
sisteme feroase incluse în proiectarea pompei. Piese de lucru pe-
Pompele sunt fabricate din materiale rezistente la coroziune, ceea ce permite utilizarea componentelor agresive în compoziția PF.
robinete
Prin proiectare, mixerele pot fi statice sau dinamice
microfon.
În mixer, se formează o singură fază mobilă din
solvenți eficienti furnizați de pompe dacă amestecul necesar nu a fost pregătit în prealabil. Amestecarea solvenților are loc de obicei spontan, dar uneori se folosesc sisteme cu amestecare forțată.
cusut.
Injectoare
Injectoarele pot fi universale pentru introducerea probelor din
1 µl până la 2 ml sau discret pentru introducerea unei probe de doar un anumit volum
ema. Ambele tipuri de injectoare pot fi automate ("autoinjectoare" sau "autosamplere"). Este amplasat injectorul pentru introducerea probei (soluție).
direct în fața coloanei de cromatografie. Designul injectorului vă permite să schimbați direcția fluxului PF și să preintroduceți o probă într-o buclă de un anumit volum (de obicei, de la 10 la 100 μl).
Acest volum este indicat pe eticheta buclei. Designul injectorului permite înlocuirea buclei. Pentru a introduce soluția de testare într-un sistem neautomat
Injectorul Tomatic folosește o microseringă manuală cu un volum semnificativ
depășind semnificativ volumul buclei. Exces de soluție injectată, nu
situat în buclă este resetat și un volum exact și întotdeauna egal de probă este injectat în coloană. Umplerea manuală incompletă a buclei reduce precizia
acuratețea și reproductibilitatea dozării și, prin urmare, afectează acuratețea
acuratețea și reproductibilitatea analizei cromatografice.
Coloana cromatografică
Coloanele cromatografice sunt de obicei tuburi din oțel inoxidabil, sticlă sau plastic, umplute cu un sorbant și închise.
căptușite pe ambele părți cu filtre cu diametrul porilor de 2–5 microni. Lungimea analitică
Grosimea coloanei, în funcție de mecanismul de separare cromatografic, poate fi în intervalul de la 5 la 60 cm sau mai mult (de obicei este
10–25 cm), diametrul intern – de la 2 la 10 mm (de obicei 4,6 mm). Coloanele cu un diametru interior mai mic de 2 mm sunt utilizate în crom microcoloană
toografie. Coloane capilare cu un diametru interior de
rom aproximativ 0,3-0,7 mm. Coloanele pentru cromatografie preparativă au un diametru interior de până la 50 mm sau mai mult.
Tuburile scurte pot fi instalate în fața coloanei analitice.
coloane (precoloane) care îndeplinesc diverse funcţii auxiliare
(mai des – protecția coloanei analitice). De obicei analiza se face cu
la temperatura normală, totuși, pentru a crește eficiența separării și a con-
Pentru a scurta durata analizei, pot fi folosite termostate.
testarea coloanelor la temperaturi nu mai mari de 60 C. La temperaturi mai ridicate, sunt posibile distrugerea sorbantului și modificări ale compoziției PF.
Faza staționară (sorbant)
Următoarele sunt de obicei utilizate ca absorbanți:
1. În mod normal se folosesc silicagel, oxid de aluminiu, grafit poros
cromatografia în fază mică. Mecanismul de reținere în acest caz este
ceai - de obicei adsorbție;
2. Rășini sau polimeri cu grupări acide sau bazice. Domeniul de aplicare: cromatografia cu schimb ionic;
3. Silicagel poros sau polimeri (cromatografie cu excludere dimensională);
4. Sorbitori modificați chimic (sorbanți cu faze altoite)
zami), preparată cel mai adesea pe bază de silicagel. Mecanismul de reținere este în majoritatea cazurilor distribuția între elementele mobile
faze noi și staționare;
5. Sorbanți chirali modificați chimic, de exemplu cei produși
celuloze și amiloze apoase, proteine și peptide, ciclodextrine,
utilizat pentru separarea enantiomerilor (cromatografie chirală
Sorbenții cu faze altoite pot avea diferite grade de substanță chimică
modificare ică. Particulele absorbante pot fi sferice sau nesferice
forma corecta si porozitate variata.
Cele mai frecvent utilizate faze de altoit sunt:
– grupări octil(octilsilan sau sorbent C8);
– grupări octadecil(sorbent octadecilsilan
(ODS) sau C18);
– grupări fenil(sorbent de fenilsilan);
– grupări cianopropil(sorbent CN);
– grupări aminopropil(sorbent de NH2);
– grupări diol (diol absorbant).
Cel mai adesea, analiza se efectuează pe faze grefate nepolare în
modul de fază inversă folosind sorbent C18.
În unele cazuri, este mai potrivit să folosiți normal
cromatografia de fază. În acest caz, gelul de silice sau fazele grefate polare („CN”, „NH2”, „diol”) sunt utilizate în combinație cu soluții nepolare.
Sorbenții cu faze altoite sunt stabili din punct de vedere chimic la valori ale pH-ului de la 2,0 la 8,0, dacă nu se specifică altfel de către producător.
Particulele absorbante pot avea forme sferice sau neregulate și porozitate variată. Dimensiunea particulelor sorbantului în HPLC analitică este de obicei de 3–10 µm, în HPLC preparativă – până la 50 µm sau mai mult.
Se folosesc și adsorbanți monolitici.
Eficiența ridicată a separării este asigurată de suprafața mare a particulelor absorbante (care este o consecință a microscopiei lor).
mărimea și prezența porilor), precum și uniformitatea compoziției sorbantului și împachetarea sa densă și uniformă.
Detectoare
Sunt utilizate diferite metode de detectare. În cazul general, PF cu componente dizolvate în el după o coloană cromatografică
ki intră în celula detectorului, unde una sau alta dintre proprietățile sale este măsurată în mod continuu (absorbție în regiunea UV sau vizibilă a spectrului, fluorescență,
indicele de refracție, conductivitatea electrică etc.). Cromatograma rezultată este un grafic al dependenței unor elemente fizice
parametrul logic sau fizico-chimic al PF în funcție de timp.
Cele mai frecvente sunt depistarea spectrofotometrică.
tectori (inclusiv diode-matrice) care înregistrează modificările optice
densitate în ultraviolet, vizibil și adesea în infraroșu apropiat
n zone ale spectrului de la 190 la 800 sau 900 nm. Cromatograma în acest caz
ceaiul reprezintă dependența densității optice a PF de timp.
Detectorul spectrofotometric utilizat în mod tradițional permite
permite detectarea la orice lungime de undă din domeniul său de operare
zona. De asemenea, sunt utilizați detectoare cu mai multe unde, permițând
Efectuați detectarea la mai multe lungimi de undă simultan.
Folosind un detector cu matrice de diode, nu numai că puteți detecta mai multe lungimi de undă simultan, ci și aproape instantaneu
Este posibil să se obțină în orice moment spectrul optic al PF direct (fără scanare), ceea ce simplifică foarte mult analiza calitativă a componentelor separate.
componente.
Sensibilitatea detectorilor cu fluorescență este de aproximativ 1000 de ori mai mare decât sensibilitatea celor spectrofotometrice. În acest caz, se utilizează fie propria sa fluorescență, fie fluorescența derivaților corespunzători dacă substanța care este determinată în sine nu are fluorescență. Modern
detectoarele fluorescente variabile permit nu numai obținerea cromato-
grame, dar și pentru a înregistra spectrele de excitație și fluorescență ale analiticului
conexiuni zirovabile.
Pentru a analiza probe care nu absorb în UV și regiunile vizibile ale spectrului (de exemplu, carbohidrați), se folosesc detectoare refractometrice.
(refractometre). Dezavantajele acestor detectoare sunt sensibilitatea lor scăzută (comparativ cu detectoarele spectrofotometrice) și dependența semnificativă de temperatură a intensității semnalului (detectorul trebuie să fie termostat).
Se folosesc și detectoare electrochimice (conductometrice
schi, amperometric etc.), spectrometric de masă și Fourier-IR
detectoare, detectoare de împrăștiere a luminii, detectoare de radioactivitate și altele
Faza mobila
ÎN O varietate de solvenți pot fi utilizați ca PF - atât individuali, cât și amestecuri ale acestora.
ÎN fază normală cromatografia folosește de obicei carbon lichid
clorhidrati (hexan, ciclohexan, heptan) si altele relativ nepolare
solvenți cu mici adaosuri de compuși organici polari,
care reglează rezistența de eluție a PF.
În cromatografia în fază inversă, compoziția PF include polar sau-
solvenți organici (de obicei acetonitril și metanol) și apă. Pentru optic
sistemele de separare folosesc adesea soluții apoase cu un anumit
Modificări ale pH-ului, în special soluții tampon. Se folosesc aditivi anorganici
acizi chimici și organici, baze și săruri și alți compuși (de exemplu,
de exemplu, modificatori chirali pentru separarea enantiomerii în achirali-
nom sorbent).
Valoarea pH-ului trebuie monitorizată separat pentru componenta apoasă, și nu pentru amestecul acesteia cu un solvent organic.
PF poate consta dintr-un singur solvent, adesea doi, dacă este necesar
interval - trei sau mai multe. Compoziția PF este indicată ca raportul de volum al solvenților săi constituenți. În unele cazuri, masa poate fi indicată
raportul bufniței, care ar trebui să fie stipulat în mod special.
Când utilizați un detector spectrofotometric UV, PF nu ar trebui să aibă o absorbție pronunțată la lungimea de undă selectată pentru detectare. Limită de transparență sau densitate optică atunci când este determinată
Lungimea de undă specifică a unui solvent de la un anumit producător este adesea indicată
este pe ambalaj.
Analiza cromatografică este foarte influențată de gradul de puritate al PF, de aceea este de preferat să se utilizeze solvenți produși
special conceput pentru cromatografie lichidă (inclusiv apă).
PF și soluțiile analizate nu trebuie să conțină nedizolvate
de particule și bule de gaz. Apa obtinuta in conditii de laborator
soluții apoase, soluții organice preamestecate cu apă
Mediile, precum si solutiile analizate, trebuie supuse la filtrare si degazare fina. Filtrarea este de obicei folosită în aceste scopuri.
sub vid printr-un filtru cu membrană cu o dimensiune a porilor de 0,45 μm, inert față de un anumit solvent sau soluție.
Sistem de colectare și prelucrare a datelor
Un sistem modern de procesare a datelor este conectat
un computer personal conectat la un cromatograf cu software instalat
software care vă permite să înregistrați și să procesați cro-
matograma, precum și controlul funcționării cromatografului și monitorizarea principalului
parametrii sistemului cromatografic.
Lista condițiilor cromatografice care trebuie specificate
Monografia farmacopeei private trebuie să indice dimensiunile co-
coloane, tipul de sorbant care indică dimensiunea particulelor, temperatura coloanei (dacă este necesară termostatarea), volumul probei injectate (volumul buclei),
devenirea PF și metoda de preparare a acestuia, rata de alimentare cu PF, detectorul și condițiile de detectare, descrierea modului de gradient (dacă este utilizat), timpul de cromatografie.
SCHIMB DE IONI ȘI HPLC DE IONI
Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pentru analiza ambelor substanțe organice
atât (baze heterociclice, aminoacizi, proteine etc.), cât și non-sau-
compuși ganici (diverși cationi și anioni). Separare compozită
Componentele amestecului analizat în cromatografia cu schimb ionic se bazează pe interacțiunea reversibilă a ionilor substanțelor analizate cu grupările ionice.
memoria sorbantului. Schimbătoarele de anioni sau schimbătoarele de cationi sunt utilizate ca absorbanți.
Tu. Acești adsorbanți sunt în principal fie ioni polimerici
rășini schimbătoare (de obicei copolimeri de stiren și divinilbenzen cu
grupări ionice) sau silicagel cu grupări schimbătoare de ioni grefate. Pentru separarea anioniilor se folosesc sorbanti cu grupari -(CH2)3 N+ X–, iar sorbantii cu grupari -(CH2)SO3 – H+ sunt folositi pentru separarea cationilor.
De obicei, rășinile polimerice sunt folosite pentru a separa anionii și pentru a separa
îndepărtarea cationilor – silicageluri modificate.
Soluțiile apoase de acizi, baze și săruri sunt utilizate ca PF în cromatografia cu schimb ionic. De obicei sunt folosite tampoane
soluții care vă permit să mențineți anumite valori ale pH-ului. De asemenea, este posibil să folosiți aditivi organici mici care se amestecă cu apă.
solvenți pentru schi - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.
Cromatografia ionică- o variantă de cromatografie cu schimb ionic, în
în care, pentru a determina concentrația ionilor analitului, folosim
folosește un detector conductometric. Pentru opțiuni extrem de sensibile
Pentru a determina modificări ale conductivității electrice care trece prin detectorul PF, conductivitatea electrică de fundal a PF ar trebui să fie scăzută.
Există două variante principale de cromatografie ionică.
Prima dintre ele se bazează pe suprimarea conductivității electrice a electroliticului
PF folosind o a doua coloană schimbătoare de ioni situată între
coloană litică și detector. Neutralizarea are loc în această coloană
PF și compușii analizați intră în celula detector în deionizare
apa distilata. Ionii detectați sunt singurii ioni
asigurarea conductivității PF. Dezavantajul coloanei de suprimare este necesitatea regenerării acesteia după perioade de timp destul de scurte.
pe mine. Coloana de suprimare poate fi înlocuită continuu
un supresor de membrană comun în care compoziția membranei este continuă
este reînnoită de fluxul de soluție regenerantă care se deplasează în direcția
opus sensului curgerii PF.
A doua versiune a cromatografiei ionice este cromatografia ionică pe o singură coloană.
matografia. în acest exemplu de realizare, este utilizat un PF cu o conductivitate electrică foarte scăzută.
continut de apa. Compușii organici slabi sunt utilizați pe scară largă ca electroliți.
Acizi chinezi - benzoici, salicilici sau izoftalici.
HPLC SECURĂ
Cromatografia de excludere a mărimii (cromatografia pe gel) este o versiune specială a HPLC bazată pe separarea moleculelor după dimensiunea lor. Distributie
moleculele dintre fazele staționare și mobile se bazează pe dimensiunea moleculelor.
molecule și parțial pe forma și polaritatea lor. Pentru separare, folosiți
adsorbanți poroși – polimeri, silicagel, sticle poroase și polizaharide.
Dimensiunea particulelor absorbanților este de 5-10 microni.
Avantajele sticlelor poroase și a gelului de silice sunt difuzia rapidă a PF și a moleculelor substanței analizate în pori, stabilitatea în diferite condiții (chiar și la temperaturi ridicate). Sorben polimeric-
sunteți copolimeri de stiren și divinilbenzen (acesta este hidro-
sorbenti fobi folositi cu fazele mobile nepolare) si
geluri hidrofile obţinute din răşini sulfonate de divinilbenzen sau poliacrilamidă.
Sunt posibile două tipuri limitative de interacțiune a moleculelor cu o fază staționară poroasă. Moleculele a căror dimensiune este mai mare decât diametrul mediu al porilor nu pătrund deloc în sorbent și sunt eluate împreună cu faza mobilă.
zoy mai întâi. Molecule cu un diametru semnificativ mai mic decât dimensiunea porilor sorbantului
benta pătrunde liber în el, rămân în faza staționară pentru cel mai mult timp și sunt ultimii care eluează. Moleculele de dimensiuni medii pătrund în porii sorbantului în funcție de dimensiunea lor și parțial în funcție de forma lor. Eluează cu timpi de retenție diferiți între
moleculele noastre cele mai mari și cele mai mici. Separarea componentelor probei cromatografiate are loc ca urmare a repetării
difuzia componentelor probei în porii sorbantului și invers.
În cromatografia de excludere prin mărime, pentru a caracteriza retenția,
Se utilizează un volum de retenție egal cu produsul dintre debitul PF și timpul de retenție.
Faza mobila. Alegerea PF depinde de tipul de absorbant. Excludere-
Cromatografia este în general împărțită în filtrare pe gel și cromatografia pe gel.
cromatografia de permeabilitate.
Pentru separare se folosește metoda cromatografiei prin filtrare pe gel
cercetarea compuşilor solubili în apă pe adsorbanţi hidrofili. Fazele mobile sunt soluții tampon apoase cu o valoare dată de pH.
În cromatografia de permeabilitate cu gel, se folosesc sorbi hidrofobi.
solvenți organici nepolari (toluen, diclormetan, te-
ragidofuran). Această metodă este utilizată pentru analiza compușilor care sunt slab solubili
jante în apă.
Detectoare. Detectoarele refractometrice diferențiale, precum și detectoarele spectrofotometrice (inclusiv în regiunea spectrală IR) sunt utilizate ca detectoare în cromatografia de excludere a mărimii.
De asemenea, sunt utilizate viscozimetru și detectoare cu laser de flux.
Aceste detectoare, în combinație cu un refractometru sau altă concentrație
detector fac posibilă determinarea continuă a masei moleculare
limer în PF.
CROMATOGRAFIE LICHIDĂ ULTRA PERFORMANȚĂ
Cromatografia lichidă ultraperformanță este o variantă a cromatografia lichidă care este mai eficientă
comparație cu HPLC clasică.
O caracteristică a cromatografiei lichide de ultra-performanță este
Este posibilă utilizarea absorbanților cu dimensiuni ale particulelor de la 1,5 la 2 microni. Dimensiuni crom
coloanele matografice au de obicei de la 50 la 150 mm lungime și de la 1
până la 4 mm în diametru. Volumul probei injectate poate varia de la 1 la 50 µl.
Echipamente cromatografice utilizate în va-
HPLC riant, de obicei special adaptat pentru acest tip de cromatografie.
Echipamentele concepute pentru cromatografie lichidă ultra-performanță pot fi utilizate și în versiunea clasică a HPLC.
(în principal intermoleculară) la limita de fază. Ca metodă de analiză, HPLC face parte dintr-un grup de metode care, datorită complexității obiectelor studiate, include separarea preliminară a amestecului complex original în unele relativ simple. Amestecuri simple rezultate sunt apoi analizate folosind metode fizico-chimice convenționale sau metode speciale dezvoltate pentru cromatografie.
Metoda HPLC este utilizată pe scară largă în domenii precum chimie, petrochimie, biologie, biotehnologie, medicină, industria alimentară, protecția mediului, producția farmaceutică și multe altele.
Conform mecanismului de separare a substanțelor analizate sau separate, HPLC se împarte în adsorbție, distribuție, schimb ionic, excludere, schimb ligand și altele.
Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea prin excludere poate fi complicată de efectele de adsorbție, separarea prin adsorbție prin efectele de distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele dintr-o probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare, bazicitate sau aciditate, greutate moleculară, polarizabilitate și alți parametri, cu atât este mai mare probabilitatea unui mecanism de separare diferit pentru astfel de substanțe.
HPLC în fază normală
Faza staționară este mai polară decât faza mobilă, prin urmare solventul nepolar predomină în eluant:
- Hexan: izopropanol = 95:5 (pentru substanțe cu polaritate scăzută)
- Cloroform:metanol = 95:5 (pentru substanțe cu polar mediu)
- Cloroform:metanol = 80:20 (pentru substanțe foarte polare)
HPLC cu fază inversă
Faza staționară este mai puțin polară decât faza mobilă, astfel încât eluentul conține aproape întotdeauna apă. În acest caz, este întotdeauna posibil să se asigure dizolvarea completă a BAS în faza mobilă, este aproape întotdeauna posibil să se utilizeze detecția UV, aproape toate fazele mobile sunt miscibile între ele, se poate folosi eluția cu gradient, coloana poate fi restabilită rapid. -echilibrata, coloana poate fi regenerata.
Eluanții comuni pentru HPLC cu fază inversă sunt:
- Acetonitril: apă
- Metanol: apă
- Izopropanol: apă
Matrici pentru HPLC
HPLC folosește compuși anorganici ca matrici, cum ar fi oxidul de siliciu (silicagel) sau alumina, sau polimeri organici, cum ar fi polistirenul (reticulat cu divinilbenzen) sau polimetacrilatul. Silicagelul este, desigur, acum general acceptat.
Principalele caracteristici ale matricei:
- Dimensiunea particulelor (µm);
- Dimensiunea porilor interni (Å, nm).
Prepararea gelului de silice pentru HPLC:
- Turnarea microsferelor de acid polisilicic;
- Uscarea particulelor de silicagel;
- Separarea aerului.
Particule absorbante:
- Regular (sferic): rezistență mai mare la presiune, cost mai mare;
- Nesferic: rezistență la presiune mai mică.
Dimensiunea porilor în HPLC este unul dintre cei mai importanți parametri. Cu cât dimensiunea porilor este mai mică, cu atât permeabilitatea lor pentru moleculele de substanțe eluate este mai slabă. Și, prin urmare, cu atât capacitatea de sorbție a absorbanților este mai slabă. Cu cât porii sunt mai mari, cu atât este mai mică, în primul rând, stabilitatea mecanică a particulelor de sorbant și, în al doilea rând, cu cât suprafața de sorbție este mai mică, prin urmare, cu atât eficiența este mai slabă.
Vaccinări în fază staționară
HPLC în fază normală:
- Faza staționară cu altoire de propilnitril (nitril);
- Faza staționară cu grefare de propilamină (amină).
HPLC cu fază inversă:
- Faza staționară cu grefare cu alchil;
- Faza staționară cu grefare de alchilsilil.
End-capping este protecția zonelor negrefate ale sorbentului prin grefare suplimentară cu molecule „mici”. Capacul hidrofob (C1, C2): selectivitate mai mare, umectabilitate mai slabă; capsare hidrofilă (diol): selectivitate mai mică, umectabilitate mai mare.
Detectoare pentru HPLC
- UV
- Matricea diodelor
- Fluorescent
- Electrochimic
- Refractometric
- Selectiv în masă
Legături
Fundația Wikimedia. 2010.
Vedeți ce este „Cromatografie lichidă de înaltă performanță” în alte dicționare:
cromatografie lichidă de înaltă performanță- - [A.S. Goldberg. Dicționar energetic englez-rus. 2006] Subiecte: energie în general EN cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC... Ghidul tehnic al traducătorului
Termenul cromatografie lichidă de înaltă performanță Termenul în engleză cromatografie lichidă de înaltă performanță Sinonime Abrevieri HPLC, HPLC Termeni înrudiți adsorbție, oligopeptidă, proteomică, sorbent, fullerene, endoedral, cromatografie... ...
Cromatografia lichidă, în care, pentru a crește eficiența separării, solventul (eluentul) sub presiune (mai mult de 3x107 Pa) este pompat prin coloane umplute cu sorbant cu particule de diametru mic (până la 1 μm), iar filtrele de perfuzie sunt de asemenea folosit... ...
Un tip de cromatografie în care lichidul (eluentul) servește ca fază mobilă, iar cea staționară. sorbent, TV un purtător cu un lichid sau gel aplicat pe suprafața sa. Se efectuează într-o coloană umplută cu sorbant (cromatografie pe coloană) pe un plan... ... Științele naturii. Dicţionar enciclopedic
- [κρώμα (υrum) culoare] un proces bazat pe capacitatea inegală a componentelor individuale ale amestecului (lichid sau gazos) de a rămâne pe suprafața adsorbantului atât la absorbția lor din fluxul purtătorului, cât și atunci când ... ... Enciclopedie geologică
- (din altă greacă ... Wikipedia
Termenul cromatografie Termenul în engleză cromatografie Sinonime Abrevieri Termeni înrudiți cromatografie lichidă de înaltă performanță, clatrat, laborator pe cip, porometrie, proteom, proteomică, sorbent, enzimă, fuleren, endoedric... ... Dicţionar Enciclopedic de Nanotehnologie
Cromatografia lichidă pe bază de decomp. capacitatea ionilor separați de a face schimb de ioni cu fix. ionii de absorbție formați ca urmare a disocierii grupărilor ionogene ale acestuia din urmă. Schimbătoarele de cationi sunt folosite pentru a separa cationii, pentru... ... Enciclopedie chimică
HPLC- cromatografie lichidă de înaltă performanță… Dicționar de abrevieri rusești
Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este una dintre metodele eficiente de separare a amestecurilor complexe de substanțe, utilizată pe scară largă atât în chimia analitică, cât și în tehnologia chimică. Baza separării cromatografice este participarea... Wikipedia
Cărți
- Cromatografie lichidă practică de înaltă performanță, Veronica R. Mayer. Prezentăm cititorului ediția a V-a a cărții, care a fost extinsă cu metode și echipamente moderne. Multe au fost îmbunătățite în carte și au fost adăugate un număr mare de referințe. Acele locuri din text în care...
„Cromatografie lichidă de înaltă performanță a poluanților din apele naturale și uzate”
Introducere
Capitolul 1. Concepte de bază și clasificare a metodelor de cromatografie lichidă
1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă
Capitolul 2. Esența HPLC
2.1 Aplicare
Capitolul 3. Exemple de utilizare a HPLC în analiza obiectelor din mediu
Capitolul 4. Echipamente HPLC
Literatură
Aplicație
Introducere
Metode cromatografice adesea se dovedesc indispensabile pentru identificarea și cuantificarea substanțelor organice cu structuri similare. Cu toate acestea, cromatografia de gaze și cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru analiza de rutină a poluanților de mediu. Analiza cromatografică gazoasă a poluanților organici din apele potabile și uzate s-a bazat inițial pe utilizarea coloanelor împachetate, iar ulterior coloanele capilare de cuarț au devenit larg răspândite. Diametrul intern al coloanelor capilare este de obicei de 0,20-0,75 mm, lungime - 30-105 m. Rezultatele optime la analiza poluanților din apă sunt cel mai adesea obținute la utilizarea coloanelor capilare cu grosimi diferite de film de siliconi metilfenil cu un conținut de grupe fenil de 5 si 50%. Punctul slab al tehnicilor cromatografice care folosesc coloane capilare este adesea sistemul de introducere a probei. Sistemele de introducere a probelor pot fi împărțite în două grupe: universale și selective. Cele universale includ sisteme de injecție split și splitless, injecție „rece” în coloană și evaporare cu programare de temperatură. Când este utilizată intrare selectivă, purjare cu captură intermediară într-o capcană, analiza spațiului de cap etc. Când se utilizează sisteme de injecție universale, întreaga probă intră în coloană; în cazul injecției selective, se introduce doar o anumită fracțiune. Rezultatele obținute cu injecția selectivă sunt semnificativ mai precise, deoarece fracția care intră în coloană conține doar substanțe volatile, iar tehnica poate fi complet automatizată.
Detectoarele gaz-cromatografice utilizate în monitorizarea poluanților sunt adesea împărțite în universale, care răspund la fiecare componentă în faza mobilă, și selective, care răspund la prezența în faza mobilă a unui anumit grup de substanțe cu caracteristici chimice similare. Detectoarele universale includ ionizare cu flacără, emisie atomică, detectoare cu spectrometrie de masă și spectrometrie în infraroșu. Detectoarele selective utilizate în analiza apei sunt captarea de electroni (selectivă pentru substanțele care conțin atomi de halogen), termoionică (selectivă pentru compușii care conțin azot și fosfor), fotoionizarea (selectivă pentru hidrocarburi aromatice), detectorul de conductivitate electrolitică (selectiv pentru compușii care conțin atomi de halogeni). , sulf și azot). Cantitățile minime detectabile de substanțe variază de la nanograme la picograme pe secundă.
Cromatografie lichidă de înaltă performanță(HPLC) este o metodă ideală pentru determinarea unui număr mare de compuși labili din punct de vedere termic care nu pot fi analizați prin cromatografie gazoasă. Produsele agrochimice moderne, care includ carbonați de metil și insecticide organofosforice și alte substanțe nevolatile, sunt adesea obiectul analizei prin cromatografia lichidă. Cromatografia lichidă de înaltă performanță devine din ce în ce mai răspândită printre alte metode utilizate în monitorizarea mediului, și pentru că are perspective strălucitoare în ceea ce privește automatizarea pregătirii probelor.
CAPITOLUL 1. CONCEPTE DE BAZĂ ȘI CLASIFICAREA METODELOR DE CROMATOGRAFIE LICHIDĂ
Cromatografia lichidă este împărțită în mai multe clase în funcție de tipul de purtător de fază staționară. Simpla instrumentare a cromatografiei pe hârtie și în strat subțire a condus la utilizarea pe scară largă a acestor metode în practica analitică. Cu toate acestea, marile capacități ale cromatografiei lichide pe coloană au stimulat îmbunătățirea echipamentelor pentru această metodă clasică și au condus la introducerea rapidă a HPLC. Trecerea eluentului prin coloană sub presiune înaltă a făcut posibilă creșterea dramatică a vitezei de analiză și creșterea semnificativă a eficienței separării datorită utilizării sorbantului fin dispersat. Metoda HPLC permite în prezent izolarea, analiza cantitativă și calitativă a amestecurilor complexe de compuși organici.
Pe baza mecanismului de interacțiune a substanței care este separată (eluat) cu faza staționară, se disting cromatografia de adsorbție, partiție, schimb ionic, excludere, pereche de ioni, schimb de liganzi și cromatografia de afinitate.
Cromatografia de adsorbție. Separarea prin cromatografie de adsorbție se realizează ca urmare a interacțiunii substanței care este separată cu un adsorbant, cum ar fi oxid de aluminiu sau silicagel, care are centri polari activi la suprafață. Solventul (eluentul) este un lichid nepolar. Mecanismul de sorbție constă într-o interacțiune specifică între suprafața polară a sorbantului și secțiunile polare (sau capabile de polarizare) ale moleculelor componentei analizate (Fig. 1).
Orez. 1. Cromatografia lichidă de adsorbție.
Cromatografia de partiție. În varianta de distribuție a cromatografiei lichide, separarea unui amestec de substanțe se realizează datorită diferenței dintre coeficienții lor de distribuție între două faze nemiscibile - eluantul (fază mobilă) și faza situată pe sorbent (faza staționară).
La faza normala Cromatografia lichidă de partiție utilizează un eluent nepolar și grupări polare grefate pe suprafața sorbantului (cel mai adesea silicagel). Alchilclorosilanii substituiți care conțin grupări polare cum ar fi nitril, grupare amino etc. sunt utilizați ca modificatori de suprafață de silicagel (faze grefate) (Fig. 2). Utilizarea fazelor altoite face posibilă controlul fin al proprietăților de sorbție ale suprafeței fazei staționare și obținerea unei eficiențe ridicate de separare.
Orez. 2. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune de fază normală).
Faza inversata cromatografia lichidă se bazează pe distribuția componentelor amestecului între un eluent polar și grupări nepolare (lanțuri lungi de alchil) grefate pe suprafața sorbantului (Fig. 3).
Orez. 3. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune cu fază inversă).
O variantă mai puțin utilizată a cromatografiei lichide în fază suportată este cea în care o fază staționară lichidă este depusă pe un suport staționar.
Exclusiv (pentru gel) cromatografia este o variantă a cromatografiei lichide în care separarea substanțelor are loc datorită distribuției moleculelor între solventul situat în porii sorbentului și solventul care curge între particulele acestuia.
Afină cromatografia se bazează pe interacțiuni specifice ale proteinelor separate (anticorpi) cu substanțe (antigene) grefate pe suprafața sorbantului (rășină sintetică), care formează selectiv complexe (conjugate) cu proteine.
Schimbul de ioni, perechea de ioni și cromatografia de schimb de liganzi sunt utilizate în principal în analiza anorganică.
Parametrii de bază ai separării cromatografice.
Principalii parametri ai separării cromatografice sunt volumul de retenție și timpul de retenție al componentei amestecului (Fig. 4).
Timpul de retenție tR este timpul scurs din momentul introducerii probei în coloană până la eliberarea maximului vârfului corespunzător. Înmulțind timpul de retenție cu viteza volumetrică a eluentului F, obținem volumul de retenție VR:
Timpul de retenție corectat este timpul scurs de la apariția vârfului maxim al componentei nesorbite până la vârful compusului corespunzător:
tR" = tR - t0 ;
Volumul de retenție normalizat sau corectat este volumul de retenție corectat pentru volumul mort al coloanei V0, adică volumul de retenție al componentei nesorbite:
VR" = VR - V0;
O caracteristică a retenției este și coeficientul de capacitate k", definit ca raportul dintre masa unei substanțe în faza staționară și masa unei substanțe în faza mobilă: k" = mn / mp;
Valoarea k" poate fi determinată cu ușurință din cromatogramă:
Cei mai importanți parametri ai separării cromatografice sunt eficiența și selectivitatea acesteia.
Eficiența coloanei, măsurată prin înălțimea plăcilor teoretice (HETP) și invers proporțională cu numărul acestora (N), este mai mare, cu cât vârful substanței eliberate în același timp de retenție este mai îngust. Valoarea eficienței poate fi calculată din cromatogramă folosind următoarea formulă:
N = 5,54. (tR / 1/2) 2 ,
Unde tR- timp de retenție,
w 1/2 - lățimea vârfului la jumătatea înălțimii
Cunoscând numărul de plăci teoretice pe coloană, lungimea coloanei L și diametrul mediu al granulelor de absorbant dc, este ușor de obținut valorile înălțimii echivalente cu placa teoretică (HETT) și înălțimea redusă (RHETT):
HETT = L/N PVET = HETT/d c
Aceste caracteristici fac posibilă compararea eficienței diferitelor tipuri de coloane, evaluarea calității sorbantului și a calității umplerii coloanelor.
Selectivitatea pentru separarea a două substanțe este determinată de ecuația:
Când luăm în considerare separarea unui amestec de două componente, gradul de separare RS este, de asemenea, un parametru important:
;
Vârfurile sunt considerate rezolvate dacă valoarea RS este mai mare sau egală cu 1,5.
Principalii parametri cromatografici sunt legați de următoarea ecuație pentru rezoluție:
;
Factorii care determină selectivitatea separării sunt:
1) natura chimică a sorbantului;
2) compoziția solventului și a modificatorilor săi;
3) structura chimică și proprietățile componentelor amestecului care se separă;
4) temperatura coloanei
1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă
În cromatografia lichidă modernă, sunt utilizate instrumente de diferite grade de complexitate - de la cele mai simple sisteme până la cromatografe de înaltă clasă echipate cu diferite dispozitive suplimentare.
În fig. 4. Se prezintă o schemă bloc a unui cromatograf lichid, care conține setul minim necesar de componente, într-o formă sau alta, prezente în orice sistem cromatografic.
Orez. 4. Schema bloc a unui cromatograf lichid.
Pompa (2) este proiectată pentru a crea un debit constant de solvent. Designul său este determinat în primul rând de presiunea de funcționare din sistem. Pentru a funcționa în intervalul 10-500 MPa, se folosesc pompe de tip piston (seringă) sau cu piston. Dezavantajul primului este necesitatea opririlor periodice pentru umplerea cu eluent, iar al doilea este complexitatea mai mare a designului și, în consecință, prețul ridicat. Pentru sistemele simple cu presiuni de funcționare scăzute de 1-5 MPa, se folosesc cu succes pompe peristaltice ieftine, dar deoarece este dificil să se obțină o presiune și un debit constant, utilizarea lor este limitată la sarcini pregătitoare.
Injectorul (3) asigură introducerea în coloană a unei probe dintr-un amestec de componente care se separă cu o reproductibilitate destul de ridicată. Sistemele simple de injectare a probei „stop-flow” necesită oprirea pompei și, prin urmare, sunt mai puțin convenabile decât pipetele cu buclă dezvoltate de Reodyne.
Coloanele HPLC (4) sunt tuburi din oțel inoxidabil cu pereți groși care pot rezista la presiuni mari. Densitatea și uniformitatea ambalării coloanei cu sorbant joacă un rol important. Coloanele de sticlă cu pereți groși sunt utilizate cu succes pentru cromatografia lichidă la presiune joasă. Temperatura constantă este asigurată de un termostat (5).
Detectoarele (6) pentru cromatografie lichidă au o celulă de curgere în care are loc o măsurare continuă a unei proprietăți a eluentului care curge. Cele mai populare tipuri de detectoare de uz general sunt refractometrele, care măsoară indicele de refracție și detectoarele spectrofotometrice, care măsoară absorbanța unui solvent la o lungime de undă fixă (de obicei în regiunea ultravioletă). Avantajele refractometrelor (și dezavantajele spectrofotometrelor) includ sensibilitatea scăzută la tipul de compus determinat, care poate să nu conțină grupări cromofore. Pe de altă parte, utilizarea refractometrelor este limitată la sisteme izocratice (cu o compoziție de eluent constantă), astfel încât utilizarea unui gradient de solvent în acest caz este imposibilă.
Coloanele HPLC, care sunt cele mai des utilizate în analiza poluanților de mediu, au 25 cm lungime și un diametru interior de 4,6 mm și sunt împachetate cu particule sferice de silicagel de 5-10 µm grefate cu grupări octadecil. În ultimii ani, au devenit disponibile coloane cu diametre interne mai mici umplute cu particule mai mici. Utilizarea unor astfel de coloane duce la o reducere a consumului de solvenți și a timpului de analiză, o creștere a sensibilității și a eficienței separării și, de asemenea, simplifică problema conectării coloanelor la detectoarele spectrale. Coloanele cu diametrul interior de 3,1 mm sunt echipate cu un cartus de siguranta (precoloana) pentru a creste durata de viata si a imbunatati reproductibilitatea analitica.
Detectoarele utilizate în instrumentele HPLC moderne sunt de obicei un detector cu matrice de diode UV, un detector fluorescent și un detector electrochimic.
Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea prin excludere poate fi complicată de efectele de adsorbție, separarea prin adsorbție prin efectele de distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele din probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare, bazicitate sau aciditate, greutate moleculară, polarizabilitate și alți parametri, cu atât este mai mare probabilitatea unui mecanism de separare diferit pentru astfel de substanțe.
În practică, cea mai răspândită este cromatografia în „fază inversă” (distribuție), în care faza staționară nu este polară, dar faza mobilă este polară (adică inversul cromatografia în „fază directă”).
În majoritatea laboratoarelor din întreaga lume, un grup de 16 HAP prioritare sunt analizate prin HPLC sau CMS.
CAPITOLUL 2. ESENȚA HPLC
În cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), natura proceselor care au loc în coloana cromatografică este în general identică cu procesele din cromatografia în gaz. Singura diferență este în utilizarea lichidului ca fază staționară. Datorită densității mari a fazelor mobile lichide și rezistenței mari a coloanelor, cromatografia de gaz și lichid diferă foarte mult în instrumentație.
În HPLC, solvenții puri sau amestecurile acestora sunt de obicei utilizați ca faze mobile.
Pentru a crea un flux de solvent pur (sau amestecuri de solvenți), numit eluent în cromatografia lichidă, se folosesc pompe incluse în sistemul hidraulic al cromatografului.
Cromatografia de adsorbție este efectuată ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.
Cele mai utilizate în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu și alți adsorbanți sunt folosiți mult mai rar. Motivul principal pentru aceasta:
Rezistenta mecanica insuficienta, care nu permite ambalarea si utilizarea la presiuni mari caracteristice HPLC;
silicagel, în comparație cu oxidul de aluminiu, are o gamă mai largă de porozitate, suprafață și diametru al porilor; Activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu duce la denaturarea rezultatelor analizei din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimiosorbției ireversibile a acestora.
Detectoare pentru HPLC
Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este utilizată pentru a detecta substanțe polare nevolatile care, din anumite motive, nu pot fi transformate într-o formă adecvată pentru cromatografia în gaz, chiar și sub formă de derivați. Astfel de substanțe, în special, includ acizi sulfonici, coloranți solubili în apă și unele pesticide, de exemplu derivați de fenil-uree.
Detectoare:
Detector UV pe o matrice de diode. O „matrice” de fotodiode (mai mult de două sute dintre ele) înregistrează în mod constant semnale în regiunile UV și vizibile ale spectrului, oferind astfel înregistrarea spectrelor UV-B în modul de scanare. Acest lucru vă permite să înregistrați continuu, la sensibilitate ridicată, spectre nedistorsionate ale componentelor care trec rapid printr-o celulă specială.
În comparație cu detecția cu o singură lungime de undă, care nu oferă informații despre puritatea maximă, capacitatea de a compara spectre complete ale unei rețele de diode oferă un grad mult mai mare de încredere în rezultatul identificării.
Detector de fluorescență. Marea popularitate a detectorilor fluorescenți se datorează selectivității și sensibilității lor foarte ridicate, precum și faptului că mulți poluanți ai mediului fluoresc (ex. hidrocarburi poliaromatice).
Un detector electrochimic este utilizat pentru a detecta substanțe care se oxidează sau se reduc cu ușurință: fenoli, mercaptani, amine, derivați aromatici nitro și halogen, aldehide, cetone, benzidine.
Separarea cromatografică a unui amestec pe o coloană din cauza progresului lent al PF necesită mult timp. Pentru a accelera procesul, cromatografia se efectuează sub presiune. Această metodă se numește cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)
Modernizarea echipamentelor utilizate în cromatografia clasică în coloană lichidă a făcut din aceasta una dintre cele mai promițătoare și moderne metode de analiză. Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o metodă convenabilă pentru separarea, izolarea preparativă și analiza calitativă și cantitativă a compușilor termolabili nevolatili cu greutate moleculară mică și mare.
În funcție de tipul de sorbent utilizat, această metodă folosește 2 opțiuni de cromatografie: pe un sorbent polar folosind un eluent nepolar (opțiune cu fază directă) și pe un sorbent nepolar cu un eluant polar - așa-numitul înalt cu fază inversă. -cromatografie lichidă de performanţă (RPHPLC).
În timpul tranziției de la eluent la eluent, echilibrul în condiții HPLC este stabilit de multe ori mai repede decât în condițiile de adsorbanți polari și PF-uri neapoase. Ca urmare a acestui fapt, precum și confortul de a lucra cu eluanți apoși și apos-alcool, OFVLC a câștigat acum o mare popularitate. Majoritatea analizelor HPLC sunt efectuate folosind această metodă.
Detectoare. Ieșirea unei componente individuale din coloană este înregistrată cu ajutorul unui detector. Pentru înregistrare, puteți utiliza o modificare a oricărui semnal analitic provenit din faza mobilă și asociată cu natura și cantitatea componentului amestecului. Cromatografia lichidă folosește semnale analitice precum absorbția luminii sau emisia de lumină a soluției de ieșire (detectori fotometrici și fluorimetrici), indicele de refracție (detectori refractometrici), conductivitatea potențială și electrică (detectori electrochimici) etc.
Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.
2.1 Aplicare
HPLC este utilizat pe scară largă în următoarele domenii de analiză chimică (sunt evidențiate obiectele de analiză în care HPLC practic nu are concurență):
· Controlul calitatii alimentelor - aditivi tonici si aromatizanti, aldehide, cetone, vitamine, zaharuri, coloranti, conservanti, medicamente hormonale, antibiotice, triazine, carbamat si alte pesticide, micotoxine, nitrozamine, hidrocarburi aromatice policiclice etc.
· Protecția mediului - fenoli, compuși organici nitro, hidrocarburi aromatice mono- și policiclice, o serie de pesticide, anioni și cationi principali.
· Criminalistică - droguri, explozivi organici și coloranți, produse farmaceutice puternice.
· Industria farmaceutică - hormoni steroizi, aproape toate produsele de sinteză organică, antibiotice, preparate polimerice, vitamine, preparate proteice.
· Medicină - substanțele biochimice și medicinale enumerate și metaboliții acestora din fluidele biologice (aminoacizi, purine și pirimidine, hormoni steroizi, lipide) în diagnosticarea bolilor, determinarea ratei de eliminare a medicamentelor din organism în scopul dozării lor individuale.
· Agricultura – determinarea nitraților și fosfatului în sol pentru determinarea cantității necesare de îngrășăminte aplicate, determinarea valorii nutritive a furajelor (aminoacizi și vitamine), analiza pesticidelor din sol, apă și produse agricole.
· Biochimie, chimie bioorganică, inginerie genetică, biotehnologie - zaharuri, lipide, steroizi, proteine, aminoacizi, nucleozide și derivații acestora, vitamine, peptide, oligonucleotide, porfirine etc.
· Chimie organică - toți produsele stabile de sinteză organică, coloranți, compuși termolabili, compuși nevolatili; chimie anorganică (aproape toți compușii solubili sub formă de ioni și compuși complecși).
· controlul calității și siguranței alimentelor, băuturilor alcoolice și nealcoolice, apei potabile, substanțelor chimice de uz casnic, parfumurilor în toate etapele producției acestora;
· determinarea naturii poluării la locul unui dezastru sau urgență provocat de om;
· detectarea și analiza substanțelor narcotice, puternice, otrăvitoare și explozive;
· determinarea prezenței substanțelor nocive (hidrocarburi policiclice și alte aromatice, fenoli, pesticide, coloranți organici, ioni de metale grele, alcaline și alcalino-pământoase) în efluenții lichizi, emisiile atmosferice și deșeurile solide din întreprinderi și în organismele vii;
· monitorizarea proceselor de sinteza organica, rafinarea petrolului si carbunelui, productia biochimica si microbiologica;
analiza calității solului pentru fertilizare, prezența pesticidelor și erbicidelor în sol, apă și produse, precum și valoarea nutritivă a furajelor; sarcini complexe de cercetare analitică; obţinerea de microcantităţi de substanţe ultrapure.
CAPITOLUL 3. EXEMPLE DE UTILIZARE HPLC ÎN ANALIZA OBIECTELOR DE MEDIU
HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu
Pentru hidrocarburile aromatice policiclice (HAP), substanțele ecotoxice din clasa I de pericol, au fost stabilite niveluri extrem de scăzute ale concentrațiilor maxime admisibile (MAC) în obiectele naturale. Determinarea HAP la nivelul MPC și mai jos este una dintre cele mai complexe probleme analitice, iar pentru rezolvarea acestora sunt folosite metode analitice de înaltă tehnologie (GC-MS, GC, HPLC). La alegerea unei metode de monitorizare, la principalele caracteristici luate în considerare se adaugă sensibilitatea și selectivitatea, viteza și eficiența, deoarece monitorizarea presupune analize în serie. Opțiunea HPLC pe coloane scurte, cu diametru mic, îndeplinește în mare măsură aceste cerințe. Folosind această metodă, autorii au dezvoltat și certificat metode de monitorizare a benzo[a]pirenului în trei medii naturale: aerosoli, strat de zăpadă și apă de suprafață. Metodele se caracterizează prin: prepararea simplă a probelor standardizate, inclusiv extracția HAP cu solvenți organici și concentrarea extractului, introducerea directă a extractului concentrat într-o coloană cromatografică, utilizarea detectiei fotometrice cu lungimi de undă multiple în regiunea UV a spectrului. , identificarea vârfurilor PAH în cromatograme folosind doi parametri, timpul de retenție și raportul spectral . Eroarea totală nu depășește 10% la determinarea benzo[a]pirenului în aerosol în intervalul de concentrație de la 0,3 la 450 ng/m3, în apa de suprafață în intervalul de concentrație de la 10 la 1000 ng/l, în stratul de zăpadă de suprafață interval de densitate de la 0,5 până la 50 μg/m2. Pentru cazul determinării simultane a HAP prioritare (până la 12 compuși) și înregistrarea vârfurilor neomogene de analiți, s-a propus separarea repetată a extractului prin modificarea selectivității fazei mobile, a lungimii de undă de detecție și a temperaturii coloanei, ținând cont de individualitatea. se determină proprietăţile HAP.
1 . Calitatea aerului ambiental. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2000.
2 . Calitatea apelor uzate de suprafață și tratate. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2001.
3 . Calitatea stratului de zăpadă. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 02-2001.
Îndepărtarea anilinei din soluțiile apoase folosind deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru
Problema eliminării hidrocarburilor din apele uzate este o sarcină urgentă. În multe industrii chimice, petrochimice și alte industrii se formează anilina și derivații săi, care sunt substanțe toxice. Anilina este o substanță foarte toxică, MPC - 0,1 mg/m 3. Anilina și derivații săi sunt solubili în apă și, prin urmare, nu pot fi îndepărtați prin sedimentare gravitațională.
Una dintre cele mai bune metode de tratare a apelor uzate din poluanți organici este utilizarea adsorbanților anorganici și organici care pot fi regenerați (aluminosilicați, argile modificate, lemn, fibre etc.) și incapabili de regenerare (cărbune activ, materiale polimerice macroporoase etc.). ).
Adsorbanții regenerabili pot elimina din apă substanțele organice cu polarități diferite. Căutarea adsorbanților eficienți este o sarcină urgentă.
Acest raport prezintă rezultatele unui studiu în domeniul utilizării cântarilor de cupru laminat de la Uzina de cabluri din Erevan (OPMOErKZ) ca absorbanți de anilină.
Studiile cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf HPLC / cromatografie lichidă de înaltă performanță / sisteme (Waters 486 - detector, Waters 600S - controler, Waters 626 - Pompă), pe o coloană de 250 x 4 mm umplută cu absorbanții studiati, mobilul viteza de fază a fost de 1 ml/m / faza mobilă sunt solvenții pe care îi studiem/, detectorul este UV-254. Analiza spectroscopică UV a fost efectuată pe un spectrofotometru Specord-50; spectrele au fost obținute folosind programul de calculator ASPECT PLUS.
La anumite volume de anilină din apă au fost adăugate porții de adsorbanți cântărite cu precizie, ale căror concentrații inițiale au fost variate. Amestecul a fost agitat bine timp de 6 ore, apoi proba a fost lăsată să se sedimenteze. Adsorbția este finalizată aproape în 48 de ore.Cantitatea de anilină precipitată este determinată prin analiză spectrofotometrică UV și refractometrică.
În primul rând, proprietățile de adsorbție ale OPMOErKZ au fost studiate la îndepărtarea anilinei dintr-o soluție în tetraclorură de carbon. S-a dovedit că anilina absoarbe cel mai bine sorbentul 3 (tabel).
S-au efectuat măsurători și pentru soluții apoase de anilină în concentrații de 0,01-0,0001 mol/l. Tabelul prezintă datele pentru o soluție de 0,01 M.
Absorbția anilinei de către diverși adsorbanți dintr-o soluție apoasă 0,01 M de anilină la 20°C
S-a stabilit anterior că adsorbția în intervalele de concentrație specificate crește și depinde liniar de indicele de refracție. Cantitatea de anilină a fost determinată din relația grafică „indice de refracție - concentrație molară” și corectată prin date atât din cromatografia lichidă, cât și din analiza spectrală UV.
Cel mai activ sorbent pentru soluții apoase este sorbentul 3. Cantitatea de poluant adsorbit a fost calculată ca diferență între cantitatea totală de poluant adăugată la soluția inițială și reziduul acestuia în soluția finală.
Metode de determinare a HAP în obiectele din mediu
În mod obișnuit, metodele de cromatografie gazoasă (GC) și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) sunt utilizate pentru a determina HAP. Separarea principalelor 16 PAH suficiente pentru analiza cantitativă se realizează fie prin utilizarea coloanelor capilare în cromatografia în gaz, fie a coloanelor de înaltă performanță utilizate în HPLC. Trebuie amintit că o coloană care separă bine amestecurile de calibrare a șaisprezece PAH nu garantează că acestea vor fi, de asemenea, bine separate de fundalul compușilor organici însoțitori din probele studiate.
Pentru a simplifica analiza, precum și pentru a obține rezultate de înaltă calitate, majoritatea procedurilor analitice conțin o etapă de izolare preliminară (separare) a HAP din alte grupe de compuși asociați din probe. Cel mai adesea, metodele de cromatografie lichidă la presiune joasă sunt utilizate în aceste scopuri într-un sistem lichid-solid sau lichid-lichid folosind mecanisme de adsorbție, de exemplu folosind silicagel sau alumină, uneori se folosesc mecanisme mixte, de exemplu adsorbția și excluderea folosind Sephadex.
Utilizarea purificării preliminare a probelor permite evitarea influenței:
Compuși complet nepolari, cum ar fi hidrocarburile alifatice;
Compuși polari moderat și puternic, de exemplu, ftalan, fenoli, alcooli polihidroxilici, acizi;
Compuși cu greutate moleculară mare, cum ar fi rășinile.
Există în principal două tipuri de detectoare utilizate în cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC): un detector fluorimetric sau un detector spectrofotometric cu matrice de fotodiode. Limita de detecție a HAP în detecția fluorimetrică este foarte scăzută, ceea ce face această metodă deosebit de potrivită pentru determinarea urmelor de compuși poliaromatici. Cu toate acestea, detectoarele fluorimetrice clasice nu oferă practic nicio informație despre structura compusului studiat. Modelele moderne fac posibilă înregistrarea spectrelor de fluorescență care sunt caracteristice compușilor individuali, dar acestea nu sunt încă utilizate pe scară largă în practica de măsurare de rutină. Un detector spectrofotometric cu o matrice de fotodiode (PDL) face posibilă înregistrarea spectrelor de absorbție în domeniul spectral UV și vizibil; aceste spectre pot fi utilizate pentru identificare. Informații similare pot fi obținute folosind detectoare cu scanare rapidă.
La selectarea tehnicilor analitice pentru separarea, identificarea și analiza cantitativă a acestor HAP, trebuie să se țină seama de următoarele condiții:
Nivelul conținuturilor determinate în probele de testat;
Numărul de substanțe înrudite;
Procedura analitică utilizată (tehnica de măsurare);
Capabilitățile echipamentelor în serie.
Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică
Dezvoltarea și îmbunătățirea metodelor care permit rezolvarea problemelor de analiză a apei este o problemă importantă în chimia analitică. Dezvoltarea cromatografiei lichide de înaltă performanță la presiune înaltă a stimulat dezvoltarea unei noi direcții în cromatografia cu schimb ionic, așa-numita cromatografie ionică. Sinteza absorbanților pentru cromatografia ionică este dificilă, deoarece există destul de multe cerințe pentru aceștia. Din cauza lipsei schimbătoarelor de cationi foarte eficiente disponibile comercial, a fost utilizată o fază inversă modificată dinamic, pentru care a fost sintetizat un modificator: acid N-hexadecil-N-decanoil-paraminobenoilsulfonic etil-diizopropilamoniu (DHDAS), în care amina hidrofobă care conține SO 3 - grup, capabil de schimb de cationi. După trecerea soluției modificatoare, absorbția la l = 260 nm a atins 6,4 unități de densitate optică (°E) și a atins un platou. Capacitatea de schimb ionic calculată este de 15,65 µmol. Deoarece cationii elementelor alcalino-pământoase și magneziul nu absorb în regiunea UV a spectrului, a fost utilizată detecția UV indirectă folosind un eluant de absorbție UV sintetizat bromură de 1,4-dipiridiniubutan (bromură DPB). Deoarece ionii de halogen distrug părțile de oțel ale coloanei, ionul de bromură al 1,4-dipiridiniubutanului a fost înlocuit cu ionul acetat. La spălarea coloanei cu eluent, contraionul modificatorului, etildiizopropilamoniul, este înlocuit cu ionul absorbant UV 1,4-dipiridiniubutan. Separarea cationilor s-a efectuat la lungimea de undă optimă l = 260 nm pe o scară de 0,4 A în modul „scara pliabilă”; Polaritatea reportofonului a fost inversată. Separarea tuturor cationilor studiați a fost realizată prin adăugarea unui aditiv complexant - acid oxalic. Limitele de detecție pentru Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ sunt de 8 μg/L; 16 ug/l; 34 ug/l; respectiv 72 µg/l. În condiţiile selectate, sa analizat apă de la robinet, conţinutul de Ca2+ în care a fost de 10,6 + 1,9 mg-ion/l, Mg2+ -2,5 + mg-ion/l. Eroarea de reproductibilitate nu depășește -2,2% pentru Ca2+ și 1,4% pentru Mg2+.
Analiza complexelor de cadmiu din mediu
Pentru a studia mecanismele de migrare a metalelor grele în biosferă, sunt necesare date despre formele chimice de existență a metalelor în natură. Dificultățile în analiza compușilor unuia dintre cele mai toxice metale - cadmiul - se datorează faptului că formează complexe fragile, iar atunci când se încearcă izolarea acestora, echilibrele naturale sunt distorsionate. În această lucrare, compușii de cadmiu din sol și plante au fost studiați folosind o tehnică bazată pe separarea cromatografică a extractelor urmată de identificarea componentelor prin metode de analiză chimică. Această abordare a făcut posibilă nu numai identificarea formelor chimice ale cadmiului, ci și urmărirea transformărilor acestora în obiectele din mediu.
Grupările OH de carbohidrați și polifenoli (inclusiv flavonoide), C=O, fosfați, NH2, NO2 și grupările SH sunt coordonate cu cadmiul din obiectele biosferei. În scopul acestui studiu, a fost compilat un set de liganzi model reprezentând aceste clase de compuși. Interacțiunea liganzilor model cu sărurile de cadmiu solubile în apă a fost studiată folosind spectroscopie UV și HPLC.
Pentru a izola compușii de cadmiu s-a folosit extracția cu solvenți special selectați (fără formând complexe cu Cd). Acest lucru face posibilă separarea cadmiului de toate metalele grele, cu excepția analogului său chimic apropiat, zincul. Picurile cu conținut de cadmiu și zinc în cromatogramele extractelor obținute au fost detectate prin legarea metalelor sub forma ditizonaților acestora. Pentru a separa de zinc, a fost utilizată diferența de stabilitate a complexelor Cd și Zn la pH 6-8. Compușii Cd izolați au fost identificați prin HPLC utilizând modificări ale pH-ului în timpul procesului de eluare. A fost efectuată o analiză a compușilor de cadmiu cu componente ale solurilor și țesuturilor plantelor și au fost identificate substanțe produse de plante ca răspuns la creșterea aportului de cadmiu din sol. S-a demonstrat că flavonoidele, în special tricina, sunt agenți de protecție în cereale, derivați alcoxi ai cisteinei în leguminoase și atât polifenoli, cât și tioli în legumele crucifere.
CAPITOLUL 4. ECHIPAMENTE HPLC
SERIE ACCELA
Noul cromatograf lichid de performanță ultra-înaltă ACCELA este capabil să funcționeze într-o gamă largă de debite și presiuni, oferind atât separarea HPLC tipică pe coloane convenționale, cât și separare ultra-rapidă și eficientă pe coloane cu o dimensiune a particulelor de sorbant mai mică de 2 microni. la presiuni ultra-înalte (mai mult de 1000 atm.).
Sistemul include o pompă cu gradient de cadran capabilă să genereze presiuni care depășesc 1000 atm și cu un volum de retenție de numai 65 µL, permițând separări cromatografice de mare viteză. Autosampler ACCELA Capabil să funcționeze la un ciclu de injectare a probei de 30 de secunde și să ofere cea mai mare reproductibilitate a injecției. Detector cu matrice de diode Accela PDA cu un volum minim al celulei cu flux (2 µl) optimizat pentru cromatografie de mare viteză, utilizează tehnologia patentată LightPipe și menține formele simetrice ale vârfurilor care vin cu un sistem de cromatografie și coloane impecabile.
Sistemul se interfață perfect cu spectrometrele de masă pentru a crea cele mai puternice și mai bune sisteme LC/MS disponibile în lume.
Coloane UHP de 1,9 µm disponibile de la Thermo Electron pentru orice aplicație
SERIE TSP
Principiul modular al construcției instrumentelor HPLC permite clientului să asambleze în mod flexibil echipamentele pentru a rezolva orice probleme analitice și, dacă se schimbă, să le modifice rapid și economic. O selecție largă de module include pompe - de la gradient izocratic la gradient cu patru componente, de la microcoloană la semipreparativ, toți detectoarele disponibile, sisteme de introducere a probelor - de la injectoare manuale la autosamplere cu posibilitatea oricărei manipulări cu mostre, software puternic pentru măsurarea procesării rezultate și gestionarea tuturor modulelor de sistem. Toate modulele sunt certificate de CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sunt compacte, au un design modern, sunt ușor de operat, dotate cu afișaj încorporat și autodiagnosticare sistem, vă permit să creați și să salvați metode de sarcină. Ele îndeplinesc criteriile „Exemplary Laboratory Practice” (GLP) și sunt incluse în Registrul Instrumentelor de Măsurare al Federației Ruse. Rapoartele de măsurare sunt emise în conformitate cu Farmacopeile din Anglia, SUA, Germania și Franța.
Sistemele modulare TSP se caracterizează prin cea mai mare fiabilitate și stabilitate în funcționare.
Combinația de module oferă analistului toate avantajele unui sistem integrat, pe de o parte, și flexibilitatea unui sistem modular, pe de altă parte. Indiferent de aplicația cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) - produse farmaceutice, biotehnologie, analize de mediu, analize clinice, analize de alimente și băuturi, analize petrochimice și chimice - acest instrument este întotdeauna configurat optim pentru a se potrivi celor mai înalte cerințe.
Atât sistemele de rutină de cercetare, cât și cele de mare debit oferă:
Degazare cu solvent foarte eficient
Abilitatea de a lucra cu cantități mici și ultra-mice de eșantion
Cea mai mare sensibilitate, atât cu detector UV/VIS, cât și cu matrice de diode (cu celebra tehnologie LightPipe cu lungimea opțională opțională de 1 sau 5 cm)
Lucrul cu diferite coloane
Analiză cantitativă de cea mai înaltă precizie
Abilitatea de a lucra automat cu diferite volume de mostre
Eroare RMS pentru timpi de retenție mai mici de 0,3%
Suprafața minimă de lucru ocupată de sistem
Cea mai mare fiabilitate și stabilitate a parametrilor.
Pompă Surveyor LC- Pompă HPLC cu cel mai bun timp de retenție reproductibil al oricărei pompe cu gradient cu patru componente disponibile în lume. Degazătorul de vid cu patru canale și amortizorul de pulsații integrate oferă o stabilitate excelentă a liniei de bază pentru o sensibilitate maximă și precizie de cuantificare.
Autosampler oferă cea mai mare productivitate și flexibilitate de analiză. O gamă largă de tăvi de mostre - de la flacoane standard la microplăci cu 96 și 384 de godeuri - acoperă nevoile pentru aproape toate aplicațiile. Noua tehnologie asigură injectarea probei practic fără pierderi; aproape 5 µl de probă sunt injectați cu un autosampler dintr-un volum total de probă de 5 µl.
INSPECTOR
Detector UV/Vis și PDA (Detector cu matrice de diode)
Surveyor UV/Vis- Detectorul de lumină vizibilă și ultravioletă cu lungime de undă variabilă este o combinație de rentabilitate și fiabilitate cu cea mai mare sensibilitate a tehnologiei LightPipe. O selecție largă de celule de flux face acest detector versatil pentru toate aplicațiile, de la cele care utilizează cromatografia capilară sau pe microcoloană până la semipreparativă și preparativă.
Surveyor PDA Detectorul este cel mai sensibil dintre toți detectoarele HPLC care utilizează o matrice de diode. Optica cu sursă de lampă dublă acoperă fără probleme întregul interval de lungimi de undă de la 190 la 800 nm. Formatorul de fascicul cu fibră optică oferă o rezoluție optică excelentă fără a sacrifica sensibilitatea.
Topograf R.I. detector refractometric cu o cuvă termostatată de volum minim cu control electronic complet de la un computer.
Surveyor FL detector de scanare fluorimetrică cu cea mai mare sensibilitate și capacități de detectare pentru fluorescență, chemiluminiscență și fosforescență.
O selecție largă de autosamplere vă permite să lucrați atât cu fiole convenționale, cât și cu plăci cu 96 de poziții, utilizate pe scară largă în biochimie și practica clinică. Lucrul cu ele este facilitat de utilizarea plăcilor similare pentru prepararea probelor folosind extracția în fază solidă.
400 Acționare electrică, buclă Valco (20 µl - standard) cu capacitate de umplere parțială.
Carusel 96 mostre.
Acționare electrică, termostat coloană, buclă Valco (100 µl - standard) cu posibilitate de umplere parțială.Mod AutoMix pentru prepararea probei. Carusel de probe: 84 x 2 ml (probe) + 3 x 10 ml (reactivi). Termostat în coloană încorporat. 420
Autosampler în buclă pentru lucrări de cercetare cu capacitatea de a funcționa în modurile de umplere completă, parțială și injectare a probei de microlitri. O gamă largă de carusele (standard - 96 de mostre).
Autosampler tabletă pentru lucrul cu plăci cu 96 și 384 de poziții. Injectarea probei în buclă sub presiune, capacitatea de a injecta probe mai mici de 1 µl. Posibilitatea de a instala un alimentator de tablete. HPLC
Principalii producători de echipamente HPLC
· Ape - cromatografie ultraperformanta, spectrometrie de masa, coloane, extractie in faza solida;
Varian, Inc. - cromatografe și coloane, accesorii pentru extracția în fază solidă;
· Agilent Technologies - cromatografe și coloane;
· Hypersil - coloane și adsorbanți.
· Merck KGaA - plăci și accesorii TLC pentru TLC, coloane, adsorbanți, faze mobile pentru HPLC, accesorii pentru extracția în fază solidă
· Dionex - echipamente si coloane pentru HPLC, in special pentru cromatografie ionica.
Literatură
1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..1 - M.: Chimie, 1990, -480 p.
1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..2 - M.: Chimie, 1990, -480 p.
2. Vasiliev V.P. Chimie analitică. În 2 ore.Partea 2. Metode fizico-chimice de analiză: Manual. pentru Khimko - technol. specialist. universități – M.: Mai sus. şcoală, 1989. – 384 p.
3. Materiale hidrochimice. Volumul 100. Metode şi mijloace tehnice de monitorizare operaţională a calităţii apelor de suprafaţă. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. – 200 p.
4. Lurie Yu.Yu. Chimia analitică a apelor uzate industriale / Yu.Yu. Lurie; M.: KhimiyaYU, 1984. - 448 p.
5. Ewing G. Metode instrumentale de analiză chimică / Trad. din engleza M.: Mir, 1989. – 348 p.
6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorizarea mediului. În 2 volume.Sankt Petersburg: Crăciun. 2000. – 260 p.
7. Aivazov B.V. Introducere în cromatografie. M.: Mai sus. şcoală, 1983. – 450 p.
8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Introducere în cromatografia gazoasă. M.: Chimie, 1990. – 329 p.
9. Stolyarov B.V. și altele // Cromatografie practică în gaz și lichid. Sankt Petersburg: Universitatea de Stat din Sankt Petersburg, 1998. - P. 81.
11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu
12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O.. Îndepărtarea anilinei din soluții apoase utilizând deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru laminat
13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică
14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analiza complexelor de cadmiu din mediu
Aplicație
DETERMINAREA CLOMAZONEI ÎN APA PRIN METODE CROMATOGRAFICE
INSTRUCȚIUNI METODOLOGICE MUK 4.1.1415-03
1. Întocmit de: Centrul Științific Federal de Igienă numit după. F.F.
Erisman; Academia Agricolă din Moscova poartă numele. K.A.
Timiryazev; cu participarea Departamentului de Supraveghere Sanitară și Epidemiologică de Stat al Ministerului Sănătății din Rusia. Dezvoltatorii metodologiei sunt enumerați la sfârșit.
3. Aprobat de Medicul Sef Sanitar de Stat
Federația Rusă, prim-viceministru al Sănătății al Federației Ruse, academician. RAMS G.G. Onishcenko 24 iunie 2003
5. Introdus pentru prima dată.
1. Partea introductivă
Producător: FMS (SUA).
Nume comercial: COMMAND.
Ingredient activ: clomazonă.
2-(2-clorbenzil)-4,4-dimetil-3-izoxalidin-3-onă (IUPAC)
Lichid vâscos maro deschis.
Punct de topire: 25 -C.
Punct de fierbere: 275 -C.
Presiunea vaporilor la 25 -C: 19,2 MPa.
Coeficientul de partiție n-octanol/apă: K logP = 2,5.
Foarte solubil în acetonă, hexan, etanol, metanol,
cloroform, diclormetan şi acetonitril; Solubilitate in apa -
1,10 g/m3 dm. Stabil la temperatura camerei cel puțin 2 ani, la 50 -C cel puțin 3 luni.
Scurte caracteristici toxicologice: orală acută
toxicitate (LD) pentru șobolani - 1369 - 2077 mg/kg; dermică acută
toxicitate (LD) pentru șobolani - mai mult de 2000 mg/kg; acut
toxicitate prin inhalare (LC) pentru șobolani - 4,8 mg/m3. dm (4 ore).
Standarde de igienă. Limita maximă de concentrație în apă este de 0,02 mg/m3. dm.
Zona de aplicare a medicamentului. Clomazona este un erbicid selectiv folosit pentru combaterea cerealelor și buruienilor dicotiledonate în culturile de soia și orez cu aplicare pre-emergență sau înainte de însămânțare.
2. Metoda de determinare a clomazonei în apă
metode cromatografice
2.1. Dispoziții de bază
2.1.1. Principiul tehnicii
Tehnica se bazează pe extragerea clomazonei din proba analizată cu hexan, concentrarea extractului și determinarea cantitativă ulterioară prin metode alternative:
cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu
detector de ultraviolete, cromatografie gaz-lichid (GLC) cu un detector de viteză de recombinare constantă sau cromatografie în strat subțire (TLC). Determinarea cantitativă se realizează prin metoda de calibrare absolută.
2.1.2. Selectivitatea metodei
În condițiile propuse, metoda este specifică în prezența poluanților globale de mediu: cicloparafine clorurate (izomeri HCCH), compuși difenil (DDT și derivații săi), metaboliții acestora - benzen și fenoli policlorurați, precum și în prezența tricloroacetatului de sodiu. , care poate fi folosit pe culturi ca erbicid.
2.1.3. Caracteristicile metrologice ale metodei (P = 0,95)
Reactivi, solutii si materiale
Clomazonă care conține d.v. 99,8%
(FMS, SUA)
Azot, foarte mare GOST 9293-79
Amoniac apos, 25%, h GOST 1277-81
Acetonă, h GOST 2603-79
n-hexan, h GOST 2603-79
Peroxid de hidrogen, soluție apoasă 30% GOST 10929-77
Alcool izopropilic, chimic pur TU 6-09-402-75
Acid sulfuric, grad de reactiv GOST 4203-77
Acid clorhidric (acid clorhidric), grad de reactiv GOST 3118-77
Alcool metilic, grad de reactiv GOST
Hidroxid de sodiu, chimic pur, soluție apoasă 25% GOST 4323-77
Sulfat de sodiu anhidru, grad de reactiv GOST 1277-81
Azotat de argint, grad de reactiv GOST 1277-81
2-fenoximetanol, parte TU 6-09-3688-76
Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)
cu 5% SE-30, Hemapol, Cehia
Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) cu 1,5
OV-17 + 1,95% QF-1, Hemapol, Cehia
Plăci pentru HPTLC (URSS)
Plăci „Kieselgel 60 F-254” (Germania)
Recorduri „Silufol” Republica Cehă
Filtre de hârtie „bandă albă”, tăiate și pre-spălate cu hexan TU 6-09-2678-77
2.3. Dispozitive, echipamente, vase
Cromatograf lichid Milichrome
cu detector de ultraviolete
Coloana cromatografica din otel,
lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,
umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni
Cromatograf gazos seria „Color” sau
similar, echipat cu un detector constant
rata de recombinare (RPR) cu o limită
detecție pentru lindan 4 x 10 g/cc. cm
Coloană cromatografică din sticlă, lungime
1 sau 2 m, diametru interior 2 - 3 mm
Microseringă tip MSh-10, capacitate 10 µl TU 5E2-833-024
Aparat de agitare tip AVU-6s TU 64-1-2851-78
Baie de apă TU 64-1-2850-76
Balanțe analitice tip VLA-200 GOST 34104-80E
Camera cromatografică GOST 10565-74
Pompă cu jet de apă GOST 10696-75
Iradiator cu mercur-cuarț tip OKN-11 TU 64-1-1618-77
Sticle de pulverizare din sticlă GOST 10391-74
Evaporator rotativ cu vid IR-1M
sau similar TU 25-11-917-76
Grup compresor TU 64-1-2985-78
Dulap de uscare TU 64-1-1411-76E
Pâlnii de separare GOST 3613-75
Baloane cotate, capacitate 100 ml GOST 1770-74
Cilindri de măsurare, capacitate 10, 50 ml GOST 1770-74E
Baloane în formă de para cu secțiune măcinată,
cu o capacitate de 100 ml GOST 10394-72
Baloane conice, capacitate 100 ml GOST 22524-77
Tuburi de centrifugare, măsurarea GOST 25336-82E
Pipete, capacitate 0,1, 1, 2, 5 și 10 ml GOST 20292-74
Pâlnii chimice, conice, cu diametru
34 - 40 mm GOST 25336-82E
2.4. Selectarea eșantionului
Selecția, depozitarea și pregătirea probelor se efectuează în conformitate cu
„Reguli unificate de prelevare a probelor de produse agricole, produse alimentare și obiecte de mediu pentru determinarea urmelor de pesticide”, aprobat prin N 2051-79 din 21.08.79.
Probele selectate pot fi păstrate la frigider pentru cel mult 5 zile. Înainte de analiză, apa (dacă este prezentă materie în suspensie) este filtrată printr-un filtru de hârtie liber.
2.5. Pregătirea pentru determinare
2.5.1. Metoda HPLC
2.5.1.1. Pregătirea fazei mobile pentru HPLC
Folosind o pipetă, se pun 5 ml de izopopanol și 5 ml de metanol într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan la semn, se amestecă și se filtrează.
2.5.1.2. Condiționarea coloanei
Se clătește coloana HPLC cu hexan-metanol-izopropanol (90:5:5, v/v) timp de 30 min. la un debit de solvent de 100 µl/min.
2.5.2. Metoda GLC. Pregătirea și condiționarea coloanei
Ambalajul finit (5% SE-30 pe Chromaton N-AW-DMCS) se toarnă într-o coloană de sticlă, se compactează sub vid, se instalează coloana în termostatul cromatograf fără a fi conectată la detector și se stabilizează într-un curent de azot la un temperatura de 250 -C pentru orele 10 - 12
2.5.3. Metoda TLC
2.5.3.1. Prepararea reactivilor de dezvoltare
2.5.3.1.1. Reactiv de dezvoltare nr. 1
1 g azotat de argint se dizolvă în 1 ml apă distilată, 10 ml 2-fenoximetanol, 190 ml acetonă, se adaugă 1 - 2 picături de peroxid de hidrogen, soluția se agită și se transferă într-o sticlă de sticlă închisă la culoare.
2.5.3.2.2. Reactiv de dezvoltare N 2
0,5 g azotat de argint se dizolvă în 5 ml apă distilată într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 10 ml de amoniac apos 25%, soluția se ajustează la 100 ml cu acetonă, se amestecă și se transferă într-un balon de sticlă închisă la culoare.
2.5.3.2. Pregătirea fazei mobile pentru TLC
Se adaugă 20 ml de acetonă într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan până la semn și se amestecă. Amestecul este turnat în camera cromatografică într-un strat de cel mult 6 - 8 mm în 30 de minute. Înainte de a începe cromatografia.
2.5.4. Prepararea solutiilor standard
O soluție standard stoc de clomazonă care conține 100 pg/ml este preparată prin dizolvarea a 0,010 g de medicament care conține 99,8% ingredient activ în hexan într-un balon cotat de 100 ml. Soluția se păstrează la frigider timp de o lună.
Soluții standard de lucru cu o concentrație de 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; Se prepară 20 și 40,0 μg/ml din soluția standard stoc de clomazonă prin diluție în serie corespunzătoare cu hexan.
Soluțiile de lucru sunt păstrate în frigider pentru cel mult o lună.
2.5.5. Construirea unui grafic de calibrare
2.5.5.1. Graficul de calibrare A (măsurare conform clauzei 2.7.1, HPLC)
Pentru a construi un grafic de calibrare, se injectează 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 4,0 în injectorul cromatograf; 10,0; 20,0 şi 40 pg/ml.
2.5.5.2. Graficul de calibrare B (măsurare conform clauzei 2.7.2, GLC)
Pentru a construi o curbă de calibrare, se injectează 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 0,4 în evaporatorul cromatograf; 1,0; 2,0; 4.0 și 10.0.
Efectuați cel puțin 5 măsurători paralele. Găsiți înălțimea medie a vârfului cromatografic pentru fiecare concentrație. Construiți un grafic de calibrare (A sau B) al dependenței înălțimii vârfului cromatografic în mm de concentrația de clomazonă din soluție în μg/ml.
2.6. Descrierea definiției
100 ml din proba de apă analizată se pun într-o pâlnie de separare cu o capacitate de 250 ml, se adaugă 10 ml soluție apoasă 25% de hidroxid de sodiu, se amestecă și se adaugă 20 ml n-hexan. Pâlnia se agită timp de 3 minute, după separarea fazelor, stratul de hexan se toarnă într-un balon de 100 ml în formă de pară, trecându-l printr-un strat de sulfat de sodiu anhidru plasat într-o pâlnie conică pe un filtru de hârtie pliat. Extracția medicamentului din proba apoasă se repetă de încă două ori, folosind 20 ml de n-hexan. Extractul combinat de hexan este evaporat pe un evaporator rotativ cu vid la o temperatură de 40-C aproape până la uscare, reziduul este eliminat cu un curent de aer sau azot de înaltă puritate. Reziduul uscat este dizolvat în 0,1 (HPLC, TLC) sau 0,25 ml (GLC) n-hexan și analizat prin una dintre metodele cromatografice.
2.7. Condiții de cromatografie
Cromatograf lichid cu detector de ultraviolete Milichrom (Rusia).
Coloana de otel lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,
umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni.
Temperatura coloanei: temperatura camerei.
Faza mobilă: hexan-izopropanol-metanol (90:5:5, v/v).
Debit de eluant: 100 µl/min.
Lungime de undă de operare: 240 nm.
Sensibilitate: 0,4 unități absorbția pe scară.
Volumul probei injectat: 5 µl.
Timp de eliberare a clomazonei: aproximativ 6 minute.
Domeniu de detecție liniară: 20 - 200 ng.
Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 40 ug/mL sunt diluate cu fază mobilă de calitate HPLC.
Cromatograf gazos „Tsvet-570” cu un detector de viteză constantă de recombinare a ionilor.
Coloana de sticla de 1 m lungime, diametru interior 3 mm, umpluta cu Chromaton N-AW-DMCS cu 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).
Scara de lucru a electrometrului este de 64 x 10 10 Ohm.
Viteza casetei de înregistrare este de 200 mm/h.
Temperatura termostatului coloana - 190 -C
detector - 300 -С
evaporator - 220 -С
Viteza gazului purtător (azot) - 60 ml/min.
Volumul probei injectate este de 5 µl.
Timpul de eliberare a clomazonei este de 2,5 minute.
Domeniu de detecție liniară: 2 - 50 ng.
Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 10 μg/mL sunt diluate cu hexan.
Pentru a crește acuratețea identificării clomazonei în prezența gamma-HCH în probă, care are un timp de retenție similar, clomazona este îndepărtată din probă prin tratare cu acid sulfuric concentrat. Analiza repetată a probei face posibilă determinarea contribuției clomazonei la semnalul cromatografic primar.
Soluție de hexan într-un balon obținută cantitativ conform punctului 2.6
(sau o parte alicotă a acestuia) se aplică pe plăci cromatografice „Silufol”, „Kieselgel 60F-254” sau „plăci HPTLC”. Soluțiile standard sunt aplicate în apropiere într-un volum corespunzător conținutului de clomazonă de 1, 2, 5 și 10 mcg. Placa este plasată într-o cameră de cromatografie care conține un amestec de n-hexan-acetonă (4:1, în volum). După ce s-a dezvoltat cromatograma, placa este scoasă din cameră, plasată sub tracțiune până când solvenții se evaporă, apoi tratată cu unul dintre reactivii de dezvoltare și plasată sub o lampă cu ultraviolete timp de 5 minute. Zona de localizare a medicamentului pe plăcile „Silufol”, „plăci HPTLC” și „Kieselgel 60F-254” apare sub formă de pete gri-maronii cu o valoare Rf de 0,35, 0,85 și, respectiv, 0,43. Pentru a determina clomazona prin TLC, puteți utiliza plăci „Alugram” și „Poligram” (fabricate în Germania). Valoarea Rf a clomazonei pe aceste plăci este de 0,37 și, respectiv, 0,38.
3. Cerințe de siguranță
Este necesar să se respecte regulile de siguranță general acceptate atunci când se lucrează cu solvenți organici, substanțe toxice și dispozitive electrice de încălzire.
4. Controlul erorilor de măsurare
Controlul operațional al erorii de măsurare și al reproductibilității se efectuează în conformitate cu recomandările MI 2335-95. GSI „Controlul intern al calității rezultatelor analizei chimice cantitative”.
5. Dezvoltatori
Yudina T.V., Fedorova N.E. (Centrul Federal de Cercetare numit după F.F. Erisman).
Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (Institutul de Medicină Muncii al Academiei de Științe și Academiei de Științe Medicale din Ucraina, Kiev).
