480 rubľov. | 150 UAH | 7,5 $, MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Dizertačná práca - 480 RUR, dodávka 10 minút 24 hodín denne, sedem dní v týždni a sviatky

Kaisheva, Anna Leonidovna. Hmotnostná spektrometrická identifikácia proteínov a proteínových komplexov na čipoch mikroskopu atómovej sily: dizertačná práca... Kandidát biologických vied: 01.03.04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Miesto ochrany: Vedecký výskum. Inštitút Biomed. chémia pomenovaná po V.N. Orechovich RAMS] - Moskva, 2010. - 104 s.: chorý. RSL OD, 61 10-3/1308

Úvod

Kapitola 1. Prehľad literatúry 10

1.1. Analýza vedecko-technického pokroku v oblasti vysoko citlivých proteomických technológií

1.2 Charakteristika vírusu hepatitídy C 20

1.2.1 Metódy diagnostiky hepatitídy C 22

1.2.2 Sérologické proteínové markery hepatitídy C 25

Kapitola 2. Materiály a metódy 28

2.1 AFM čipy 28

2.2 Proteínové prípravky a činidlá 29

2.3 Analýza AFM 30

2.4 Príprava vzoriek na hmotnostnú spektrometrickú analýzu 31

2.5 Hmotnostná spektrometrická analýza 33

2.5.1 MALDI-MS analýza proteínov na povrchu AFM čipu 33

2.5.2 ESI-MS analýza proteínov na povrchu AFM čipu 34

Kapitola 3. Výsledky a diskusia 35

3.1 MS - identifikácia proteínov zachytených pomocou „chemického phishingu“ na povrchu čipu AFM z roztoku analytu

3.2 MS identifikácia proteínov biošpecificky zachytených na povrchu AFM čipu z roztoku analytu

3.3 MS identifikácia proteínov na povrchu AFM čipu, biošpecificky zachytených zo vzoriek krvného séra

Záver 83

Literatúra

Úvod do práce

Relevantnosť práce.

Jednou z prioritných oblastí modernej biochémie je vytvorenie efektívnych analytických metód pre proteomickú analýzu, ktorej hlavnou úlohou je detegovať a inventarizovať proteíny v tele, študovať ich štruktúru, funkcie a identifikovať proteínové interakcie. Vyriešenie tohto problému umožní vytvárať nové systémy diagnostiky chorôb a ich liečby. Štandardné metódy modernej proteomickej analýzy sú založené na separácii viaczložkových proteínových zmesí pomocou chromatografie, elektroforézy v kombinácii s hmotnostnými spektrometrickými metódami (MS) na identifikáciu proteínov. Napriek nepochybným výhodám štandardnej MS analýzy, pokiaľ ide o rýchlosť a spoľahlivosť identifikácie proteínových molekúl, má táto metóda značné obmedzenia v jej použití z dôvodu nízkej

koncentračnú citlivosť analýzy na úrovni 10" "10" M a vysoký dynamický rozsah obsahu bielkovín v biologickom materiáli. Zároveň prevažujúci počet funkčných proteínov vrátane biomarkerov takých spoločensky významných ochorení, akými sú vírusová hepatitída B a C, nádorové markery, atď., sú prítomné v krvnej plazme v koncentračnom rozsahu o 10" Mi menej.

Jedným zo spôsobov, ako prekonať toto metodologické obmedzenie koncentračnej citlivosti analýzy, je použitie biomolekulových detektorov, ktoré umožňujú registrovať jednotlivé molekuly a ich komplexy a teoreticky nemajú žiadne obmedzenia v koncentračnej citlivosti. Biomolekulárne detektory zahŕňajú detektory založené na nanotechnologických zariadeniach, ako sú mikroskopy atómovej sily (AFM), nanodrôtové detektory, nanopóry a množstvo ďalších detektorov. Jedinečná citlivosť AFM detektorov umožňuje vizualizovať jednotlivé molekuly proteínov a spočítať ich počet. Pri použití AFM ako biomolekulového detektora je nutné použiť špeciálne čipy, ktoré umožňujú koncentrovať makromolekuly biologického analytu z veľkého objemu inkubačného roztoku na obmedzenom povrchu čipu. Študované proteínové objekty sa môžu koncentrovať na povrchu čipu v dôsledku fyzikálnej alebo chemickej adsorpcie, ako aj v dôsledku biošpecifických interakcií (AFM-biošpecifické phishing).

V praxi je však obmedzením použitia nanodetektorov na báze AFM to, že napriek schopnosti vizualizovať jednotlivé proteínové molekuly na povrchu čipu, takéto detektory ich nedokážu identifikovať, čo je dôležité najmä pri štúdiu komplexných proteínové zmesi vrátane biologického materiálu. Preto sa vývoj metódy analýzy, ktorá dopĺňa možnosti metódy AFM, javí ako naliehavá úloha. Doteraz jedinou proteomickou metódou, ktorá umožňuje jednoznačnú a spoľahlivú identifikáciu proteínových molekúl, je MS analýza. Dizertačná práca vyvinula prístup, ktorý kombinuje vysokú citlivosť metódy AFM a spoľahlivú MS identifikáciu na detekciu proteínov a ich komplexov z roztoku analytu.

Účel a ciele štúdie.

Cieľom tejto práce bola hmotnostná spektrometrická identifikácia proteínov a proteínových komplexov identifikovaných v biomateriáloch pomocou mikroskopie atómovej sily.

Na dosiahnutie tohto cieľa boli vyriešené nasledujúce úlohy:

Bola vyvinutá schéma MS identifikácie proteínov zachytených na povrchu AFM čipu pomocou chemického alebo biošpecifického phishingu;

Boli vyvinuté podmienky pre enzymatickú hydrolýzu proteínov na povrchu AFM čipu pre následnú MS identifikáciu;

Uskutočnila sa MS identifikácia modelových proteínov na povrchu AFM čipu;

Uskutočnila sa MS identifikácia proteínov na povrchu AFM čipu, biošpecificky zachytených z viaczložkovej zmesi (séra).

Vedecká novinka diela .

V dizertačnej práci bola vyvinutá schéma, ktorá umožňuje MS identifikáciu proteínov a proteínových komplexov zachytených z roztoku alebo viaczložkovej zmesi na povrchu AFM čipu. Na tento účel boli zvolené optimálne podmienky prípravy vzorky, vrátane režimu hydrolýzy (teplota, vlhkosť, zloženie trypsinolytickej zmesi, doba trypsinolýzy) proteínových molekúl kovalentne a nekovalentne imobilizovaných na povrchu AFM čipu. Zvláštnosťou tejto práce bolo, že v porovnaní so štandardnými proteomickými protokolmi pre enzymatickú hydrolýzu sa príprava vzoriek na MS analýzu neuskutočňovala v roztoku, ale v obmedzenom priestore.

povrch čipu. Vyvinutá schéma umožnila efektívne vykonávať MS analýzu a identifikovať jednotlivé proteíny aj proteínové komplexy na povrchu AFM čipu. MS analýza proteotypových peptidov študovaných proteínov bola uskutočnená s použitím dvoch typov ionizácie (MALDI A EST) a dva typy detektorov (time-of-flight a iónová pasca). Vyvinutá schéma na spojenie AFM-biošpecifického phishingu a MS bola tiež úspešne testovaná na detekciu proteínových markerov vírusu hepatitídy C (HCV) (HCVcoreAg a E2) vo vzorkách krvného séra.

Praktický význam práce .

Výsledky tejto práce umožňujú vytvárať vysoko citlivé proteomické metódy bez použitia značiek a dodatočných postupov prípravy vzoriek na detekciu proteínov nachádzajúcich sa v nízkych koncentráciách v biologickom materiáli, vrátane krvného séra. Bol navrhnutý prístup založený na mikroskopii atómovej sily a hmotnostnej spektrometrii, ktorý umožní detekciu a identifikáciu proteínových markerov vírusu hepatitídy C v ľudskom krvnom sére.

Tento prístup je možné využiť pri vývoji zameraných na vytváranie nových diagnostických čipov a hľadanie biomarkerov širokého spektra spoločensky významných ochorení.

Schválenie práce.

Hlavné výsledky výskumu boli prezentované na „1., 2. a 3. medzinárodnom fóre o nanotechnológii“ (Moskva, 2008-2010); „IV. kongres Ruskej spoločnosti biochemikov a molekulárnych biológov“, Novosibirsk, 2008; na medzinárodnom kongrese „Human Proteome“, Amsterdam, 2008; na medzinárodnom ľudskom proteómovom kongrese v Sydney, 2010.

Publikácie.

Štruktúra a rozsah dizertačnej práce.

Dizertačná práca pozostáva z úvodu, literárneho prehľadu, popisu materiálov a výskumných metód, výsledkov výskumu a ich diskusie, záveru, záverov a zoznamu literatúry. Práca je prezentovaná na 104 stranách, ilustrovaná 33 obrázkami a 4 tabuľkami, bibliografiu tvorí 159 titulov.

Analýza vedecko-technického pokroku v oblasti vysoko citlivých proteomických technológií

Jednou z prioritných oblastí modernej vedy je objavenie a objasnenie úlohy rôznych typov proteínov v organizme, ako aj pochopenie molekulárnych mechanizmov vedúcich k rozvoju chorôb.

Napriek neustálemu zlepšovaniu proteomických metód sa počet novoobjavených biomarkerov chorôb za posledné desaťročie prakticky nezmenil. Je to spôsobené tým, že koncentračný limit detekcie tradičných proteomických metód nepresahuje 10"9 M. Zároveň je pre proteomiku dôležité vyvinúť nové analytické prístupy na identifikáciu proteínov s nižším koncentračným rozsahom, najmä proteínové molekuly s nízkou kópiou (s koncentráciou 10"13 M a menej), vrátane biomarkerov v biologickom materiáli. Pretože sa dá predpokladať, že práve v týchto koncentračných rozsahoch sa nachádzajú proteínové markery väčšiny chorôb.

Jednou z aktívne sa rozvíjajúcich oblastí, ktorá umožňuje mierne zvýšiť koncentračnú citlivosť analýzy, je vytváranie analytických komplexov na báze nanochromatografických a nanoelektroforetických systémov kompatibilných s hmotnostnými spektrometrami.

Nanochromatografický systém v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou a elektrosprejovou ionizáciou umožnil zvýšiť citlivosť detekcie proteínov o dva rády v porovnaní s chromatografiou s vysokým rozlíšením (HPLC). Hranica koncentračnej citlivosti takýchto spojených systémov je obmedzená citlivosťou štádia elektroforézy/chromatografie a nepresahuje 10-12 M pre jednotlivé proteíny (napríklad pre cytochróm C a bradykinín).

V súčasnosti sa chromatografické metódy rozvinuli do samostatných nezávislých oblastí - SELDI MS analýza (povrchová laserová desorpcia a ionizácia/hmotnostná spektrometria s časom letu), proteínové phishingové metódy využívajúce magnetické mikročastice. V týchto technológiách sú hydrofóbne alebo nabité povrchy čipov SELDI... alebo magnetické mikročastice v kombinácii s hmotnostnou spektrometrickou analýzou sa úspešne používajú: pre? identifikácia - a identifikácia ako samostatné typy; proteíny a na profilovanie proteínov/peptidov krvného séra [c, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ je výkonný prístup, ktorý umožňuje študovať biomateriál prostredníctvom adsorpcie biomolekúl (proteínov, peptidov) na chemicky aktivované? povrchu (katión/aniónomeničové čipy), po ktorej nasleduje hmotnostná spektrometrická analýza adsorbovaných molekúl:. uplatňuje sa prístup SEEDPMЄ; na proteínové profilovanie biomateriálu; a nedávno: začala sa používať ako „diagnostika založená na proteomických čiarových kódoch“ [17].. Podstatou takejto „diagnostiky čiarových kódov“ je identifikovať? vlastnosti proteínového profilu biologickej vzorky; spojené s konkrétnou chorobou: Takže, je to známe; čo g pri. Pri rakovinových ochoreniach sa „proteomický čiarový kód“ biomateriálu výrazne líši od kódu u zdravých1 skupín jedincov: Preto kontrola nad zmenami v proteíne; Zloženie biomateriálu sa môže stať základom pre včasnú diagnostiku chorôb. Na; dnes pomocou prístupu SELDI? Boli identifikované markery MЄ. rakovina žalúdka, vaječníkov, prostaty a prsníka: Obmedzením tejto metódy5 je neschopnosť identifikovať proteíny s vysokým rozlíšením a spoľahlivosťou, čo je obzvlášť dôležité, keď; analýza viaczložkových zmesí, ako je biologický materiál.

Okrem problému nízkej koncentračnej citlivosti existujúcich analytických systémov sa kameňom úrazu proteomickej analýzy biologického materiálu stal široký dynamický rozsah koncentrácií proteínov, najmä v krvnom sére, ktorý sa pohybuje od 1 (GM až po jednotlivé molekuly proteínov). Proteíny s vysokou kópiou (hlavné) interferujú s detekciou takýchto systémov a identifikáciou proteínov s nízkou kópiou (vedľajších).

Problém širokého koncentračného rozsahu proteínov v biomateriáli je možné riešiť použitím metód deplécie krvného séra od hlavných frakcií proteínov, separačných metód viaczložkových zmesí a nanotechnologických metód založených na biošpecifickom a chemickom love molekúl proteínového analytu z komplexných zmesí. na povrch čipov do rôznych biosenzorov alebo na aktivovaný povrch magnetických mikroguľôčok.

Na separáciu viaczložkových proteínových zmesí sa tradične používa jednorozmerná, častejšie dvojrozmerná gélová elektroforéza. Princíp separácie proteínov metódami dvojrozmernej gélovej elektroforézy je založený na rozdiele medzi proteínmi podľa hodnôt ich izoelektrických bodov Hf molekulových hmotností. V proteomike sa tieto prístupy využívajú na proteínové mapovanie biomateriálu (tkaniva, krvnej plazmy atď.). Kombinácia jednorozmernej a/alebo dvojrozmernej elektroforézy s hmotnostnou spektrometriou umožňuje identifikáciu separovaných a vizualizovaných proteínov. Postup dvojrozmernej gélovej elektroforézy však stále nie je automatizovaný, je pomerne zložitý a náročný na prácu, vyžaduje si vysoko kvalifikovaného operátora a výsledky analýzy sú často zle reprodukovateľné.

Vhodnejším postupom na separáciu proteínov v porovnaní s dvojrozmernou elektroforézou je chromatografia s vysokým rozlíšením (HPLC); čo je automatizovaný postup, ktorý umožňuje odstránenie proteínov s vysokou kópiou z komplexnej zmesi s cieľom následne identifikovať proteíny s nízkou kópiou.

Na účely priamej identifikácie proteínov v komplexných zmesiach môže byť chromatografická kolóna spojená s hmotnostným spektrometrom. Neporušené proteíny však prakticky nie sú prístupné vysokokvalitnej separácii pomocou HPLC, pretože počas analýzy dochádza k ich denaturácii (kvôli nízkym hodnotám pH prostredia a vysokým koncentráciám organických rozpúšťadiel), ako aj nízkym presnosť hmotnostnej spektrometrickej analýzy je preto priama identifikácia väčšiny intaktných proteínov, najmä s molekulovou hmotnosťou presahujúcou 10 kDa, často nemožná. Analytickú presnosť merania možno zlepšiť hydrolytickým štiepením proteínov na peptidové fragmenty s molekulovou hmotnosťou 700 až 4000 Da pomocou proteáz; ako je trypsín (technológia zdola nahor). Na dosiahnutie kvalitnej separácie bielkovín v zmesi sa používa kombinácia viacerých chromatografických postupov, takzvaná multidimenzionálna chromatografia.

Metódy diagnostiky hepatitídy

V súčasnosti sa na proteínovú diagnostiku hepatitídy C používajú testovacie systémy na identifikáciu anti-HCV jadra. Prvé testy ELISA zisťujúce prítomnosť protilátok proti HCV core boli dostupné začiatkom 90-tych rokov, ale mali nízku citlivosť a selektivitu. Neskôr, koncom 90-tych rokov, sa objavila nová generácia testov ELISA na anti-HCVcore, ktorá mala dosť vysokú citlivosť okolo 95-99% a dokázala detekovať HCV niekoľko mesiacov po infekcii.

Napríklad v roku 1996 sa na ruskom trhu objavili testovacie systémy vyvinuté spoločnosťami Vector-Best (Novosibirsk) a Diagnostic Systems (Nižný Novgorod) na detekciu protilátok - triedy anti-HCV IgM. Úloha protilátok triedy IgM v sérodiagnostike nebola dostatočne študovaná, avšak niektoré štúdie ukázali dôležitosť tohto markera pre identifikáciu chronickej hepatitídy C. Tiež sa zistilo, že korelácia medzi detekciou vírusovej RNA a anti-HCV IgM u pacientov je 80-95 %. Na určenie fázy vývoja vírusovej hepatitídy C Afanasyev A.Yu. a kol., použili koeficient odrážajúci pomer anti-HCV IgG k anti-HCV IgM v krvi pacientov. Doposiaľ bolo vyvinutých mnoho systémov ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ktoré detegujú cirkulujúce protilátky proti mnohým epitopom vírusu hepatitídy E.

Moderná laboratórna diagnostika: vírusovej hepatitídy E sa vykonáva vo väčšine zdravotníckych zariadení v Moskve; v súlade s existujúcimi nariadeniami Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie a Ministerstva zdravotníctva: Moskva a spočíva v stanovení imunoglobulínov? triedy G na vírus hepatitídy E (anti-HGV IgG) v krvnom sére pacientov. Identifikácia tohto markera umožňuje posúdiť prítomnosť súčasnej alebo minulej infekcie.

Nevýhody metód; detekcia na základe EEISA, okrem nízkej citlivosti (viac ako GO "12 M)j sú spôsobené aj falošnou detekciou; vírusová hepatitída E u pacientov - v dôsledku postinfekčnej imunity, skríženej reaktivity protilátok, ako aj nedostatočnej citlivosti v akútnom období) fázy BFG BI SPOJENIA S: TOTO pokračuje v aktívnom hľadaní citlivých, špecifických, rýchlych a ľahko použiteľných metód na detekciu markerov hepatitídy E.

Ďalšia skupina metód na detekciu vírusovej hepatitídy v sére: krv pozostáva z registrácie RNA BE pomocou PCR; Stanovenie RNA. metódy BFG; HSR nemožno použiť ako primárny test na - potvrdenie alebo vylúčenie; diagnóza; Ale; Možno; užitočné na potvrdenie diagnózy: Diagnóza1 BFG sa vykonáva analýzou 5-nekódujúcej oblasti RNA. Výsledky testu sa však medzi rôznymi genotypmi BFG líšia.

Na ruskom trhu sa objavili biologické mikročipy, ktoré umožňujú genotypizáciu BFG a určujú účinný antivírusový režim; terapiu. Tento biočip je oligonukleotidový čip na genotypizáciu BFG na základe analýzy oblasti NS5B. Získané výsledky naznačujú schopnosť biočipu identifikovať všetkých 6 genotypov a 36 podtypov HCV, vrátane najvirulentnejších a voči liekom rezistentných foriem.

Na jednej strane sú metódy PCR analýzy ultrasenzitívne a umožňujú detekciu a amplifikáciu signálu len z jednej molekuly RNA vo vzorke, no na druhej strane sa tieto metódy vyznačujú falošne pozitívnymi výsledkami v dôsledku náhodnej kontaminácie vzoriek, falošnými negatívne výsledky v dôsledku vysokej mutability vírusu a relatívne vysokých nákladov na analýzu. Dokonca aj u tej istej osoby sa hladina HCV RNA môže periodicky meniť viac ako niekoľkonásobne, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom v prípade nízkej? replikácie vírusu alebo ak vírus pretrváva v tkanivách bez toho, aby sa dostal do krvi. Výsledky kvantitatívneho stanovenia RIG a HCV v rôznych laboratóriách sa dostatočne nezhodujú.

Osobitný význam pre včasnú detekciu biomateriálu vírusovej hepatitídy C Bt majú HCV proteínové antigény, pretože sa objavujú1 v krvnom sére o niekoľko týždňov skôr, ešte pred rozvinutím plnohodnotnej imunitnej odpovede organizmu.

Povrchový antigén HCVcoreAg vírusu hepatitídy C je hlavným markerom infekcie vírusom hepatitídy C. Zisťuje sa 16 týždňov pred objavením sa protilátok v krvi v dôsledku imunitnej odpovede organizmu a pred vznikom klinických príznakov. sa zaznamenáva v akútnom aj chronickom štádiu ochorenia. Existuje len jeden zahraničný komerčný produkt (Ortho Clinical Diagnostics) na ELISA diagnostiku hepatitídy C počas akútnej fázy na základe detekcie HCVcoreAg.

Štrukturálny proteín HCVcoreAg pozostávajúci zo 121 aminokyselinových zvyškov sa nachádza na N-konci polypeptidu a vzniká pod vplyvom bunkových proteáz. Prvá proteolytická hydrolýza nastáva medzi zvyškami 191 a 192 (miesto C1) a vedie k tvorbe glykoproteínu E1. Druhé miesto štiepenia (C2) sa nachádza medzi aminokyselinami 174 a 191. Zodpovedajúce produkty štiepenia sa nazývajú p21 a p23. Analýza expresie v mnohých cicavčích bunkách ukázala, že p21 je hlavným produktom a p23 sa nachádza v malých množstvách. Je možné, že štiepenie v miestach C1 a C2 sú vzájomne prepojené procesy, pretože p21 sa tvorí v podmienkach, keď nie je pozorovaná hydrolýza na G2 [G45]. HCVcoreAg je jadrový proteín viažuci RNA, ktorý podľa všetkého tvorí vírusový nukleokapsid. Biochemické vlastnosti tohto proteínu sú stále nedostatočne charakterizované. Štúdie AFM vírusových častíc hepatitídy C umožnili získať obraz HCV kapsidy.

AFM čipy

V experimentálnej časti práce boli použité dva typy AFM čipov. Pomocou prvého typu bola uskutočnená MS identifikácia modelových proteínov na povrchu AFM čipov. Tieto čipy boli substráty s funkčne aktívnymi chemickými skupinami (ďalej len AFM čipy s chemicky aktivovaným povrchom), na ktorých boli sledované molekuly zachytené a nevratne imobilizované prostredníctvom kovalentných väzieb, takzvaný „chemický phishing“. Druhý typ AFM čipov bol použitý na MS identifikáciu proteínov na ich povrchu, biošpecificky zachytených z roztoku analytu. Biologické sondy boli predtým imobilizované na povrchu týchto čipov v pracovných oblastiach. Ako biologické sondy boli použité monoklonálne protilátky proti markerovým proteínom vírusovej hepatitídy B a C (BFB a BFC) alebo aptaméry proti proteínu gpl20 a trombínu. Pre postup biošpecifického phishingu sa inkubovali čipy s kovalentne imobilizovanými molekulami sondy. v % roztoku analytu obsahujúceho iba detegovaný proteín alebo vzorky krvného séra

Na splnenie úlohy MS identifikácie modelových proteínov kovalentne imobilizovaných na povrchu AFM čipov prvého typu boli v práci použité: avidín (Agilent, USA), HSA (Agilent, USA), P450 VMZ (láskavo poskytnuté od profesora A.V. Munra, University of Manchester, Spojené kráľovstvo), trombín (Sigma, USA), a-FP a anti-a-FP (USBio, USA); Na splnenie úlohy MS identifikácie proteínov na povrchu AFM čipov druhého typu, biošpecificky zachytených z roztoku analytu, boli ako molekuly sondy použité monoklonálne protilátky (MAbs): anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (Výskumný ústav molekulárnej diagnostiky, Moskva), anti-HBsAg (Aldevron, USA), ako cieľové molekuly: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, USA) a HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (Sigma, USA), troponín (USBio, USA).

Okrem toho boli v práci použité tieto látky: acetonitril, izopropanol, kyselina mravčia, destilovaná voda (Merck, USA), kyselina trifluóroctová (TFA), hydrogénuhličitan amónny (Sigma, USA), kyselina α-kyano-4-hydroxyškoricová ( HCCA), kyselina dihydroxybenzoová (DHB) (Bruker Daltonics, Nemecko), trypsín (Promega, USA).

Vzorky krvného séra na výskum AFM poskytli Oddelenie infekčných chorôb u detí Ruskej štátnej lekárskej univerzity, Ústredný výskumný ústav epidemiológie Rospotrebnadzor, Výskumný ústav epidemiológie Gabrichevského v Moskve: Prítomnosť častíc vírusu hepatitídy C (HCV). vo vzorkách krvného séra bola potvrdená pomocou metódy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s použitím testovacieho systému "Amplisense HCV Monitor" (Ústredný výskumný ústav epidemiológie, Ministerstvo zdravotníctva Ruskej federácie, Moskva).

AFM analýza bola vykonaná v Laboratóriu nanobiotechnológie Inštitútu biomedicínskej chémie Ruskej akadémie lekárskych vied. Počítanie proteínov a komplexov antigén/protilátka na povrchu čipu AFM sa uskutočnilo na základe korelácie výšok zodpovedajúcich obrazov proteínov a ich komplexov meraných pomocou AFM podľa metódy opísanej v. Bol použitý ACM NTEGRA (NT-MDT, Rusko). Merania AFM sa uskutočňovali v polokontaktnom režime. Ako sondy boli použité konzoly zo série NT-MDT NSG10. Typický polomer zakrivenia ihiel bol 10 nm, rezonančná frekvencia sa pohybovala od 190 do 325 kHz. Skenovacia plocha čipu bola 400 μm2. Každé meranie sa uskutočnilo najmenej 3 krát.

Imobilizácia proteínov a aptamérov na povrchu AFM čipu sa uskutočnila podľa nasledujúceho postupu.

K proteínovému roztoku (0,1 mM) s objemom 2 μl sa pridalo 8 μl roztoku zmesi NHS/EDC (v/v=l/l) a dôkladne sa premiešalo. Výsledná zmes sa naniesla na povrch silanizovaného čipu a inkubovala sa 2 minúty pri teplote miestnosti. Čip sa potom dvakrát premyl v tepelnej trepačke s 1 ml deionizovanej vody pri 800 otáčkach za minútu a 37 °C. Kvalita imobilizácie proteínu na povrchu čipu AFM bola kontrolovaná mikroskopiou atómovej sily.

Imobilizácia aptamérov na chemicky aktivovaný povrch AEM čipu sa uskutočnila nasledovne. K zásobnému roztoku DSP s koncentráciou 1,2 mM v DMSO/etanol (v/v=l/l)4 sa tiež pridal roztok PBS pufra 50 mM (pH 7,4) v objemovom pomere 1/1. . Takto získaný pracovný roztok sa naniesol na povrch AFM čipu a inkuboval sa 10 minút. Potom sa uskutočnilo premývanie 50 % roztokom etanolu vo vode s objemom 1 ml pri 15 °C počas 10 minút. Roztok aptaméru s koncentráciou 3 JIM sa aplikoval na aktivovanú zónu AFM čipu a inkuboval sa 4 minúty za miešania pri rýchlosti 800 ot./min. Blokovanie nezreagovaných aminoskupín DSP sieťovacieho činidla sa uskutočňovalo v prítomnosti 5 mM roztoku Tris-HCl počas 10 minút pri 37 °C. Konečný stupeň premývania sa uskutočnil dvakrát vodným roztokom 1 ml počas 10 minút pri 25C.

Trypsinolytická zmes obsahujúca tlmivý roztok 150 mM NH4HC03, acetonitril, 0,5 M guanidín hydrochlorid a glycerol (pH 7,4) sa naniesla na povrch AFM čipu s imobilizovanými molekulami sondy. Potom sa do tlmivého roztoku pridalo 0,5 μl roztoku modifikovaného prasačieho trypsínu s koncentráciou 0,1 μM. AFM čip sa inkuboval vo vlhkom prostredí 2 hodiny pri konštantnej teplote 45C, na jeho povrch sa opäť pridalo 0,5 μl roztoku trypsínu (0,1 μM) a inkubácia pokračovala ďalších 12 hodín. Trypsinolytická zmes bola zmytá z povrchu AFM čipu pomocou 10 ul elučného roztoku obsahujúceho 70 % acetonitrilu v 0,7 % kyseline trifluóroctovej (TFA). Takto získaný hydrolyzát z povrchu čipu AFM sa vysušil vo vákuovej odparke pri 45 °C a 4200 ot./min. Ďalej sa zmes peptidov rozpustila v 10 ul 5 % roztoku kyseliny mravčej alebo v 10 ul 0,7 % roztoku TFA na následnú MS analýzu.

Pri vykonávaní MS analýzy s typom ionizácie MALDI boli vzorky pripravené nasledovne. Vzorky rozpustené v 0,7 % roztoku TFA v objeme 10 μl boli zahustené a odsolené pomocou mikrošpičiek ZipTip C18 (Millipore, USA) v súlade s protokolom výrobcu a zmiešané s nasýteným roztokom matrice s obsahom HCCA alebo DHB v 50 % acetonitrile s 0 0,7 % TFU. Výsledná zmes sa aplikovala na MALDI cieľ veľkosti MTP.

- identifikácia proteínov zachytených pomocou „chemického phishingu“ na povrchu čipu AFM z roztoku analytu

V tomto štádiu experimentálnej práce boli získané MS spektrá pre modelové proteíny chemicky imobilizované na povrchu AFM čipov z roztoku analytu. Rozsah koncentrácie študovaných proteínov v roztoku analytu pre avidín, HSA, anti-aFP bol 10"-10"9 M, troponín, aFP a P450 VMZ - 10"6-10"8 M.

MS analýza bola vykonaná pre 6 typov proteínov, odlišných pôvodom, molekulovou hmotnosťou, počtom miest trypsinolýzy a ich priestorovou dostupnosťou, stupňom hydrofóbnosti sekvencie aminokyselín (pomer hydrofóbnych a hydrofilných aminokyselín), ktoré boli kovalentne imobilizované na povrchu čipu AFM z roztoku analytu (tabuľka 1). V týchto experimentoch boli použité čipy AFM, ktoré obsahovali pracovné a kontrolné zóny. Pracovná zóna bola chemicky aktivovaná oblasť povrchu čipu AFM, na ktorej dochádzalo k „chemickému phishingu“ modelových proteínov; kontrolná zóna bola chemicky neaktívna oblasť povrchu čipu. Počty vizualizovaných zachytených molekúl sa zaznamenali pomocou AFM. Experimentálne údaje AFM analýzy získané pre vyššie uvedené modelové proteíny, konkrétne počet molekúl zachytených na povrchu pracovnej plochy AFM čipu, sú uvedené v tabuľke 2. Stĺpec „koncentrácia proteínových molekúl v roztoku Tabuľka 2 ukazuje údaje pre minimálnu zaznamenanú koncentráciu zodpovedajúceho proteínu v roztoku analytu.

Ako je možné vidieť z tabuľky 2, počet molekúl registrovaných v pracovnej oblasti čipu AFM pre všetky prezentované proteíny bol -1040 molekúl. Hranica citlivosti MS detektorov je asi 105 molekúl. Pre prezentované modelové proteíny sa teda uskutočnila úspešná ireverzibilná imobilizácia na povrchu AFM čipu a počet AFM-registrovaných proteínových objektov bol dostatočný na následnú MS identifikáciu. Zároveň bola minimálna zaznamenaná koncentrácia modelových proteínov v inkubačnom roztoku pomerne nízka, 10" -10" M.

Hmotnostná spektrometrická analýza vzoriek bola uskutočnená s použitím typov ionizácie MALDI a ESI. AFM čip po inkubácii vo vhodnom roztoku avidínu s koncentráciou 10"9 M. Analýza týchto spektier umožnila spoľahlivo identifikovať avidín (Gallus Gallus) podľa jeho dvoch proteotypických peptidov: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) a VGINIFTR ( m/z = 460,4). Oba peptidy mali dobre definované píky svojich dvojnásobne nabitých iónov (MS spektrá s použitím AFM-MS analýzy chemicky aktivovanej pracovnej oblasti AFM čipu po inkubácii v roztoku proteínu analytu). s koncentráciou 10"8 M bol identifikovaný ďalší malý proteín - troponín I. MS a MS/MS spektrá zodpovedajúce peptidu s dvojitým nábojom 1449 Da sú uvedené na obrázku 3. MS analýza experimentálne získaných spektier umožnila na spoľahlivú detekciu a identifikáciu ľudského troponínu (gi 2460249) na povrchu AFM čipu s pravdepodobnosťou vyššou ako 95 %.

Obrázok 5 ukazuje tandemové fragmentačné spektrá globulárneho proteínu - ľudský sérový albumín (HSA), ktorý vykonáva transportné funkcie v krvnej plazme. Spektrá boli získané z chemicky aktivovanej pracovnej oblasti AFM čipu po inkubácii vo vhodnom roztoku albumínu s koncentráciou 10"9 M. Analýza týchto spektier umožnila spoľahlivo identifikovať ľudský albumín podľa jeho dvoch proteotypických peptidov: VPQVSTPTLVEVSR (m/z = 756,5) a YLYEIAR (m/z = 464,3) Oba peptidy mali dobre definované píky svojich dvojnásobne nabitých iónov (MS spektrá).

MS/MS spektrá trypsinizovaných predmetov z chemicky aktivovaného povrchu AFM čipu inkubovaného v roztoku ľudského sérového albumínu (C = 109 M). Peptid VPQVSTPTLVEVSR s m/z = 756,5 (A), peptid YLYEIAR s m/z = 464,3 (B). Experimentálne podmienky: merania sa uskutočňovali na hmotnostnom spektrometri LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent).

Analýza MS teda umožnila identifikáciu proteínov detegovaných pomocou AFM. Na základe získaných údajov bol identifikovaný vzťah medzi počtom identifikovaných proteotypických peptidov na povrchu AFM čipu a obsahom požadovaného proteínu v roztoku analytu. Táto závislosť, napríklad pre proteíny P450 BMZ a HSA, kovalentne imobilizované na chemicky aktivovanom povrchu čipu AFM, je znázornená na obrázku 6. Ako je možné vidieť na obrázku 6, čím vyššia je koncentrácia proteínu v roztoku analytu ( -KG6 M), tým väčší počet peptidov je možné spoľahlivo identifikovať v prípade MALDI-MS aj ESI-MS analýzy. Medzi analyzovanými proteínmi v roztoku analytu neboli žiadne významné rozdiely medzi počtom identifikovaných peptidov v koncentračnom rozsahu 10"6-10"9M.

Závislosť počtu identifikovaných peptidov molekúl analytu od koncentrácie proteínu v inkubačnom roztoku. (A) - analýza zmesi peptidov modelových proteínov HSA, VMS na hmotnostných spektrometroch s ionizáciou typu MALDI Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Nemecko) a Autoflex III (Bruker Daltonics, Nemecko); (B) - analýza zmesi peptidov modelových proteínov HSA, VMS na hmotnostnom spektrometri s ionizáciou typu ESI LC/MSD Trap XST Ultra (Agilent, USA).

Získané výsledky nám umožnili dospieť k záveru, že AFM-MS (MALDI a ESI) umožňuje detegovať a identifikovať proteínové molekuly, ktoré sa líšia svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami, kovalentne zachytené z roztoku analytu na povrchu čipu AFM.

Zároveň v kontrolnej zóne čipu AFM (neaktivovaného) po jeho inkubácii v roztoku analytu metóda AFM nezistila prítomnosť predmetov na povrchu čipu zodpovedajúcich výške proteínovým molekulám. MS analýza tiež neodhalila objekty proteínovej povahy. Experimentálne sa teda dokázalo, že AFM adekvátne registruje požadované objekty – proteínové molekuly analytu.

Ďalšou etapou tejto práce bol vývoj kombinovanej schémy AFM-MS na identifikáciu proteínov zachytených z roztoku. zohľadnenie biošpecifických interakcií.

Schéma na vykonanie hmotnostnej spektrometrickej analýzy v prípade biošpecifického AFM lovu proteínov z roztoku je znázornená na obrázku 7. Podľa danej schémy boli molekuly sondy najskôr imobilizované na povrchu pracovnej plochy čipov AFM, ktoré boli monoklonálne1 protilátky proti proteínovým markerom vírusovej hepatitídy B a C alebo aptaméry proti HIV-1 glykoproteínu gpl20 a trombínu, pričom povrch kontrolnej zóny neobsahoval imobilizované molekuly sondy. Kontrola kvality imobilizácie molekúl sondy sa uskutočnila pomocou vizualizácie AGM. Potom sa takýto čip inkuboval v roztoku analytu obsahujúcom skúmaný proteín. Po fáze premytia z nešpecificky adsorbovaných molekúl na povrchu čipu a fáze prípravy vzorky na následnú hmotnostnú spektrometrickú analýzu sa na povrchu čipu AFM uskutočnila MS analýza AFM-zaznamenaných proteínov.

Experimentálna časť tejto časti zahŕňala dve fázy analýzy. V prvej fáze bolo potrebné vykonať MS identifikáciu molekúl proteínovej sondy kovalentne imobilizovaných na AFM čipe, v druhej fáze boli cieľové proteíny zachytené na zodpovedajúcich partnerských molekulách z roztoku alebo zo vzoriek krvného séra v dôsledku biošpecifických interakcií. Na tento účel sa uskutočnila MS analýza mAb proti HCV a HBV markerovým proteínom, anti-HCVcore a anti-HBVcore, kovalentne imobilizovaným na povrchu AFM čipov. Pre MAbs proti anti-HCV jadrovým a anti-HBV jadrovým proteínom boli po prvýkrát v tejto práci získané spektrá tandemovej fragmentácie a spektrá peptidovej mapy.

2 PREHĽAD LITERATÚRY.

2.1 Hmotnostná spektrometria v proteomike.

2.1.1 Všeobecné zásady.

2.1.2 Proteomická analýza pomocou hmotnostnej spektrometrie.

2.1.3 Identifikácia proteínov metódou peptidovej hmotnosti.

2.1.4 Identifikácia proteínov metódou odtlačkov prstov fragmentácie peptidov.

2.2 Interpretácia výsledkov hmotnostnej spektrometrickej identifikácie proteínov.

2.2.1 Stanovenie zoznamu identifikovaných proteínov.

2.2.2 Identifikácia vysoko homológnych proteínov.

2.2.3 Databázy aminokyselinových sekvencií proteínov.

2.3 Hmotnostná spektrometrická analýza produktov jedného génu.

2.3.1 Proteotypizácia a populačná proteomika.

2.3.2 Identifikácia mikroheterogenity proteínov metódou „zhora nadol“.

2.3.3 Identifikácia geneticky podmieneného proteínového polymorfizmu metódou „zdola nahor“.

2.3.4 Databázy proteínových a génových polymorfizmov.

2.3.5 Úložisko údajov hmotnostnej spektrometrie.

3 MATERIÁLY A METÓDY.

3.1 Materiály.

3.1.1 Hmotnostné spektrometrické údaje pre proteíny mikrozomálnej frakcie ľudskej pečene.

3.1.2 Kontrolný súbor hmotnostných spektier „Aurum Dataset“.

3.1.3 Hmotnostné spektrometrické údaje z proteomického úložiska PRIDE.

3.1.4 Databázy aminokyselinových sekvencií ľudských proteínov.

3.1.5 Údaje o možných polymorfizmoch ľudských proteínov.

3.2 Metódy.

3.2.1 Webový server na identifikáciu proteínov pomocou hmotnostných spektier.

3.2.2 Dávkové spracovanie hmotnostných spektier pomocou metódy peptidového hmotnostného odtlačku.

3.2.3 Dávkové spracovanie tandemových hmotnostných spektier.

3.2.4 Jednorozmerné proteomické mapovanie.

3.2.5 Softvérová implementácia iteračného algoritmu na identifikáciu PDA.

3.2.6 Validácia identifikačného algoritmu OAP.

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA.

4.1 Zvýšenie stupňa pokrytia aminokyselinových sekvencií identifikovanými peptidmi.

4.1.1 Identifikácia proteínov v gélových rezoch.

4.1.2 Jednorozmerné proteomické mapy a ich vlastnosti.

4.1.3 Identifikácia vysoko homológnych proteínov nadrodiny cytochrómu P450 zvýšením stupňa pokrytia aminokyselinových sekvencií identifikovanými peptidmi.

4.2 Identifikácia PDA v proteínoch nadrodiny cytochrómu P450.

4.3 Algoritmus identifikácie PDA.

4.3.1 Iteratívna schéma spracovania tandemových hmotnostných spektier.

4.3.2 Citlivosť a špecifickosť identifikačného algoritmu PDA.

4.4 Aplikácia iteračného algoritmu na identifikáciu PDA v hmotnostných spektrometrických údajoch z proteomického úložiska PRIDE.

4.4.1 Počiatočné údaje používané na identifikáciu PDA.

4.4.2 Identifikácia peptidov a proteínov pomocou údajov hmotnostnej spektrometrie stiahnutých z úložiska PRIDE.

4.4.3 Identifikácia polymorfizmov jednej aminokyseliny.

4.5 Analýza identifikovaných PDA.

4.5.1 Analýza peptidov obsahujúcich OAP.

4.5.2 Vzťah identifikovaných PDA s ľudskými chorobami.

Odporúčaný zoznam dizertačných prác

• Posttranslačná regulácia cytochrómov P450 podrodiny 2B 2013, doktor biologických vied Zgoda, Viktor Gavrilovič

• Hmotnostné spektrometrické stanovenie aktivity a obsahu cytochrómov P450 2013, kandidátka biologických vied Moskaleva, Natalya Evgenievna

• Štrukturálne a funkčné mapovanie proteínov monooxygenázových systémov obsahujúcich cytochróm P450 2002, doktorka biologických vied Kolesanova, Jekaterina Fedorovna

• Spôsob rozpoznávania aminokyselinových sekvencií v peptidových hmotnostných spektrách pre proteomické problémy 2007, kandidát technických vied Lyutvinsky, Yaroslav Igorevich

• Univerzálna škála chromatografických retenčných časov biomakromolekúl v problémoch „rýchlopožiarnej“ proteomiky 2011, kandidát fyzikálnych a matematických vied Pridatchenko, Marina Leonidovna

Úvod dizertačnej práce (časť abstraktu) na tému „Analýza hmotnostných spektier peptidových fragmentov na identifikáciu geneticky podmieneného polymorfizmu proteínov“

Databáza Ensembl obsahuje informácie o 20 469 kódujúcich génoch odvodených zo zostavy ľudského genómu vykonanej v americkom Národnom centre pre biotechnologické informácie (február 2009). Malý počet génov nám umožňuje dospieť k záveru, že komplexnosť živých systémov sa dosahuje na úrovni regulácie transkripcie, translácie a posttranslačných modifikácií. Alternatívny zostrih a modifikácie ako fosforylácia, glykozylácia spolu s proteolytickým spracovaním vedú k tvorbe rôznych proteínov, ktorých počet o niekoľko rádov prevyšuje počet génov. Odhady uskutočnené rôznymi metódami ukazujú, že ľudský proteóm môže pozostávať z niekoľkých miliónov proteínov, ktoré sa líšia svojou chemickou štruktúrou.

Tradičný prístup k výskumu proteómov je založený na použití imunohistochemického farbenia tkanivových rezov. Prvá verzia ľudského proteomického atlasu bola vytvorená pomocou protilátok. Použitie biologických mikročipov obsahujúcich na nich nanesené protilátky umožňuje identifikovať a kvantifikovať až niekoľko stoviek proteínov v jednej vzorke. Tento prístup má však obmedzenia, ktoré sú spojené s potrebou vyvinúť a overiť protilátky, nedostatočnou špecifickosťou v dôsledku krížových interakcií a relatívne nízkou afinitou komplexov antigén-protilátka. V tomto ohľade získala pre výskum proteómov osobitný význam univerzálnejšia metóda identifikácie proteínov, biologická hmotnostná spektrometria, ktorá nevyžaduje imunošpecifické činidlá.

Pri hmotnostnej spektrometrickej analýze biomateriálu sa identifikácia proteínových molekúl vykonáva porovnaním nameraných hmotnostných nábojových charakteristík proteínov a/alebo ich proteolytických fragmentov s teoretickými hodnotami vypočítanými na základe aminokyselinových sekvencií kódovaných v genóme. Musí sa vziať do úvahy, že sekvencia genómu explicitne neobsahuje informácie o alternatívnych miestach zostrihu a možných posttranslačných modifikáciách. Identifikácia prípadov alternatívneho zostrihu je možná na základe experimentálnych údajov: zdrojom informácií o izoformách zostrihu sú databázy kódujúce DNA. Identifikácia posttranslačných modifikácií sa uskutočňuje pomocou vysoko presnej hmotnostnej spektrometrie proteínov alebo pomocou tandemovej hmotnostnej spektrometrie peptidových fragmentov

Spolu s alternatívnym zostrihom a posttranslačnou modifikáciou sa zvyšuje diverzita proteínových molekúl v dôsledku translácie nesynonymného jednonukleotidového polymorfizmu (nsSNP). Stanovenie prítomnosti nsSNP sa vykonáva pomocou genotypizácie, zatiaľ čo potvrdenie prítomnosti zodpovedajúcej substitúcie zvyšku v primárnej štruktúre proteínu, to znamená identifikácia polymorfizmov jednej aminokyseliny (SAP, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), je úlohou proteotypovania. .

Význam identifikácie a štúdia alternatívneho zostrihu, PDA a posttranslačných modifikácií na úrovni proteínov je spôsobený vplyvom týchto procesov na úroveň expresie a funkčné vlastnosti proteínov. Je známe, že zmeny v aktivite alebo úrovni expresie proteínov môžu viesť k vzniku a rozvoju spoločensky významných ochorení, vrátane rakoviny, kardiovaskulárnych a neurodegeneratívnych ochorení.

V genóme bola zistená prítomnosť asi 65 tisíc nesynonymných polymorfizmov, pravdepodobne preložených do PDA, pričom viac ako 30 % pravdepodobne vedie k zmenám funkčných vlastností proteínov. Pretože zmeny v aktivite proteínov sú spojené s rozvojom chorôb, štúdie PDA sú nevyhnutné na určenie štrukturálnych príčin, ktoré sú základom pozorovaných funkčných porúch. Medzi úlohy proteotypizácie patrí kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie expresie alelických variantov génov na proteomickej úrovni, ako aj sledovanie frekvencie výskytu exprimovaných alelických variantov proteínov na úrovni populácie.

Identifikácia PDA vo vysokovýkonnom režime pomocou hmotnostnej spektrometrie je spojená s technickými obmedzeniami. Pre úlohu proteotypizácie je najvhodnejší prístup „zhora nadol“, teda hmotnostná spektrometria intaktných proteínov (a nie ich fragmentov). Citlivosť tohto prístupu je však nízka, na úrovni 10 h-10 5 M. Vďaka tomu je zabezpečená identifikácia desiatok, menej často stoviek a len vo výnimočných prípadoch až tisícok proteínov. V biologickej hmotnostnej spektrometrii sa najčastejšie používa iný prístup – „zdola nahor“, pri ktorom sa prítomnosť proteínu vo vzorke zisťuje identifikáciou jeho proteolytických fragmentov (peptidov). Vo väčšine prípadov na identifikáciu proteínu stačí malý počet peptidov, ktoré spolu nemôžu tvoriť viac ako 5 % biopolymérnej sekvencie. Pre zostávajúcu časť aminokyselinovej sekvencie proteínu nie je možné určiť prítomnosť/neprítomnosť chemických modifikácií aminokyselinových zvyškov alebo polymorfizmov aminokyselín.

Na identifikáciu jednoaminokyselinových polymorfizmov ľudských proteínov pomocou biologickej hmotnostnej spektrometrie je potrebné zvýšiť stupeň pokrytia aminokyselinovej sekvencie proteínu identifikáciou ďalších proteolytických peptidov proteínu. To je možné vykonaním experimentu s veľkým počtom čiastočne alebo úplne replikovaných hmotnostných spektrometrických analýz. Údaje z proteomických experimentov vykonaných viacerými výskumnými skupinami možno navyše spojiť do jednej štúdie. Prístup k rozsiahlej zbierke hmotnostných spektier poskytujú rôzne proteomické úložiská, z ktorých najpopulárnejšie PRIDE (Protein Identification Database) uchováva výsledky viac ako 13 tisíc proteomických experimentov. Čím vyšší je stupeň pokrytia aminokyselinovej sekvencie proteínu identifikovanými peptidmi, tým väčšia je pravdepodobnosť potvrdenia prítomnosti alebo neprítomnosti jednotlivých aminokyselinových substitúcií v proteínovej štruktúre.

Vzhľadom na dostupnosť obrovského množstva hmotnostných spektrometrických údajov je riešenie problému proteotypizácie možné pomocou výpočtových metód bioinformatiky. Napríklad analýza údajov hmotnostnej spektrometrie sa môže uskutočniť pomocou databáz exprimovaných fragmentov (EST), ktoré obsahujú informácie o preložených variantoch nesynonymných génových polymorfizmov. Druhou metódou, implementovanou v mnohých programoch identifikácie proteínov, je porovnanie hmotnostných spektier s databázou teoretických proteínových sekvencií, umožňujúce nepresnosti vo forme substitúcií aminokyselinových zvyškov.

Nevýhody vyššie uvedených prístupov sú dobre známe. Databázy vyjadrených fragmentov obsahujú redundantné informácie, vrátane chýb sekvenovania, čo komplikuje analýzu výsledkov hmotnostnej spektrometrie. Pri analýze vzorky, v ktorej bolo identifikovaných niekoľko stoviek proteínov, je potrebné výsledné hmotnostné spektrá porovnať so stovkami tisíc transkriptov nahromadených za desaťročia, ktoré obsahujú viac ako 5 % chýb. Pri analýze hmotnostných spektier s predpokladom možných nepresností v databáze sa ignorujú informácie o skutočne existujúcich nesynonymných substitúciách, ktoré boli zistené genotypizáciou. Umelé predpoklady zavedené do databázy alebo algoritmu identifikácie proteínov znižujú spoľahlivosť výsledkov. Tieto nedostatky existujúcich metód proteotypizácie si vyžadujú zlepšenie výpočtových prístupov k identifikácii PDA.

Cieľom práce bolo vyvinúť metódu na analýzu hmotnostných spektrometrických údajov na identifikáciu polymorfizmov jednotlivých aminokyselín, ktoré sú výsledkom translácie nesynonymných nukleotidových substitúcií v zodpovedajúcich génoch, a použiť vyvinutú metódu na identifikáciu substitúcií aminokyselín v ľudských proteínoch. Na dosiahnutie cieľa boli vyriešené tieto úlohy:

1. Spracujte hmotnostné spektrá peptidových fragmentov, aby ste zvýšili stupeň pokrytia aminokyselinových sekvencií proteínov identifikovanými peptidmi.

2. Použitím modelovej sady hmotnostných spektrometrických údajov, ktoré poskytujú vysoký stupeň pokrytia sekvencií, vyvinúť metódu identifikácie jednoaminokyselinových substitúcií v ľudských proteínoch.

3. Zhrnúť metódu identifikácie jednoaminokyselinových substitúcií vo forme univerzálneho algoritmu na spracovanie tandemových hmotnostných spektier; vyhodnotiť citlivosť a špecifickosť vytvoreného algoritmu.

4. Použite vytvorený algoritmus na spracovanie úložiska hmotnostných spektrometrických údajov, identifikáciu jednoaminokyselinových polymorfizmov a charakterizovanie ľudských proteínov obsahujúcich identifikované polymorfizmy.

2 PREHĽAD LITERATÚRY

Termín „proteóm“ – kompletný súbor proteínov exprimovaných v tele – prvýkrát navrhol Mark Wilkins v súvislosti so vznikajúcou potrebou doplniť poznatky o genómoch relevantnými informáciami o proteínoch, ktoré sú v nich kódované. Predmetom štúdia pri analýze proteómu môže byť buď celý organizmus, alebo bunková zložka, tkanivo, subcelulárna štruktúra, napríklad jadro, mikrozomálna frakcia atď.

Výsledky rozsiahlej inventarizácie proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie boli publikované v práci Shevchenka et al v roku 1996. Nástup biologickej hmotnostnej spektrometrie znamenal nástup éry vysokovýkonných postgenomických technológií, ktoré umožňujú získať informácie o génoch a proteínoch v rozsahu celého organizmu ako výsledok jediného experimentu. Postgenomické technológie okrem proteomiky zahŕňajú aj genomiku a transkriptomiku. Pri analýze genetického materiálu umožňujú postgenomické technológie určiť prítomnosť génového polymorfizmu pomocou celogenómového opätovného sekvenovania alebo vysokohustotného mapovania jednonukleotidových substitúcií (SNP).

Existujúce prístupy k štúdiu diverzity proteínov možno rozdeliť do dvoch smerov. V prvom prípade je pred nastavením experimentu vopred určené, ktoré proteínové molekuly sa plánujú identifikovať. V tomto prístupe sa identifikácia proteínov uskutočňuje pomocou protilátok, ktoré sa používajú na histochemické farbenie tkanivových rezov, po ktorom nasleduje získanie mikrografií buniek. Na mikrofotografii rezu zodpovedajú fluorescenčné oblasti lokalizačným miestam detegovaného antigénneho proteínu a intenzita fluorescencie umožňuje získať kvantitatívne hodnotenie obsahu tohto proteínu.

V rámci veľkého medzinárodného projektu ProteinAtlas sa vo veľkom realizuje produkcia protilátok proti proteínom všetkých ľudských génov. Tento projekt vytvoril a sprístupnil verejnosti viac ako 400 000 mikrofotografií imunohistochemicky zafarbených rezov prakticky všetkých ľudských tkanív. Porovnávacia analýza distribúcie špecifického farbenia proteínov umožnila najmä identifikovať charakteristické profily expresie proteínov pre rakovinové tkanivá. Farbenie tkanivových rezov pomocou fluorescenčne značených protilátok je však dosť hrubým spôsobom štúdia proteómu. Po prvé, ako upozorňujú samotní vývojári projektu ProteinAtlas, kvalita mnohých komerčne dostupných protilátok je extrémne nízka. Pri overení približne polovica zakúpených protilátok vykazuje nízku špecificitu pre skúmaný antigén a protilátkové prípravky sa často vyznačujú nízkou čistotou. Po druhé, veľký počet komplexov antigén-protilátka sa vyznačuje disociačnou konštantou (107-108 M), ktorá obmedzuje citlivosť pri meraní koncentrácií proteínov.

Okrem histochemickej analýzy sa výskum proteómov vykonáva pomocou biologických mikročipov. Proteínové mikročipy sú výkonným nástrojom pre translačnú medicínu, ale ich schopnosť použitia na rozsiahly výskum proteómov je obmedzená. Použitie mikročipových technológií v proteomike zriedkavo umožňuje identifikovať viac ako desať proteínov naraz: so zvyšujúcim sa počtom analyzovaných proteínov je štandardizácia podmienok interakcie antigén-protilátka ťažká. Použitie mikročipov teda vedie k falošne negatívnym výsledkom v prípade, keď rozdiely v disociačných konštantách pre komplexy antigén-protilátka sú niekoľko rádov. Okrem toho stabilita protilátok veľmi závisí od podmienok ich skladovania, takže použitie proteínových mikročipov je obmedzené na čas bezprostredne po ich výrobe, čo neumožňuje rozšírenie tohto typu analýzy.

Druhý smer výskumu proteómov je spojený s nastavením experimentu v takzvanom „panoramatickom“ (prieskumnom) režime, kedy nie je vopred známe, ktoré proteíny je možné identifikovať. V dôsledku panoramatického experimentu možno potenciálne identifikovať akékoľvek proteíny kódované v genóme skúmaného organizmu, vrátane produktov z oblastí genómu, ktoré sa považujú za nekódujúce. Technické a metodologické nástroje pre celogenómový výskum proteómov poskytuje biologická hmotnostná spektrometria.

Podobné dizertačné práce v odbore "Matematická biológia, bioinformatika", 01.03.09 kód VAK

• Transkriptomicko-proteomický prístup na analýzu proteoforiem bunkovej línie HepG2 2018, kandidátka biologických vied Kiseleva, Olga Igorevna

• Transkriptóm a proteóm chromozómu 18: extrapolácia výsledkov analýzy na ľudské genómy a modelové objekty 2017, doktor biologických vied Ponomarenko, Elena Aleksandrovna

• Posúdenie plasticity proteómu krvnej plazmy zdravého človeka v extrémnych životných podmienkach 2011, kandidátka biologických vied Trifonova, Oksana Petrovna

• Vyhľadávanie a identifikácia potenciálnych biomarkerov rakoviny vaječníkov v ľudskom sére 2015, kandidát biologických vied Arapidi, Georgy Pavlovič

• Analýza fotodynamiky proteínových komplexov tylakoidných membrán pomocou hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením 2011, kandidát chemických vied Galetsky, Dmitrij Nikolajevič

Záver dizertačnej práce na tému „Matematická biológia, bioinformatika“, Černobrovkin, Alexej Leonidovič

1. Uskutočnilo sa proteomické mapovanie hmotnostných spektrometrických dát, vrátane identifikácie proteínov pomocou metódy peptidového hmotnostného odtlačku, s následnou analýzou zameranou na identifikáciu proteínovo špecifických proteotypových peptidov. Na príklade proteínov nadrodiny cytochrómu P450 sa ukázalo, že mapovaním zón lokalizácie proteínov v géli sa stupeň pokrytia sekvencie identifikovanými peptidovými fragmentmi zvyšuje o 27 %.

2. Boli identifikované proteolytické peptidy špecifické pre formy cytochrómov P450 CYP3A4 a CYP3A5, ktorých sekvenčná identita je 82 %. Boli identifikované alelické varianty translácie cytochrómov CYP3A4 a CYP3A5 obsahujúce jednoaminokyselinové polymorfizmy M445N (ZA4), K96E (ZA4), L82R (ZA5) a D277E (ZA5).

3. Bol vyvinutý iteračný algoritmus na identifikáciu jednoaminokyselinových polymorfizmov proteínov pomocou tandemových hmotnostných spektier proteolytických peptidov. Pri testovaní na kontrolnom súbore Aurum Dataset algoritmus detekcie polymorfizmu ukázal špecifickosť viac ako 95 %. Citlivosť algoritmu bola 30 %, čo zodpovedá priemernému pokrytiu sekvencií zahrnutých v kontrolnom súbore.

4. Ako výsledok analýzy hmotnostných spektrometrických experimentov uložených v úložisku PRIDE bolo identifikovaných celkovo 270 jednoaminokyselinových polymorfizmov v 156 ľudských proteínoch, vrátane 51 PDA (45 proteínov) spojených s chorobami, vrátane porúch krvi koagulačný systém a systémová amyloidóza.

Zoznam odkazov na výskum dizertačnej práce Kandidát biologických vied Černobrovkin, Alexey Leonidovič, 2012

1. Archakov A.I. atď. Metóda na zvýšenie presnosti určenia sekvencie aminokyselinových zvyškov biopolyméru na základe údajov hmotnostnej spektrometrickej analýzy, počítačový systém //2010.

2. Archakov A.I. a kol., Cytochromes P450, drogová choroba a personalizovaná medicína. Časť 1 // Klinická medicína. 2008. T. 86. Číslo 2. S. 4-8.

3. Klyuev N.A., Brodsky E.S. Moderné metódy hmotnostnej spektrometrickej analýzy organických zlúčenín // Ros. chem. a. (J. Russian Chemical Society pomenovaná po D.I. Mendelejevovi). 2002. T. XLVI. č. 4. s. 57-63.

4. Fox A.B. et al. Jednorozmerné proteomické mapovanie ľudských pečeňových cytochrómov P450 // Biochémia. 2009. T. 74. Číslo 2. S. 153-161.

5. Myasoedova K.N. Novinka v štúdiu cytochrómov P450 // Biochémia. 2008. T. 73. Číslo 9. s. 1199-1205.

6. Petushkova N.A. et al. Identifikácia cytochrómov P450 mikrozómov ľudských pečeňových buniek pomocou hmotnostnej spektrometrie // Biomedicínska chémia. 2007. T. 53. Číslo 4. s. 400-11.

7. Ponomarenko E.A., Ilgisonis E.V., Lisitsa A.B. Technológie znalostí v proteomike // Bioorganická chémia. 2011. T. 37. Číslo 2. S. 190-198.

8. Ponomarenko E.A. a kol. Identifikácia odlišne exprimovaných proteínov pomocou automatickej metaanalýzy proteomických publikácií // Biomedicínska chémia. 2009. T. 3. Číslo 1. S. 10-16.

9. Savelyeva M. et al. Význam genetického polymorfizmu izoenzýmov cytochrómu P450 pre personalizovaný výber a dávkovacie režimy antidepresív a antipsychotík // Klinická medicína. 2008. T. 86. Číslo 11. S. 22-28.

10. Genecentrický projekt ľudského proteómu: HUPO ~ organizácia Human Proteome. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2010. T. 9. č. 2. P. 4279.

11. Aebersold R., Mann M. Proteomika založená na hmotnostnej spektrometrii. //Príroda. 2003. T. 422. Číslo 6928. S. 198-207.

12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Neobmedzená identifikácia modifikovaných proteínov pomocou MS/MS // Proteomika. 2010. T. 10. Číslo 4. S. 671-686.

13. Akiyama M. h «str. Ichthyosis bullosa of Siemens: jej správna diagnóza uľahčená molekulárne genetickým testovaním. // Britský dermatologický časopis. 2005. T. 152. Číslo 6. C. 1353-6.

14. Alves G. h jxp. Kalibrácia E-hodnôt pre metódy vyhľadávania v databáze MS2. // Biológia priamo. 2007. T. 2. Číslo 1. S. 26.

15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: webový server identifikácie peptidov založený na hmotnostnej spektrometrii s integráciou znalostí. // BMC genomika. 2008. T. 9. S. 505.

16. Archakov A. h zip. Biošpecifický ireverzibilný rybolov spojený s mikroskopiou atómovej sily na detekciu extrémne nízkych bielkovín. // Proteomika. 2009. T. 9. Číslo 5. S. 1326-43.

17. Archakov A. h ap. Génocentrický pohľad na projekt ľudského proteómu: príklad ruskej cestovnej mapy pre chromozóm 18. // Proteomika. 2011. T. 11. Číslo 10. S. 1853-6.

18. Archakov A.I. h zips. Rybárska nanotechnológia AFM je spôsob, ako zvrátiť číslo Avogadro v proteomike. // Proteomika. 2007. T. 7. Číslo 1. S. 4-9.

19. Archakov A.I., Bachmanová G.I. Cytochróm P-450 a aktívny kyslík. Londýn: Taylor & Francis, 1990.

20. Asara J.M. h ^p. Metóda kvantifikácie bez označenia pomocou MS/MS TIC v porovnaní so SILAC a spektrálnym počítaním na proteomickom skríningu. // Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 5. S. 994-9.

21. Bairoch A., Apweiler R. Databáza proteínových sekvencií SWISS-PROT a jej doplnok TrEMBL v roku 2000. // Výskum nukleových kyselín. 2000. T. 28. Číslo 1. S. 45-8.

22. Baldwin M. a. Identifikácia proteínov hmotnostnou spektrometriou: problémy, ktoré treba zvážiť. //Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2004. T. 3. Číslo 1. P. 1-9.

23. Bantscheff M. h ap. Kvantitatívna chemická proteomika odhaľuje mechanizmy účinku klinických inhibítorov ABL kinázy. // Prírodná biotechnológia. 2007a. T. 25. Číslo 9. S. 1035-44.

24. Bantscheff M. h,qp. Kvantitatívna hmotnostná spektrometria v proteomike: kritický prehľad. //Analytická a bioanalytická chémia. 2007b. T. 389. Číslo 4. S. 1017-31.

25. Barsnes H. h ap. PRIDE Converter: uľahčuje zdieľanie proteomických údajov. // Prírodná biotechnológia. 2009. T. 27. Číslo 7. S. 598-9.

26. Baumgardner L.A. h Rýchle paralelné tandemové vyhľadávanie hmotnostnej spektrálnej knižnice pomocou hardvérovej akcelerácie GPU. // Journal of proteom research. 2011. T. 10. Číslo 6. S. 2882-8.

27. Beck F. h ap. Dobré, zlé, škaredé: Overenie hmotnostnej spektrometrickej analýzy modifikovaných peptidov // PROTEOMIKA. 2011. C. n/a-n/a.

28. Bell A.W. h/jp. Proteínový mikroskop: začlenenie hmotnostnej spektrometrie do bunkovej biológie. //Prírodné metódy. 2007. T. 4. Číslo 10. S. 783-4.

29. Binz P.-A. h ,qp. Molekulárny skener na automatizáciu proteomického výskumu a zobrazovanie obrázkov proteómu // Analytická chémia. 1999. T. 71. č. 21. P. 49814988.

30. Binz P.-A. h str. Molekulárny skener: koncepcia a vývoj. // Súčasný názor v biotechnológiách. 2004. T. 15. Číslo 1. s. 17-23.

31. Birney E. h ap. Prehľad Ensembl. // Výskum genómu. 2004. T. 14. Číslo 5. S. 925-8.

32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Databázy a nástroje na prehliadanie genómov. // Ročný prehľad genomiky a ľudskej genetiky. 2002. T. 3. S. 293-310.

33. Bochet P. h flp. LC-MS bez fragmentácie dokáže identifikovať stovky proteínov // PROTEOMIKA. 2010. T. 11. č. 1. C. n/a-n/a.

34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-databáza pre "exprimované sekvenčné značky". //Prírodná genetika. 1993. T. 4. Číslo 4. S. 332-3.

35. Borges C.R. hnp. Kompletná charakterizácia proteínov v ľudských populáciách. // Klinická chémia. 2010. T. 56. Číslo 2. S. 202-11.

36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: predpovedať vplyv nesynonymných polymorfizmov na funkciu. //Výskum nukleových kyselín. 2007. T. 35. Číslo 11. S. 3823-35.

37. Brosch M. h np. Porovnanie výkonu Mascot a XITandem pre hmotnostnú spektrometriu s nízkou a vysokou presnosťou a vývoj upraveného prahu Mascot. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2008. T. 7. Číslo 5. S. 962-70.

38. Bunger M.K. h ^p. Detekcia a validácia nesynonymných kódujúcich SNP z ortogonálnej analýzy proteomických údajov brokovnice. // Journal of proteom research. 2007. T. 6. Číslo 6. P. 2331-40.

39. Bunkenborg J. h jip. Skríning na N-glykozylované proteíny pomocou kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie. // Proteomika. 2004. T. 4. Číslo 2. S. 454-65.

40. Butenas S., Mann K.G., Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica distribuovaný výhradne spoločnosťou Springer Science+Business Media LLC., 2002.

41. Canas B. h jyp. Technológie hmotnostnej spektrometrie pre proteomiku. // Brífingy z funkčnej genomiky a proteomiky. 2006. T. 4. Číslo 4. S. 295-320.

42. Starostlivosť M.A. h Škodlivá predpoveď SNP: pamätajte na svoje tréningové údaje! // Bioinformatika (Oxford, Anglicko). 2007. T. 23. Číslo 6. S. 664-72.

43. Casado-Vela J. h flp. Svetlá a tiene proteomických technológií na štúdium proteínových druhov vrátane izoforiem, zostrihových variantov a proteínových posttranslačných modifikácií. // Proteomika. 2011. T. 11. Číslo 4. S. 590-603.

44. Chapman P.F. našťastie. Gény, modely a Alzheimerova choroba // Trends in Genetics 2001. T. 17. No. 5. P. 254-261.

45. Chen M. h ap. Anotácia nesynonymných jednoduchých polymorfizmov v proteóme ľudskej pečene pomocou hmotnostnej spektrometrie // Proteínové a peptidové písmená. 2010. T. 17. Číslo 3. S. 277-286.

46. ​​Chen R. h zips. Glykoproteomická analýza ľudského pečeňového tkaniva kombináciou štiepenia viacerými enzýmami a hydrazidovej chémie. // Journal of proteom research. 2009. T. 8. Číslo 2. S. 651-61.

47. Choudhary J.S. h Skúmanie ľudského genómu pomocou neinterpretovaných údajov hmotnostnej spektrometrie. // Proteomika. 2001a. T. 1. č. 5. P. 651-67.

48. Choudhary J.S. h "p. Zhoda peptidových hmotnostných spektier s databázami EST a genómovej DNA. // Trendy v biotechnológiách. 2001b. T. 19. č. 10 Suppl. C. S17-22.

49. Choudhury V. h ap. Dva nové varianty antitrombínu (L99V a Q118P), ktoré menia väzbu heparínu // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. S. 268.

50. Colinge J., Bennett K.L. Úvod do výpočtovej proteomiky. // Výpočtová biológia PLoS. 2007. T. 3. č. 7. C. el 14.

51. Cooksey A.M. našťastie. Identifikácia krvných biomarkerov a fyziologických procesov, ktoré odlišujú ľudí s vynikajúcim výkonom pri psychickom strese. //PloS one. 2009. T. 4. č. 12. P. e8371.

52. Cooper D. Databáza ľudských génových mutácií // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. č. l.C. 285-287.

53. Côté R.G. h hore. Služba Ontology Lookup Service: viac údajov a lepšie nástroje pre riadené dotazy na slovnú zásobu. // Výskum nukleových kyselín. 2008. T. 36. Nie Problém s webovým serverom. C. W372-6.

54. Cottrell J.S. Identifikácia proteínov pomocou odtlačku peptidovej hmoty. // Výskum peptidov. 1994. T. 7. č. 3. S. 115-24.

55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: párovanie proteínov s tandemovým hmotnostným spektrom. // Bioinformatika (Oxford, Anglicko). 2004. T. 20. Číslo 9. S. 1466-7.

56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Systém s otvoreným zdrojovým kódom na analýzu, overovanie a ukladanie identifikačných údajov proteínov. // Journal of proteom research. 2004. T. 3. Číslo 6. S. 1234-42.

57. Creasy D.M., Cottrell J.S. Chybovo odolné vyhľadávanie neinterpretovaných údajov tandemovej hmotnostnej spektrometrie // PROTEOMIKA. 2002. T. 2. č. 10. S. 1426-1434.

58. Crockett D.K. našťastie. Anotovaný proteóm ľudského T-bunkového lymfómu. // Časopis biomolekulových techník: JBT. 2005. T. 16. Číslo 4. S. 341-6.

59. Dai D. h jvp. Identifikácia variantov CYP3A4 a charakterizácia ich schopností metabolizovať testosterón a chlórpyrifos // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. T. 299. Číslo 3. S. 825-831.

60. Delahunty C., Yates J.R. Identifikácia proteínov v komplexných zmesiach pomocou kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie. // Aktuálne protokoly v bunkovej biológii / redakčná rada, Juan S. Bonifacino. a kol.. 2003. T. Kapitola 5. C. Jednotka 5.6.

61. Delahunty C.M., Iii J.R.Y. Tech Insight MudPIT: technológia multidimenzionálnej identifikácie proteínov Tech Insight // Biotechniques. 2007. T. 43. Číslo 5.

62. Desiere F. h jjp. Projekt PeptideAtlas. // Výskum nukleových kyselín. 2006. T. 34. č Vydanie databázy. C. D655-8.

63. Deutsch E. mzML: jednotný, jednotný dátový formát pre výstup z hmotnostného spektrometra. // Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 14. S. 2776-7.

64. Deutsch E.W. Projekt PeptideAtlas. // Metódy v molekulárnej biológii (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. S. 285-96.

65. Deutsch E.W. h ^p. Prehliadka Trans-Proteomic Pipeline so sprievodcom. // Proteomika. 2010. T. 10. č. 6. C. 1150-9.

66. Deutsch E.W. h ^p. Atlas ľudských plazmových peptidov. // Proteomika. 2005. T. 5. č. 13. S. 3497-500.

67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: zdroj pre výber cieľov pre vznikajúce cielené proteomické pracovné postupy. // Správy EMBO. 2008. T. 9. Číslo 5. S. 429-34.

68. Eckel-Passow J.E. hjsp. Pohľad do údajov hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením. // Bioštatistika (Oxford, Anglicko). 2009. T. 10. Číslo 3. S. 481-500.

69. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. Prístup ku korelácii tandemových hmotnostných spektrálnych údajov peptidov s aminokyselinovými sekvenciami v proteínovej databáze // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1994. T. 5. č. 11. S. 976-989.

70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: A Protein Identification Algorithm with Accurate Assignment of the Statistical Significance of the results // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. Číslo 1. S. 32-36.

71. Falkner J. a h hore. Validované MALDI-TOF/TOF hmotnostné spektrá pre proteínové štandardy. // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2007. T. 18. Číslo 5. S. 850-5.

72. Farrah T. h Spoľahlivá referenčná sada proteómu ľudskej plazmy s odhadovanými koncentráciami v PeptideAtlas. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2011.

73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. Ako porovnávame stovky bakteriálnych genómov? // Súčasný názor v mikrobiológii. 2006. T. 9. Číslo 5. S. 499-504.

74. Frazer K. a h ap. Druhá generácia mapy ľudského haplotypu s viac ako 3,1 miliónmi SNP. //Príroda. 2007. T. 449. Číslo 7164. S. 851-61.

75. Fredman D. h ap. HGVbase: kurátorský zdroj popisujúci variácie ľudskej DNA a fenotypové vzťahy. // Výskum nukleových kyselín. 2004. T. 32. č Vydanie databázy. C.D516-9.

76. Oslobodený G.L. h ^p. Diferenciálne zachytenie sérových proteínov na profilovanie expresie a objavenie biomarkerov vo vzorkách rakoviny hlavy a krku pred a po liečbe. // Laryngoskop. 2008. T. 118. Číslo 1. S. 61-8.

77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrofická tyrozínkináza, receptor, typ 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. Číslo 4. S. 314-317.

78. Galeva N. Priama identifikácia izozýmov cytochrómu P450 pomocou matricovej laserovej desorpcie/ionizácie Čas letu založený na proteomickom prístupe // Metabolizmus a dispozícia liečiva. 2003. T. 31. Číslo 4. S. 351-355.

79. Galeva N., Altermann M. Porovnanie jednorozmernej a dvojrozmernej gélovej elektroforézy ako separačného nástroja na proteomickú analýzu mikrozómov pečene potkanov: cytochrómy P450 a iné membránové proteíny. // Proteomika. 2002. T. 2. Číslo 6. S. 713-22.

80. Gao M. h j\p. Deplécia proteínov s vysokým výskytom vo veľkom meradle a analýza proteínov so stredným a nízkym výskytom v proteóme ľudskej pečene pomocou viacrozmernej kvapalinovej chromatografie. // Proteomika. 2008. T. 8. č. 5. P. 93947.

81. Garcia-Blanco M.a, Baraniak A.P., Lasda E.L. Alternatívny zostrih pri chorobe a terapii. // Prírodná biotechnológia. 2004. T. 22. Číslo 5. S. 535-46.

82. Gatlin C.L. našťastie. Automatizovaná identifikácia variácií sekvencie aminokyselín v proteínoch pomocou HPLC/mikrosprej tandemovej hmotnostnej spektrometrie // Analytická chémia. 2000. T. 72. Číslo 4. S. 757-763.

83. Gobom J. h £p. Kalibračná metóda, ktorá zjednodušuje a zlepšuje presné stanovenie molekulových hmotností peptidov pomocou MALDI-TOF MS // Analytická chémia. 2002. T. 74. Číslo 15. S. 3915-3923.

84. Griss J. h ap. Publikované a zaniknuté? vplyv vyhľadanej proteínovej databázy na dlhodobé uchovávanie proteomických dát. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2011. T. 10. č. 9. C. Ml 11.008490.

85. Grone J. h ^ str. Diferenciálna expresia génov kódujúcich proteíny s tesným spojením pri kolorektálnom karcinóme: častá dysregulácia klaudínu-1, -8 a -12. // Medzinárodný časopis o kolorektálnom ochorení. 2007. T. 22. Číslo 6. S. 651-9.

86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), vedomostná základňa ľudských génov a genetických porúch. // Výskum nukleových kyselín. 2005. T. 33. č Vydanie databázy. C. D514-7.

87. Hamosh A. h ap. Online Mendelovská dedičnosť u človeka (OMIM). // Ľudská mutácia. 2000. T. 15. Číslo 1. S. 57-61.

88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Hmotnostná spektrometria pre proteomiku // Aktuálne stanovisko v chemickej biológii. 2008. T. 12. Číslo 5. S. 483-490.

89. Hedden P. h ap. Biosyntéza gibberelínu v rastlinách a hubách: prípad konvergentnej evolúcie? // Časopis regulácie rastu rastlín. 2001. T. 20. č. 4. S. 319-331.

90. Hopfgartner G. h Hmotnostný spektrometer s trojitým kvadrupólovým lineárnym iónovým pascom na analýzu malých molekúl a makromolekúl. // Časopis hmotnostnej spektrometrie: JMS. 2004. T. 39. Číslo 8. S. 845-55.

91. Huang Y. n flp. Štatistická charakterizácia stavu náboja a závislosti od zvyšku nízkoenergetických vzorov disociácie CID peptidu. // Analytická chémia. 2005. T. 77. Číslo 18. S. 5800-13.

92. Hubbard T. Projekt databázy genómu Ensembl // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. Číslo 1. s. 38-41.

93. Hustert E. h £p. Genetické determinanty polymorfizmu CYP3A5. // Farmakogenetika. 2001. T. 11. č. 9. s. 773-9.

94. Ilina E.N. h ^p. Priame bakteriálne profilovanie pomocou matrice asistovanej laserovej desorpno-ionizačnej hmotnostnej spektrometrie s časom letu na identifikáciu patogénnej Neisserie. // Časopis molekulárnej diagnostiky: JMD. 2009. T. 11. č. 1. P. 7586.

95. Ingelman-Sundberg M. Enzýmy cytochrómu P450 metabolizujúce ľudské lieky: vlastnosti a polymorfizmy. // Farmakologický archív Naunyna-Schmiedeberga 2004. T. 369. č. 1. S. 89-104.

96. Medzinárodné konzorcium pre sekvenovanie ľudského genómu. Dokončenie euchromatickej sekvencie ľudského genómu. //Príroda. 2004. T. 431. Číslo 7011. S. 931 -45.

97. Ishihama Y. h str. Exponenciálne modifikovaný index proteínovej abundance (emPAI) na odhad absolútneho množstva proteínu v proteomike podľa počtu sekvenovaných peptidov na proteín. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2005. T. 4. Číslo 9. S. 1265-72.

98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov skóre a tolerancie vnútornej hmotnosti pre peptidové hromadné odtlačky prstov. // Journal of proteom research. 2010. T. 9. Číslo 2. S. 737-42.

99. Jeffrey L. Cummings. Vzťahy genotyp-proteotyp-fenotyp pri neurodegeneratívnych ochoreniach. : Springer, 2005.

100. Jenkins R.E. našťastie. Relatívne a absolútne kvantitatívne profilovanie expresie cytochrómov P450 pomocou izotopovo kódovaných afinitných značiek. // Proteomika. 2006. T. 6. Číslo 6. S. 1934-47.

101. Jones P. h flp. PRIDE: verejné úložisko identifikácií proteínov a peptidov pre proteomickú komunitu. // Výskum nukleových kyselín. 2006. T. 34. č Vydanie databázy. C. D659-63.

102. Jones P. h flp. PRIDE: nový vývoj a nové súbory údajov. // Výskum nukleových kyselín. 2008. T. 36. č Vydanie databázy. C. D878-83.

103. Kalmar L. h jip. Skríning mutácií génu inhibítora CI u maďarských pacientov s dedičným angioedémom. // Ľudská mutácia. 2003. T. 22. Číslo 6. S. 498.

104. Keller A. h ap. Empirický štatistický model na odhad presnosti identifikácie peptidov vykonanej MS/MS a vyhľadávanie v databáze // Analytická chémia. 2002. T. 74. č. 20. S. 5383-5392.

105. Kersey P.J. n jjp. Medzinárodný proteínový index: integrovaná databáza pre proteomické experimenty. // Proteomika. 2004. T. 4. Číslo 7. S. 1985-8.

106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Spektrálne pravdepodobnosti a funkcie generovania tandemových hmotnostných spektier: útok proti návnadovým databázam. // Journal of proteom research. 2008. T. 7. Číslo 8. P. 3354-63.

107. Klie S. h £p. Analýza rozsiahlych proteomických projektov s latentným sémantickým indexovaním. // Journal of proteom research. 2008. T. 7. Číslo 1. S. 182-91.

108. Kremer H. h hore. Ichtyóza Bullosa spoločnosti Siemens je spôsobená mutáciami v géne keratínu 2e. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. č. 3. S. 286-289.

109. Kuehl P. h ap. Sekvenčná diverzita v promótoroch CYP3A a charakterizácia genetického základu polymorfnej expresie CYP3A5. //Prírodná genetika. 2001. T. 27. č. 4. s. 383-91.

110. Kuhn R.M. h hore. Databáza prehliadača genómu UCSC: aktualizácia 2009. // Výskum nukleových kyselín. 2009. T. 37. č Vydanie databázy. C. D755-61.

111. Kuster B. h flp. Hmotnostná spektrometria umožňuje priamu identifikáciu proteínov vo veľkých genómoch. //Proteomika. 2001. T. 1. č. 5. s. 641-50.

112. Lane C.S. našťastie. Porovnávacia proteomika cytochrómu P450 v pečeni imunodeficientných myší pomocou 180 stabilného izotopového značenia. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2007. T. 6. Číslo 6. S. 953-62.

113. Lane C.S. h ,qp. Identifikácia enzýmov cytochrómu P450 v ľudských kolorektálnych metastázach a okolitej pečeni: proteomický prístup. // Európsky časopis o rakovine (Oxford, Anglicko: 1990). 2004. T. 40. Číslo 14. S. 2127-34.

114. Lane E.B., McLean W.H.I. Keratíny a kožné poruchy. // Patologický časopis. 2004. T. 204. Číslo 4. S. 355-66.

115. Levine a J. P53, Cellular Gatekeeper for Growth and Division. // Bunka. 1997. T. 88. Číslo 3. S. 323-31.

116. Levy S. h AP- Sekvencia diploidného genómu jednotlivého človeka. // biológia PLoS. 2007. T. 5. č. 10. P. e254.

117. Lewis D.F.V. 57 odrôd: ľudské cytochrómy P450. // Farmakogenomika. 2004. T. 5. Číslo 3. S. 305-18.

118. Lim A. h ap. Charakterizácia transtyretínových variantov pri familiárnej transtyretínovej amyloidóze pomocou hmotnostného spektrometrického peptidového mapovania a sekvenčnej analýzy DNA // Analytická chémia. 2002. T. 74. Číslo 4. S. 741-751.

119. Lim H. Identifikácia proteínov 2D-gélu: Porovnanie mapovania hmotnosti peptidu MALDI/TOF s tandemovou hmotnostnou spektrometriou p LC-ESI // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. Číslo 9. S. 957-970.

120. Lisitsa A.V. h "p. Aplikácia krájania jednorozmerných gélov s následnou hmotnostnou spektrometriou plátok po plátku na proteomické profilovanie ľudských pečeňových cytochrómov P450. // Journal of protein research. 2010. T. 9. Číslo 1. S. 95-103.

121. Liu T. h ap. Charakterizácia vysokého dynamického rozsahu plazmatického proteómu pacienta s traumou. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2006. T. 5. č. 10. P. 1899913.

122. Liu T. h/ip. Analýza N-glykoproteómu ľudskej plazmy pomocou odčítania imunoafinity, hydrazidovej chémie a hmotnostnej spektrometrie // Journal of proteome research. 2005. T. 4. č. 6. s. 2070-2080.

123. Mallick P. h flp. Výpočtová predikcia proteotypových peptidov pre kvantitatívnu proteomiku. //Prírodná biotechnológia. 2007. T. 25. Číslo 1. S. 125-31.

124. Mann M., Jensen O.N. Proteomická analýza posttranslačných modifikácií. // Prírodná biotechnológia. 2003. T. 21. Číslo 3. S. 255-61.

125. Mann M., Wilm M. Identifikácia peptidov v sekvenčných databázach odolná voči chybám pomocou značiek peptidových sekvencií // Analytická chémia. 1994. T. 66. č. 24. s. 4390-4399.

126. Marchetti A. h str. Časté mutácie v génovej rodine neurotrofickej tyrozínovej receptorovej kinázy vo veľkom bunkovom neuroendokrinnom karcinóme pľúc. // Ľudská mutácia. 2008. T. 29. Číslo 5. S. 609-16.

127. Marichal P. h Príspevok mutácií v cytochróme P450 14(alfa)-demetyláze (Ergllp, Cyp51p) k azolovej rezistencii u Candida albicans // Mikrobiológia. 1999. T. 145. č. 10. S. 2701-2713.

128. Martens L. h jxp. PRIDE: databáza proteomických identifikácií. // Proteomika. 2005. T. 5. č. 13. s. 3537-45.

129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomika čelí kombinatorickému problému. // Metódy v molekulárnej biológii (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. S. 175-86.

130. McDonald W.H., Yates J.R. Broková proteomika: integrácia technológií na zodpovedanie biologických otázok. // Súčasný názor na molekulárnu terapiu. 2003. T. 5. Číslo 3. S. 302-9.

131. Menon R., Omenn G.S. Proteomická charakterizácia nových alternatívnych zostrihových variantných proteínov v ľudských rakovinách prsníka indukovaných receptorom epidermálneho rastového faktora 2 / neu. // Výskum rakoviny. 2010. T. 70. Číslo 9. S. 3440-9.

132. Menschaert G. h £p. Peptidomics dospievanie: prehľad príspevkov z pohľadu bioinformatiky. // Journal of proteom research. 2010. T. 9. č. 5. P. 205161.

133. Millar D.S. h Tri nové missense mutácie v géne antitrombínu III (AT3) spôsobujúce rekurentnú venóznu trombózu. // Ľudská genetika. 1994. T. 94. Číslo 5. S. 509-12.

134. Mironov A.A. Časté alternatívne spájanie ľudských génov // Výskum genómu. 1999. T. 9. č. 12. S. 1288-1293.

135. Modrek B. Celogenómová detekcia alternatívneho zostrihu v exprimovaných sekvenciách ľudských génov // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. č. 13. S. 2850-2859.

136. Mueller M. h ap. Analýza experimentálnej detekcie génov súvisiacich s centrálnym nervovým systémom v súboroch údajov ľudského mozgu a cerebrospinálnej tekutiny. // Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 6. S. 1138-48.

137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. Stopárova príručka k analýze vyjadrenej sekvenčnej značky (EST) // Briefings in bioinformatics 2007. T. 8. No. 1. P. 621.

138. Nedelkov D. Populačná proteomika: Výskum proteínovej diverzity v ľudských populáciách // Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 4. S. 779-86.

139. Nedelkov D. h ap. Vysokovýkonná komplexná analýza proteínov ľudskej plazmy: krok k populačnej proteomike. // Analytická chémia. 2004. T. 76. Číslo 6. S. 1733-7.

140. Nedelkov D. h ^p. Skúmanie rozmanitosti proteínov ľudskej plazmy. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. T. 102. Číslo 31. S. 10852-7.

141. Nesvizhskii A.I. Identifikácia proteínov tandemovou hmotnostnou spektrometriou a vyhľadávaním v sekvenčnej databáze. // Metódy v molekulárnej biológii (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. S. 87-119.

142. Nesvizhskii A.I., Vitek O., Aebersold R. Analýza a validácia proteomických údajov generovaných tandemovou hmotnostnou spektrometriou // Nature Methods. 2007. T. 4. č. 10. S. 787-797.

143. Ng P.C. hflp. Genetická variácia v individuálnom ľudskom exóme // Genetika PLoS. 2008. T. 4. č. 8.

144. Ong S.-E., Mann M. Proteomika založená na hmotnostnej spektrometrii sa mení na kvantitatívnu. // Chemická biológia prírody. 2005. T. 1. č. 5. s. 252-62.

145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Optimalizácia podmienok vyhľadávania pre hromadnú identifikáciu proteínov na základe odtlačkov prstov. // Proteomika. 2006. T. 6. Číslo 7. S. 2079-85.

146. Overbeek R. h, np. Anotácia bakteriálnych a archaálnych genómov: zlepšenie presnosti a konzistencie. // Chemické recenzie. 2007. T. 107. Číslo 8. S. 3431-47.

147. Pedrioli P.G.A. Trans-proteomický pipeline: potrubie pre proteomickú analýzu. // Metódy v molekulárnej biológii (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. S. 213-38.

148. Perkins D.N. h ^p. Identifikácia proteínov založená na pravdepodobnosti prehľadávaním databáz sekvencií pomocou údajov hmotnostnej spektrometrie // Elektroforéza. 1999. T. 20. č. 18. s. 3551-3567.

149. Perry D.J., Carrell R.W. Molekulárna genetika nedostatku ľudského antitrombínu. // Ľudská mutácia. 1996. T. 7. Číslo 1. S. 7-22.

150. Petrak J. h ap. Déjà vu v proteomike. Prehliadka opakovane identifikovaných rozdielne exprimovaných proteínov. // Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 9. S. 1744-9.

151. Pevzner P.A. bedro. Efektívnosť vyhľadávania v databáze na identifikáciu mutovaných a modifikovaných proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie. // Výskum genómu. 2001. T. 11. Číslo 2. S. 290-9.

152. Porter C.J., Talbot C.C., Cuticchia A.J. Centrálne databázy mutácií – prehľad. // Ľudská mutácia. 2000. T. 15. Číslo 1. S. 36-44.

153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Je génovo-centrický projekt ľudského proteómu najlepším spôsobom, ako môže proteomika slúžiť biológii? // Proteomika. 2010. s. 1-6.

154. Rapsilber J. h £p. Rozsiahla proteomická analýza ľudského spliceozómu. // Výskum genómu. 2002. T. 12. Číslo 8. S. 1231-45.

155. Redlich G. h zips. Rozlíšenie medzi izoformami ľudského cytochrómu P450 (CYP) a identifikácia nových fosforylačných miest pomocou hmotnostnej spektrometrie. // Journal of proteom research. 2008. T. 7. Číslo 11. S. 4678-88.

156. Reid G.E., McLuckey S.A. Charakterizácia proteínov „zhora nadol“ prostredníctvom tandemovej hmotnostnej spektrometrie. // Časopis hmotnostnej spektrometrie: JMS. 2002. T. 37. Číslo 7. S. 663-75.

157. Rodriguez C. h zips. Proteotypizácia ľudského haptoglobínu profilovaním MALDI-TOF: Distribúcia fenotypov v populácii pacientov so syndrómom toxického oleja. // Proteomika. 2006. T. 6. C. S272--81.

158. Roher A. h zips. Štrukturálne zmeny v peptidovej kostre beta-amyloidového jadrového proteínu môžu zodpovedať za jeho ukladanie a stabilitu pri Alzheimerovej chorobe // J. Biol. Chem.

159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simulácia a predikcia metabolizmu liečiv in vivo v ľudských populáciách z údajov in vitro. // Recenzie prírody. Objav drog. 2007. T. 6. Číslo 2. S. 140-8.

160. Roth M.J. h zips. "Proteotypizácia": populačná proteomika ľudských leukocytov pomocou hmotnostnej spektrometrie zhora nadol. // Analytická chémia. 2008. T. 80. č. 8. P. 285766.

161. Rozman D., Vodník M.R. Lanosterol 14alfa-demetyláza (CYP51) a spermatogenéza // Metab. Dispos. 1998. T. 26. č. 12. S. 1199-1201.

162. Rubina A.Y. h zips. Prečo 3-D? Gélové mikročipy v proteomike. // Proteomika. 2008. T. 8. č. 4. s. 817-31.

163. Sadygov R.G., Cociorva D., Iii J.R.Y. Rozsiahle vyhľadávanie v databáze pomocou tandemových hmotnostných spektier: Vyhľadanie odpovede v zadnej časti knihy // Nature Methods. 2004. T. 1. Číslo 3. S. 195-202.

164. Sarkozy A. h zips. Zárodočné mutácie BRAF v Noonan, LEOPARD a kardiofaciokutánnych syndrómoch: molekulárna diverzita a súvisiace fenotypové spektrum. // Ľudská mutácia. 2009. T. 30. Číslo 4. S. 695-702.

165. Sattlele D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Genómy hmyzu: výzvy a príležitosti pre neurovedy. // Neuroveda bezstavovcov: IN. 2007. T. 7. Číslo 3. S. 133-6.

166. Schandorff S. h, np. Databáza vhodná pre hmotnostnú spektrometriu na identifikáciu cSNP. //Prírodné metódy. 2007. T. 4. Číslo 6. S. 465-6.

167. Schmuth M. h Aktualizácia ichtyózy: smerom k funkčne riadenému modelu patogenézy porúch kornifikácia a úlohe korneocytových proteínov pri týchto poruchách. //Pokroky v dermatológii. 2007. T. 23. s. 231-56.

168. Schweigert F.J., Wirth K., Raila J. Charakterizácia mikroheterogenity transtyretínu v plazme a moči pomocou imunoanalýzy SELDI-TOF-MS. // Proteomová veda. 2004. T. 2. č. 1. P. 5.

169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Zlepšenie citlivosti pravdepodobnostným kombinovaním výsledkov z viacerých metodológií vyhľadávania MS/MS. // Journal of proteom research. 2008. T. 7. Číslo 1. S. 245-53.

170. Seo J., Lee K.-J. Posttranslačné modifikácie a ich biologické funkcie: proteomická analýza a systematické prístupy. // Časopis pre biochémiu a molekulárnu biológiu. 2004. T. 37. Číslo 1. S. 35-44.

171. Sherry S.T. dbSNP: NCBI databáza genetických variácií // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. č. 1. P. 308-311.

172. Ševčenko A. h j\p. Hmotnostné spektrometrické sekvenovanie proteínov z polyakrylamidových gélov zafarbených striebrom // Analytická chémia. 1996. T. 68. č. 5. P. 850858.

173. Shi W.-feng h hore. Proteotypizácia: Nový prístup k štúdiu vývoja vírusu chrípky na úrovni proteínov // Virologica Sinica. 2008. T. 22. Číslo 5. S. 405-411.

174. Shteynberg D. h np. iProphet: Viacúrovňová integračná analýza proteomických údajov brokovnice zlepšuje mieru identifikácie peptidov a proteínov a odhady chýb. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.

175. Smigielski E.M. dbSNP: databáza jednonukleotidových polymorfizmov // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. č. 1. S. 352-355.

176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. Spojenie medzi zostrihom a rakovinou. // Journal of cell science. 2006. T. 119. Číslo Pt 13. S. 2635-41.

177. Stamm S. h zips. ASD: bioinformatický zdroj o alternatívnom spájaní. // Výskum nukleových kyselín. 2006. T. 34. č Vydanie databázy. C. D46-55.

178. Stein P.E., Carrell R.W. Čo nám dysfunkčné serpíny hovoria o molekulárnej mobilite a chorobách? // Prírodná štrukturálna biológia. 1995. T. 2. č. 2. S. 96-113.

179. Supek F. n zip. Vylepšený analytický výkon SDS-PAGE pomocou algoritmov strojového učenia. //Proteomika. 2008. T. 8. Číslo 1. S. 28-31.

180. Taylor C.F. Minimálne požiadavky na podávanie správ pre proteomiku: základný náter MIAPE. // Proteomika. 2006. T. 6 Suppl 2. S. 39-44.

181. Taylor C.F. h zips. Minimálne informácie o proteomickom experimente (MIAPE). // Prírodná biotechnológia. 2007. T. 25. Číslo 8. S. 887-93.

182. Thiede B. h zips. Peptidové hromadné odtlačky prstov. // Metódy (San Diego, Kalifornia). 2005. T. 35. Číslo 3. S. 237-47.

183. Tsvetkov P.O. h zips. Izomerizácia zvyšku Asp7 má za následok zinkom indukovanú oligomerizáciu amyloidného beta(l-16) peptidu pri Alzheimerovej chorobe // Chembiochem: a European Journal of Chemical biology 2008. T. 9. No. 10. P. 1564-7.

184. Uhlen M. h zips. Atlas ľudských proteínov pre normálne a rakovinové tkanivá založený na proteomike protilátok. // Molekulárna a bunková proteomika: MCP. 2005. T. 4. Číslo 12. S. 1920-32.

185. Ullrich A. h zips. PROTEÍNOVÉ KINAZY SÚVISIACE S RAKOVINOU // Patentová prihláška USA. 12/. 2007.

186. Venter J.C. h zips. Sekvencia ľudského genómu. // Veda (New York, NY). 2001. T. 291. Číslo 5507. S. 1304-51.

187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Repozitáre údajov proteomiky: Poskytovanie bezpečného prístavu pre vaše údaje a pôsobenie ako odrazový mostík pre ďalší výskum // Journal of Proteomics. 2010. s. 1-11.

188. W Vogel K. h zips. Vývoj testov na objavovanie kinázových liekov, odkiaľ pochádzajú pokroky? // 2007.

189. Westlind-Johnsson A. Porovnávacia analýza expresie CYP3A v ľudskej pečeni naznačuje len malú úlohu CYP3A5 v metabolizme liekov // Metabolizmus a distribúcia liekov. 2003. T. 31. Číslo >6. 755-761.

190. Wheeler D.L. h zips. Databázové zdroje Národného centra biotechnologických informácií. //Výskum nukleových kyselín. 2007. T. 35. č Vydanie databázy. C. D5-12.

191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. Polymorfizmy p53: implikácie rakoviny. //Recenzie prírody. Rakovina. 2009. T. 9. Číslo 2. S. 95-107.

192. Wilkins M.R. bedro. Od proteínov k proteómom: identifikácia proteínov vo veľkom meradle dvojrozmernou elektroforézou a analýzou aminokyselín // Bio/technológia. 1996. T. 14. Číslo 1. S. 61-65.

193. Wu C.H. našťastie. Univerzálny proteínový zdroj (UniProt): rozširujúci sa vesmír informácií o proteínoch. // Výskum nukleových kyselín. 2006. T. 34. č Vydanie databázy. C. D187-91.

194. Yates J. R., Eng J. K., McCormack A. L. Ťažba genómov: Korelácia tandemových hmotnostných spektier modifikovaných a nemodifikovaných peptidov so sekvenciami v databázach nukleotidov // Analytická chémia. 1995. T. 67. č. 18. S. 3202-3210.

195. Yip Y.L. h Anotovanie polymorfizmov jednotlivých aminokyselín v databáze znalostí UniProt/Swiss-Prot. // Ľudská mutácia. 2008. T. 29. č. 3. P. 3616.

196. Zanger U.M. našťastie. Polymorfný CYP2B6: molekulárne mechanizmy a objavujúci sa klinický význam. //Farmakogenomika. 2007. T. 8. Číslo 7. S. 743-59.

197. Zgoda V.G. h £p. Proteomika myších pečeňových mikrozómov: vykonávanie rôznych pracovných postupov separácie proteínov pre LC-MS/MS. // Proteomika. 2009. T. 9. Číslo 16. S. 4102-5.

198. Zhou H. h ap. Kvantitatívna analýza proteómu pomocou značkovania izotopov na pevnej fáze a hmotnostnej spektrometrie. //Prírodná biotechnológia. 2002. T. 20. Číslo 5. S. 512-5.

199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Zachytenie/prenos elektrónov verzus kolízne aktivované/indukované disociácie: sólo alebo duet? // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2008. T. 19. Číslo 6. S. 753-61.

Upozorňujeme, že vyššie uvedené vedecké texty sú zverejnené len na informačné účely a boli získané prostredníctvom rozpoznávania textu pôvodnej dizertačnej práce (OCR). Preto môžu obsahovať chyby spojené s nedokonalými rozpoznávacími algoritmami. V súboroch PDF dizertačných prác a abstraktov, ktoré dodávame, sa takéto chyby nevyskytujú.

Kniha je prvou učebnicou v ruštine o základoch hmotnostnej spektrometrie proteínov a peptidov. Účelom tejto publikácie je zaujať mladých výskumníkov o informatívnu, krásnu a žiadanú disciplínu na celom svete, poskytnúť možnosť efektívnejšieho využitia hmotnostnej spektrometrie pri riešení základných a aplikovaných vedeckých problémov. Kniha je písaná formou prednášky pre začiatočníkov, je dobre ilustrovaná a doplnená reprezentatívnym zoznamom citovanej literatúry.

Publikácia je určená pre študentov bakalárskeho a postgraduálneho štúdia chemických, fyzikálno-chemických, biologických a medicínskych odborov; budú užitočné pre výskumníkov, ktorí už pracujú v oblasti výskumu proteínov a peptidov alebo sa zaujímajú o túto vedeckú oblasť.

		7
Použité skratky		9
Úvod		11
Kapitola 1. Metódy ionizácie molekúl peptidov a proteínov		14
1.1. Bombardovanie rýchlymi atómami (FAB)		14
1.2. Matrix-asistovaná laserová desorpcia/ionizácia, MALDI (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16
1.3. Elektrosprejová ionizácia (ESI)		19
Kapitola 2: Meranie molekulovej hmotnosti peptidov a proteínov		25
Kapitola 3. Stanovenie primárnej štruktúry peptidov		34
3.1. Edmanova degradácia		34
3.2. Identifikácia peptidov cDNA sekvenciou		36
3.3. Rebríkové sekvenovanie		37
Kapitola 4. Hmotnostné spektrometrické sekvenovanie		39
4.1. Nomenklatúra iónov peptidových fragmentov		39
4.2. Hmotnostné spektrá záporných iónov		45
4.3. Metódy na spustenie fragmentácie molekulárnych iónov 46
4.3.1. Collisionally Activated Disociation (CAD)		47
4.3.2. Povrchovo indukovaná disociácia (SID)		56
4.3.3. Disociácia elektrónového záchytu, ECD		59
4.3.4. Disociácia prenosu elektrónov, ETD		64
4.3.5. Fotoaktivačná disociácia		65
4.3.6. Elektrónmi aktivovaná disociácia		69
4.3.7. Disociácia záporných iónov pri abstrakcii elektrónov		70
4.4. Metódy sekvenovania peptidov pomocou laserových desorpčných/ionizačných zariadení s podporou matrice		71
4.4.1. Metóda oneskorenej extrakcie. Rozpad v zdroji, RVI (In Source Decay, ISD)		71
4.4.2. Rozpad mimo zdroja, PSD (Post Source Decay, PSD)		72
Kapitola 5. Identifikácia proteínov a peptidov		7 6
5.1. Identifikácia pomocou databáz		76
5.1.1. Metóda identifikácie proteínov zdola nahor		76
5.1.2. Metóda identifikácie proteínov zhora nadol		91
5.2. Manuálna identifikácia peptidov		94
Kapitola 6. Hlavné ťažkosti hmotnostného spektrometrického sekvenovania peptidov a spôsoby ich prekonania		97
6.1. Sekvenčné pokrytie		98
6.2. Aminokyseliny s rovnakou hmotnosťou celého čísla		102
6.2.1. Lyzín a glutamín		102
6.2.2. Fenylalanín a oxidovaný metionín		104
6.3. Izomérne aminokyseliny: leucín a izoleucín		106
6.4. Cyklizácia krátkych peptidov		108
6.5. Peptidy obsahujúce disulfidovú väzbu		116
Kapitola 7: Použitie hmotnostne spektronegatívnych iónov na sekvenovanie		121
Kapitola 8. Kvantitatívna analýza proteínov pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie. Kvantitatívna proteomika		126
8.1. Porovnávacia (kvantitatívna) proteomika		129
8.1.1. Bezizotopová metóda		129
8.1.2. Izotopové metódy		132
8.2. Stanovenie absolútnych množstiev		145
Bibliografia		149
Aplikácia. Bruker: Viacrozmerná cesta k odhaleniu proteómu		163

Predslov

Oddaný
profesori Chemickej fakulty
Moskovská štátna univerzita pomenovaná po M.V. Lomonosov
Alexander Leonidovič Kurts
Kim Petrovič Butin

Najvýznamnejšie úspechy hmotnostnej spektrometrie za posledných 20 rokov sú spojené so štúdiom prírodných zlúčenín vrátane biopolymérov. S príchodom elektrosprejovej ionizácie a techník laserovej desorpcie/ionizácie za pomoci matrice sa cukry, nukleové kyseliny, proteíny, lipidy a ďalšie bioorganické makromolekuly stali dostupnými pre hmotnostnú spektrometriu. Samozrejme, najväčšie úspechy boli dosiahnuté pri štúdiu bielkovín. Hmotnostná spektrometria je dnes vďaka svojej citlivosti, informačnému obsahu, výraznosti a schopnosti pracovať so zmesami hlavnou metódou analýzy týchto ťažko študovateľných objektov.

Možno môžeme priznať, že moderná hmotnostná spektrometria zvíťazila v konkurencii s klasickou metódou stanovenia primárnej sekvencie aminokyselín v peptidoch podľa Edmana, keďže hmotnostné spektrometrické sekvenovanie sa ukázalo byť výrazne rýchlejšie, citlivejšie, informatívnejšie a dokonca lacnejšie. . Rýchle a spoľahlivé stanovenie primárnej štruktúry bielkovín, t.j. sekvencia aminokyselinových jednotiek je sama o sebe vynikajúcim výsledkom. Hmotnostná spektrometria je však schopná študovať štruktúry zložitejších rádov (od 2 do 4), vrátane nekovalentných interakcií proteínov s výskytom supraproteínových útvarov, stanovenie typu a miesta posttranslačných modifikácií, prácu s glykoproteínmi lipoproteíny, fosfoproteíny atď. Hmotnostná spektrometria sa stala v medicíne nenahraditeľnou, pretože dokáže rýchlo a spoľahlivo diagnostikovať kardiovaskulárne, genetické a onkologické ochorenia. Práve úspechy hmotnostnej spektrometrie viedli na konci minulého storočia k sformovaniu nového vedeckého smeru – proteomiky. Obrovská je aj úloha metódy v metabolomike.

Bohužiaľ, v ruskojazyčnej literatúre zatiaľ neexistujú žiadne učebnice alebo monografie na túto najdôležitejšiu a mnohostrannú tému. Rusko zásadne zaostáva za vyspelými krajinami tak v štúdiu tejto disciplíny, ako aj vo využívaní jej úspechov. Masoví spektrometri pracujúci v Rusku sa musia spoliehať na vydania kníh, pôvodné články a recenzie v anglickom jazyku. V roku 2012 vyšla v ruštine kniha „Principles of mass spectrometry as apply to biomolecules“, ktorú vydali J. Laskin a X. Lifshitz (preklad z angličtiny, vydavateľstvo Technosphere), ktorá je súborom článkov popredných odborníkov v oblasti poľná hmotnostná spektrometria aplikovaná v biológii. Kniha je určená pre pokročilých čitateľov. Ona poskytuje

dobrá, v mnohých smeroch, korešpondenčná príležitosť zoznámiť sa s modernými výdobytkami v oblasti hmotnostnej spektrometrie biomolekúl, keďže väčšina metód v nej popísaných sa u nás ešte nepoužíva.

Kniha „Základy hmotnostnej spektrometrie proteínov a peptidov“ ponúkaná čitateľom je prvou učebnicou v ruštine, ktorá stanovuje základy hmotnostnej spektrometrie proteínov a peptidov. Kniha je písaná formou prednášok pre začiatočníkov, je ilustrovaná veľkým množstvom kresieb, spektier, schém a je doplnená reprezentatívnym zoznamom citovanej literatúry. Je určený pre študentov bakalárskeho a postgraduálneho štúdia chemických, fyzikálno-chemických, biologických a medicínskych odborov; budú užitočné pre výskumníkov, ktorí už pracujú v oblasti výskumu proteínov a peptidov alebo sa zaujímajú o túto vedeckú oblasť.

Účelom vydania takejto knihy je zaujať mladých výskumníkov o informatívnu, veľmi krásnu a žiadanú disciplínu na celom svete, poskytnúť príležitosť efektívnejšie využívať hmotnostnú spektrometriu na riešenie vlastných základných a aplikovaných vedeckých problémov.

Učebnica je zameraná na metódy ionizácie proteínov a peptidov a procesy fragmentácie týchto zlúčenín v plynnej fáze. Dostatočne podrobne sú diskutované otázky tandemovej hmotnostnej spektrometrie a existujúcich metód na iniciáciu fragmentácie. Táto sekcia je veľmi dôležitá v modernej hmotnostnej spektrometrii. Je to užitočné pre výskumníkov pracujúcich s akýmikoľvek chemickými zlúčeninami a biopolymérmi. Niekoľko kapitol je venovaných identifikácii proteínov a peptidov. To zahŕňa možnosti pre automatizovanú identifikáciu, manuálnu interpretáciu spektier a popis určitých ťažkostí pri hmotnostnom spektrometrickom sekvenovaní a možnosti ich prekonania. Zvažujú sa výhody a nevýhody dvoch hlavných prístupov k stanoveniu chemickej štruktúry proteínov: hmotnostná spektrometria „zhora nadol“ a „zdola nahor“. Samostatná kapitola je venovaná problematike kvantitatívnej analýzy.

Kniha je venovaná Alexandrovi Leonidovičovi Kurtzovi a Kim Petrovičovi Butinovi, dvom priateľom, úžasným profesorom Chemickej fakulty Moskovskej štátnej univerzity pomenovanej po M. V. Ľudsky nám veľmi blízky Lomonosov, priamo zapojený do nášho chemického a humanitárneho vzdelávania. Vždy sme vysoko oceňovali chemickú erudíciu a úžasné osobné kvality týchto vedcov. Práve komunikácia s týmito ľuďmi nás inšpirovala k začatiu výskumu v oblasti hmotnostnej spektrometrie peptidov na samom začiatku 21. storočia.

A.T. Lebedev
K.A. Artemenko
T.Yu Samgina

Najcharakteristickejšie fyzikálno-chemické vlastnosti proteínov sú: vysoká viskozita roztokov, nepatrná difúzia, schopnosť napučiavať vo veľkých medziach, optická aktivita, pohyblivosť v elektrickom poli, nízky osmotický tlak a vysoký onkotický tlak, schopnosť absorbovať UV žiarenie pri 280 nm ( táto posledná vlastnosť sa v dôsledku prítomnosti aromatických aminokyselín v proteínoch využíva na kvantitatívne stanovenie proteínov).

Proteíny, podobne ako aminokyseliny, sú amfotérne v dôsledku prítomnosti voľných skupín NH2 a COOH a podľa toho sa vyznačujú všetkými vlastnosťami kyselín a zásad.

Proteíny majú výrazné hydrofilné vlastnosti. Ich roztoky majú veľmi nízky osmotický tlak, vysokú viskozitu a nízku difúznu schopnosť. Proteíny sú schopné napučiavať vo veľmi veľkých medziach.

S koloidným stavom proteínov je spojených množstvo charakteristických vlastností, najmä fenomén rozptylu svetla, ktorý je základom kvantitatívneho stanovenia proteínov nefelometriou. Tento efekt sa využíva aj v moderných metódach mikroskopie biologických objektov. Molekuly bielkovín nie sú schopné prechádzať cez polopriepustné umelé membrány (celofán, pergamen, kolódium), ako aj biomembrány rastlinných a živočíšnych tkanív, aj keď s organickými léziami, ako sú obličky, puzdro obličkového glomerulu (Shumlyansky- Bowman) sa stávajú priepustnými pre sérový albumín a objavujú sa v moči.

Denaturácia bielkovín pod vplyvom rôznych fyzikálnych a chemických faktorov spôsobuje koaguláciu a zrážanie bielkovín, čím strácajú svoje prirodzené vlastnosti. Denaturácia by sa teda mala chápať ako porušenie všeobecného plánu - jedinečnej štruktúry molekuly natívneho proteínu, čo vedie k strate jej charakteristických vlastností (rozpustnosť, elektroforetická pohyblivosť, biologická aktivita atď.). Väčšina bielkovín sa denaturuje pri zahriatí s roztokom nad 50-60o C. Vonkajšie prejavy denaturácie sa redukujú na stratu rozpustnosti najmä v izoelektrickom bode, zvýšenie viskozity bielkovinových roztokov, zvýšenie množstva voľných funkčný SH-rpypp a zmena charakteru rozptylu röntgenového žiarenia. Najcharakteristickejším znakom denaturácie je prudký pokles alebo úplná strata biologickej aktivity proteínu (katalytická antigénna alebo hormonálna). Počas denaturácie dochádza k deštrukcii najmä nekovalentných (najmä vodíkových) väzieb a disulfidových mostíkov a k zničeniu peptidových väzieb proteínu. V tomto prípade sa globuly natívnych proteínov rozvinú a tvoria sa náhodné a neusporiadané štruktúry.

vysolenie: zrážanie so soľami alkalických kovov, kovov alkalických zemín (chlorid sodný, síran horečnatý), síran amónny; primárna štruktúra proteínu nie je narušená;

depozícia: použitie látok odstraňujúcich vodu: alkohol alebo acetón pri nízkych teplotách (asi –20 С).

Pri použití týchto metód strácajú proteíny svoj hydratačný obal a zrážajú sa v roztoku.

Denaturácia- porušenie priestorovej štruktúry bielkovín (primárna štruktúra molekuly je zachovaná). Môže byť reverzibilná (po odstránení denaturačného činidla sa obnoví bielkovinová štruktúra) alebo ireverzibilná (neobnoví sa priestorová štruktúra molekuly napr. pri vyzrážaní bielkovín koncentrovanými minerálnymi kyselinami, soľami ťažkých kovov).

Metódy separácie proteínov Separácia proteínov od nečistôt s nízkou molekulovou hmotnosťou

Dialýza

Používa sa špeciálna polymérová membrána, ktorá má póry určitej veľkosti. Malé molekuly (nečistoty s nízkou molekulovou hmotnosťou) prechádzajú cez póry v membráne a veľké molekuly (proteíny) sú zadržané. Bielkoviny sa tak odplavia od nečistôt.

Separácia proteínov podľa molekulovej hmotnosti

Gélová chromatografia

Chromatografická kolóna je naplnená gélovým granulátom (Sephadex), ktorý má póry určitej veľkosti. Do kolóny sa pridá zmes proteínov. Proteíny, ktorých veľkosť je menšia ako veľkosť pórov Sephadexu, sú zadržané v stĺpci, pretože sú „uviaznuté“ v póroch, zatiaľ čo zvyšok voľne opúšťa stĺpec (obr. 2.1). Veľkosť proteínu závisí od jeho molekulovej hmotnosti.

Ryža. 2.1. Separácia proteínov gélovou filtráciou

Ultracentrifugácia

Táto metóda je založená na rôznych rýchlostiach sedimentácie (precipitácie) molekúl proteínov v roztokoch s rôznym gradientom hustoty (sacharózový pufor alebo chlorid cézny) (obr. 2.2).

Ryža. 2.2. Separácia proteínov ultracentrifugáciou

Elektroforéza

Táto metóda je založená na rôznych rýchlostiach migrácie proteínov a peptidov v elektrickom poli v závislosti od náboja.

Gély, acetát celulózy a agar môžu slúžiť ako nosiče pre elektroforézu. Oddelené molekuly sa pohybujú v géli v závislosti od ich veľkosti: tie, ktoré sú väčšie, budú pri prechode cez póry gélu oneskorené. Menšie molekuly budú čeliť menšiemu odporu, a preto sa budú pohybovať rýchlejšie. Výsledkom je, že po elektroforéze budú väčšie molekuly bližšie k štartu ako menšie (obr. 2.3).

Ryža. 2.3. Separácia proteínov gélovou elektroforézou

Elektroforéza sa môže použiť aj na separáciu proteínov podľa molekulovej hmotnosti. Na to používajú PAGE elektroforéza v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-Na).

Izolácia jednotlivých proteínov

Afinitná chromatografia

Metóda je založená na schopnosti proteínov silne sa viazať na rôzne molekuly prostredníctvom nekovalentných väzieb. Používa sa na izoláciu a čistenie enzýmov, imunoglobulínov a receptorových proteínov.

Molekuly látok (ligandy), na ktoré sa špecificky viažu určité proteíny, sú kovalentne spojené s časticami inertnej látky. Proteínová zmes sa pridá do kolóny a požadovaný proteín sa pevne pripojí k ligandu. Zvyšné proteíny opúšťajú kolónu voľne. Zadržaný proteín sa potom môže z kolóny vymyť pomocou roztoku pufra obsahujúceho voľný ligand. Táto vysoko citlivá metóda umožňuje izolovať veľmi malé množstvá proteínu v čistej forme z bunkového extraktu obsahujúceho stovky iných proteínov.

Izoelektrické zaostrovanie

Metóda je založená na rôznych IET hodnotách proteínov. Proteíny sa oddeľujú elektroforézou na platni s amfolínom (ide o látku, v ktorej je vopred vytvorený gradient pH v rozmedzí od 3 do 10). Počas elektroforézy sa proteíny separujú podľa ich hodnoty IET (v IET bude náboj proteínu nulový a nebude sa pohybovať v elektrickom poli).

2D elektroforéza

Ide o kombináciu izoelektrickej fokusácie a elektroforézy s SDS-Na. Elektroforéza sa najskôr uskutoční v horizontálnom smere na platni s amfolínom. Proteíny sú separované na základe náboja (IET). Potom sa platňa ošetrí roztokom SDS-Na a uskutoční sa elektroforéza vo vertikálnom smere. Proteíny sú separované na základe molekulovej hmotnosti.

Imunoelektroforéza (Western blot)

Analytická metóda používaná na identifikáciu špecifických proteínov vo vzorke (obrázok 2.4).

Izolácia proteínov z biologického materiálu.

Separácia proteínov podľa molekulovej hmotnosti elektroforézou v PAGE s SDS-Na.

Prenos bielkovín z gélu na polymérnu platňu na uľahčenie ďalšej práce.

Ošetrenie platne roztokom nešpecifického proteínu na vyplnenie zostávajúcich pórov.

Po tejto fáze sa teda získa doštička, ktorej póry obsahujú oddelené proteíny a priestor medzi nimi je vyplnený nešpecifickým proteínom. Teraz musíme určiť, či medzi proteínmi je ten, ktorý hľadáme a ktorý je zodpovedný za nejakú chorobu. Na detekciu sa používa liečba protilátkami. Primárne protilátky sú protilátky proti proteínu záujmu. Sekundárne protilátky znamenajú protilátky proti primárnym protilátkam. K sekundárnym protilátkam sa pridá ďalšia špeciálna značka (takzvaná molekulárna sonda), aby bolo možné následne vizualizovať výsledky. Ako značka sa používa rádioaktívny fosfát alebo enzým pevne naviazaný na sekundárnu protilátku. Väzba najprv na primárne a potom na sekundárne protilátky má dva účely: štandardizáciu metódy a zlepšenie výsledkov.

Ošetrenie roztokom primárnych protilátok  väzba nastáva v mieste platničky, kde sa nachádza antigén (požadovaný proteín).

Odstránenie nenaviazaných protilátok (premývanie).

Liečba roztokom značených sekundárnych protilátok pre následný vývoj.

Odstránenie nenaviazaných sekundárnych protilátok (premývanie).

Ryža. 2.4. Imunoelektroforéza (Western blot)

Ak je požadovaný proteín prítomný v biologickom materiáli, na platni sa objaví pás, ktorý indikuje väzbu tohto proteínu na zodpovedajúce protilátky.