Centrifugavimo metodas pagrįstas skirtingu dalelių elgesiu centrifugos sukurtame išcentriniame lauke. Mėginys centrifugos inde dedamas į rotorių, varomą centrifugos pavara. Norint atskirti dalelių mišinį, reikia pasirinkti tam tikras sąlygas, tokias kaip sukimosi greitis, centrifugavimo laikas ir rotoriaus spindulys. Sferinių dalelių nusėdimo (sedimentacijos) greitis priklauso ne tik nuo pagreičio, bet ir nuo dalelių spindulio bei tankio, taip pat nuo terpės, kurioje nusodinamas mėginys, klampumo.

Centrifugavimą galima suskirstyti į du tipus: paruošiamąjį ir analitinį. Paruošiamasis centrifugavimas naudojamas, kai reikia atskirti dalį mėginio tolesnei analizei. Šis metodas naudojamas ląstelėms izoliuoti nuo suspensijos, biologinių makromolekulių ir kt.

Analitinis centrifugavimas naudojamas tiriant biologinių makromolekulių elgseną išcentriniame lauke. Šis metodas leidžia gauti duomenis apie molekulių, esančių santykinai mažuose mėginio tūriuose, masę, formą ir dydį. Paruošiamasis centrifugavimas yra dažniausiai naudojamas būdas kasdienėje laboratorinėje praktikoje.

Paruošiamosios laboratorinės centrifugos savo ruožtu skirstomos į grupes pagal paskirtį: paruošiamąsias ultracentrifugas, bendrosios paskirties centrifugas ir greitąsias centrifugas. Bendrosios paskirties centrifugos turi didžiausią praktinį pritaikymą medicinos laboratorijose, jų maksimalus greitis siekia iki 6 tūkst. Pagrindinis šio tipo prietaisų bruožas yra gana didelė talpa – iki 6 litrų, todėl centrifugavimui galima naudoti ne tik centrifuginius mėgintuvėlius iki 100 ml, bet ir talpas iki 1,25 l. Visose bendrosios paskirties centrifugose rotoriai yra standžiai sumontuoti ant pavaros veleno, todėl centrifuguojami konteineriai turi būti gana tiksliai subalansuoti. Kad būtų išvengta lūžimo, į rotorių negalima dėti nelyginio mėgintuvėlių skaičiaus, o nepilno pakrovimo atveju indas turi būti dedamas vienas priešais kitą.

Didelio greičio centrifugų maksimalus greitis siekia 25 tūkst. aps./min., o pagreitis – iki 89 tūkst. g. Kameroje, kurioje yra rotorius ir centrifuguojami mėginiai, yra aušinimo sistema, neleidžianti šilumai susidaryti dėl trinties, kai rotorius sukasi dideliu greičiu. Paprastai šios centrifugos gali apdoroti iki 1,5 litro tūrį ir yra su kampiniais arba keičiamais dubens rotoriais.

Paruošiamosios ultracentrifugos įsibėgėja iki 75 000 aps./min., o didžiausias išcentrinis pagreitis yra 510 tūkst. Juose įrengti šaldymo ir vakuuminiai įrenginiai, kad rotorius neperkaistų dėl oro trinties. Šių centrifugų rotoriai pagaminti iš didelio stiprumo titano arba aliuminio lydinių. Ultracentrifugų velenas, priešingai nei greitųjų ir paruošiamųjų, yra lankstus, kad sumažintų vibraciją, kai rotorius yra išbalansuotas. Rotoriaus talpos turi būti kruopščiai subalansuotos dešimtosios gramo dalies tikslumu.

2.5.1 Gradientų pobūdis

Tirpalų tankio gradientams sukurti dažniausiai naudojami sacharozės tirpalai, kartais su fiksuotu pH. Kai kuriais atvejais geras atskyrimas pasiekiamas naudojant D 2 0 vietoj įprasto vandens. 2.1 parodytos kai kurių sacharozės tirpalų savybės.

Gradiento pasirinkimą lemia specifinės frakcionavimo užduotys. Pavyzdžiui, fikolis, kurį gamina Pharmacia Fine Chemicals, gali pakeisti sacharozę tais atvejais, kai reikia sukurti didelio tankio ir mažo osmosinio slėgio gradientus. Kitas ficol privalumas yra tai, kad jis neprasiskverbia pro ląstelių membranas. Didesnio tankio gradientams sukurti naudojamos sunkiųjų metalų druskos, tokios kaip rubidis ir cezis, tačiau dėl korozinio CsCl poveikio tokie gradientai naudojami tik rotoriuose, pagamintuose iš atsparių metalų, pavyzdžiui, titano.

2.5.2 Žingsnio tankio gradiento technika

Norint sukurti tankio gradientą, keli tirpalai, kurių tankis paeiliui mažėja, atsargiai pipete įleidžiami į centrifugos mėgintuvėlį. Tada ant viršutinio sluoksnio, kuris turi mažiausią tankį, mėginys sluoksniuojamas siauros zonos pavidalu, po to mėgintuvėlis centrifuguojamas. Lygius tiesinius gradientus galima gauti išlyginus laipsniškus gradientus ilgai stovint tirpalui. Procesą galima paspartinti švelniai maišant mėgintuvėlio turinį viela arba švelniai purtant mėgintuvėlį.

2.5.3 Tolygaus tankio gradiento sukūrimo technika

Daugeliu atvejų sklandžiai tankio gradientui sukurti naudojamas specialus įtaisas. Jį sudaro du griežtai apibrėžto vienodo skersmens cilindriniai indai, kurie dugne susisiekia vienas su kitu stikliniu vamzdeliu su valdymo vožtuvu, leidžiančiu reguliuoti abiejų indų turinio maišymo proporcijas. Viename iš jų yra maišytuvas ir išleidimo anga, per kurią tirpalas patenka į centrifugos mėgintuvėlius. Į maišytuvą dedamas tankesnis tirpalas; antrasis cilindras pripildytas mažesnio tankio tirpalu. Tirpalų kolonėlės aukštis abiejuose cilindruose nustatomas taip, kad hidrostatinis slėgis juose būtų vienodas. Tankesnis tirpalas palaipsniui išleidžiamas iš maišytuvo į centrifugos vamzdelius ir tuo pačiu metu pakeičiamas tokiu pat kiekiu mažesnio tankio tirpalo, patenkančio į maišytuvą iš antrojo cilindro per valdymo vožtuvą. Tirpalo homogeniškumas maišytuve užtikrinamas nuolat maišant tirpalą maišytuvu. Tirpalui nusausinant į centrifugos mėgintuvėlius, jo tankis mažėja ir mėgintuvėliuose susidaro linijinis tankio gradientas. Netiesinius gradientus galima sukurti naudojant sistemą, kurią sudaro du nevienodo skersmens cilindrai.

Skirtingo statumo tankio gradientams formuoti naudojama dviejų mechaniškai valdomų švirkštų sistema, užpildyta nevienodo tankio tirpalais. Keičiant santykinį stūmoklių greitį galima sukurti įvairius gradientus.

2.5.4 Gradientų ištraukimas iš centrifugos mėgintuvėlių

Pasibaigus centrifugavimui ir atskirus daleles, susidariusias zonas reikia pašalinti. Tai atliekama keliais būdais, dažniausiai taikant poslinkio metodą. Centrifugos vamzdelis praduriamas prie pagrindo ir į jo apatinę dalį lėtai įleidžiama labai tanki terpė, pavyzdžiui, 60-70% sacharozės tirpalas. Viršutinis tirpalas išstumiamas, o frakcijos surenkamos naudojant švirkštą, pipetę arba specialų prietaisą, prijungtą per vamzdelį prie frakcijų rinktuvo. Jei vamzdeliai pagaminti iš celiuliozės arba nitroceliuliozės, frakcijos išgaunamos perpjaunant vamzdelį specialiu peiliuku. Tam tiesiai po norima zona nupjaunamas stove pritvirtintas centrifugos vamzdelis ir frakcija išsiurbiama švirkštu arba pipete. Tinkamai suprojektavus pjovimo įrenginį, tirpalo praradimas bus minimalus. Frakcijos taip pat renkamos plona tuščiavidure adata praduriant mėgintuvėlio pagrindą. Lašai, tekantys iš vamzdelio per adatą, surenkami į frakcijų rinktuvą tolesnei analizei.

2.5.5 Paruošiamosios centrifugos ir jų pritaikymas

Parengiamąsias centrifugas galima suskirstyti į tris pagrindines grupes: bendrosios paskirties centrifugas, greitaeigias centrifugas ir preparatines ultracentrifugas. Bendrosios paskirties centrifugos maksimalus greitis yra 6000 aps./min -1 ir OCU iki 6000 g . Jie skiriasi vienas nuo kito tik talpa ir turi nemažai keičiamų rotorių: kampinių ir su pakabinamais stiklais. Viena iš šio tipo centrifugų ypatybių yra didelė talpa – nuo ​​4 iki 6 dm 3 , leidžianti į jas krauti ne tik 10,50 ir 100 cm 3 centrifugų vamzdelius, bet ir indus, kurių talpa iki 1,25 dm 3 . Visose šio tipo centrifugose rotoriai yra tvirtai pritvirtinti prie pavaros veleno, o centrifugos vamzdeliai kartu su jų turiniu turi būti kruopščiai subalansuoti ir skirtis svoriu ne daugiau kaip 0,25 g. turi būti dedami simetriškai, vienas prieš kitas, taip užtikrinant vienodą mėgintuvėlių pasiskirstymą rotoriaus sukimosi ašies atžvilgiu.

Didelio greičio centrifugos maksimalus greitis yra 25 000 aps./min -1 ir OCU iki 89 000 g. Rotoriaus kameroje yra aušinimo sistema, kuri neleidžia įkaisti dėl trinties rotoriaus sukimosi metu. Paprastai didelės spartos centrifugos yra 1,5 dm 3 talpos ir yra su keičiamais rotoriais, tiek kampiniais, tiek su pakabinamais stiklais.

Paruošiamosios ultracentrifugos maksimalus greitis iki 75 000 aps./min -1 ir maksimalus išcentrinis pagreitis 510 000 g . Juose yra ir šaldytuvas, ir vakuuminis blokas, kad rotorius neperkaistų dėl jo trinties su oru. Tokių centrifugų rotoriai pagaminti iš didelio stiprumo aliuminio arba titano lydinių. Dažniausiai naudojami aliuminio lydinio rotoriai, tačiau tais atvejais, kai reikia ypač didelių greičių, naudojami titano rotoriai. Siekiant sumažinti vibraciją, atsirandančią dėl rotoriaus disbalanso dėl netolygaus centrifugos vamzdelių užpildymo, ultracentrifugos turi lankstų veleną. Centrifugų mėgintuvėliai ir jų turinys turi būti kruopščiai subalansuoti 0,1 g tikslumu.. Panašių reikalavimų reikia laikytis ir apkraunant bendros paskirties centrifugų rotorius.

2.6 Rotorių konstrukcija

2.6.1 Kampiniai rotoriai ir rotoriai su pakabinamais kaušais

Paruošiamųjų centrifugų rotoriai dažniausiai būna dviejų tipų – kampiniai ir pakabinami kaušai. Jie vadinami kampiniais, nes juose įtaisyti centrifugos vamzdeliai visada yra tam tikru kampu sukimosi ašies atžvilgiu. Rotoriuose su pakabintais stiklais mėgintuvėliai montuojami vertikaliai, o sukdami, veikiami susidariusios išcentrinės jėgos, pasislenka į horizontalią padėtį; pasvirimo kampas į sukimosi ašį yra 90°.

Kampiniuose rotoriuose atstumas, kurį dalelės nukeliauja iki atitinkamos mėgintuvėlio sienelės, yra labai mažas, todėl nusėdimas vyksta gana greitai. Susidūrusios su mėgintuvėlio sienelėmis dalelės slysta žemyn ir apačioje susidaro nuosėdos. Centrifuguojant susidaro konvekciniai srautai, kurie labai apsunkina panašių nusėdimo savybių dalelių atskyrimą. Nepaisant to, panašaus dizaino rotoriai sėkmingai naudojami atskirti daleles, kurių nusėdimo greitis labai skiriasi.

Rotoriuose su kabančiomis taurelėmis taip pat stebimi konvekcijos reiškiniai, tačiau jie nėra tokie ryškūs. Konvekcija atsiranda dėl to, kad, veikiant išcentriniam pagreičiui, dalelės nusėda kryptimi, kuri nėra griežtai statmena sukimosi ašiai, todėl, kaip ir kampiniuose rotoriuose, atsitrenkia į mėgintuvėlio sieneles ir nuslysta į apačia.

Konvekcijos ir sūkurio efektų tam tikru mastu galima išvengti naudojant sektorinius vamzdžius kabančių puodelių rotoriuose ir reguliuojant rotoriaus greitį; Išvardintas aukščiau, centrifugavimo pagal tankio gradientą metodas taip pat neturi trūkumų.

2.6.2 Ištisiniai rotoriai

Nepertraukiami rotoriai yra skirti greitam sąlyginai nedidelių kietos medžiagos kiekių frakcionavimui iš didelio tūrio suspensijų, pavyzdžiui, ląstelėms atskirti nuo auginimo terpės. Centrifuguojant į rotorių nuolat pilama dalelių suspensija; rotoriaus pralaidumas priklauso nuo nusodinto preparato pobūdžio ir svyruoja nuo 100 cm 3 iki 1 dm 3 per 1 min. Rotoriaus ypatumas yra tas, kad tai yra izoliuota specialios konstrukcijos kamera; jo turinys nesusisiekia su išorine aplinka, todėl nėra užterštas ar purškiamas.

2.6.3 Zoniniai arba Andersono rotoriai

Zoniniai rotoriai gaminami iš aliuminio arba titano lydinių, kurie gali atlaikyti labai didelius išcentrinius pagreičius. Paprastai jie turi cilindrinę ertmę, uždarą nuimamu dangteliu. Ertmės viduje, ant sukimosi ašies, yra ašinis vamzdis, ant kurio uždedamas antgalis su mentėmis, dalijantis rotoriaus ertmę į keturis sektorius. Mentės arba pertvaros turi radialinius kanalus, per kuriuos įpurškiamas gradientas nuo ašinio vamzdžio iki rotoriaus periferijos. Dėl šios ašmenų konstrukcijos konvekcija sumažinama iki minimumo.

Rotoriaus užpildymas atliekamas jam sukantis maždaug 3000 aps./min -1 greičiu. Iš anksto sukurtas gradientas pumpuojamas į rotorių, pradedant nuo mažiausio tankio sluoksnio, kuris yra tolygiai paskirstytas išilgai rotoriaus periferijos ir laikomas prie jo išorinės sienelės statmenai sukimosi ašiai dėl išcentrinės jėgos. . Vėliau pridedant didesnio tankio gradiento sluoksnius, vyksta nuolatinis poslinkis mažiau tankių sluoksnių centro link. Po to, kai visas gradientas yra pumpuojamas į rotorių, jis iki viso tūrio užpildomas tirpalu, vadinamu „pagalve“, kurio tankis yra toks pat arba šiek tiek viršija didžiausią iš anksto suformuoto gradiento tankį.

Tada per ašinį vamzdelį tiriamasis mėginys yra sluoksniuojamas , kuris iš vamzdelio išstumiamas į rotoriaus tūrį naudojant mažesnio tankio tirpalą, o iš periferijos pašalinamas toks pat „pagalvėlės“ tūris. Po visų šių procedūrų rotoriaus sukimosi greitis padidinamas iki darbinio greičio ir reikiamą laiką atliekama arba zoninė, arba zoninė-izopikninė frakcionavimas. . Frakcijų ekstrahavimas atliekamas 3000 aps./min -1 rotoriaus greičiu. Rotoriaus turinys išstumiamas pridedant „pagalvėlę“ iš periferijos, pirmiausia išstumiami mažiau tankūs sluoksniai . Dėl ypatingos Anderson rotoriaus ašinio kanalo konstrukcijos nesimaišo zonos jų poslinkio metu. Išeinantis gradientas perduodamas per registravimo įrenginį, pavyzdžiui, spektrofotometro kamerą, su kuria baltymų kiekis gali būti nustatomas absorbuojant 280 nm, arba per specialų radioaktyvumo detektorių, po kurio surenkamos frakcijos.

Vidutiniu greičiu naudojamų zoninių rotorių talpa svyruoja nuo 650 iki 1600 cm 3, todėl galima gauti gana didelį kiekį medžiagos. Zoniniai rotoriai naudojami baltymų teršalams pašalinti iš įvairių preparatų ir izoliuoti bei išvalyti mitochondrijas, lizosomas, polisomas ir baltymus.

2.6.4 Subląstelinių frakcijų analizė

Poląstelinių dalelių preparato, gauto frakcionuojant, savybes galima priskirti pačių dalelių savybėms tik tuo atveju, jei preparate nėra priemaišų. Todėl visada būtina įvertinti gautų preparatų grynumą. Mikroskopiniu tyrimu galima nustatyti homogenizacijos efektyvumą ir priemaišų buvimą preparate. Tačiau matomų priemaišų nebuvimas dar nėra patikimas vaisto grynumo įrodymas. Norint kiekybiškai įvertinti gauto preparato grynumą, jam atliekama cheminė analizė, kuri leidžia nustatyti baltymų ar DNR kiekį jame, nustatyti, jei įmanoma, fermentinį aktyvumą ir imunologines savybes.

Fermentų pasiskirstymo frakcionuotuose audiniuose analizė grindžiama dviem bendrais principais. Pirmasis iš jų yra tas, kad visos tam tikros tarpląstelinės populiacijos dalelės turi tą patį fermentų rinkinį. Antrasis reiškia, kad kiekvienas fermentas yra lokalizuotas tam tikroje ląstelės vietoje. Jei ši pozicija būtų teisinga, fermentai galėtų veikti kaip atitinkamų organelių žymenys: pavyzdžiui, citochromo oksidazė ir monoaminooksidazė veiktų kaip mitochondrijų žymenų fermentai, rūgštinės hidrolazės kaip lizosomų žymenys, katalazė kaip peroksisomų žymeklis ir gliukozė-6- fosfatazė – mikrosominės membranos žymuo. Tačiau paaiškėjo, kad kai kurie fermentai, tokie kaip malato dehidrogenazė, R-gliukuronidazė, NADP "H-citochromo-c-reduktazė, yra lokalizuota daugiau nei vienoje frakcijoje. Todėl kiekvienu konkrečiu atveju reikia labai atsargiai pasirinkti tarpląstelinių frakcijų fermentų žymenis. Be to, žymeklio fermento nebuvimas nereiškia tinkamų Organelių nebuvimo Tikėtina, kad frakcionuojant fermentą organelės praranda arba jis yra slopinamas arba inaktyvuojamas, todėl kiekvienai frakcijai paprastai nustatomi bent du žymeniniai fermentai.

Frakcija	Tūris, cm"	Bendras veisimas	Eksuliacija, 660 nm	Fermentų aktyvumo vienetai	Aktyvumo išeiga trupmenomis,%

2.7 Frakcionavimas diferenciniu centrifugavimu

2.7.1 Rezultatų pristatymas

Audinių frakcionavimo rezultatai patogiausiai pateikiami grafikų pavidalu. Taigi, tiriant fermentų pasiskirstymą audiniuose, duomenys geriausiai pateikiami histogramų pavidalu, leidžiančių vizualiai įvertinti eksperimentų rezultatus.

Baltymų kiekio fermentinis aktyvumas mėginyje nustatomas tiek pirminiame homogenate, tiek kiekvienoje išskirtoje tarpląstelinėje frakcijoje atskirai. Bendras fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis frakcijose neturėtų labai skirtis nuo atitinkamų verčių pradiniame homogenate.

Tada kiekvienoje frakcijoje apskaičiuojamas fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis procentais nuo bendros išeigos, pagal kurią daroma histograma. Santykinis baltymų kiekis kiekvienoje frakcijoje paeiliui brėžiamas išilgai abscisių ašies jų išskyrimo tvarka, o santykinis kiekvienos frakcijos specifinis aktyvumas – išilgai ordinačių ašies. Taigi kiekvienos frakcijos fermentinis aktyvumas nustatomas pagal strypų plotą.

2.7.2 Analitinis ultracentrifugavimas

Skirtingai nuo preparatinės centrifugavimo, kurios tikslas – atskirti medžiagas ir jas išvalyti, analitinė ultracentrifuga daugiausia naudojama biologinių makromolekulių ir kitų struktūrų nusėdimo savybėms tirti. Todėl analitiniame centrifugavime naudojami specialios konstrukcijos rotoriai ir registravimo sistemos: jie leidžia nuolat stebėti medžiagos nusėdimą. in išcentrinis laukas.

Analitinės ultracentrifugos gali pasiekti greitį iki 70 000 aps./min -1, o generuoti išcentrinį pagreitį iki 500 000 g . Jų rotorius, kaip taisyklė, yra elipsoido formos ir styga sujungtas su varikliu, todėl galima keisti rotoriaus sukimosi greitį. Rotorius sukasi vakuuminėje kameroje su šaldymo įtaisu ir turi dvi analizines ir balansavimo kameras, kurios centrifugoje sumontuotos griežtai vertikaliai, lygiagrečiai sukimosi ašiai. Balansavimo elementas skirtas analitinės ląstelės balansavimui ir yra metalinis blokas su tikslia sistema. Jame taip pat yra dvi rodyklės skylės, esančios griežtai apibrėžtu atstumu nuo sukimosi ašies, kurių pagalba nustatomi atitinkami atstumai analizės langelyje. Analitinė ląstelė, kurios talpa paprastai yra 1 cm 3, yra sektorinės formos. Tinkamai įmontuotas į rotorių, nors jis yra vertikaliai, jis veikia tuo pačiu principu kaip ir rotorius su pakabinamomis kaušais, todėl susidaro beveik idealios sedimentacijos sąlygos. Analitinės kameros galuose yra langai su kvarciniais stiklais. Analitinėse ultracentrifugose įrengtos optinės sistemos, leidžiančios stebėti dalelių nusėdimą per visą centrifugavimo laikotarpį. Iš anksto nustatytais laiko intervalais nuosėdų medžiaga gali būti fotografuojama. Frakcionuojant baltymus ir DNR, sedimentacija stebima absorbuojant ultravioletiniuose spinduliuose, o tais atvejais, kai tiriami tirpalai turi skirtingus lūžio rodiklius, naudojant Schlieren sistemą arba Rayleigh interferencinę sistemą. Paskutiniai du metodai pagrįsti tuo, kad kai šviesa praeina per skaidrų tirpalą, susidedantį iš skirtingo tankio zonų, šviesa lūžta ties zonos riba. Sedimentacijos metu tarp zonų su sunkiosiomis ir lengvosiomis dalelėmis susidaro riba, kuri veikia kaip refrakcinis lęšis; šiuo atveju ant fotografinės plokštelės, naudojamos kaip detektorius, atsiranda smailė. Sedimentacijos metu juda riba, taigi ir smailė, pagal kurios greitį galima spręsti apie medžiagos nusėdimo greitį. Interferometrinės sistemos yra jautresnės nei Schlieren sistemos. Analitinės ląstelės yra vieno sektoriaus, kurios naudojamos dažniausiai, ir dviejų sektorių, kurios naudojamos lyginamajam tirpiklio ir tirpios medžiagos tyrimui.

Biologijoje analitinis ultracentrifugavimas naudojamas makromolekulių molekulinėms masėms nustatyti, gautų mėginių grynumui patikrinti, makromolekulių konformaciniams pokyčiams tirti.

2.8 Analitinio ultracentrifugavimo taikymas

2.8.1 Molekulinių masių nustatymas

Yra trys pagrindiniai molekulinės masės nustatymo metodai, naudojant analitinį ultracentrifugavimą: sedimentacijos greičio nustatymas, sedimentacijos pusiausvyros metodas ir sedimentacijos pusiausvyros aproksimacijos metodas.

Molekulinės masės nustatymas nusėdimo greičiu tai yra labiausiai paplitęs metodas. Centrifugavimas atliekamas dideliu greičiu, kad dalelės, iš pradžių tolygiai paskirstytos visame tūryje, pradėtų judėti spinduliu nuo sukimosi centro. Tarp tirpiklio srities, kurioje jau nėra dalelių, ir tos jo dalies, kurioje jos yra, susidaro aiški sąsaja. Ši riba juda centrifuguojant, todėl galima nustatyti dalelių nusėdimo greitį vienu iš aukščiau pateiktų metodų, registruojant šį judėjimą fotografinėje plokštelėje.

Sedimentacijos greitis nustatomas pagal šį ryšį:

kur X - atstumas nuo sukimosi ašies cm,

t - laikas s,

w yra kampinis greitis rad-s -1 ,

s - sedimentacijos koeficientas "molekulė.

Sedimentacijos koeficientas yra greitis vienam pagreičio vienetui, jis matuojamas Seedberg vienetai ; 1 Švedbergo vienetas lygus 10 _13 s. Skaitinė s reikšmė priklauso nuo dalelių molekulinės masės ir formos ir yra tam tikrai molekulei ar supramolekulinei struktūrai būdinga reikšmė. Pavyzdžiui, lizocimo sedimentacijos koeficientas yra 2,15 S; katalazės sedimentacijos koeficientas yra 11,35S, bakterijų ribosomų subvienetai – nuo ​​30 iki 50S, o eukariotų ribosomų subvienetai – nuo ​​40 iki 60S.

kur M yra molekulės molekulinė masė, R yra dujų konstanta, T - absoliuti temperatūra, s - molekulės sedimentacijos koeficientas, D yra molekulės difuzijos koeficientas, v - dalinis savitasis tūris, kuris gali būti laikomas tūriu, kurį užima vienas gramas ištirpusios medžiagos, p - tirpiklio tankis.

Sedimentacijos balanso metodas. Molekulinės masės šiuo metodu nustatomos esant santykinai mažam rotoriaus greičiui, maždaug 7000-8000 aps./min -1, kad didelės molekulinės masės molekulės nenusėstų ant dugno. Ultracentrifugavimas atliekamas tol, kol dalelės pasiekia pusiausvyrą, kuri susidaro veikiant išcentrinėms jėgoms, viena vertus, ir difuzijos jėgoms, kita vertus, tai yra, kol dalelės nustos judėti. Tada pagal gautą koncentracijos gradientą apskaičiuojama medžiagos molekulinė masė "pagal formulę

kur R yra dujų konstanta, T - absoliuti temperatūra, o - kampinis greitis, p - tirpiklio tankis, v - dalinis specifinis tūris, Su X ir Su 2 yra tirpios medžiagos koncentracija per atstumus G G ir r 2 nuo sukimosi ašies.

Šio metodo trūkumas yra tas, kad nusėdimo pusiausvyrai pasiekti reikia daug laiko – nuo ​​kelių dienų iki kelių savaičių, nuolat veikiant centrifugai.

Sedimentacijos pusiausvyros nustatymo metodas buvo sukurtas siekiant atsikratyti ankstesnio metodo trūkumų, susijusių su didelėmis laiko investicijomis, reikalingomis „pusiausvyrai nustatyti. Naudojant šį metodą, galima nustatyti molekulines mases, kai centrifuguojamas tirpalas yra priartėjimo prie pusiausvyros būsenos.Pirmiausia makromolekulės tolygiai pasiskirsto visame analitinės ląstelės tūryje, paskui centrifuguojant molekulės nusėda, o tirpalo tankis menisko srityje palaipsniui mažėja. kruopščiai užrašoma, o tada, atliekant sudėtingus skaičiavimus, apimančius daug kintamųjų, tam tikro junginio molekulinė masė nustatoma pagal formules:

kur R yra dujų konstanta, T yra absoliuti temperatūra, v - dalinis savitasis tūris, p – tirpiklio tankis, dcldr - makromolekulės koncentracijos gradientas, g m ir g d - atitinkamai atstumas iki menisko ir vamzdelio dugno, c m ir s d - makromolekulių koncentracija atitinkamai menike ir vamzdelio apačioje, M m ir M R -molekulinių masių vertės, nustatomos atitinkamai pagal medžiagos koncentracijos pasiskirstymą menisku ir mėgintuvėlio dugne.

2.8.2 Preparatų grynumo įvertinimas

DNR, virusų ir baltymų preparatų grynumui įvertinti plačiai taikomas analitinis ultracentrifugavimas. Preparatų grynumas neabejotinai labai svarbus tais atvejais, kai reikia tiksliai nustatyti molekulės molekulinę masę. Daugeliu atvejų preparato homogeniškumą galima spręsti pagal sedimentacijos ribos pobūdį, taikant sedimentacijos greičio metodą: homogeniškas preparatas dažniausiai duoda vieną aiškiai apibrėžtą ribą. Priemaišos, esančios preparate, atrodo kaip papildoma smailė arba mentė; jie taip pat lemia pagrindinės smailės asimetriją.

2.8.3 Makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas

Kita analitinės ultracentrifugavimo taikymo sritis yra makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas. Pavyzdžiui, DNR molekulė gali būti viengrandė arba dvigrandė, linijinė arba apskrita. Įvairių junginių įtakoje arba aukštesnėje temperatūroje DNR patiria nemažai grįžtamųjų ir negrįžtamų konformacinių pokyčių, kuriuos galima nustatyti keičiant mėginio nusėdimo greitį. Kuo molekulė kompaktiškesnė, tuo mažesnis jos trinties koeficientas tirpale ir atvirkščiai: kuo ji mažiau kompaktiška, tuo didesnis trinties koeficientas ir, atitinkamai, lėčiau ji nusėda. Taigi, mėginio sedimentacijos greičio skirtumai prieš ir po įvairaus poveikio jam leidžia aptikti makromolekulėse vykstančius konformacinius pokyčius.

Allosteriniuose baltymuose, tokiuose kaip, pavyzdžiui, aspartato transkarbamoilazė, konformaciniai pokyčiai atsiranda dėl jų prisijungimo prie substrato ir mažų ligandų. Baltymų disociacija į subvienetus gali būti paskatinta jį apdorojant tokiomis medžiagomis kaip karbamidas arba parachlormerkuribenzoatas. Visus šiuos pokyčius galima lengvai stebėti naudojant analitinį ultracentrifugavimą.

Vamzdžių gaminių formavimas metodu centrifugavimas. Pagal centrifugavimas statybinių medžiagų pramonėje ... kurioms toks poveikis atliekamas yra vadinami centrifugavimas. Baltarusijos Respublikos pramonėje naudojamos horizontalios centrifugos ...

Dalelių nusodinimas

Laboratoriniai darbai >> Chemija

Ląstelės jau išleistos mažu greičiu centrifugavimas iš branduolio, mitochondrijų ir... ultracentrifugavimo Šio tipo ypatybės centrifugavimas atsispindi jos labai... mums naudojimo atvejais centrifugavimas sacharozės tankio gradiente, ...

Naudojant centrifugą

Kursiniai darbai >> Pramonė, gamyba

Partijinėse centrifugose įvairios operacijos centrifugavimas- pakrovimas, atskyrimas, iškrovimas - įvyksta ... atskirti parengiamąjį ir analitinį centrifugavimas. Su parengiamuoju centrifugavimas paimama biologinė medžiaga...

Kursinis darbas

centrifugavimas

1. Metodo principas

Medžiagų atskyrimas centrifugavimo būdu pagrįstas skirtingu dalelių elgesiu išcentriniame lauke. Į mėgintuvėlį patalpinta dalelių suspensija sukraunama į rotorių, sumontuotą ant centrifugos pavaros veleno.

Išcentriniame lauke skirtingo tankio, formos ar dydžio dalelės nusėda skirtingu greičiu. Sedimentacijos greitis priklauso nuoišcentrinis pagreitis, tiesiogiai proporcingas rotoriaus kampiniam greičiui ir atstumui tarp dalelės ir sukimosi ašies:

o išcentrinis pagreitis tada bus

Kadangi vienas rotoriaus apsisukimas yra2p radianais, rotoriaus kampinis greitis apsisukimais per minutę gali būti parašytas taip:

Išcentrinis pagreitis paprastai išreiškiamas vienetaisg ir paskambinosantykinis išcentrinis pagreitis , t.y.

arba

Išvardydami dalelių atskyrimo sąlygas, nurodykite rotoriaus sukimosi greitį ir spindulį, taip pat centrifugavimo laiką. Išcentrinis pagreitis paprastai išreiškiamas vienetaisg , apskaičiuojamas pagal vidutinį skysčio kolonėlės sukimosi spindulįincentrifugos vamzdelis. Remdamiesi lygtimi, Dole ir Kotzias sudarė nomogramą, išreiškiančią GCC priklausomybę nuo rotoriaus greičio ir spindulio r.

Ryžiai. 2 .1. Nomograma, skirta išcentriniam pagreičiui apskaičiuoti.

Norint nustatyti O, rotoriaus spindulio ir sukimosi greičio vertės ekstremaliose skalėse yra sujungtos tiesia linija; šios tiesės susikirtimo taškas su vidutine skale suteikia norimą išcentrinio pagreičio reikšmę. Reikėtų nepamiršti, kad dešinysis skalės skaičių stulpelis O atitinka dešinįjį rotoriaus greičio skalės skaičių stulpelį; kairė - kairė.

Sferinių dalelių nusėdimo greitis priklauso ne tik nuo išcentrinio pagreičio, bet ir nuo pačių dalelių tankio bei spindulio bei nuo suspensijos terpės klampumo. Laikas, reikalingas sferinės dalelės nusėdimui skystoje terpėje nuo skysto menisko iki centrifugos vamzdžio dugno, yra atvirkščiai proporcingas nusėdimo greičiui ir nustatomas pagal šią lygtį:

kurt - nusėdimo laikas sekundėmis,rj- terpės klampumas,Gh- dalelės spindulys, rh- dalelių tankis, p - vidutinis tankis, gm- atstumas nuo sukimosi ašies iki skysčio menisko, gd- atstumas nuo sukimosi ašies iki vamzdžio apačios.

Kaip matyti iš lygties, esant tam tikram rotoriaus greičiui, laikas, reikalingas vienalyčių sferinių dalelių nusėdimui, yra atvirkščiai proporcingas jų spindulių kvadratui ir dalelių bei terpės tankių skirtumui ir yra tiesiogiai proporcingas terpės klampumui. . Todėl nevienalyčių, maždaug sferinių dalelių, kurių tankis ir dydis skiriasi, mišinys gali būti atskirtas arba dėl skirtingo jų nusėdimo vamzdžio dugne laiko tam tikru pagreičiu, arba dėl nuosėdų dalelių pasiskirstymo vamzdyje. , kuris nustatomas po tam tikro laiko. Atskiriant medžiagas būtina atsižvelgti į tokius svarbius veiksnius kaip terpės tankis ir klampumas. Aprašytais metodais galima atskirti ląstelių organelius nuo audinių homogenatų. Pagrindiniai ląstelės komponentai nusėda tokia seka: pirmiausia ištisos ląstelės ir jų fragmentai, vėliau branduoliai, chloroplastai, mitochondrijos, lizosomos, mikrosomos ir galiausiai ribosomos. Nesferinių dalelių nusėdimas nepaklūsta lygčiai, todėl tos pačios masės, bet skirtingų formų dalelės nusėda skirtingu greičiu. Ši savybė naudojama tyrime naudojant makromolekulių konformacijos ultracentrifugavimą.

susideda iš biologinės medžiagos paskyrimo tolesniems biocheminiams tyrimams. Tokiu atveju galima paimti didelius pradinės biologinės medžiagos kiekius, pavyzdžiui, mikrobų ląsteles sėti iš paketinių ar nuolatinių kultūrų, taip pat augalų ir gyvūnų ląsteles iš audinių ir kraujo plazmos kultūrų. Paruošiamojo centrifugavimo pagalba išskiriama daug ląstelių dalelių, siekiant ištirti jų morfologiją, struktūrą ir biologinį aktyvumą. Metodas taip pat naudojamas tokioms biologinėms makromolekulėms kaip DNR ir baltymai išskirti iš anksčiau išgrynintų preparatų.

Analitinis centrifugavimas Jis daugiausia naudojamas tiriant grynus arba praktiškai grynus makromolekulių ar dalelių preparatus, tokius kaip ribosomos. Šiuo atveju naudojamas nedidelis medžiagos kiekis, o tiriamų dalelių nusėdimas nuolat fiksuojamas naudojant specialias optines sistemas. Metodas leidžia gauti duomenis apie medžiagos grynumą, molekulinę masę ir struktūrą. Bakalauro seminaruose parengiamoji centrifuga naudojama daug dažniau nei analitinė centrifuga, todėl jai skirsime daugiau dėmesio, nors abu metodai yra pagrįsti bendrais principais.

2. Paruošiamasis centrifugavimas

2 .1 Diferencinis centrifugavimas

Šis metodas pagrįstas dalelių, kurios skiriasi viena nuo kitos dydžiu ir tankiu, nusėdimo greičio skirtumais. Atskiriama medžiaga, pavyzdžiui, audinių homogenatas, centrifuguojama laipsniškai didinant išcentrinį pagreitį, kuris parenkamas taip, kad kiekviename etape tam tikra frakcija nusėda ant mėgintuvėlio dugno. Kiekvieno etapo pabaigoje nuosėdos atskiriamos nuo supernatanto ir kelis kartus plaunamos, kad galiausiai būtų gauta gryna nusodinta frakcija. Deja, praktiškai neįmanoma gauti visiškai grynų nuosėdų; Norėdami suprasti, kodėl taip nutinka, pereikime prie proceso, kuris vyksta centrifugos mėgintuvėlyje kiekvieno centrifugavimo etapo pradžioje.

Pirma, visos homogenato dalelės yra tolygiai paskirstytos centrifugos mėgintuvėlio tūryje, todėl neįmanoma gauti grynų preparatų iš sunkiausių dalelių nuosėdų per vieną centrifugavimo ciklą: pirmosiose susidariusiose nuosėdose daugiausia yra sunkiausių dalelių, tačiau be to, taip pat tam tikras kiekis visų pradinių komponentų. Pakankamai gryną sunkiųjų dalelių preparatą galima gauti tik pakartotinai suspensuojant ir centrifuguojant pradines nuosėdas. Tolesnis supernatanto centrifugavimas su vėlesniu išcentrinio pagreičio padidėjimu lemia vidutinio dydžio ir tankio dalelių nusėdimą, o po to - mažiausių mažiausio tankio dalelių nusėdimą. Ant pav. 2.3 yra žiurkių kepenų homogenato frakcionavimo diagrama.

Ryžiai. 2.2. Diferencinis dalelių suspensijos centrifugavimas išcentriniame lauke.

Pirma, dalelės tolygiai paskirstomos visame centrifugos mėgintuvėlio tūryje. (a): centrifuguojant dalelės nusėda pagal savo dydį ir formą (b - e).

Ryžiai. 2.3. Žiurkių kepenų homogenato frakcionavimo į tarpląstelines frakcijas schema.

Atrodo, kad diferencinė centrifuga yra labiausiai paplitęs ląstelių organelių išskyrimo iš audinių homogenatų metodas. Sėkmingiausiai šiuo metodu galima atskirti tokias ląstelių organoles, kurios dydžiu ir tankiu labai skiriasi viena nuo kitos. Tačiau net ir šiuo atveju gautos frakcijos niekada nėra absoliučiai vienalytės, o tolesniam jų atskyrimui naudojami kiti metodai, aprašyti toliau. Šie metodai, pagrįsti organelių tankio skirtumais, užtikrina efektyvesnį atskyrimą centrifuguojant tirpaluose su nuolatiniu arba laipsnišku tankio gradientu. Šių metodų trūkumas yra tas, kad tirpalo tankio gradientui gauti reikia laiko.

2.2 Zonos greičio centrifugavimas

Zonos greičio metodas arba, kaip dar vadinamas,s-zoninė centrifuga, kurią sudaro tiriamojo mėginio sluoksniavimas ant tirpalo paviršiaus su nuolatiniu tankio gradientu. Tada mėginys centrifuguojamas, kol dalelės pasiskirsto palei gradientą atskirose zonose arba juostose. Sukūrus tankio gradientą, galima išvengti zonų maišymosi dėl konvekcijos. Greitosios zoninės centrifugavimo metodas naudojamas RNR-DNR hibridams, ribosomų subvienetams ir kitiems ląstelių komponentams atskirti.

Ryžiai. 2 .4. Dalelių greitis ir izopikninis atskyrimas tankio gradiente. Prieš pradedant centrifugavimą, dalelių suspensija sluoksniuojama ant skysčio tankio gradiento (a). Centrifuguojant dideliu greičiu, dalelės nepasiekia izopikninio taško, o atliekant izopikninį atskyrimą, centrifuguojama tol, kol tiriamos dalelės nepasiekia atitinkamo tankio zonos. (b).

2.3 Izopikninis centrifugavimas

Izopikninis centrifugavimas atliekamas tiek tankio gradientu, tiek įprastu būdu. Jei centrifuguojama ne pagal tankio gradientą, preparatas pirmiausia centrifuguojamas taip, kad nusėstų dalelės, kurių molekulinė masė didesnė už tiriamųjų dalelių. Šios sunkiosios dalelės išmetamos, o mėginys suspenduojamas terpėje, kurios tankis yra toks pat kaip ir izoliuojamos frakcijos, o po to centrifuguojamas tol, kol tiriamos dalelės nusėda ant mėgintuvėlio dugno, o mažesnio tankio dalelės plūduriuoja į mėgintuvėlio dugną. skysčio paviršius...

Ryžiai. 2.5. Izopikninis atskyrimas be tankio gradiento.

Prieš centrifuguojant, dalelės tolygiai paskirstomos visame centrifugos mėgintuvėlio tūryje (a). Po centrifugavimo lengvesnės dalelės plūduriuoja į viršų, o sunkios dalelės nusėda vamzdelio apačioje. b)

Kitas būdas yra sluoksniuoti mėginį ant tirpalo paviršiaus su nuolatiniu tankio gradientu, apimančiu visų mišinio komponentų tankių diapazoną. Centrifuguojama tol, kol dalelių plūduriuojantis tankis yra lygus atitinkamų zonų tankiui, t.y. kol dalelės išsiskirs į zonas. Metodas vadinamas zoniniu izopnikiniu arba rezonansiniu centrifugavimu, nes pagrindinis dalykas čia yra plūduriuojantis tankis, o ne dalelių dydis ar forma. Tankio, kuriam esant dalelės sudaro izopiknalines juostas, dydį įtakoja suspensijos terpės pobūdis; dalelės gali būti pralaidžios vieniems tirpalo junginiams ir nepralaidžios kitiems arba gali prijungti tirpalo molekules. Naudojant zoninį rotorių, mitochondrijos, lizosomos, peroksisomos ir mikrosomos koncentruojasi juostose su 42%, 47%, 47% ir 27% sacharozės, atitinkančios 1,18, 1,21, 1,21 ir 1,10 g-cm tankį.-3 atitinkamai. Subląstelinių organelių tankis taip pat priklauso nuo jų selektyvaus tam tikrų junginių pasisavinimo. Supažindinimas su žiurkėmis su nehemoliziniu plovikliu TritonWR-1339 padidina kepenų lizosomų dydį ir sumažina jų tankį; mitochondrijų ir peroksisomų tankis išlieka nepakitęs. Nepaisant to, kad lizosomų sedimentacijos savybės, kaip taisyklė, nesikeičia, jų pusiausvyros tankis sacharozės gradiente sumažėja nuo 1,21 iki 1,1, o tai lemia atitinkamą lizosomų-peroksisomų frakcijos atskyrimą. Ši savybė naudojama kiekybiniam lizosomų, mitochondrijų ir peroksisomų atskyrimui, remiantis visų dalelių, kurių tankis didesnis nei mikrosomų tankis, pašalinimu iš homogeninės terpės ir po to nusodintų sunkiųjų dalelių izopikniniu centrifugavimu.

2.4 Pusiausvyros tankio gradiento centrifugavimas

Tankio gradientui sukurti naudojamos sunkiųjų metalų druskos, tokios kaip rubidis ar cezis, taip pat sacharozės tirpalai. Mėginys, pavyzdžiui, DNR, sumaišomas su koncentruotu cezio chlorido tirpalu. Tiek ištirpusi medžiaga, tiek tirpiklis iš pradžių tolygiai pasiskirsto visame tūryje. Centrifuguojant nustatomas pusiausvyrinis koncentracijos ir atitinkamai tankio pasiskirstymasCsCl, nes cezio jonai turi didelę masę. Veikiant išcentriniam pagreičiui, DNR molekulės perskirstomos, susikaupdamos atskiros zonos pavidalu jas atitinkančioje mėgintuvėlio dalyje. Šis metodas daugiausia naudojamas analitiniam centrifugavimui, o Meselsonas ir Stahlas jį naudojo DNR replikacijos mechanizmui tirti.E. coli . Pusiausvyros tankio gradiento centrifugavimas taip pat yra vienas iš žmogaus plazmos lipoproteinų atskyrimo ir tyrimo metodų.

2. 5 Gradientų formavimas ir ištraukimas

2.5.1 Gradientų pobūdis

Tirpalų tankio gradientams sukurti dažniausiai naudojami sacharozės tirpalai, kartais su fiksuotu pH. Kai kuriais atvejais geras atskyrimas gaunamas naudojant vietoj įprasto vandens.D2 0. Lentelėje. 2.1 parodytos kai kurių sacharozės tirpalų savybės.

Koncentracija, %

Sacharozės tirpalų savybės

Gradiento pasirinkimą lemia specifinės frakcionavimo užduotys. Taigi, pavyzdžiui, fikol, kurį gamina įmonėPharmacia gerai Chemikalai, gali pakeisti sacharozę tais atvejais, kai reikia sukurti didelio tankio ir mažo osmosinio slėgio gradientus. Kitas ficol privalumas yra tai, kad jis neprasiskverbia pro ląstelių membranas. Didesnio tankio gradientams sukurti naudojamos sunkiųjų metalų druskos, tokios kaip rubidis ir cezis, tačiau dėl korozinio poveikioCsCltokie gradientai naudojami tik rotoriuose, pagamintuose iš atsparių metalų, pavyzdžiui, titano.

2.5.2 Žingsnio tankio gradiento technika

Norint sukurti tankio gradientą, keli tirpalai, kurių tankis paeiliui mažėja, atsargiai pipete įleidžiami į centrifugos mėgintuvėlį. Tada ant viršutinio sluoksnio, kuris turi mažiausią tankį, mėginys sluoksniuojamas siauros zonos pavidalu, po to mėgintuvėlis centrifuguojamas. Lygius tiesinius gradientus galima gauti išlyginus laipsniškus gradientus ilgai stovint tirpalui. Procesą galima paspartinti švelniai maišant mėgintuvėlio turinį viela arba švelniai purtant mėgintuvėlį.

2.5.3 Tolygaus tankio gradiento sukūrimo technika

Daugeliu atvejų sklandžiai tankio gradientui sukurti naudojamas specialus įtaisas. Jį sudaro du griežtai apibrėžto vienodo skersmens cilindriniai indai, kurie dugne susisiekia vienas su kitu stikliniu vamzdeliu su valdymo vožtuvu, leidžiančiu reguliuoti abiejų indų turinio maišymo proporcijas. Viename iš jų yra maišytuvas ir išleidimo anga, per kurią tirpalas patenka į centrifugos mėgintuvėlius. Į maišytuvą dedamas tankesnis tirpalas; antrasis cilindras pripildytas mažesnio tankio tirpalu. Tirpalų kolonėlės aukštis abiejuose cilindruose nustatomas taip, kad hidrostatinis slėgis juose būtų vienodas. Tankesnis tirpalas palaipsniui išleidžiamas iš maišytuvo į centrifugos vamzdelius ir tuo pačiu metu pakeičiamas tokiu pat kiekiu mažesnio tankio tirpalo, patenkančio į maišytuvą iš antrojo cilindro per valdymo vožtuvą. Tirpalo homogeniškumas maišytuve užtikrinamas nuolat maišant tirpalą maišytuvu. Tirpalui nusausinant į centrifugos mėgintuvėlius, jo tankis mažėja ir mėgintuvėliuose susidaro linijinis tankio gradientas. Netiesinius gradientus galima sukurti naudojant sistemą, kurią sudaro du nevienodo skersmens cilindrai.

Skirtingo statumo tankio gradientams formuoti naudojama dviejų mechaniškai valdomų švirkštų sistema, užpildyta nevienodo tankio tirpalais. Keičiant santykinį stūmoklių greitį galima sukurti įvairius gradientus.

2.5.4 Gradientų ištraukimas iš centrifugos mėgintuvėlių

Pasibaigus centrifugavimui ir atskirus daleles, susidariusias zonas reikia pašalinti. Tai atliekama keliais būdais, dažniausiai taikant poslinkio metodą. Centrifugos vamzdelis praduriamas prie pagrindo ir į jo apatinę dalį lėtai įleidžiama labai tanki terpė, pavyzdžiui, 60-70% sacharozės tirpalas. Viršutinis tirpalas išstumiamas, o frakcijos surenkamos naudojant švirkštą, pipetę arba specialų prietaisą, prijungtą per vamzdelį prie frakcijų rinktuvo. Jei vamzdeliai pagaminti iš celiuliozės arba nitroceliuliozės, frakcijos išgaunamos perpjaunant vamzdelį specialiu peiliuku. Tam tiesiai po norima zona nupjaunamas stove pritvirtintas centrifugos vamzdelis ir frakcija išsiurbiama švirkštu arba pipete. Tinkamai suprojektavus pjovimo įrenginį, tirpalo praradimas bus minimalus. Frakcijos taip pat renkamos plona tuščiavidure adata praduriant mėgintuvėlio pagrindą. Lašai, tekantys iš vamzdelio per adatą, surenkami į frakcijų rinktuvą tolesnei analizei.

2.5.5 Paruošiamosios centrifugos ir jų pritaikymas

Parengiamąsias centrifugas galima suskirstyti į tris pagrindines grupes: bendrosios paskirties centrifugas, greitaeigias centrifugas ir preparatines ultracentrifugas.Bendrosios paskirties centrifugos maksimalus greitis yra 6000 aps./min-1 ir OCU iki 6000g . Jie skiriasi vienas nuo kito tik talpa ir turi nemažai keičiamų rotorių: kampinių ir su pakabinamais stiklais. Viena iš šio tipo centrifugų savybių yra didelė jų talpa – nuo ​​4 iki 6 dm3 , kuri leidžia į juos įkelti ne tik 10,50 ir 100 cm centrifugos mėgintuvėlius3 , bet ir laivus, kurių talpa iki 1,25 dm3 . Visose šio tipo centrifugose rotoriai yra tvirtai pritvirtinti prie pavaros veleno, o centrifugos vamzdeliai kartu su jų turiniu turi būti kruopščiai subalansuoti ir skirtis svoriu ne daugiau kaip 0,25 g. turi būti dedami simetriškai, vienas prieš kitas, taip užtikrinant vienodą mėgintuvėlių pasiskirstymą rotoriaus sukimosi ašies atžvilgiu.

Didelio greičio centrifugos maksimalus greitis yra 25 000 aps./min-1 ir OCU iki 89000g. Rotoriaus kameroje yra aušinimo sistema, kuri neleidžia įkaisti dėl trinties rotoriaus sukimosi metu. Paprastai didelės spartos centrifugos yra 1,5 dm talpos3 ir yra su keičiamais rotoriais, tiek kampiniais, tiek su pakabinamais stiklais.

Paruošiamosios ultracentrifugos suteikti maksimalų greitį iki 75 000 aps./min-1 o didžiausias išcentrinis pagreitis 510 000g . Juose yra ir šaldytuvas, ir vakuuminis blokas, kad rotorius neperkaistų dėl jo trinties su oru. Tokių centrifugų rotoriai pagaminti iš didelio stiprumo aliuminio arba titano lydinių. Dažniausiai naudojami aliuminio lydinio rotoriai, tačiau tais atvejais, kai reikia ypač didelių greičių, naudojami titano rotoriai. Siekiant sumažinti vibraciją, atsirandančią dėl rotoriaus disbalanso dėl netolygaus centrifugos vamzdelių užpildymo, ultracentrifugos turi lankstų veleną. Centrifugų mėgintuvėliai ir jų turinys turi būti kruopščiai subalansuoti 0,1 g tikslumu.. Panašių reikalavimų reikia laikytis ir apkraunant bendros paskirties centrifugų rotorius.

2.6 Rotorių konstrukcija

2.6.1 Kampiniai rotoriai ir rotoriai su pakabinamais kaušais

Paruošiamųjų centrifugų rotoriai dažniausiai būna dviejų tipų – kampiniai ir pakabinami kaušai. Jie vadinami kampiniais, nes juose įtaisyti centrifugos vamzdeliai visada yra tam tikru kampu sukimosi ašies atžvilgiu. Rotoriuose su pakabintais stiklais mėgintuvėliai montuojami vertikaliai, o sukdami, veikiami susidariusios išcentrinės jėgos, pasislenka į horizontalią padėtį; pasvirimo kampas į sukimosi ašį yra 90°.

Kampiniuose rotoriuose atstumas, kurį dalelės nukeliauja iki atitinkamos mėgintuvėlio sienelės, yra labai mažas, todėl nusėdimas vyksta gana greitai. Susidūrusios su mėgintuvėlio sienelėmis dalelės slysta žemyn ir apačioje susidaro nuosėdos. Centrifuguojant susidaro konvekciniai srautai, kurie labai apsunkina panašių nusėdimo savybių dalelių atskyrimą. Nepaisant to, panašaus dizaino rotoriai sėkmingai naudojami atskirti daleles, kurių nusėdimo greitis labai skiriasi.

Rotoriuose su kabančiomis taurelėmis taip pat stebimi konvekcijos reiškiniai, tačiau jie nėra tokie ryškūs. Konvekcija atsiranda dėl to, kad, veikiant išcentriniam pagreičiui, dalelės nusėda kryptimi, kuri nėra griežtai statmena sukimosi ašiai, todėl, kaip ir kampiniuose rotoriuose, atsitrenkia į mėgintuvėlio sieneles ir nuslysta į apačia.

Konvekcijos ir sūkurio efektų tam tikru mastu galima išvengti naudojant sektorinius vamzdžius kabančių puodelių rotoriuose ir reguliuojant rotoriaus greitį; Išvardintas aukščiau, centrifugavimo pagal tankio gradientą metodas taip pat neturi trūkumų.

2.6.2 Ištisiniai rotoriai

Nepertraukiami rotoriai yra skirti greitam sąlyginai nedidelių kietos medžiagos kiekių frakcionavimui iš didelio tūrio suspensijų, pavyzdžiui, ląstelėms atskirti nuo auginimo terpės. Centrifuguojant į rotorių nuolat pilama dalelių suspensija; rotoriaus pralaidumas priklauso nuo nusodinto preparato pobūdžio ir svyruoja nuo 100 cm3 iki 1 dm3 per 1 min. Rotoriaus ypatumas yra tas, kad tai yra izoliuota specialios konstrukcijos kamera; jo turinys nesusisiekia su išorine aplinka, todėl nėra užterštas ar purškiamas.

2.6.3 Zoniniai arba Andersono rotoriai

Ryžiai. 2 .6. Centrifugavimo etapai (a- e) zoniniame rotoriuje

Zoniniai rotoriai gaminami iš aliuminio arba titano lydinių, kurie gali atlaikyti labai didelius išcentrinius pagreičius. Paprastai jie turi cilindrinę ertmę, uždarą nuimamu dangteliu. Ertmės viduje, ant sukimosi ašies, yra ašinis vamzdis, ant kurio uždedamas antgalis su mentėmis, dalijantis rotoriaus ertmę į keturis sektorius. Mentės arba pertvaros turi radialinius kanalus, per kuriuos įpurškiamas gradientas nuo ašinio vamzdžio iki rotoriaus periferijos. Dėl šios ašmenų konstrukcijos konvekcija sumažinama iki minimumo.

Rotorius užpildomas, kai jis sukasi maždaug 3000 aps./min. greičiu-1 . Iš anksto sukurtas gradientas pumpuojamas į rotorių, pradedant nuo mažiausio tankio sluoksnio, kuris yra tolygiai paskirstytas išilgai rotoriaus periferijos ir laikomas prie jo išorinės sienelės statmenai sukimosi ašiai dėl išcentrinės jėgos.. Vėliau pridedant didesnio tankio gradiento sluoksnius, vyksta nuolatinis poslinkis mažiau tankių sluoksnių centro link. Po to, kai visas gradientas yra pumpuojamas į rotorių, jis iki viso tūrio užpildomas tirpalu, vadinamu „pagalve“, kurio tankis yra toks pat arba šiek tiek viršija didžiausią iš anksto suformuoto gradiento tankį.

Tada per ašinį vamzdelį tiriamasis mėginys yra sluoksniuojamas, kuris iš vamzdelio išstumiamas į rotoriaus tūrį naudojant mažesnio tankio tirpalą, tuo pačiu metu iš periferijos pašalinamas tas pats „pagalvėlės“ tūris. Po visų šių procedūrų rotoriaus sukimosi greitis padidinamas iki darbinio greičio ir reikiamą laiką atliekama arba zoninė, arba zoninė-izopikninė frakcionavimas.. Frakcijų ekstrahavimas atliekamas 3000 aps./min. rotoriaus greičiu-1 . Rotoriaus turinys išstumiamas pridedant „pagalvėlę“ iš periferijos, pirmiausia išstumiami mažiau tankūs sluoksniai. Dėl ypatingos Anderson rotoriaus ašinio kanalo konstrukcijos nesimaišo zonos jų poslinkio metu. Išeinantis gradientas perduodamas per registravimo įrenginį, pavyzdžiui, spektrofotometro kamerą, su kuria baltymų kiekis gali būti nustatomas absorbuojant 280 nm, arba per specialų radioaktyvumo detektorių, po kurio surenkamos frakcijos.

Vidutiniu greičiu naudojamų zoninių rotorių talpa svyruoja nuo 650 iki 1600 cm3 , kuri leidžia gauti gana didelį kiekį medžiagos. Zoniniai rotoriai naudojami baltymų teršalams pašalinti iš įvairių preparatų ir izoliuoti bei išvalyti mitochondrijas, lizosomas, polisomas ir baltymus.

2.6.4 Subląstelinių frakcijų analizė

Poląstelinių dalelių preparato, gauto frakcionuojant, savybes galima priskirti pačių dalelių savybėms tik tuo atveju, jei preparate nėra priemaišų. Todėl visada būtina įvertinti gautų preparatų grynumą. Mikroskopiniu tyrimu galima nustatyti homogenizacijos efektyvumą ir priemaišų buvimą preparate. Tačiau matomų priemaišų nebuvimas dar nėra patikimas vaisto grynumo įrodymas. Norint kiekybiškai įvertinti gauto preparato grynumą, jam atliekama cheminė analizė, kuri leidžia nustatyti baltymų ar DNR kiekį jame, nustatyti, jei įmanoma, fermentinį aktyvumą ir imunologines savybes.

Fermentų pasiskirstymo frakcionuotuose audiniuose analizė grindžiama dviem bendrais principais. Pirmasis iš jų yra tas, kad visos tam tikros tarpląstelinės populiacijos dalelės turi tą patį fermentų rinkinį. Antrasis reiškia, kad kiekvienas fermentas yra lokalizuotas tam tikroje ląstelės vietoje. Jei ši pozicija būtų teisinga, fermentai galėtų veikti kaip atitinkamų organelių žymenys: pavyzdžiui, citochromo oksidazė ir monoaminooksidazė veiktų kaip mitochondrijų žymenų fermentai, rūgštinės hidrolazės kaip lizosomų žymenys, katalazė kaip peroksisomų žymeklis ir gliukozė-6- fosfatazė – mikrosominės membranos žymuo. Tačiau paaiškėjo, kad kai kurie fermentai, tokie kaip malato dehidrogenazė,R -gliukuronidazė, NADP'H-citochromo-c-reduktazė, yra lokalizuota daugiau nei vienoje frakcijoje. Todėl kiekvienu konkrečiu atveju į tarpląstelinių frakcijų fermentų žymenų pasirinkimą reikia žiūrėti labai atsargiai. Be to, žymeklio fermento nebuvimas nereiškia, kad nėra atitinkamų organelių. Tikėtina, kad frakcionuojant fermentą organelės praranda arba jis slopinamas arba inaktyvuojamas; todėl kiekvienai frakcijai paprastai nustatomi bent du žymenų fermentai.

Frakcija

2.7 Frakcionavimas diferenciniu centrifugavimu

2.7.1 Rezultatų pristatymas

Audinių frakcionavimo rezultatai patogiausiai pateikiami grafikų pavidalu. Taigi, tiriant fermentų pasiskirstymą audiniuose, duomenys geriausiai pateikiami histogramų pavidalu, leidžiančių vizualiai įvertinti eksperimentų rezultatus.

Baltymų kiekio fermentinis aktyvumas mėginyje nustatomas tiek pirminiame homogenate, tiek kiekvienoje išskirtoje tarpląstelinėje frakcijoje atskirai. Bendras fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis frakcijose neturėtų labai skirtis nuo atitinkamų verčių pradiniame homogenate.

Tada kiekvienoje frakcijoje apskaičiuojamas fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis procentais nuo bendros išeigos, pagal kurią daroma histograma. Santykinis baltymų kiekis kiekvienoje frakcijoje paeiliui brėžiamas išilgai abscisių ašies jų išskyrimo tvarka, o santykinis kiekvienos frakcijos specifinis aktyvumas – išilgai ordinačių ašies. Taigi kiekvienos frakcijos fermentinis aktyvumas nustatomas pagal strypų plotą.

2.7.2 Analitinis ultracentrifugavimas

Skirtingai nuo preparatinės centrifugavimo, kurios tikslas – atskirti medžiagas ir jas išvalyti, analitinė ultracentrifuga daugiausia naudojama biologinių makromolekulių ir kitų struktūrų nusėdimo savybėms tirti. Todėl analitiniame centrifugavime naudojami specialios konstrukcijos rotoriai ir registravimo sistemos: jie leidžia nuolat stebėti medžiagos nusėdimą.in išcentrinis laukas.

Analitinės ultracentrifugos gali pasiekti greitį iki 70 000 aps./min -1 , tuo pačiu sukuriant išcentrinį pagreitį iki 500 000g . Jų rotorius, kaip taisyklė, yra elipsoido formos ir styga sujungtas su varikliu, todėl galima keisti rotoriaus sukimosi greitį. Rotorius sukasi vakuuminėje kameroje su šaldymo įtaisu ir turi dvi analizines ir balansavimo kameras, kurios centrifugoje sumontuotos griežtai vertikaliai, lygiagrečiai sukimosi ašiai. Balansavimo elementas skirtas analitinės ląstelės balansavimui ir yra metalinis blokas su tikslia sistema. Jame taip pat yra dvi rodyklės skylės, esančios griežtai apibrėžtu atstumu nuo sukimosi ašies, kurių pagalba nustatomi atitinkami atstumai analizės langelyje. Analitinė ląstelė, paprastai 1 cm 3 , turi sektorinę formą. Tinkamai įmontuotas į rotorių, nors jis yra vertikaliai, jis veikia tuo pačiu principu kaip ir rotorius su pakabinamomis kaušais, todėl susidaro beveik idealios sedimentacijos sąlygos. Analitinės kameros galuose yra langai su kvarciniais stiklais. Analitinėse ultracentrifugose įrengtos optinės sistemos, leidžiančios stebėti dalelių nusėdimą per visą centrifugavimo laikotarpį. Iš anksto nustatytais laiko intervalais nuosėdų medžiaga gali būti fotografuojama. Frakcionuojant baltymus ir DNR, sedimentacija stebima absorbuojant ultravioletiniuose spinduliuose, o tais atvejais, kai tiriami tirpalai turi skirtingus lūžio rodiklius, naudojant Schlieren sistemą arba Rayleigh interferencinę sistemą. Paskutiniai du metodai pagrįsti tuo, kad kai šviesa praeina per skaidrų tirpalą, susidedantį iš skirtingo tankio zonų, šviesa lūžta ties zonos riba. Sedimentacijos metu tarp zonų su sunkiosiomis ir lengvosiomis dalelėmis susidaro riba, kuri veikia kaip refrakcinis lęšis; šiuo atveju ant fotografinės plokštelės, naudojamos kaip detektorius, atsiranda smailė. Sedimentacijos metu juda riba, taigi ir smailė, pagal kurios greitį galima spręsti apie medžiagos nusėdimo greitį. Interferometrinės sistemos yra jautresnės nei Schlieren sistemos. Analitinės ląstelės yra vieno sektoriaus, kurios naudojamos dažniausiai, ir dviejų sektorių, kurios naudojamos lyginamajam tirpiklio ir tirpios medžiagos tyrimui.

Biologijoje analitinis ultracentrifugavimas naudojamas makromolekulių molekulinėms masėms nustatyti, gautų mėginių grynumui patikrinti, makromolekulių konformaciniams pokyčiams tirti.

2.8 Analitinio ultracentrifugavimo taikymas

2.8.1 Molekulinių masių nustatymas

Yra trys pagrindiniai molekulinės masės nustatymo metodai, naudojant analitinį ultracentrifugavimą: sedimentacijos greičio nustatymas, sedimentacijos pusiausvyros metodas ir sedimentacijos pusiausvyros aproksimacijos metodas.

Molekulinės masės nustatymas nusėdimo greičiu tai yra labiausiai paplitęs metodas. Centrifugavimas atliekamas dideliu greičiu, kad dalelės, iš pradžių tolygiai paskirstytos visame tūryje, pradėtų judėti spinduliu nuo sukimosi centro. Tarp tirpiklio srities, kurioje jau nėra dalelių, ir tos jo dalies, kurioje jos yra, susidaro aiški sąsaja. Ši riba juda centrifuguojant, todėl galima nustatyti dalelių nusėdimo greitį vienu iš aukščiau pateiktų metodų, registruojant šį judėjimą fotografinėje plokštelėje.

Sedimentacijos greitis nustatomas pagal šį ryšį:

kurX - atstumas nuo sukimosi ašies cm,

t - laikas s,

w- kampinis greitis rad-s -1 ,

s - sedimentacijos koeficientas "molekulės.

Sedimentacijos koeficientas yra greitis vienam pagreičio vienetui, jis matuojamasSeedberg vienetai ; 1 swedberg vienetas lygus 10 _13 Su. Skaitinė reikšmėspriklauso nuo dalelių molekulinės masės ir formos ir yra tam tikrai molekulei ar supramolekulinei struktūrai būdinga reikšmė. Pavyzdžiui, lizocimo sedimentacijos koeficientas yra 2,15S; katal aza sedimentacijos koeficientas yra 11,35S, bakterijų ribosomų subvienetai - nuo 30 iki 50S, o eukariotinių ribosomų subvienetai – nuo ​​40 iki 60S.

kurM yra molekulės molekulinė masė,R yra dujų konstanta,T yra absoliuti temperatūra,syra molekulės sedimentacijos koeficientas,D yra molekulės difuzijos koeficientas,v - dalinis savitasis tūris, kuris gali būti laikomas tūriu, kurį užima vienas gramas ištirpusios medžiagos, p - tirpiklio tankis.

Sedimentacijos balanso metodas. Molekulinės masės šiuo metodu nustatomos esant santykinai mažam rotoriaus greičiui, apie 7000-8000 aps./min. -1 kad didelės molekulinės masės molekulės nenusėstų dugne. Ultracentrifugavimas atliekamas tol, kol dalelės pasiekia pusiausvyrą, kuri susidaro veikiant išcentrinėms jėgoms, viena vertus, ir difuzijos jėgoms, kita vertus, tai yra, kol dalelės nustos judėti. Tada pagal gautą koncentracijos gradientą pagal formulę apskaičiuojama medžiagos molekulinė masė

kurR yra dujų konstanta,T - absoliuti temperatūra, o - kampinis greitis, p - tirpiklio tankis,v - dalinis specifinis tūris,Su X irSu 2 yra tirpios medžiagos koncentracija per atstumusG G ir g 2 nuo sukimosi ašies.

Šio metodo trūkumas yra tas, kad nusėdimo pusiausvyrai pasiekti reikia daug laiko – nuo ​​kelių dienų iki kelių savaičių, nuolat veikiant centrifugai.

Metodas artėjant prie sedimentacijos pusiausvyros buvo sukurta siekiant atsikratyti ankstesnio metodo trūkumų, susijusių su didelėmis laiko investicijomis, reikalingomis „subalansuoti“. Šiuo metodu galima nustatyti molekulines mases, kai centrifuguotas tirpalas yra artimos pusiausvyros būsenai. Pirma, makromolekulės tolygiai pasiskirsto visame analitinės ląstelės tūryje; tada, centrifuguojant, molekulės nusėda, o tirpalo tankis menisko srityje palaipsniui mažėja. Tankio pokytis kruopščiai užregistruojamas, o tada, atliekant sudėtingus skaičiavimus, apimančius daug kintamųjų, tam tikro junginio molekulinė masė nustatoma pagal formules:

kurR yra dujų konstanta,T yra absoliuti temperatūra,v - dalinis savitasis tūris, p – tirpiklio tankis,dcldr - makromolekulių koncentracijos gradientas, g mir g d- atstumas iki menisko ir vamzdelio dugno atitinkamai s mir su d- makromolekulių koncentracija atitinkamai meniske ir vamzdelio apačioje,M m irM R -molekulinių masių vertės, nustatomos atitinkamai pagal medžiagos koncentracijos pasiskirstymą menisku ir mėgintuvėlio dugne.

2.8.2 Preparatų grynumo įvertinimas

DNR, virusų ir baltymų preparatų grynumui įvertinti plačiai taikomas analitinis ultracentrifugavimas. Preparatų grynumas neabejotinai labai svarbus tais atvejais, kai reikia tiksliai nustatyti molekulės molekulinę masę. Daugeliu atvejų preparato homogeniškumą galima spręsti pagal sedimentacijos ribos pobūdį, taikant sedimentacijos greičio metodą: homogeniškas preparatas dažniausiai duoda vieną aiškiai apibrėžtą ribą. Priemaišos, esančios preparate, atrodo kaip papildoma smailė arba mentė; jie taip pat lemia pagrindinės smailės asimetriją.

2.8.3 Makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas

Kita analitinės ultracentrifugavimo taikymo sritis yra makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas. Pavyzdžiui, DNR molekulė gali būti viengrandė arba dvigrandė, linijinė arba apskrita. Įvairių junginių įtakoje arba aukštesnėje temperatūroje DNR patiria nemažai grįžtamųjų ir negrįžtamų konformacinių pokyčių, kuriuos galima nustatyti keičiant mėginio nusėdimo greitį. Kuo molekulė kompaktiškesnė, tuo mažesnis jos trinties koeficientas tirpale ir atvirkščiai: kuo ji mažiau kompaktiška, tuo didesnis trinties koeficientas ir, atitinkamai, lėčiau ji nusėda. Taigi, mėginio sedimentacijos greičio skirtumai prieš ir po įvairaus poveikio jam leidžia aptikti makromolekulėse vykstančius konformacinius pokyčius.

Allosteriniuose baltymuose, tokiuose kaip, pavyzdžiui, aspartato transkarbamoilazė, konformaciniai pokyčiai atsiranda dėl jų prisijungimo prie substrato ir mažų ligandų. Baltymų disociacija į subvienetus gali būti paskatinta jį apdorojant tokiomis medžiagomis kaip karbamidas arba parachlormerkuribenzoatas. Visus šiuos pokyčius galima lengvai stebėti naudojant analitinį ultracentrifugavimą.

Be filtravimo, skystų ir kietų medžiagų mišinį galima atskirti ir centrifuguojant, tai yra, atskiriant medžiagas įrenginiuose, vadinamuose centrifugomis.

Centrifugos naudojimas pagrįstas išcentrinės jėgos panaudojimu. Greito sukimosi (centrifugavimo) metu skystyje (kurio tankis didesnis nei skysčio tankis) pakibusios kietos dalelės, veikiamos sukimosi metu besivystančios išcentrinės jėgos, išmetamos nuo centro ir taip atskiriamos nuo skysčio.

Ryžiai. 407. Thyssen aparatas mikroanalitiniam darbui

Ryžiai. 408. Rankinė centrifuga

Centrifugos yra: atviros ir uždaros, su rankine ir mechanine pavara. Pagrindinė atviros rankinės centrifugos dalis (408 pav.) – tai vertikaliai nustatyta sukimosi ašis, kuriai statmenai viršutiniame jos gale pritvirtintas strypas su judinamai sustiprintomis dviem (arba keturiomis) metalinėmis rankovėmis. Šios rankovės įkišamos į specialius į apačią susiaurintus vamzdelius (409 pav.) su skysčiu, iš kurio turi būti pašalintos suspenduotos dalelės,

Rankovės apačioje įdedamas vatos gabalėlis, „kad būtų išvengta tiesioginio stiklo ir metalo kontakto. Įkišus mėgintuvėlius į įvores, centrifuga paleidžiama ir po kurio laiko (priklausomai nuo skysčio klampumo, suspenduotų dalelių dydžio ir tankio skirtumo) skendinčios kietosios medžiagos atskiriamos nuo skysčio, po to kurios centrifuga sustabdoma. Mėgintuvėlio apačioje surenkamos tankios kietos medžiagos nuosėdos, virš kurių yra skaidrus skystis.

W uždengtos centrifugos(410 pav.), priklausomai nuo dydžio, turi skirtingą skaičių rankovių, nuo 2 iki 12 ar daugiau, išdėstytų simetriškai tuo pačiu atstumu viena nuo kitos ir nuo centrifugos ašies.

Mechaninės uždaros centrifugos(410 pav., b) yra patogesni nei rankiniai (410 pav., a). Paprastai jie duoda 2000-3000 aps./min., leidžia pasiekti tobulesnį skysčio ir kietos medžiagos atskyrimą.

Užpildžius skysčiu, centrifugos mėgintuvėlių masė turi būti tokia pati. Ten, kur centrifuga turi būti naudojama dažnai, rekomenduojama turėti specialias svarstykles, pritaikytas mėgintuvėliams sverti (tiksliau – taruoti). Šiose svarstyklėse puodeliai yra pakabinami nuo sijos, naudojant strypus, pritvirtintus prie puodelių centro. Šie strypai turi žiedus, į kuriuos įkišami mėgintuvėliai.

Sustiprinę mėgintuvėlius, pirmiausia supilkite centrifuguojamą skystį į vieną mėgintuvėlį (pavyzdžiui, pipete), o po to į antrą, bandydami subalansuoti puodelius.

Niekada nepilkite per daug skysčio į mėgintuvėlius; mėgintuvėliai užpildomi taip, kad atstumas nuo krašto iki skysčio lygio būtų ne mažesnis kaip 10 mm.

Kai reikia subalansuoti daug mėgintuvėlių, patartina naudoti šią techniką. Subalansavus pirmąją mėgintuvėlių porą, vienas iš jų išimamas ir įdedamas į centrifugos lizdą, o kitas paliekamas ant svarstyklių; šis paskutinis mėgintuvėlis bus naudojamas kaip standartas likusiems, įkiškite kitą mėgintuvėlį į laisvą vietą ant svarstyklių, subalansuokite jį su standartu ir išimkite. Taip pat patartina iš anksto užpildyti mėgintuvėlius (skysčio kiekį imant kiek mažiau nei reikia) ir įpilti reikiamą kiekį skysčio jau balansavimo metu. Šis metodas pagreitina darbą.

Ryžiai. 409. Mėgintuvėliai centrifugoms.

Subalansuoti mėgintuvėliai įkišti į centrifugos lizdus.

Centrifuga turi būti paleista ne iš karto visu greičiu, o palaipsniui. Tai taikoma ir rankinėms, ir mechaninėms centrifugoms.

Ryžiai. 410. Uždaros centrifugos: a - su rankine pavara; b - su elektros varikliu.

Mechaninės greičio reguliavimo centrifugos turi atitinkamus įtaisus. Taigi, elektrinėse centrifugose yra reostatai, skirti laipsniškam įjungimui iki viso apsisukimų skaičiaus. Centrifugose, varomose vandens turbinos, laipsniškas greičio didinimas pasiekiamas reguliuojant vandens srovę. Kuo kruopščiau buvo įtraukta, tuo patikimiau veikia centrifuga.

Centrifuga turi būti nuolat stebima; jo, ypač judančių dalių, užteršimas yra nepriimtinas. Metalinės rankovės turi lengvai ir laisvai suktis. Centrifugą varančios krumpliaračiai turi būti lengvai judinami; jų negalima tepti tepalais, kurie gali sutirštėti. Centrifugos velenas taip pat turi būti tvarkingas ir visada švarus.

Neatsargus elgesys su centrifugomis, ypač su rankinėmis centrifugomis, gali sulenkti ašį ir taip išjungti centrifugą.

Išjungus centrifugą leidžiama savaiminiam paleidimui sustoti ir tik po to mėgintuvėliai išimami.

Pastaruoju metu vis labiau plinta vadinamosios supercentrifugos, duodančios iki 40 000 aps./min. (411 pav.).

Ryžiai. 411 supercentrifuga

Tokios centrifugos ypač tinka centrifuguoti visų rūšių klampius tirpalus, tokius kaip lakai, smulkios dispersijos, emulsijos.

Supercentrifuguojamas skystis patenka į antgalį 1, esantį apatinėje aparato dalyje. Tada skystis pilamas į darbinį cilindrą 2, besisukantį iki 40 000 aps./min., kuriame atskiriamos sunkesnės skystyje pakibusios dalelės. Skystis palaipsniui kyla išilgai cilindro 2 iki separatoriaus 5, o jei emulsija sunaikinama, lengvesnis skystis išteka per kanalizaciją 8, o sunkesnis - per kanalizaciją 4. Atskiriant kietąsias daleles, kurių tankis didesnis. nei vienas, skystis išteka pro kanalizaciją 3. Ant darbinio cilindro vidinės sienelės nusėda atskiriamos kietos nuosėdos. Supercentrifuga. Kartkartėmis supercentrifuga sustabdoma, išimamas darbinis cilindras 2, išvalomas nuo nuosėdų ir, padėjus atgal į vietą, toliau dirbama. Visas darbinio cilindro valymo procesas nuo sustojimo iki naujo supercentrifugos paleidimo momento trunka ne ilgiau kaip 15 minučių. Jei reikia išvalyti santykinai didelius skysčių kiekius, naudokite tris8 supercentrifugas: viena veikia, kita valoma, trečia yra rezerve,

Kursinis darbas

centrifugavimas

1. Metodo principas

Medžiagų atskyrimas centrifugavimo būdu pagrįstas skirtingu dalelių elgesiu išcentriniame lauke. Į mėgintuvėlį patalpinta dalelių suspensija sukraunama į rotorių, sumontuotą ant centrifugos pavaros veleno.

Išcentriniame lauke skirtingo tankio, formos ar dydžio dalelės nusėda skirtingu greičiu. Sedimentacijos greitis priklauso nuo išcentrinio pagreičio, kuris yra tiesiogiai proporcingas rotoriaus kampiniam greičiui ir atstumui tarp dalelės ir sukimosi ašies:

o išcentrinis pagreitis tada bus

Kadangi vienas rotoriaus apsisukimas yra 2p radianais, rotoriaus kampinis greitis apsisukimais per minutę gali būti parašytas taip:

Išcentrinis pagreitis paprastai išreiškiamas vienetais g ir paskambino santykinis išcentrinis pagreitis, t.y.

Išvardydami dalelių atskyrimo sąlygas, nurodykite rotoriaus sukimosi greitį ir spindulį, taip pat centrifugavimo laiką. Išcentrinis pagreitis paprastai išreiškiamas vienetais g, apskaičiuojamas iš vidutinio skysčio kolonėlės sukimosi spindulio centrifugos mėgintuvėlyje. Remdamiesi lygtimi, Dole ir Kotzias sudarė nomogramą, išreiškiančią GCC priklausomybę nuo rotoriaus greičio ir spindulio r.

Sferinių dalelių nusėdimo greitis priklauso ne tik nuo išcentrinio pagreičio, bet ir nuo pačių dalelių tankio bei spindulio bei nuo suspensijos terpės klampumo. Laikas, reikalingas sferinės dalelės nusėdimui skystoje terpėje nuo skysto menisko iki centrifugos vamzdžio dugno, yra atvirkščiai proporcingas nusėdimo greičiui ir nustatomas pagal šią lygtį:

kur t - sedimentacijos laikas sekundėmis, rj - vidutinis klampumas, g h - dalelės spindulys, r h - dalelės tankis, p - terpės tankis, g m - atstumas nuo sukimosi ašies iki skysčio menisko, g d - atstumas nuo sukimosi ašies iki mėgintuvėlio dugno.

Kaip matyti iš lygties, esant tam tikram rotoriaus greičiui, laikas, reikalingas vienalyčių sferinių dalelių nusėdimui, yra atvirkščiai proporcingas jų spindulių kvadratui ir dalelių bei terpės tankių skirtumui ir yra tiesiogiai proporcingas terpės klampumui. . Todėl nevienalyčių, maždaug sferinių dalelių, kurių tankis ir dydis skiriasi, mišinys gali būti atskirtas arba dėl skirtingo jų nusėdimo vamzdžio dugne laiko tam tikru pagreičiu, arba dėl nuosėdų dalelių pasiskirstymo vamzdyje. , kuris nustatomas po tam tikro laiko. Atskiriant medžiagas būtina atsižvelgti į tokius svarbius veiksnius kaip terpės tankis ir klampumas. Aprašytais metodais galima atskirti ląstelių organelius nuo audinių homogenatų. Pagrindiniai ląstelės komponentai nusėda tokia seka: pirmiausia ištisos ląstelės ir jų fragmentai, vėliau branduoliai, chloroplastai, mitochondrijos, lizosomos, mikrosomos ir galiausiai ribosomos. Nesferinių dalelių nusėdimas nepaklūsta lygčiai, todėl tos pačios masės, bet skirtingų formų dalelės nusėda skirtingu greičiu. Ši savybė naudojama tyrime naudojant makromolekulių konformacijos ultracentrifugavimą.

susideda iš biologinės medžiagos paskyrimo tolesniems biocheminiams tyrimams. Tokiu atveju galima paimti didelius pradinės biologinės medžiagos kiekius, pavyzdžiui, mikrobų ląsteles sėti iš paketinių ar nuolatinių kultūrų, taip pat augalų ir gyvūnų ląsteles iš audinių ir kraujo plazmos kultūrų. Paruošiamojo centrifugavimo pagalba išskiriama daug ląstelių dalelių, siekiant ištirti jų morfologiją, struktūrą ir biologinį aktyvumą. Metodas taip pat naudojamas tokioms biologinėms makromolekulėms kaip DNR ir baltymai išskirti iš anksčiau išgrynintų preparatų.

Analitinis centrifugavimas Jis daugiausia naudojamas tiriant grynus arba praktiškai grynus makromolekulių ar dalelių preparatus, tokius kaip ribosomos. Šiuo atveju naudojamas nedidelis medžiagos kiekis, o tiriamų dalelių nusėdimas nuolat fiksuojamas naudojant specialias optines sistemas. Metodas leidžia gauti duomenis apie medžiagos grynumą, molekulinę masę ir struktūrą. Bakalauro seminaruose parengiamoji centrifuga naudojama daug dažniau nei analitinė centrifuga, todėl jai skirsime daugiau dėmesio, nors abu metodai yra pagrįsti bendrais principais.

2. Paruošiamasis centrifugavimas

2.1 Diferencinis centrifugavimas

Šis metodas pagrįstas dalelių, kurios skiriasi viena nuo kitos dydžiu ir tankiu, nusėdimo greičio skirtumais. Atskiriama medžiaga, pavyzdžiui, audinių homogenatas, centrifuguojama laipsniškai didinant išcentrinį pagreitį, kuris parenkamas taip, kad kiekviename etape tam tikra frakcija nusėda ant mėgintuvėlio dugno. Kiekvieno etapo pabaigoje nuosėdos atskiriamos nuo supernatanto ir kelis kartus plaunamos, kad galiausiai būtų gauta gryna nusodinta frakcija. Deja, praktiškai neįmanoma gauti visiškai grynų nuosėdų; Norėdami suprasti, kodėl taip nutinka, pereikime prie proceso, kuris vyksta centrifugos mėgintuvėlyje kiekvieno centrifugavimo etapo pradžioje.

Pirma, visos homogenato dalelės yra tolygiai paskirstytos centrifugos mėgintuvėlio tūryje, todėl neįmanoma gauti grynų preparatų iš sunkiausių dalelių nuosėdų per vieną centrifugavimo ciklą: pirmosiose susidariusiose nuosėdose daugiausia yra sunkiausių dalelių, tačiau be to, taip pat tam tikras kiekis visų pradinių komponentų. Pakankamai gryną sunkiųjų dalelių preparatą galima gauti tik pakartotinai suspensuojant ir centrifuguojant pradines nuosėdas. Tolesnis supernatanto centrifugavimas su vėlesniu išcentrinio pagreičio padidėjimu lemia vidutinio dydžio ir tankio dalelių nusėdimą, o po to - mažiausių mažiausio tankio dalelių nusėdimą. Ant pav. 2.3 yra žiurkių kepenų homogenato frakcionavimo diagrama.

Atrodo, kad diferencinė centrifuga yra labiausiai paplitęs ląstelių organelių išskyrimo iš audinių homogenatų metodas. Sėkmingiausiai šiuo metodu galima atskirti tokias ląstelių organoles, kurios dydžiu ir tankiu labai skiriasi viena nuo kitos. Tačiau net ir šiuo atveju gautos frakcijos niekada nėra absoliučiai vienalytės, o tolesniam jų atskyrimui naudojami kiti metodai, aprašyti toliau. Šie metodai, pagrįsti organelių tankio skirtumais, užtikrina efektyvesnį atskyrimą centrifuguojant tirpaluose su nuolatiniu arba laipsnišku tankio gradientu. Šių metodų trūkumas yra tas, kad tirpalo tankio gradientui gauti reikia laiko.

2.2 Zonos greičio centrifugavimas

Zoninio greičio arba, kaip dar vadinama, s-zonos centrifugavimo metodas susideda iš tiriamojo mėginio sluoksniuojimu ant tirpalo paviršiaus su nuolatiniu tankio gradientu. Tada mėginys centrifuguojamas, kol dalelės pasiskirsto palei gradientą atskirose zonose arba juostose. Sukūrus tankio gradientą, galima išvengti zonų maišymosi dėl konvekcijos. Greitosios zoninės centrifugavimo metodas naudojamas RNR-DNR hibridams, ribosomų subvienetams ir kitiems ląstelių komponentams atskirti.

2.3 Izopikninis centrifugavimas

Izopikninis centrifugavimas atliekamas tiek tankio gradientu, tiek įprastu būdu. Jei centrifuguojama ne pagal tankio gradientą, preparatas pirmiausia centrifuguojamas taip, kad nusėstų dalelės, kurių molekulinė masė didesnė už tiriamųjų dalelių. Šios sunkiosios dalelės išmetamos, o mėginys suspenduojamas terpėje, kurios tankis yra toks pat kaip ir izoliuojamos frakcijos, o po to centrifuguojamas tol, kol tiriamos dalelės nusėda ant mėgintuvėlio dugno, o mažesnio tankio dalelės plūduriuoja į mėgintuvėlio dugną. skysčio paviršius...

Kitas būdas yra sluoksniuoti mėginį ant tirpalo paviršiaus su nuolatiniu tankio gradientu, apimančiu visų mišinio komponentų tankių diapazoną. Centrifuguojama tol, kol dalelių plūduriuojantis tankis yra lygus atitinkamų zonų tankiui, t.y. kol dalelės išsiskirs į zonas. Metodas vadinamas zoniniu izopnikiniu arba rezonansiniu centrifugavimu, nes pagrindinis dalykas čia yra plūduriuojantis tankis, o ne dalelių dydis ar forma. Tankio, kuriam esant dalelės sudaro izopiknalines juostas, dydį įtakoja suspensijos terpės pobūdis; dalelės gali būti pralaidžios vieniems tirpalo junginiams ir nepralaidžios kitiems arba gali prijungti tirpalo molekules. Naudojant zoninį rotorių, mitochondrijos, lizosomos, peroksisomos ir mikrosomos koncentruojasi juostose, kuriose yra 42%, 47%, 47% ir 27% sacharozės, atitinkančios atitinkamai 1,18, 1,21, 1,21 ir 1,10 g-cm -3 tankį. Subląstelinių organelių tankis taip pat priklauso nuo jų selektyvaus tam tikrų junginių pasisavinimo. Įvedus žiurkėms ploviklį Triton WR-1339, kuris nesukelia hemolizės, padidėja kepenų lizosomų dydis ir sumažėja jų tankis; mitochondrijų ir peroksisomų tankis išlieka nepakitęs. Nepaisant to, kad lizosomų sedimentacijos savybės, kaip taisyklė, nesikeičia, jų pusiausvyros tankis sacharozės gradiente sumažėja nuo 1,21 iki 1,1, o tai lemia atitinkamą lizosomų-peroksisomų frakcijos atskyrimą. Ši savybė naudojama kiekybiniam lizosomų, mitochondrijų ir peroksisomų atskyrimui, remiantis visų dalelių, kurių tankis didesnis nei mikrosomų tankis, pašalinimu iš homogeninės terpės ir po to nusodintų sunkiųjų dalelių izopikniniu centrifugavimu.

2.4 Pusiausvyros tankio gradiento centrifugavimas

Tankio gradientui sukurti naudojamos sunkiųjų metalų druskos, tokios kaip rubidis ar cezis, taip pat sacharozės tirpalai. Mėginys, pavyzdžiui, DNR, sumaišomas su koncentruotu cezio chlorido tirpalu. Tiek ištirpusi medžiaga, tiek tirpiklis iš pradžių tolygiai pasiskirsto visame tūryje. Centrifuguojant nustatomas pusiausvyrinis CsCl koncentracijos ir atitinkamai tankio pasiskirstymas, nes cezio jonai turi didelę masę. Veikiant išcentriniam pagreičiui, DNR molekulės perskirstomos, susikaupdamos atskiros zonos pavidalu jas atitinkančioje mėgintuvėlio dalyje. Šis metodas daugiausia naudojamas analitiniam centrifugavimui, o Meselsonas ir Stahlas jį naudojo DNR replikacijos mechanizmui tirti. E. coli . Pusiausvyros tankio gradiento centrifugavimas taip pat yra vienas iš žmogaus plazmos lipoproteinų atskyrimo ir tyrimo metodų.

2. 5 Gradientų formavimas ir ištraukimas

2.5.1 Gradientų pobūdis

Tirpalų tankio gradientams sukurti dažniausiai naudojami sacharozės tirpalai, kartais su fiksuotu pH. Kai kuriais atvejais geras atskyrimas pasiekiamas naudojant D 2 0 vietoj įprasto vandens. 2.1 parodytos kai kurių sacharozės tirpalų savybės.

Gradiento pasirinkimą lemia specifinės frakcionavimo užduotys. Pavyzdžiui, fikolis, kurį gamina Pharmacia Fine Chemicals, gali pakeisti sacharozę tais atvejais, kai reikia sukurti didelio tankio ir mažo osmosinio slėgio gradientus. Kitas ficol privalumas yra tai, kad jis neprasiskverbia pro ląstelių membranas. Didesnio tankio gradientams sukurti naudojamos sunkiųjų metalų druskos, tokios kaip rubidis ir cezis, tačiau dėl korozinio CsCl poveikio tokie gradientai naudojami tik rotoriuose, pagamintuose iš atsparių metalų, pavyzdžiui, titano.

2.5.2 Žingsnio tankio gradiento technika

Norint sukurti tankio gradientą, keli tirpalai, kurių tankis paeiliui mažėja, atsargiai pipete įleidžiami į centrifugos mėgintuvėlį. Tada ant viršutinio sluoksnio, kuris turi mažiausią tankį, mėginys sluoksniuojamas siauros zonos pavidalu, po to mėgintuvėlis centrifuguojamas. Lygius tiesinius gradientus galima gauti išlyginus laipsniškus gradientus ilgai stovint tirpalui. Procesą galima paspartinti švelniai maišant mėgintuvėlio turinį viela arba švelniai purtant mėgintuvėlį.

2.5.3 Tolygaus tankio gradiento sukūrimo technika

Daugeliu atvejų sklandžiai tankio gradientui sukurti naudojamas specialus įtaisas. Jį sudaro du griežtai apibrėžto vienodo skersmens cilindriniai indai, kurie dugne susisiekia vienas su kitu stikliniu vamzdeliu su valdymo vožtuvu, leidžiančiu reguliuoti abiejų indų turinio maišymo proporcijas. Viename iš jų yra maišytuvas ir išleidimo anga, per kurią tirpalas patenka į centrifugos mėgintuvėlius. Į maišytuvą dedamas tankesnis tirpalas; antrasis cilindras pripildytas mažesnio tankio tirpalu. Tirpalų kolonėlės aukštis abiejuose cilindruose nustatomas taip, kad hidrostatinis slėgis juose būtų vienodas. Tankesnis tirpalas palaipsniui išleidžiamas iš maišytuvo į centrifugos vamzdelius ir tuo pačiu metu pakeičiamas tokiu pat kiekiu mažesnio tankio tirpalo, patenkančio į maišytuvą iš antrojo cilindro per valdymo vožtuvą. Tirpalo homogeniškumas maišytuve užtikrinamas nuolat maišant tirpalą maišytuvu. Tirpalui nusausinant į centrifugos mėgintuvėlius, jo tankis mažėja ir mėgintuvėliuose susidaro linijinis tankio gradientas. Netiesinius gradientus galima sukurti naudojant sistemą, kurią sudaro du nevienodo skersmens cilindrai.

Skirtingo statumo tankio gradientams formuoti naudojama dviejų mechaniškai valdomų švirkštų sistema, užpildyta nevienodo tankio tirpalais. Keičiant santykinį stūmoklių greitį galima sukurti įvairius gradientus.

2.5.4 Gradientų ištraukimas iš centrifugos mėgintuvėlių

Pasibaigus centrifugavimui ir atskirus daleles, susidariusias zonas reikia pašalinti. Tai atliekama keliais būdais, dažniausiai taikant poslinkio metodą. Centrifugos vamzdelis praduriamas prie pagrindo ir į jo apatinę dalį lėtai įleidžiama labai tanki terpė, pavyzdžiui, 60-70% sacharozės tirpalas. Viršutinis tirpalas išstumiamas, o frakcijos surenkamos naudojant švirkštą, pipetę arba specialų prietaisą, prijungtą per vamzdelį prie frakcijų rinktuvo. Jei vamzdeliai pagaminti iš celiuliozės arba nitroceliuliozės, frakcijos išgaunamos perpjaunant vamzdelį specialiu peiliuku. Tam tiesiai po norima zona nupjaunamas stove pritvirtintas centrifugos vamzdelis ir frakcija išsiurbiama švirkštu arba pipete. Tinkamai suprojektavus pjovimo įrenginį, tirpalo praradimas bus minimalus. Frakcijos taip pat renkamos plona tuščiavidure adata praduriant mėgintuvėlio pagrindą. Lašai, tekantys iš vamzdelio per adatą, surenkami į frakcijų rinktuvą tolesnei analizei.

2.5.5 Paruošiamosios centrifugos ir jų pritaikymas

Parengiamąsias centrifugas galima suskirstyti į tris pagrindines grupes: bendrosios paskirties centrifugas, greitaeigias centrifugas ir preparatines ultracentrifugas. Bendrosios paskirties centrifugos maksimalus greitis yra 6000 aps./min -1 ir OCU iki 6000 g . Jie skiriasi vienas nuo kito tik talpa ir turi nemažai keičiamų rotorių: kampinių ir su pakabinamais stiklais. Viena iš šio tipo centrifugų ypatybių yra didelė talpa – nuo ​​4 iki 6 dm 3 , leidžianti į jas krauti ne tik 10,50 ir 100 cm 3 centrifugų vamzdelius, bet ir indus, kurių talpa iki 1,25 dm 3 . Visose šio tipo centrifugose rotoriai yra tvirtai pritvirtinti prie pavaros veleno, o centrifugos vamzdeliai kartu su jų turiniu turi būti kruopščiai subalansuoti ir skirtis svoriu ne daugiau kaip 0,25 g. turi būti dedami simetriškai, vienas prieš kitas, taip užtikrinant vienodą mėgintuvėlių pasiskirstymą rotoriaus sukimosi ašies atžvilgiu.

Didelio greičio centrifugos maksimalus greitis yra 25 000 aps./min -1 ir OCU iki 89 000 g. Rotoriaus kameroje yra aušinimo sistema, kuri neleidžia įkaisti dėl trinties rotoriaus sukimosi metu. Paprastai didelės spartos centrifugos yra 1,5 dm 3 talpos ir yra su keičiamais rotoriais, tiek kampiniais, tiek su pakabinamais stiklais.

Paruošiamosios ultracentrifugos maksimalus greitis iki 75 000 aps./min -1 ir maksimalus išcentrinis pagreitis 510 000 g . Juose yra ir šaldytuvas, ir vakuuminis blokas, kad rotorius neperkaistų dėl jo trinties su oru. Tokių centrifugų rotoriai pagaminti iš didelio stiprumo aliuminio arba titano lydinių. Dažniausiai naudojami aliuminio lydinio rotoriai, tačiau tais atvejais, kai reikia ypač didelių greičių, naudojami titano rotoriai. Siekiant sumažinti vibraciją, atsirandančią dėl rotoriaus disbalanso dėl netolygaus centrifugos vamzdelių užpildymo, ultracentrifugos turi lankstų veleną. Centrifugų mėgintuvėliai ir jų turinys turi būti kruopščiai subalansuoti 0,1 g tikslumu.. Panašių reikalavimų reikia laikytis ir apkraunant bendros paskirties centrifugų rotorius.

2.6 Rotorių konstrukcija

2.6.1 Kampiniai rotoriai ir rotoriai su pakabinamais kaušais

Paruošiamųjų centrifugų rotoriai dažniausiai būna dviejų tipų – kampiniai ir pakabinami kaušai. Jie vadinami kampiniais, nes juose įtaisyti centrifugos vamzdeliai visada yra tam tikru kampu sukimosi ašies atžvilgiu. Rotoriuose su pakabintais stiklais mėgintuvėliai montuojami vertikaliai, o sukdami, veikiami susidariusios išcentrinės jėgos, pasislenka į horizontalią padėtį; pasvirimo kampas į sukimosi ašį yra 90°.

Kampiniuose rotoriuose atstumas, kurį dalelės nukeliauja iki atitinkamos mėgintuvėlio sienelės, yra labai mažas, todėl nusėdimas vyksta gana greitai. Susidūrusios su mėgintuvėlio sienelėmis dalelės slysta žemyn ir apačioje susidaro nuosėdos. Centrifuguojant susidaro konvekciniai srautai, kurie labai apsunkina panašių nusėdimo savybių dalelių atskyrimą. Nepaisant to, panašaus dizaino rotoriai sėkmingai naudojami atskirti daleles, kurių nusėdimo greitis labai skiriasi.

Rotoriuose su kabančiomis taurelėmis taip pat stebimi konvekcijos reiškiniai, tačiau jie nėra tokie ryškūs. Konvekcija atsiranda dėl to, kad, veikiant išcentriniam pagreičiui, dalelės nusėda kryptimi, kuri nėra griežtai statmena sukimosi ašiai, todėl, kaip ir kampiniuose rotoriuose, atsitrenkia į mėgintuvėlio sieneles ir nuslysta į apačia.

Konvekcijos ir sūkurio efektų tam tikru mastu galima išvengti naudojant sektorinius vamzdžius kabančių puodelių rotoriuose ir reguliuojant rotoriaus greitį; Išvardintas aukščiau, centrifugavimo pagal tankio gradientą metodas taip pat neturi trūkumų.

2.6.2 Ištisiniai rotoriai

Nepertraukiami rotoriai yra skirti greitam sąlyginai nedidelių kietos medžiagos kiekių frakcionavimui iš didelio tūrio suspensijų, pavyzdžiui, ląstelėms atskirti nuo auginimo terpės. Centrifuguojant į rotorių nuolat pilama dalelių suspensija; rotoriaus pralaidumas priklauso nuo nusodinto preparato pobūdžio ir svyruoja nuo 100 cm 3 iki 1 dm 3 per 1 min. Rotoriaus ypatumas yra tas, kad tai yra izoliuota specialios konstrukcijos kamera; jo turinys nesusisiekia su išorine aplinka, todėl nėra užterštas ar purškiamas.

2.6.3 Zoniniai arba Andersono rotoriai

Zoniniai rotoriai gaminami iš aliuminio arba titano lydinių, kurie gali atlaikyti labai didelius išcentrinius pagreičius. Paprastai jie turi cilindrinę ertmę, uždarą nuimamu dangteliu. Ertmės viduje, ant sukimosi ašies, yra ašinis vamzdis, ant kurio uždedamas antgalis su mentėmis, dalijantis rotoriaus ertmę į keturis sektorius. Mentės arba pertvaros turi radialinius kanalus, per kuriuos įpurškiamas gradientas nuo ašinio vamzdžio iki rotoriaus periferijos. Dėl šios ašmenų konstrukcijos konvekcija sumažinama iki minimumo.

Rotoriaus užpildymas atliekamas jam sukantis maždaug 3000 aps./min -1 greičiu. Iš anksto sukurtas gradientas pumpuojamas į rotorių, pradedant nuo mažiausio tankio sluoksnio, kuris yra tolygiai paskirstytas išilgai rotoriaus periferijos ir laikomas prie jo išorinės sienelės statmenai sukimosi ašiai dėl išcentrinės jėgos. . Vėliau pridedant didesnio tankio gradiento sluoksnius, vyksta nuolatinis poslinkis mažiau tankių sluoksnių centro link. Po to, kai visas gradientas yra pumpuojamas į rotorių, jis iki viso tūrio užpildomas tirpalu, vadinamu „pagalve“, kurio tankis yra toks pat arba šiek tiek viršija didžiausią iš anksto suformuoto gradiento tankį.

Tada per ašinį vamzdelį tiriamasis mėginys yra sluoksniuojamas , kuris iš vamzdelio išstumiamas į rotoriaus tūrį naudojant mažesnio tankio tirpalą, o iš periferijos pašalinamas toks pat „pagalvėlės“ tūris. Po visų šių procedūrų rotoriaus sukimosi greitis padidinamas iki darbinio greičio ir reikiamą laiką atliekama arba zoninė, arba zoninė-izopikninė frakcionavimas. . Frakcijų ekstrahavimas atliekamas 3000 aps./min -1 rotoriaus greičiu. Rotoriaus turinys išstumiamas pridedant „pagalvėlę“ iš periferijos, pirmiausia išstumiami mažiau tankūs sluoksniai . Dėl ypatingos Anderson rotoriaus ašinio kanalo konstrukcijos nesimaišo zonos jų poslinkio metu. Išeinantis gradientas perduodamas per registravimo įrenginį, pavyzdžiui, spektrofotometro kamerą, su kuria baltymų kiekis gali būti nustatomas absorbuojant 280 nm, arba per specialų radioaktyvumo detektorių, po kurio surenkamos frakcijos.

Vidutiniu greičiu naudojamų zoninių rotorių talpa svyruoja nuo 650 iki 1600 cm 3, todėl galima gauti gana didelį kiekį medžiagos. Zoniniai rotoriai naudojami baltymų teršalams pašalinti iš įvairių preparatų ir izoliuoti bei išvalyti mitochondrijas, lizosomas, polisomas ir baltymus.

2.6.4 Subląstelinių frakcijų analizė

Poląstelinių dalelių preparato, gauto frakcionuojant, savybes galima priskirti pačių dalelių savybėms tik tuo atveju, jei preparate nėra priemaišų. Todėl visada būtina įvertinti gautų preparatų grynumą. Mikroskopiniu tyrimu galima nustatyti homogenizacijos efektyvumą ir priemaišų buvimą preparate. Tačiau matomų priemaišų nebuvimas dar nėra patikimas vaisto grynumo įrodymas. Norint kiekybiškai įvertinti gauto preparato grynumą, jam atliekama cheminė analizė, kuri leidžia nustatyti baltymų ar DNR kiekį jame, nustatyti, jei įmanoma, fermentinį aktyvumą ir imunologines savybes.

Fermentų pasiskirstymo frakcionuotuose audiniuose analizė grindžiama dviem bendrais principais. Pirmasis iš jų yra tas, kad visos tam tikros tarpląstelinės populiacijos dalelės turi tą patį fermentų rinkinį. Antrasis reiškia, kad kiekvienas fermentas yra lokalizuotas tam tikroje ląstelės vietoje. Jei ši pozicija būtų teisinga, fermentai galėtų veikti kaip atitinkamų organelių žymenys: pavyzdžiui, citochromo oksidazė ir monoaminooksidazė veiktų kaip mitochondrijų žymenų fermentai, rūgštinės hidrolazės kaip lizosomų žymenys, katalazė kaip peroksisomų žymeklis ir gliukozė-6- fosfatazė – mikrosominės membranos žymuo. Tačiau paaiškėjo, kad kai kurie fermentai, tokie kaip malato dehidrogenazė, R-gliukuronidazė, NADP "H-citochromo-c-reduktazė, yra lokalizuota daugiau nei vienoje frakcijoje. Todėl kiekvienu konkrečiu atveju reikia labai atsargiai pasirinkti tarpląstelinių frakcijų fermentų žymenis. Be to, žymeklio fermento nebuvimas nereiškia tinkamų Organelių nebuvimo Tikėtina, kad frakcionuojant fermentą organelės praranda arba jis yra slopinamas arba inaktyvuojamas, todėl kiekvienai frakcijai paprastai nustatomi bent du žymeniniai fermentai.

Frakcija	Tūris, cm"	Bendras veisimas	Eksuliacija, 660 nm	Fermentų aktyvumo vienetai	Aktyvumo išeiga trupmenomis,%

2.7 Frakcionavimas diferenciniu centrifugavimu

2.7.1 Rezultatų pristatymas

Audinių frakcionavimo rezultatai patogiausiai pateikiami grafikų pavidalu. Taigi, tiriant fermentų pasiskirstymą audiniuose, duomenys geriausiai pateikiami histogramų pavidalu, leidžiančių vizualiai įvertinti eksperimentų rezultatus.

Baltymų kiekio fermentinis aktyvumas mėginyje nustatomas tiek pirminiame homogenate, tiek kiekvienoje išskirtoje tarpląstelinėje frakcijoje atskirai. Bendras fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis frakcijose neturėtų labai skirtis nuo atitinkamų verčių pradiniame homogenate.

Tada kiekvienoje frakcijoje apskaičiuojamas fermentinis aktyvumas ir baltymų kiekis procentais nuo bendros išeigos, pagal kurią daroma histograma. Santykinis baltymų kiekis kiekvienoje frakcijoje paeiliui brėžiamas išilgai abscisių ašies jų išskyrimo tvarka, o santykinis kiekvienos frakcijos specifinis aktyvumas – išilgai ordinačių ašies. Taigi kiekvienos frakcijos fermentinis aktyvumas nustatomas pagal strypų plotą.

2.7.2 Analitinis ultracentrifugavimas

Skirtingai nuo preparatinės centrifugavimo, kurios tikslas – atskirti medžiagas ir jas išvalyti, analitinė ultracentrifuga daugiausia naudojama biologinių makromolekulių ir kitų struktūrų nusėdimo savybėms tirti. Todėl analitiniame centrifugavime naudojami specialios konstrukcijos rotoriai ir registravimo sistemos: jie leidžia nuolat stebėti medžiagos nusėdimą. in išcentrinis laukas.

Analitinės ultracentrifugos gali pasiekti greitį iki 70 000 aps./min -1, o generuoti išcentrinį pagreitį iki 500 000 g . Jų rotorius, kaip taisyklė, yra elipsoido formos ir styga sujungtas su varikliu, todėl galima keisti rotoriaus sukimosi greitį. Rotorius sukasi vakuuminėje kameroje su šaldymo įtaisu ir turi dvi analizines ir balansavimo kameras, kurios centrifugoje sumontuotos griežtai vertikaliai, lygiagrečiai sukimosi ašiai. Balansavimo elementas skirtas analitinės ląstelės balansavimui ir yra metalinis blokas su tikslia sistema. Jame taip pat yra dvi rodyklės skylės, esančios griežtai apibrėžtu atstumu nuo sukimosi ašies, kurių pagalba nustatomi atitinkami atstumai analizės langelyje. Analitinė ląstelė, kurios talpa paprastai yra 1 cm 3, yra sektorinės formos. Tinkamai įmontuotas į rotorių, nors jis yra vertikaliai, jis veikia tuo pačiu principu kaip ir rotorius su pakabinamomis kaušais, todėl susidaro beveik idealios sedimentacijos sąlygos. Analitinės kameros galuose yra langai su kvarciniais stiklais. Analitinėse ultracentrifugose įrengtos optinės sistemos, leidžiančios stebėti dalelių nusėdimą per visą centrifugavimo laikotarpį. Iš anksto nustatytais laiko intervalais nuosėdų medžiaga gali būti fotografuojama. Frakcionuojant baltymus ir DNR, sedimentacija stebima absorbuojant ultravioletiniuose spinduliuose, o tais atvejais, kai tiriami tirpalai turi skirtingus lūžio rodiklius, naudojant Schlieren sistemą arba Rayleigh interferencinę sistemą. Paskutiniai du metodai pagrįsti tuo, kad kai šviesa praeina per skaidrų tirpalą, susidedantį iš skirtingo tankio zonų, šviesa lūžta ties zonos riba. Sedimentacijos metu tarp zonų su sunkiosiomis ir lengvosiomis dalelėmis susidaro riba, kuri veikia kaip refrakcinis lęšis; šiuo atveju ant fotografinės plokštelės, naudojamos kaip detektorius, atsiranda smailė. Sedimentacijos metu juda riba, taigi ir smailė, pagal kurios greitį galima spręsti apie medžiagos nusėdimo greitį. Interferometrinės sistemos yra jautresnės nei Schlieren sistemos. Analitinės ląstelės yra vieno sektoriaus, kurios naudojamos dažniausiai, ir dviejų sektorių, kurios naudojamos lyginamajam tirpiklio ir tirpios medžiagos tyrimui.

Biologijoje analitinis ultracentrifugavimas naudojamas makromolekulių molekulinėms masėms nustatyti, gautų mėginių grynumui patikrinti, makromolekulių konformaciniams pokyčiams tirti.

2.8 Analitinio ultracentrifugavimo taikymas

2.8.1 Molekulinių masių nustatymas

Yra trys pagrindiniai molekulinės masės nustatymo metodai, naudojant analitinį ultracentrifugavimą: sedimentacijos greičio nustatymas, sedimentacijos pusiausvyros metodas ir sedimentacijos pusiausvyros aproksimacijos metodas.

Molekulinės masės nustatymas nusėdimo greičiu tai yra labiausiai paplitęs metodas. Centrifugavimas atliekamas dideliu greičiu, kad dalelės, iš pradžių tolygiai paskirstytos visame tūryje, pradėtų judėti spinduliu nuo sukimosi centro. Tarp tirpiklio srities, kurioje jau nėra dalelių, ir tos jo dalies, kurioje jos yra, susidaro aiški sąsaja. Ši riba juda centrifuguojant, todėl galima nustatyti dalelių nusėdimo greitį vienu iš aukščiau pateiktų metodų, registruojant šį judėjimą fotografinėje plokštelėje.

Sedimentacijos greitis nustatomas pagal šį ryšį:

kur X - atstumas nuo sukimosi ašies cm,

t - laikas s,

w yra kampinis greitis rad-s -1 ,

s - sedimentacijos koeficientas "molekulė.

Sedimentacijos koeficientas yra greitis vienam pagreičio vienetui, jis matuojamas Seedberg vienetai ; 1 Švedbergo vienetas lygus 10 _13 s. Skaitinė s reikšmė priklauso nuo dalelių molekulinės masės ir formos ir yra tam tikrai molekulei ar supramolekulinei struktūrai būdinga reikšmė. Pavyzdžiui, lizocimo sedimentacijos koeficientas yra 2,15 S; katalazės sedimentacijos koeficientas yra 11,35S, bakterijų ribosomų subvienetai – nuo ​​30 iki 50S, o eukariotų ribosomų subvienetai – nuo ​​40 iki 60S.

kur M yra molekulės molekulinė masė, R yra dujų konstanta, T - absoliuti temperatūra, s - molekulės sedimentacijos koeficientas, D yra molekulės difuzijos koeficientas, v - dalinis savitasis tūris, kuris gali būti laikomas tūriu, kurį užima vienas gramas ištirpusios medžiagos, p - tirpiklio tankis.

Sedimentacijos balanso metodas. Molekulinės masės šiuo metodu nustatomos esant santykinai mažam rotoriaus greičiui, maždaug 7000-8000 aps./min -1, kad didelės molekulinės masės molekulės nenusėstų ant dugno. Ultracentrifugavimas atliekamas tol, kol dalelės pasiekia pusiausvyrą, kuri susidaro veikiant išcentrinėms jėgoms, viena vertus, ir difuzijos jėgoms, kita vertus, tai yra, kol dalelės nustos judėti. Tada pagal gautą koncentracijos gradientą apskaičiuojama medžiagos molekulinė masė "pagal formulę

kur R yra dujų konstanta, T - absoliuti temperatūra, o - kampinis greitis, p - tirpiklio tankis, v - dalinis specifinis tūris, Su X ir Su 2 yra tirpios medžiagos koncentracija per atstumus G G ir r 2 nuo sukimosi ašies.

Šio metodo trūkumas yra tas, kad nusėdimo pusiausvyrai pasiekti reikia daug laiko – nuo ​​kelių dienų iki kelių savaičių, nuolat veikiant centrifugai.

Sedimentacijos pusiausvyros nustatymo metodas buvo sukurtas siekiant atsikratyti ankstesnio metodo trūkumų, susijusių su didelėmis laiko investicijomis, reikalingomis „pusiausvyrai nustatyti. Naudojant šį metodą, galima nustatyti molekulines mases, kai centrifuguojamas tirpalas yra priartėjimo prie pusiausvyros būsenos.Pirmiausia makromolekulės tolygiai pasiskirsto visame analitinės ląstelės tūryje, paskui centrifuguojant molekulės nusėda, o tirpalo tankis menisko srityje palaipsniui mažėja. kruopščiai užrašoma, o tada, atliekant sudėtingus skaičiavimus, apimančius daug kintamųjų, tam tikro junginio molekulinė masė nustatoma pagal formules:

kur R yra dujų konstanta, T yra absoliuti temperatūra, v - dalinis savitasis tūris, p – tirpiklio tankis, dcldr - makromolekulės koncentracijos gradientas, g m ir g d - atitinkamai atstumas iki menisko ir vamzdelio dugno, c m ir s d - makromolekulių koncentracija atitinkamai menike ir vamzdelio apačioje, M m ir M R -molekulinių masių vertės, nustatomos atitinkamai pagal medžiagos koncentracijos pasiskirstymą menisku ir mėgintuvėlio dugne.

2.8.2 Preparatų grynumo įvertinimas

DNR, virusų ir baltymų preparatų grynumui įvertinti plačiai taikomas analitinis ultracentrifugavimas. Preparatų grynumas neabejotinai labai svarbus tais atvejais, kai reikia tiksliai nustatyti molekulės molekulinę masę. Daugeliu atvejų preparato homogeniškumą galima spręsti pagal sedimentacijos ribos pobūdį, taikant sedimentacijos greičio metodą: homogeniškas preparatas dažniausiai duoda vieną aiškiai apibrėžtą ribą. Priemaišos, esančios preparate, atrodo kaip papildoma smailė arba mentė; jie taip pat lemia pagrindinės smailės asimetriją.

2.8.3 Makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas

Kita analitinės ultracentrifugavimo taikymo sritis yra makromolekulių konformacinių pokyčių tyrimas. Pavyzdžiui, DNR molekulė gali būti viengrandė arba dvigrandė, linijinė arba apskrita. Įvairių junginių įtakoje arba aukštesnėje temperatūroje DNR patiria nemažai grįžtamųjų ir negrįžtamų konformacinių pokyčių, kuriuos galima nustatyti keičiant mėginio nusėdimo greitį. Kuo molekulė kompaktiškesnė, tuo mažesnis jos trinties koeficientas tirpale ir atvirkščiai: kuo ji mažiau kompaktiška, tuo didesnis trinties koeficientas ir, atitinkamai, lėčiau ji nusėda. Taigi, mėginio sedimentacijos greičio skirtumai prieš ir po įvairaus poveikio jam leidžia aptikti makromolekulėse vykstančius konformacinius pokyčius.

Allosteriniuose baltymuose, tokiuose kaip, pavyzdžiui, aspartato transkarbamoilazė, konformaciniai pokyčiai atsiranda dėl jų prisijungimo prie substrato ir mažų ligandų. Baltymų disociacija į subvienetus gali būti paskatinta jį apdorojant tokiomis medžiagomis kaip karbamidas arba parachlormerkuribenzoatas. Visus šiuos pokyčius galima lengvai stebėti naudojant analitinį ultracentrifugavimą.

Vamzdžių gaminių formavimas metodu centrifugavimas. Pagal centrifugavimas statybinių medžiagų pramonėje ... kurioms toks poveikis atliekamas yra vadinami centrifugavimas. Baltarusijos Respublikos pramonėje naudojamos horizontalios centrifugos ...

Dalelių nusodinimas

Laboratoriniai darbai >> Chemija

Ląstelės jau išleistos mažu greičiu centrifugavimas iš branduolio, mitochondrijų ir... ultracentrifugavimo Šio tipo ypatybės centrifugavimas atsispindi jos labai... mums naudojimo atvejais centrifugavimas sacharozės tankio gradiente, ...

Naudojant centrifugą

Kursiniai darbai >> Pramonė, gamyba

Partijinėse centrifugose įvairios operacijos centrifugavimas- pakrovimas, atskyrimas, iškrovimas - įvyksta ... atskirti parengiamąjį ir analitinį centrifugavimas. Su parengiamuoju centrifugavimas paimama biologinė medžiaga...