CENTRIFUGÁLÁS

100 nm-nél nagyobb részecskéket tartalmazó folyékony diszperz rendszerek centrifugális erőinek területén történő szétválasztása. Alkotó fázisok (folyékony - centrifuga vagy szűrlet, szilárd anyag - üledék) elkülönítésére szolgál kétkomponensű (emulziók) és háromkomponensű (szilárd fázist tartalmazó emulziók) rendszerekből.

Módszerek és felszerelések. A C.-nek két módja van: centrifugális és szűrés. C. centrifugális gépekben - centrifugákban és folyékony centrifugális szeparátorokban - történik. Fő ezeknek a gépeknek a munkateste egy tengelyszimmetrikus héj, vagy egy forgórész (dob), nagy c -1 frekvencián forog, aminek következtében centrifugális erőtér jön létre 2 x 10 4-ig. g ipari és 35 x 10 4 g-ig laboratóriumi gépekben ( g- szabad gyorsulás. esés a gravitációban terület). A C. módszertől függően szilárd (kicsapó; 1. ábra a) vagy perforált (szűrőanyaggal bevont; 1. ábra b) rotorokban történik.

Rizs. egy. Centrifugális ülepítő (a) és szűrési gépek rotorjai ( b): C - szuszpenzió, F - centrifuga (szűrlet), O - üledék; magyarázat a szövegben, r W a folyadék szabad felületének sugara.

A C.-t számos technológia jellemzi. a folyamat minőségét és kinetikáját meghatározó paraméterek. Ezek közé tartozik: osztott tényező (r RT - max. a rotor belső sugara), amely a centrifugális mező intenzitását tükrözi; centrifugális sebesség - a centrifugális gép termelékenysége a kezdeti folyadékrendszer vagy annak alkotóelemei tekintetében; elszívás - a centrátumban (szűrletben) lévő szilárd fázis tartalma; az üledék telítése a folyékony fázissal (beleértve az üledéket is) C. után; elválasztási finomság - min. a centrifugális ülepítésben megfogott részecskék mérete.
A C. kinetikája sok mindentől függ. a tényezőket két csoportba soroljuk. Az első csoport tényezőit a fizikai meghatározza. szétválasztod a rendszert (fázissűrűség-különbség, szilárd fázis granulometrikus összetétele, folyékony fázis, fajlagos üledékállóság a szűrés során). A centrifugális gép forgórészének kialakítása és forgási sebessége által meghatározott második csoportba tartozó tényezők (a rotoron belüli áramlás szerkezete, hidrodinamikája és sebességtere) döntően befolyásolják a centrifugális ülepedést, részben pedig a centrifugális szűrést; viszont hidrodinamikus. mód a gép teljesítményétől függ. Mat. az áramlás leírását a Navier - Stokes és a folytonosság egyenlete adja meg (lásd. hidromechanikai eljárások), a to-rye a forgórész geometriájának és a peremfeltételeknek a figyelembevételével készül; a megoldást gyakran módszerekkel találják meg elméleti hasonlóságok.
A centrifugális ülepítés magában foglalja a sűrítést, valamint az ülepítést C. Derítés - a szilárd fázis eltávolítása az 5 térfogatszázalékot nem meghaladó részecsketartalmú szuszpenziókból; például kőolajok tisztítására használják. A sűrítés olyan eljárás, amelyben a diszpergált fázis részecskéit a diszperziós közeg viszonylag kis térfogatában csoportosítják; lehetővé teszi szuszpenziók megvalósítását (pl. kaolin vizes szuszpenziója). C. csapadék - 5-10 térfogatszázaléknál nagyobb szilárdfázisú szuszpenziók szétválasztása; túlnyomórészt alkalmazni. szilárd komponensek (pl. CaSO 4) dehidratálására.
A centrifugális ülepítés során a szilárd részecskék mozgása centrifugális erő hatására történik ( d- részecskeátmérő - a szilárd és folyékony fázis sűrűsége közötti különbség; r- távolság a részecske és a forgórész forgástengelye között) és a folyékony közeg ellenállási ereje S. Ezen erők aránya határozza meg a lerakódás sebességét w. A világosságra jellemző lamináris rendszerben az S erőt a Stokes-törvény fejezi ki: ahol pedig dinamikus. a folyékony fázis viszkozitása. A nagy részecskék lerakódása közbeni turbulens rendszerhez, erősen koncentrált. szuszpenziók esetén az S erőt a következő egyenletből kapjuk: (- légellenállási együttható; p W - a folyadékfázis sűrűsége). Az áramlás hidrodinamikája határozza meg a részecskék tartózkodási idejét a rotorban, aw az ülepedési idő; ezeknek az értékeknek az összehasonlítása lehetővé teszi az elválasztás finomságának meghatározását.
A centrifugális szűrés úgy történik, hogy üledék képződik a szűrő válaszfalán vagy anélkül, valamint mindkét folyamat egyidejű áramlása a zónákban; max. hatékony csapadék előállítására min. páratartalom. A folyamatot általában három periódusra osztják: csapadékképződés, abból a felesleges folyadék eltávolítása és az intermol által visszatartott folyadék eltávolítása. erők (fur. huzat). Az első periódus a centrifugális ülepítést és a képződött csapadékrétegen keresztül történő szűrést foglalja magában. A folyamat kinetikájának kiszámításához a Darcy-Weisbach törvényt használjuk; a hajtóerőt (nyomásesést) a felfüggesztésre ható centrifugális tér határozza meg: ahol a felfüggesztés sűrűsége; r w - sugár szabad. a folyadék felülete (1. ábra, b). Befolyásolja a folyadéknak az üledékréteg feletti megcsúszása. Az időszak diff-en futhat. módok; max. üzemmódok jellemzőek az állandó és a felfüggesztési teljesítményre. A második és harmadik periódus az üledéktömörödéssel kapcsolatos számos tényezőtől, póruscsatornáinak alakjától stb. függ; építik a szőnyegüket. modellek rendkívül nehéz.
A centrifugális gépek összetettsége miatt a centrifugális gépek teljesítményét leggyakrabban modellezéssel értékelik az ún. teljesítményindex, amely F-vel az első közelítésben a forgórész oldalfelületének területét jelenti. Phys. ez azt jelenti, hogy az ülepítő tartályokban történő ülepítéshez hasonlóan a centrifugák termelékenysége is arányos a munkafelület területével, azonban a centrifugális tér hatására az Fr tényezővel növekszik. Az egyes típusú gépek forgórészének tervezési jellemzőitől függően azt a saját egyenlete határozza meg, és a teljesítmény átszámítására szolgál az egyik centrifugaméretről a másikra. A modellezést a geom. a rotorok hasonlósága és a folyamat meghatározó kritériumainak azonossága.

Rizs. 2. Folyamatos centrifuga: a -ülepítő csiga; b - szűrőcsavar; felől pulzáló iszapkibocsátás; g - inerciális; d - rezgés; e - precessziós; 1 - rotor; 2 - kirakodó mechanizmus.

A C. a többi elválasztási (szűrési) módszerhez képest kisebb nedvességtartalmú csapadék kinyerését teszi lehetővé. Centrifugális ülepítéssel a szűréssel ellentétben lehetőség van a szuszpenziók szétválasztására (pl. festékek és lakkok gyártásánál) finoman diszpergált szilárd fázissal, min. a részecskék mérete egy vágás 5-10 mikron. A C. fontos előnye, hogy viszonylag kis térfogatú berendezésekben is alkalmazható; hátrány - magas energiafogyasztás.
Prom. a centrifugákat megkülönböztetik: az elválasztás elve szerint - kicsapás, szűrés és kombinált; tervezés szerint - preim. a forgórész és az üledékleeresztő rendszer elhelyezkedése szerint (csiga, toló vagy dugattyú; tehetetlenségi erők alkalmazásával); a folyamat megszervezéséről - időszakos vagy folyamatos cselekvés.
C. gépekben időszakos. a műveleteket ciklikusan hajtják végre néha állítható késsel vagy kézi iszapürítéssel ellátott rotorokban.
ábrán. A 2. ábra a szuszpenziók szétválasztásának sematikus diagramjait mutatja folyamatos gépekben. Az ülepítőcsigás centrifugákat (2. ábra, a) oldhatatlan szilárd fázisú szuszpenziók (pl. polisztirol, szennyvíziszap) elkülönítésére, a kristályok dehidratálására tervezték. és szemcsés termékek, osztályozás (pl. TiO 2), sűrítés (pl. eleveniszap). A folyamat szilárd rotorban megy végbe; az üledéket folyamatosan üríti ki a frekvenciával forgó csiga Ehhez az Fr600-3500 centrifugához.
A szűrőcsigás centrifugák (2. ábra, b) gyakoriak az erősen koncentrált anyagok elválasztásánál. durva szilárd anyagokat tartalmazó szuszpenziók (0,2 mm-nél nagyobb szemcseméret, pl. Glauber-só). A C.-t lemezszitával ellátott keretes rotorban állítják elő, amelyen keresztül a szűrlet kiürül. Az iszapot a forgási sebesség különbségének hatására csiga távolítja el a rotorról. A magas Fr értékek (1200-1800) lehetővé teszik a minimális termékek előállítását. páratartalom.
A főben pulzáló üledékürítésű szűrőcentrifugákat (2. ábra, c) használnak. ugyanazokra a célokra, mint a szűrőcsavar. Az egy- vagy többfokozatú rotor rostélyos szitáján vastag üledékréteg jelenléte miatt lehetőség van a termék mélymosására (pl. KC1, finomított cukor). Az üledék kirakása egy toló segítségével történik, amely oda-vissza mozog. mozgás lineáris sebességgel v; 300-700 frt.
Az inerciális centrifugákban (2. ábra, d) a centrifugális tér összetevője miatt az üledék eltávolításra kerül a rotorról; vibrációs centrifugákban (2. ábra, e) - a forgórész tengely menti rezgése miatt v sebességgel; precessziós centrifugákban (2. ábra, f) - giroszkópos miatt forgórész mozgások forgási sebességgel és minden típusú gépet használnak centrifugális szűréshez erősen koncentrált. durva kristályokat tartalmazó szuszpenziók. szilárd fázis (például szén, kristálycukor).
C. fajta szuszpenziók és emulziók szétválasztása centrifugális szeparátorokban. Rotoraik kúpos csomaggal vannak felszerelve. egymáshoz képest kis hézaggal (0,4-1,5 mm) szerelt lemezek. Magas fokú elválasztás érhető el annak köszönhetően, hogy lamináris üzemmódban a lemezközi rés vékony rétegében áramlik. Finoman diszpergált szuszpenziók (olajadalékok, hormonkészítmények stb.), amelyek 0,5-4,0 térfogatszázalék szőrt tartalmaznak. a szennyeződéseket szeparátor-tisztítókban tisztítják (3. ábra, a). A forgórész iszapterében összegyűlt szilárd fázis a fenék (dugattyú) kinyitásakor időszakonként eltávolítódik belőle. A centrifugális sűrítést (pl. takarmány- és sütőélesztő) szeparátor-sűrítőben végezzük (3. ábra, b). A kondenzált frakció folyamatosan távozik a fúvókákon keresztül a rotor kerülete mentén, a tisztított frakció pedig a tetején keresztül. zóna. Az emulziók (például olajiszap) elválasztására szeparátorokat használnak (4. ábra), amelyek rotorjaiban a nehéz és könnyű folyadékok határfelületén elhelyezkedő lyukakkal ellátott lemezcsomag van; a komponensek (F 1 és F 2 fugák) külön jelennek meg. Ha az emulzióban szilárd fázis van, akkor univerzális rotorokat használnak üledék kiürítéssel az 1. ábra szerint. 3, vagy kézzel.
A centrifugákkal analóg módon a szeparátorok elválasztó képességét a teljesítményindex becsüli meg

ahol z - a csomagban lévő tányérok száma; - a lemez tetején lévő kúp szögének fele; R max, R min - külső és belső. edény sugarai. A szeparátorokban a folyamatok szimulációja a centrifugákhoz hasonlóan a teljesítményindex szerint történik

Rizs. 3. Elválasztók szuszpenziók leválasztásához: a 2. ábrán. a szeparátor-tisztító (a) és a szeparátor-sűrítő ( b); 1 - rotor; 2 - egy csomag lemez; 3 - mozgatható alsó.

Rizs. négy. Elválasztó az emulziók szétválasztásához: 1 - rotor; 2 - egy csomag lemez; F 1 és F2 - centrátok; E - emulzió.

A centrifugális folyamatok laboratóriumi tanulmányozására modelleket használnak. 150-250 mm rotorátmérőjű centrifugák és szeparátorok, valamint az ún. csésze centrifugák (a rotor számos kémcsőből - csészéből áll). Ezek a kis méretű minták lehetővé teszik nemcsak a szalagavató produktivitásának kísérleti meghatározását. gépek, hanem az üledék kiürítésének lehetősége a forgórészekről, a termék végső nedvességtartalma, elszívása. A kutatásokat kis mennyiségű termékekkel speciálisan végzik. áll. A főzőpohár centrifugákat a részecskék bomláskori ülepedési idejének becslésére használják. fr.
Modern A centrifugális technológia növeli a rotorok forgási sebességét, növeli a termelékenységet, csökkenti az ütemeket. fém és energiaintenzitás. A gépek termelékenysége növekszik a forgórészek hidrodinamikájának javulása, hosszuk (ülepítő centrifugákban) és a csomag magasságának (leválasztókban) növekedése miatt. A nagy kapacitású gépek forgórészeinek átmérője nő; kombinálva jönnek létre. rotorok, a tervekben to-rykh kombinált decomp. C. módszerek Mikroprocesszoros vezérlőrendszereket és állítható hajtásokat vezetnek be, hogy a C. optimális legyen. módok.
A C. elterjedt a technol. a vegyi-erdészeti komplexum folyamatai, élelmiszer-, textil- és egyéb termelések. C. fontos szerepet játszik az ökológiai problémák megoldásában. problémák (kommunális és ipari szennyvíz tisztítása), az erőforrás-takarékos technológiákban.

Megvilágított.: Sokolov V. I., Centrifugálás, M., 1976; Shkoropad D. E., Novikov O. P., Centrifugák és szeparátorok a vegyipar számára, M., 1987.

I. A. Fainerman.

Ultracentrifugálás - 100 nm-nél kisebb részecskék (állati és növényi organellumok makromolekulái, vírusok stb.) elválasztásának és vizsgálatának módszere a centrifugális erők területén. Lehetővé teszi a részecskék keverékeinek frakciókra vagy egyedi komponensekre történő szétválasztását a móló megtalálásához. a polimerek tömege és MWD-je, szelvátumaik sűrűsége. Lehetővé teszi az oldatban lévő makromolekulák alakjának és méretének értékelését (lásd. diszperzióanalízis), a statikusság hatása a részecskék stabilitására gyakorolt ​​nyomás, a kölcsönhatás paraméterei. asszociációs típus - makromolekulák egymással vagy alacsony mol molekulákkal. komponensek és ionok, az oldószer természetének hatása a makromolekulák konformációira stb.
Az üreges rotorral ellátott ultracentrifugák segítségével történik, az üregek zárva és áramlóan történnek. Tegyen különbséget a nagy sebesség és az egyensúly között. Az első esetben a részecskék a forgórész sugara mentén, ill. együtthatójukkal üledékképződés, első közelítésben a részecske tömegével arányos, a részecske és a folyadék sűrűségének különbsége, amikor a részecskék a forgórész forgástengelyétől a kerület felé (üledék) mozognak, a - tengelye felé. forgatás (úszó). Egyensúlyi ultracentrifugálással a részecskék sugárirányú átvitele a vegyszer összegéig folytatódik. a potenciál és a moláris potenciálenergia a rendszer egyes pontjaiban nem lesz állandó érték, ami után a részecskék eloszlása ​​megszűnik változni.
T. naz. elemző Az ultracentrifugálást az oldatok, varianciaanalízisnél alkalmazzák, és analit segítségével végzik. ultracentrifugák felszerelt rotorok optikailag átlátszó zárt tartállyal és optikai. rendszerek a koncentrációnak vagy annak gradiensének a rotor sugara mentén történő időbeni meghatározására; vizsgált térfogatok - 0,01-2 ml, több részecske tömegével. mcg-tól mg-ig. Preparatív ultracentrifugálást alkalmaznak a komponensek komplex keverékekből való izolálására; a folyadék térfogata és a vizsgálati minta tömege m. b. többen többet rendel, mint analittal. ultracentrifugálás. A centrifugális gyorsulások ultracentrifugákban elérik az 5 x 10 5 g-t. Az első elemző. az ultracentrifugát T. Svedberg (1923; 5 x 10 3 g) készítette.

Megvilágított.: Bowen T., Bevezetés az ultracentrifugálásba, ford. angolból, M., 1973.

A. D. Morozkin.

Kémiai enciklopédia. - M.: Szovjet enciklopédia. Szerk. I. L. Knunyants. 1988 .

Szinonimák:

Nézze meg, mi a "CENTRIFUGING" más szótárakban:

Inhomogén rendszerek (pl. folyékony szilárd anyagok) frakciókra bontása sűrűség alapján centrifugális erők segítségével. A centrifugálást centrifugáknak nevezett berendezésekben végzik. Centrifugálással választják el az üledéket a ... ... Wikipédiától

Inhomogén rendszerek szétválasztása (például a folyadék szilárd test) centrifugális erők segítségével; szuszpenziók leválasztására, szennyezett folyadékok derítésére, az iszapok szilárd részecskék mérete szerinti osztályozására stb. szétválási lehetőségek ...... Atomenergia kifejezések

centrifugálás- Ndp. illesztési fugázó Folyékony inhomogén rendszerek szétválasztása a rotorokban centrifugális erők hatására. [GOST 16887 71] [GOST R 51109 97] Megengedhetetlen, nem ajánlott hézagkötés Témakörök ipari tisztaság szűrés, centrifugálás, ... ... Műszaki fordítói kézikönyv

centrifugálás- - termékek fröccsöntésének módszere centrifugális erők alkalmazásával, amelyek a keverékből kinyomják a keverővíz és a magával ragadott levegő egy részét. [Terminológiai szótár betonhoz és vasbetonhoz. FSUE "Kutatóközpont" Építőipari "NIIZHB és M. A. A. Gvozdev, ... ... Építőanyagok kifejezések, definíciók és magyarázatok enciklopédiája

Inhomogén keverékek (szuszpenziók, emulziók, iszapok) részekre bontása centrifugális erő hatására. Centrifugákban végzik. Tudományos kutatásban, vegyiparban, élelmiszeriparban, bányászatban és más iparágakban használják... Nagy enciklopédikus szótár

Eljárás inhomogén, diszpergált folyadékrendszerek szétválasztására a centrifugális erők területén (centrifuga mező). Nagyobb elválasztási képességgel rendelkezik, mint a préselés, ülepítés és szűrés. C. centrifugában végzett, a működési elv a ... ... Mikrobiológiai szótár

Létezik., szinonimák száma: 1 ultracentrifugálás (1) ASIS Synonym Dictionary. V.N. Trishin. 2013... Szinonima szótár

centrifugálás- * centrifugálás * centrifugálás a centrifuga által létrehozott erők felhasználása (lásd) molekulák elválasztására folyékony közegben. A C.-nek többféle típusa van: sűrűséggradiensben, differenciálisban, szacharózgradiensben ... Genetika. Enciklopédiai szótár - inhomogén rendszerek (pl. folyékony szilárd anyag) szétválasztása centrifugális erők segítségével. Szuszpenziók leválasztására, szennyező anyagok derítésére használják. folyadékok, hidraulika az iszap osztályozása a szilárd részecskék mérete szerint stb. Ezt a ... ... Nagy enciklopédikus politechnikai szótár

Könyvek

• Principles and Methods of Biochemistry and Molecular Biology, Derek Gordon, Egy brit szerzők által írt oktatási kiadvány, amely lefekteti a biokémia és molekuláris biológia elméleti koncepcióinak alapjait a modern kutatási módszerekre, többek között ... Kategória: Orvostudomány Sorozat: Módszerek a biológiában (Tudáslaboratórium) Kiadó: Knowledge Lab, elektronikus könyv(fb2, fb3, epub, mobi, pdf, html, pdb, lit, doc, rtf, txt)

Tanfolyami munka

centrifugálás

1. A módszer elve

Az anyagok centrifugálással történő elválasztása a részecskék eltérő viselkedésén alapul a centrifugális térben. A kémcsőbe helyezett részecskeszuszpenziót a centrifuga hajtótengelyére szerelt rotorba töltjük.

A centrifugális mezőben a különböző sűrűségű, alakú vagy méretű részecskék különböző sebességgel rakódnak le. Az ülepedési sebesség a centrifugális gyorsulástól függ, amely egyenesen arányos a forgórész szögsebességével, valamint a részecske és a forgástengely távolságával:

és a centrifugális gyorsulás akkor lesz

Mivel a forgórész egy fordulata 2n radián, a forgórész szögsebessége fordulat/percben a következőképpen írható fel:

A centrifugális gyorsulást általában g egységekben fejezik ki, és relatív centrifugális gyorsulásnak nevezik, pl.

A részecskék leválasztási feltételeinek felsorolásakor tüntesse fel a forgórész forgási sebességét és sugarát, valamint a centrifugálási időt. A centrifugális gyorsulást általában g egységekben fejezik ki, a centrifugacsőben lévő folyadékoszlop átlagos forgási sugarából számítva. Az egyenlet alapján Dole és Kotzias összeállított egy nomogramot, amely kifejezi a GCC függését a forgórész fordulatszámától és r sugarától.

A gömb alakú részecskék ülepedési sebessége nemcsak a centrifugális gyorsulástól függ, hanem maguknak a részecskék sűrűségétől és sugarától, valamint a szuszpenziós közeg viszkozitásától is. A gömb alakú részecske folyékony közegben a folyékony meniszkusztól a centrifugacső aljáig történő ülepedéséhez szükséges idő fordítottan arányos az ülepedési sebességgel, és a következő egyenlet határozza meg:

ahol t az ülepedési idő másodpercben, rj a közeg viszkozitása, rh a részecske sugara, rf a részecske sűrűsége, p a közeg sűrűsége, hm a távolság a forgástengelytől a folyadék meniszkuszához, ahol a forgástengely és a kémcső alja közötti távolság.

Az egyenletből az következik, hogy adott rotorfordulatszám mellett a homogén gömb alakú részecskék ülepedéséhez szükséges idő fordítottan arányos sugaruk négyzetével, valamint a részecske- és közegsűrűség különbségével, és egyenesen arányos a közeg viszkozitásával. . Emiatt heterogén, megközelítőleg gömb alakú, sűrűségben és méretű részecskék keveréke különíthető el akár a cső aljára adott gyorsulás melletti leülepedésük különböző időpontjai, akár az ülepedő részecskék cső mentén történő eloszlása ​​miatt. , amely egy bizonyos idő elteltével jön létre. Az anyagok szétválasztásakor olyan fontos tényezőket kell figyelembe venni, mint a közeg sűrűsége és viszkozitása. A leírt módszerek elválaszthatják a sejtszerveket a szövethomogenizátumoktól. A sejt fő összetevői a következő sorrendben rakódnak le: először az egész sejtek és azok töredékei, majd a sejtmagok, kloroplasztiszok, mitokondriumok, lizoszómák, mikroszómák, végül a riboszómák. A nem gömb alakú részecskék ülepedése nem engedelmeskedik az egyenletnek, így az azonos tömegű, de eltérő alakú részecskék különböző sebességgel rakódnak le. Ezt a tulajdonságot használják a makromolekulák konformációjának ultracentrifugálásával végzett vizsgálatban.

Az előkészítő centrifugálás a biológiai anyag izolálását jelenti a későbbi biokémiai vizsgálatokhoz. Ebben az esetben nagy mennyiségű kiindulási biológiai anyagot lehet venni, például mikrobiális sejteket kötegelt vagy folyamatos tenyészetekből, valamint növényi és állati sejteket szövet- és vérplazmatenyészetekből. Preparatív centrifugálás segítségével nagyszámú sejtrészecskét izolálnak, hogy tanulmányozzák morfológiájukat, szerkezetüket és biológiai aktivitásukat. A módszert olyan biológiai makromolekulák, mint például DNS és fehérjék izolálására is használják korábban tisztított készítményekből.

Az analitikai centrifugálást elsősorban makromolekulák vagy részecskék, például riboszómák tiszta vagy lényegében tiszta preparátumainak tanulmányozására használják. Ebben az esetben kis mennyiségű anyagot használnak fel, és speciális optikai rendszerekkel folyamatosan rögzítik a vizsgált részecskék ülepedését. A módszer lehetővé teszi az anyag tisztaságára, molekulatömegére és szerkezetére vonatkozó adatok beszerzését. Az alapképzési műhelyekben a preparatív centrifugálást sokkal gyakrabban alkalmazzák, mint az analitikus centrifugálást, ezért erre térünk ki részletesebben, bár mindkét módszer közös elveken alapul.

2. Preparatív centrifugálás

2.1 Differenciálcentrifugálás

Ez a módszer az egymástól méretben és sűrűségben eltérő részecskék ülepedési sebességének különbségén alapul. Az elválasztandó anyagot, például egy szövethomogenizátumot, a centrifugális gyorsulás fokozatos növelésével centrifugálják, amelyet úgy választanak meg, hogy minden szakaszban egy bizonyos frakció rakódjon le a cső alján. Az egyes lépések végén a csapadékot elválasztjuk a felülúszótól, és többször mossuk, hogy végül tiszta kicsapott frakciót kapjunk. Sajnos gyakorlatilag lehetetlen abszolút tiszta csapadékot előállítani; Hogy megértsük, miért történik ez, térjünk át arra a folyamatra, amely minden centrifugálási lépés elején a centrifugacsőben megy végbe.

Először is, a homogenizátum minden részecskéje egyenletesen oszlik el a centrifugacső térfogatában, így a legnehezebb részecskék csapadékából egy centrifugálási ciklusban nem lehet tiszta készítményt előállítani: az első képződő csapadék főleg a legnehezebb részecskéket tartalmazza, de ezen túlmenően az összes kezdeti komponens bizonyos mennyiségét is. A nehéz részecskék kellően tiszta készítményét csak a kiindulási csapadék újraszuszpendálásával és centrifugálásával lehet előállítani. A felülúszó további centrifugálása a centrifugális gyorsulás ezt követő növelésével a közepes méretű és sűrűségű részecskék ülepedéséhez, majd a legkisebb, legkisebb sűrűségű részecskék ülepedéséhez vezet. ábrán. A 2.3. ábra egy patkánymáj homogenizátum frakcionálási diagramja.

Úgy tűnik, hogy a differenciális centrifugálás a leggyakoribb módszer a sejtszervecskék szövethomogenizátumokból történő izolálására. Ezzel a módszerrel a legsikeresebben olyan sejtszervecskéket lehet szétválasztani, amelyek méretükben és sűrűségükben jelentősen különböznek egymástól. A kapott frakciók azonban még ebben az esetben sem teljesen homogének, és további elválasztásukra más módszereket alkalmaznak, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Ezek az organellum-sűrűség-különbségeken alapuló eljárások hatékonyabb elválasztást biztosítanak folyamatos vagy lépcsőzetes sűrűséggradiensű oldatokban történő centrifugálással. E módszerek hátránya, hogy időbe telik az oldat sűrűséggradiensének megállapítása.

2.2 Zónás centrifugálás sebessége

A zónasebességű, vagy más néven s-zónás centrifugálás módszere abból áll, hogy a vizsgálati mintát egy folyamatos sűrűséggradienssel rendelkező oldat felületére rétegezzük. A mintát ezután centrifugálják, amíg a részecskék el nem oszlanak a gradiens mentén különálló zónákban vagy sávokban. A sűrűséggradiens kialakításával elkerülhető a konvekcióból adódó zónák keveredése. A sebességzónás centrifugálási módszert RNS-DNS hibridek, riboszóma alegységek és egyéb sejtkomponensek elkülönítésére használják.

2.3 Izopiknikus centrifugálás

Az izopiknikus centrifugálást mind sűrűséggradiensben, mind a szokásos módon végezzük. Ha a centrifugálást nem sűrűséggradiensben hajtják végre, a készítményt először centrifugálják, hogy a vizsgált részecskéknél nagyobb molekulatömegű részecskék leülepedjenek. Ezeket a nehéz részecskéket eldobják, és a mintát egy olyan közegben szuszpendálják, amelynek sűrűsége megegyezik az izolálandó frakció sűrűségével, majd centrifugálják, amíg a vizsgált részecskék a cső alján leülepednek, és a kisebb sűrűségű részecskék a cső aljára úsznak. a folyadék felülete...

Egy másik módszer az, hogy a mintát az oldat felületére egy folytonos sűrűséggradienssel rétegezzük, amely lefedi a keverék összes komponensének sűrűségtartományát. A centrifugálást addig végezzük, amíg a részecskék felhajtósűrűsége megegyezik a megfelelő zónák sűrűségével, azaz addig, amíg a részecskék zónákra nem válnak szét. A módszert zonális izopiknikusnak vagy rezonáns centrifugálásnak nevezik, mivel itt a lebegő sűrűség a lényeg, nem pedig a részecskék mérete vagy alakja. Azt a sűrűséget, amelynél a részecskék izopiknális sávokat alkotnak, a szuszpenziós közeg természete befolyásolja; A részecskék egyes vegyületek számára oldatban áteresztőek lehetnek, mások számára átjárhatatlanok, vagy oldatmolekulákat köthetnek hozzá. A zónarotor használatakor a mitokondriumok, lizoszómák, peroxiszómák és mikroszómák 42%, 47%, 47% és 27% szacharózt tartalmazó sávokban koncentrálódnak, ami 1,18, 1,21, 1,21 és 1,10 g-cm -3 sűrűségnek felel meg. A szubcelluláris organellumok sűrűsége bizonyos vegyületek szelektív felvételétől is függ. A Triton WR-1339 detergens patkányoknak való bevezetése, amely nem okoz hemolízist, a májlizoszómák méretének növekedéséhez és sűrűségének csökkenéséhez vezet; a mitokondriumok és a peroxiszómák sűrűsége változatlan marad. Annak ellenére, hogy a lizoszómák ülepedési tulajdonságai általában nem változnak, egyensúlyi sűrűségük a szacharóz gradiensben 1,21-ről 1,1-re csökken, ami a lizoszómális-peroxiszomális frakció megfelelő elválasztásához vezet. Ezt a tulajdonságot a lizoszómák, mitokondriumok és peroxiszómák kvantitatív szétválasztására használják, amely a mikroszómákénál nagyobb sűrűségű részecskék homogén közegből történő eltávolításán, majd a kicsapott nehéz részecskék ezt követő izopiknális centrifugálásán alapul.

2.4 Egyensúlyi sűrűséggradiens centrifugálás

Nehézfémsókat, például rubídiumot vagy céziumot, valamint szacharózoldatokat használnak a sűrűséggradiens létrehozására. Egy mintát, például DNS-t tömény cézium-klorid oldattal keverünk össze. Az oldott anyag és az oldószer kezdetben egyenletesen oszlik el a térfogatban. A centrifugálás során kialakul a CsCl koncentrációjának és ennek következtében a sűrűségének egyensúlyi eloszlása, mivel a céziumionok tömege nagy. A centrifugális gyorsítás hatására a DNS-molekulák újra eloszlanak, és külön zóna formájában gyűlnek össze a kémcső egy részében, amelynek sűrűsége megfelelő. A módszert elsősorban analitikai centrifugálásban alkalmazzák, Meselson és Stahl pedig az E. coli DNS-replikáció mechanizmusának tanulmányozására alkalmazta. Az egyensúlyi sűrűséggradiens centrifugálás szintén a humán plazma lipoproteinek elválasztásának és tanulmányozásának egyik módszere.

2.5 Gradiensek formálása és kiemelése

2.5.1 A gradiensek jellege

Az oldatok sűrűséggradiensének létrehozásához leggyakrabban szacharóz oldatokat használnak, néha rögzített pH-val. Egyes esetekben jó elválasztást érünk el, ha közönséges víz helyett D2 0-t használunk. A 2.1 néhány szacharózoldat tulajdonságait mutatja be.

A gradiens kiválasztását a frakcionálás konkrét feladatai határozzák meg. Például a Pharmacia FineChemicals által gyártott ficol helyettesítheti a szacharózt olyan esetekben, amikor nagy sűrűségű és alacsony ozmotikus nyomású gradienseket kell létrehozni. A ficol másik előnye, hogy nem jut át ​​a sejtmembránokon. Nehézfémsókat, például rubídiumot és céziumot használnak nagyobb sűrűségű gradiensek létrehozására, azonban a CsCl korrozív hatása miatt ilyen gradienseket csak ellenálló fémekből, például titánból készült rotoroknál alkalmaznak.

2.5.2 Lépéssűrűség gradiens technika

A sűrűséggradiens létrehozásához több, egymás után csökkenő sűrűségű oldatot óvatosan pipettával egy centrifugacsőbe juttatunk. Ezután a legfelső rétegre, amely a legkisebb sűrűségű, a mintát keskeny zóna formájában rétegezik, majd a csövet centrifugálják. Sima lineáris gradiensek érhetők el, ha az oldat hosszabb állása során lépcsőzetes gradienseket simítunk. A folyamat felgyorsítható, ha a cső tartalmát egy dróttal finoman megkeverjük, vagy a tubus finoman rázzuk.

2.5.3 Sima sűrűséggradiens létrehozásának technikája

A legtöbb esetben egy speciális eszközt használnak a sima sűrűséggradiens létrehozására. Két, szigorúan meghatározott, azonos átmérőjű hengeres edényből áll, amelyek alul egy vezérlőszelepes üvegcsővel kommunikálnak egymással, amely lehetővé teszi a két edény tartalmának keverési arányának beállítását. Az egyik keverővel van felszerelve, és van egy kimenete, amelyen keresztül az oldat a centrifugacsövekbe áramlik. Sűrűbb oldatot helyezünk egy keverőbe; a második hengert kisebb sűrűségű oldattal töltjük meg. Az oldatoszlop magassága mindkét hengerben úgy van beállítva, hogy a hidrosztatikus nyomás bennük azonos legyen. A sűrűbb oldat fokozatosan távozik a keverőből a centrifugacsövekbe, és ezzel egyidejűleg helyettesíti a keverőbe a második hengerből a szabályozószelepen keresztül azonos térfogatú kisebb sűrűségű oldattal. A keverőben lévő oldat homogenitását az oldat keverővel való folyamatos keverése biztosítja. Ahogy az oldatot centrifugacsövekbe engedjük le, sűrűsége csökken, és a csövekben lineáris sűrűséggradiens jön létre. Nemlineáris gradiensek hozhatók létre két nem egyenlő átmérőjű hengerből álló rendszer segítségével.

Különböző meredekségű sűrűséggradiensek kialakításához két, mechanikusan vezérelt fecskendőből álló rendszert használnak, amelyeket nem egyenlő sűrűségű oldatokkal töltenek meg. A dugattyúk relatív sebességének változtatásával különféle gradiensek hozhatók létre.

2.5.4 Gradiensek kinyerése centrifugacsövekből

A centrifugálás befejezése és a részecskék elválasztása után a kialakult zónákat el kell távolítani. Ez többféleképpen történik, leggyakrabban eltolásos módszerrel. Egy centrifugacsövet átszúrnak az alján, és az alsó részébe lassan nagyon sűrű közeget, például 60-70%-os szacharózoldatot vezetnek. A felső oldatot kiszorítják, és a frakciókat fecskendővel, pipettával vagy speciális eszközzel gyűjtik össze, amely egy csövön keresztül a frakciógyűjtőhöz van csatlakoztatva. Ha a csövek celluloidból vagy nitrocellulózból készülnek, a frakciókat a cső speciális pengével történő levágásával vonják ki. Ehhez egy állványra rögzített centrifugacsövet közvetlenül a kívánt zóna alá vágunk, és a frakciót fecskendővel vagy pipettával leszívjuk. A vágószerkezet megfelelő kialakításával az oldatveszteség minimális lesz. A frakciók összegyűjtése a kémcső aljának vékony üreges tűvel történő átszúrásával is történik. A csőből a tűn keresztül kifolyó cseppeket egy frakciógyűjtőbe gyűjtik további elemzés céljából.

2.5.5 Preparatív centrifugák és alkalmazásaik

Az előkészítő centrifugák három fő csoportba sorolhatók: általános célú centrifugák, nagy sebességű centrifugák és preparatív ultracentrifugák. Az általános célú centrifugák maximális sebessége 6000 ford./perc, az RCF pedig 6000 g-ig. Csak kapacitásukban különböznek egymástól, és számos cserélhető rotorral rendelkeznek: szögletes és függőüveges. Az ilyen típusú centrifugák egyik jellemzője a nagy kapacitásuk - 4-6 dm3, ami lehetővé teszi, hogy ne csak 10,50 és 100 cm3-es centrifugacsövekkel, hanem akár 1,25 dm3 kapacitású edényekkel is megtöltsék őket. Minden ilyen típusú centrifugánál a forgórészek mereven vannak a hajtótengelyre szerelve, és a centrifugacsöveket a tartalommal együtt gondosan ki kell egyensúlyozni, és a tömegük legfeljebb 0,25 g-mal különbözhet egymástól. más, így biztosítva a kémcsövek egyenletes eloszlását a rotor forgástengelyéhez képest.

A nagy sebességű centrifugák 25 000 rpm-1 maximális sebességet és akár 89 000 g RCF-et biztosítanak. A rotorkamra hűtőrendszerrel van felszerelve, amely megakadályozza a forgórész forgása során fellépő súrlódás miatt felmelegedést. A nagy sebességű centrifugák általában 1,5 dm3 kapacitásúak, és cserélhető rotorokkal vannak felszerelve, mind ferde, mind függőkanalakkal.

Az előkészítő ultracentrifugák akár 75 000 fordulat/perc maximális sebességet és 510 000 g maximális centrifugális gyorsulást adnak. Hűtővel és vákuumegységgel is fel vannak szerelve, hogy megakadályozzák a forgórész túlmelegedését a levegővel való súrlódás miatt. Az ilyen centrifugák rotorjai nagy szilárdságú alumíniumból vagy titánötvözetből készülnek. Főleg alumíniumötvözetből készült rotorokat használnak, azonban olyan esetekben, amikor különösen nagy fordulatszámra van szükség, titán rotorokat használnak. A centrifugacsövek egyenetlen töltéséből adódó rotor kiegyensúlyozatlanságból eredő vibráció csökkentése érdekében az ultracentrifugák rugalmas tengelyűek. A centrifugacsöveket és azok tartalmát gondosan ki kell egyensúlyozni 0,1 g pontossággal Hasonló követelményeket kell betartani a centrifugák rotorjainak általános célú betöltésekor.

2.6 A rotorok kialakítása

2.6.1 Szögrotorok és függőkanalakkal ellátott rotorok

A preparatív centrifugák rotorjai általában két típusúak - szögletes és függővödrök. Szögletesnek nevezik őket, mert a bennük elhelyezett centrifugacsövek mindig bizonyos szöget zárnak be a forgástengelyhez képest. A függőüveges rotorokban a kémcsövek függőlegesen vannak felszerelve, és a keletkező centrifugális erő hatására elforgatva vízszintes helyzetbe kerülnek; a dőlésszög a forgástengelyhez képest 90°.

A szögletes rotoroknál a részecskék által a kémcső megfelelő faláig megtett távolság nagyon kicsi, ezért az ülepedés viszonylag gyorsan megtörténik. A kémcső falával való ütközés után a részecskék lecsúsznak és üledéket képeznek az alján. A centrifugálás során konvekciós áramlások keletkeznek, amelyek nagymértékben megnehezítik a hasonló ülepedési tulajdonságú részecskék elválasztását. Ennek ellenére a hasonló felépítésű rotorokat sikeresen használják olyan részecskék elválasztására, amelyek ülepedési sebessége meglehetősen változó.

A lógó poharas rotoroknál konvekciós jelenségek is megfigyelhetők, de ezek nem annyira hangsúlyosak. A konvekció annak az eredménye, hogy centrifugális gyorsítás hatására a részecskék a forgástengelyre nem szigorúan merőleges irányban leülepednek, és ezért a szögrotorokhoz hasonlóan a kémcső falának ütköznek, és elcsúsznak az alsó.

A konvekciós és örvénylési hatások bizonyos mértékig elkerülhetők szektorális alakú csövek használatával a függőcsészős rotorokban és a forgórész fordulatszámának beállításával; A fent felsorolt ​​​​sűrűséggradiens centrifugálási módszer szintén megfosztja a hátrányait.

2.6.2 Folyamatos forgórészek

A folyamatos rotorokat viszonylag kis mennyiségű szilárd anyag nagy sebességű frakcionálására tervezték nagy térfogatú szuszpenziókból, például sejtek izolálására a tápközegből. A centrifugálás során a részecskék szuszpenzióját folyamatosan adják a rotorhoz; a forgórész teljesítménye a lerakott készítmény jellegétől függ, és percenként 100 cm3 és 1 dm3 között változik. A rotor sajátossága, hogy egy speciális kialakítású szigetelt kamra; tartalma nem kommunikál a külső környezettel, ezért nem szennyeződik vagy permetezett.

2.6.3 Zóna vagy Anderson rotorok

A zónarotorok alumíniumból vagy titánötvözetből készülnek, amelyek igen jelentős centrifugális gyorsulásokat képesek ellenállni. Általában hengeres üregük van, levehető fedéllel zárva. Az üreg belsejében a forgástengelyen egy axiális cső található, amelyre egy lapátokkal ellátott fúvókát helyeznek, amely a rotor üreget négy szektorra osztja. A lapátok vagy terelőlemezek sugárirányú csatornákkal rendelkeznek, amelyeken keresztül gradienst fecskendeznek be az axiális csőtől a forgórész kerületébe. A pengék ilyen kialakításának köszönhetően a konvekció minimálisra csökken.

A rotor feltöltése körülbelül 3000 rpm-1 fordulatszámmal történik. Egy előre elkészített gradienst pumpálnak a rotorba, a legkisebb sűrűségű rétegből kiindulva, amely egyenletesen oszlik el a rotor kerülete mentén, és a külső falánál a forgástengelyre merőlegesen a centrifugális erő hatására megmarad. A nagyobb sűrűségű gradiens rétegek ezt követő hozzáadásával folyamatos eltolódás következik be a kevésbé sűrű rétegek közepe felé. Miután a teljes gradienst a forgórészbe pumpáltuk, azt teljes térfogatára megtöltjük egy „párnának” nevezett oldattal, amelynek sűrűsége megegyezik az előre kialakított gradiens legnagyobb sűrűségével, vagy kissé meghaladja azt.

Ezután az axiális csövön keresztül rétegezzük a vizsgálati mintát, amelyet kisebb sűrűségű oldat segítségével a csőből a rotor térfogatába tolnak, míg a perifériáról eltávolítják az azonos térfogatú "párnát". Mindezen eljárások után a forgórész forgási sebességét az üzemi sebességhez igazítják, és vagy zonális sebességű vagy zóna-izopiknikus frakcionálást hajtanak végre a szükséges ideig. A frakciók extrakcióját 3000 ford./perc - min-1 forgórész-fordulatszámmal végezzük. A rotor tartalmát a perifériáról "párna" hozzáadásával elmozdítják, először is kevésbé sűrű rétegeket helyeznek el. Az Anderson rotor axiális csatornájának speciális kialakítása miatt nem keverednek össze a zónák az elmozdulásuk során. A kimenő gradienst egy rögzítőeszközön, például spektrofotométer cellán vezetik át, amellyel a fehérjetartalom 280 nm-en történő abszorpcióval határozható meg, vagy egy speciális radioaktivitás-detektoron keresztül, amely után frakciókat gyűjtenek.

A közepes fordulatszámon használt zónarotorok kapacitása 650 és 1600 cm3 között változik, ami meglehetősen nagy mennyiségű anyag előállítását teszi lehetővé. A zónás rotorokat a különböző készítményekből származó fehérjeszennyeződések eltávolítására, valamint a mitokondriumok, lizoszómák, poliszómák és fehérjék izolálására és tisztítására használják.

2.6.4 A szubcelluláris frakciók elemzése

A frakcionálással nyert szubcelluláris részecskék készítményének tulajdonságai csak akkor tulajdoníthatók maguknak a részecskéknek, ha a készítmény nem tartalmaz szennyeződéseket. Ezért mindig szükséges a kapott készítmények tisztaságának értékelése. A homogenizálás hatékonysága és a szennyeződések jelenléte a készítményben mikroszkópos vizsgálattal meghatározható. A látható szennyeződések hiánya azonban még nem megbízható bizonyítéka a gyógyszer tisztaságának. A kapott készítmény tisztaságának mennyiségi meghatározásához kémiai elemzésnek vetik alá, amely lehetővé teszi a fehérje- vagy DNS-tartalmának meghatározását, lehetőség szerint enzimatikus aktivitásának és immunológiai tulajdonságainak meghatározását.

Az enzimek frakcionált szövetekben való eloszlásának elemzése két általános elven alapul. Ezek közül az első az, hogy egy adott szubcelluláris populáció minden részecskéje ugyanazt az enzimkészletet tartalmazza. A második feltételezi, hogy minden enzim a sejten belül valamilyen meghatározott helyen található. Ha ez az álláspont igaz, akkor az enzimek a megfelelő organellumok markereiként működhetnének: például a citokróm-oxidáz és a monoamin-oxidáz mitokondriális markerenzimként, a savas hidrolázok lizoszómamarkerként, a kataláz peroxiszóma markerként és a glükóz-6- foszfatáz - mikroszomális membrán marker. Kiderült azonban, hogy egyes enzimek, például a malát-dehidrogenáz, a P-glükuronidáz, a NADP-H-citokróm-c-reduktáz egynél több frakcióban lokalizálódnak, ezért a szubcelluláris frakciók enzimmarkereit minden specifikusan meg kell választani. Az esetet nagy körültekintéssel kell megközelíteni, ráadásul a markerenzim hiánya nem jelenti a megfelelő sejtszervecskék hiányát.Valószínűleg a frakcionálás során az enzim elveszik az organellumoktól, vagy gátolja vagy inaktiválja, így legalább kettő a marker enzimeket általában minden frakcióhoz meghatározzák.

Töredék	Térfogat, cm"	Általános tenyésztés	Exnuláció, 660 nm	Az enzimaktivitás egységei	Aktivitáshozam töredékben, %
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7. Frakcionálás differenciális centrifugálással

2.7.1 Az eredmények bemutatása

A szövetfrakcionálás során kapott eredményeket legkényelmesebben grafikonok formájában mutatjuk be. Így az enzimek szövetekben való eloszlásának vizsgálatakor az adatok legjobban hisztogramok formájában jeleníthetők meg, amelyek lehetővé teszik a kísérletek eredményeinek vizuális értékelését.

A minta fehérjetartalmának enzimaktivitását mind az eredeti homogenizátumban, mind az egyes izolált szubcelluláris frakciókban külön-külön határozzuk meg. A frakciók teljes enzimaktivitása és fehérjetartalma nem térhet el jelentősen az eredeti homogenizátum megfelelő értékétől.

Ezután minden frakcióban kiszámítjuk az enzimaktivitást és a fehérjetartalmat az összhozam %-ában, amely alapján hisztogramot készítünk. Az egyes frakciókban lévő fehérje relatív mennyiségét szekvenciálisan ábrázoljuk az abszcissza tengely mentén az elkülönítés sorrendjében, és az egyes frakciók relatív fajlagos aktivitását az ordináta tengely mentén ábrázoljuk. Így az egyes frakciók enzimaktivitását a rudak területe alapján határozzuk meg.

2.7.2. Analitikai ultracentrifugálás

Ellentétben a preparatív centrifugálással, amelynek célja az anyagok szétválasztása és tisztítása, az analitikai ultracentrifugálást elsősorban biológiai makromolekulák és egyéb szerkezetek ülepedési tulajdonságainak vizsgálatára használják. Ezért az analitikai centrifugálás során speciális kialakítású rotorokat és rögzítőrendszereket használnak: lehetővé teszik az anyag ülepedésének folyamatos nyomon követését a centrifugális mezőben.

Az analitikai ultracentrifugák akár 70 000 fordulat/perc sebességet is elérhetnek, miközben centrifugális gyorsulást 500 000 g-ig képesek elérni. Rotoruk általában ellipszoid alakú, és egy zsinórral csatlakozik a motorhoz, ami lehetővé teszi a rotor forgási sebességének változtatását. A rotor egy hűtőberendezéssel felszerelt vákuumkamrában forog, és két elemző és kiegyensúlyozó cellával rendelkezik, amelyeket szigorúan függőlegesen, a forgástengellyel párhuzamosan helyeznek el a centrifugában. A kiegyensúlyozó cella az analitikai cella kiegyensúlyozására szolgál, és egy fémtömb precíziós rendszerrel. A forgástengelytől szigorúan meghatározott távolságban elhelyezett két indexfurattal is rendelkezik, amelyek segítségével meghatározzák a megfelelő távolságokat az analitikai cellában. Az általában 1 cm3 űrtartalmú analitikai cella szektorális alakú. Megfelelően beszerelve a rotorba, annak ellenére, hogy függőlegesen áll, ugyanazon az elven működik, mint a felfüggesztett serlegekkel ellátott rotor, így szinte ideális ülepedési feltételeket teremt. Az analitikai cella végein kvarcüveges ablakok vannak. Az analitikai ultracentrifugák optikai rendszerekkel vannak felszerelve, amelyek lehetővé teszik a részecskék ülepedésének nyomon követését a teljes centrifugálási időszak alatt. Előre meghatározott időközönként le lehet fényképezni az ülepedő anyagot. A fehérjék és a DNS frakcionálásakor az ülepedést ultraibolya sugárzásban történő abszorpcióval, illetve azokban az esetekben, amikor a vizsgált oldatok eltérő törésmutatókkal rendelkeznek, schlieren rendszerrel vagy Rayleigh-féle interferenciarendszerrel követik nyomon. Az utolsó két módszer azon alapul, hogy amikor a fény áthalad egy átlátszó oldaton, amely különböző sűrűségű zónákból áll, a fény a zóna határán megtörik. Az ülepedés során a nehéz és könnyű részecskéket tartalmazó zónák között határvonal képződik, amely fénytörő lencseként működik; ilyenkor egy csúcs jelenik meg a detektorként használt fényképezőlapon. Az ülepedés során elmozdul a határ, következésképpen a csúcs, melynek sebessége alapján meg lehet ítélni az anyag ülepedési sebességét. Az interferometrikus rendszerek érzékenyebbek, mint a schlieren rendszerek. Az analitikai cellák egyszektorosak, amelyeket leggyakrabban használnak, és kétszektorosak, amelyeket az oldószer és az oldott anyag összehasonlító vizsgálatára használnak.

A biológiában analitikai ultracentrifugálást alkalmaznak a makromolekulák molekulatömegének meghatározására, a kapott minták tisztaságának ellenőrzésére, valamint a makromolekulák konformációs változásainak vizsgálatára.

2.8. Analitikai ultracentrifugálás alkalmazása

2.8.1 A molekulatömeg meghatározása

Három fő módszer létezik a molekulatömeg meghatározására analitikus ultracentrifugálással: az ülepedési sebesség meghatározása, az ülepedési egyensúlyi módszer és az ülepedési egyensúlyi közelítés módszere.

A molekulatömeg ülepedési sebességgel történő meghatározása a legelterjedtebb módszer. A centrifugálást nagy sebességgel hajtják végre, így a részecskék, amelyek kezdetben egyenletesen oszlanak el a térfogatban, sorrendben elkezdenek mozogni a forgásközépponttól számított sugár mentén. Az oldószer részecskéktől már mentes területe és az azokat tartalmazó része között világos határfelület képződik. Ez a határ a centrifugálás során elmozdul, ami lehetővé teszi a részecskék ülepedési sebességének meghatározását a fenti módszerek valamelyikével, ezt a mozgást egy fényképező lemezen regisztrálva.

Az ülepedési sebességet a következő összefüggés határozza meg:

ahol x a forgástengelytől mért távolság cm-ben,

t - idő másodpercben,

w a szögsebesség rad-s-1-ben,

s a „molekula ülepedési együtthatója.

Az ülepedési együttható a sebesség egységnyi gyorsulási sebessége, mértékegysége Seedberg; 1 Swedberg egység 10_13 s. Az s számértéke a részecskék molekulatömegétől és alakjától függ, és egy adott molekulára vagy szupramolekuláris szerkezetre jellemző érték. Például a lizozim ülepedési együtthatója 2,15 S; A kataláz ülepedési együtthatója 11,35S, a bakteriális riboszóma alegységei 30-50S, az eukarióta riboszóma alegységei pedig 40-60S.

ahol M a molekula molekulatömege, R a gázállandó, T az abszolút hőmérséklet, s a molekula ülepedési együtthatója, D a molekula diffúziós együtthatója, v a parciális fajtérfogat, amely az oldott anyag egy grammja által elfoglalt térfogatnak tekintve p a sűrűségű oldószer.

Az ülepedési egyensúly módszere. A molekulatömeg-meghatározás ezzel a módszerrel viszonylag alacsony, 7000-8000 ford./perc nagyságrendű forgórész-fordulatszámon történik, így a nagy molekulatömegű molekulák nem ülepednek le az aljára. Az ultracentrifugálást addig végezzük, amíg a részecskék el nem érik az egyensúlyt, amely egyrészt a centrifugális erők, másrészt a diffúziós erők hatására jön létre, azaz amíg a részecskék mozgása meg nem áll. Ezután a kapott koncentráció gradiensnek megfelelően kiszámítjuk az anyag molekulatömegét "a képlet szerint

ahol R a gázállandó, T az abszolút hőmérséklet, ω a szögsebesség, p az oldószer sűrűsége, v a parciális fajtérfogat, cx és c2 az oldott anyag koncentrációja r és r2 távolságra forgástengely.

Ennek a módszernek az a hátránya, hogy hosszú időbe telik az ülepedési egyensúly elérése - több naptól több hétig a centrifuga folyamatos működése mellett.

Az ülepedési egyensúly megközelítésének módszerét azért dolgozták ki, hogy megszabaduljanak az előző módszer hátrányaitól, amelyek az egyensúly megteremtéséhez szükséges nagy időbefektetéssel jártak. Ezzel a módszerrel molekulatömegek határozhatók meg, amikor a centrifugált oldat Először a makromolekulák egyenletesen oszlanak el az analitikai cella teljes térfogatában, majd a centrifugálás előrehaladtával a molekulák leülepednek, és az oldat sűrűsége a meniszkusz régióban fokozatosan csökken. gondosan rögzítjük, majd összetett számításokkal, nagyszámú változóval, egy adott vegyület molekulatömegét a következő képletekkel határozzuk meg:

ahol R a gázállandó, T az abszolút hőmérséklet, v a részleges fajtérfogat, p az oldószer sűrűsége, dcldr a makromolekula koncentráció-gradiense, gm és gd a meniszkusztól és a meniszkusz aljától mért távolság. a kémcső, cm és sd a makromolekulák koncentrációja a meniszkusznál és y a cső alján, Mm és MR a molekulatömegek értékei, amelyeket az anyag koncentrációjának eloszlásából határoznak meg a meniszkusz és a cső alja, ill.

2.8.2 A készítmények tisztaságának értékelése

Az analitikai ultracentrifugálást széles körben használják a DNS-, vírus- és fehérjekészítmények tisztaságának értékelésére. A készítmények tisztasága kétségtelenül nagyon fontos olyan esetekben, amikor a molekula molekulatömegének pontos meghatározása szükséges. A legtöbb esetben a készítmény homogenitása az ülepedési határ jellege alapján ítélhető meg, az ülepedési sebesség módszerével: egy homogén készítmény általában egy élesen meghatározott határt ad. A készítményben jelenlévő szennyeződések további csúcsként vagy vállként jelennek meg; ezek határozzák meg a főcsúcs aszimmetriáját is.

2.8.3 A makromolekulák konformációs változásainak vizsgálata

Az analitikai ultracentrifugálás másik alkalmazási területe a makromolekulák konformációs változásainak vizsgálata. A DNS-molekula lehet például egy- vagy kétszálú, lineáris vagy cirkuláris. Különböző vegyületek hatására vagy megemelt hőmérsékleten a DNS számos reverzibilis és irreverzibilis konformációs változáson megy keresztül, ami a minta ülepedési sebességének változtatásával határozható meg. Minél tömörebb a molekula, annál kisebb a súrlódási együtthatója az oldatban, és fordítva: minél kevésbé tömör, annál nagyobb a súrlódási együttható, és ennek következtében annál lassabban ülepedik. Így a minta ülepedési sebességének különbségei a különböző hatások előtt és után lehetővé teszik a makromolekulákban előforduló konformációs változások kimutatását.

Az alloszterikus fehérjékben, mint például az aszpartát-transzkarbamoiláz, konformációs változások következnek be a szubsztráthoz és a kis ligandumokhoz való kötődésük eredményeként. Egy fehérje alegységekre való disszociációja előidézhető olyan anyagokkal történő kezeléssel, mint a karbamid vagy paraklór-mercuribenzoát. Mindezek a változások könnyen nyomon követhetők analitikai ultracentrifugálással.

A szűrés a folyadékokban vagy gázokban lévő lebegő szilárd anyagok elválasztásának folyamata. A szilárd részecskéket tartalmazó folyadékot vagy gázt olyan porózus anyagon (szűrőn) vezetik át, amelynek pórusmérete olyan kicsi, hogy a szilárd részecskék nem jutnak át a szűrőn. A pórusméret határozza meg a szűrő képességét a különböző méretű szilárd részecskék visszatartására, valamint a teljesítményét, vagyis az időegység alatt leválasztható folyadék mennyiségét.

A szűrési folyamatot befolyásolja a folyadék viszkozitása és a nyomáskülönbség a szűrő mindkét oldalán. Minél nagyobb egy folyadék viszkozitása, annál nehezebb szűrni. Mivel a folyadék viszkozitása a hőmérséklet emelkedésével csökken, a forró folyadékok könnyebben szűrhetők, mint a hidegek. A viszkózus folyadékok szűrése gyakran megkönnyíthető olyan oldószerrel való hígítással, amely a szűrés befejezése után könnyen ledesztillálható. Minél nagyobb a nyomáskülönbség, annál nagyobb a szűrési sebesség. Ezért a szűrést gyakran csökkentett vagy túlnyomáson végzik. A kocsonyás csapadék nyomás alatti szűrésekor az utóbbi szorosan a szűrőhöz kapcsolódik, amelynek pórusai könnyen eltömődnek, és a szűrés leáll.

Ha a szilárd fázis részecskemérete kisebb, mint a szűrő pórusmérete, a szuszpenzió nem szűrhető. Tehát a közönséges papírszűrők nem tartják meg sok kolloid oldat finom részecskéit. Ilyenkor szűrés előtt a kolloid oldatot felmelegítik, vagy elektrolitot adnak hozzá, ami koagulációhoz (részecskék megnagyobbodásához, csapadékképződéshez) vezet.

Ha a szűrés célja az, hogy tiszta szűrletet kapjunk, nem pedig tiszta csapadékot, hogy a finom részecskéket jobban elválasszuk a folyadéktól, kis mennyiségű porított aktív szenet adunk az utóbbihoz, összerázzuk és szűrjük.

A szűrő pórusait eltömítő és azon viszkózus rétegeket képző anyagokat tartalmazó keverékek szűrését gyakran megkönnyíti finom kvarchomok, kovaföld, azbesztszál, cellulóz (papír) pép hozzáadásával.

A szűrés a szűrendő folyadékok természetétől és a folyadéktól vagy gáztól elválasztandó szilárd fázis (csapadék) tulajdonságaitól függően többféleképpen is elvégezhető.

Ha a keverék szilárd fázisa könnyen kicsapódik, akkor annak nagy része dekantálással még a szűrés előtt eltávolítható. A dekantálás - a szilárd és folyékony fázisok szétválasztásának legegyszerűbb módja - azon alapul, hogy keverés hiányában a szilárd anyag leülepszik az edény aljára, és a leülepedett csapadékból lecsapolással tiszta folyadék választható ki. Néha a dekantálás is használható két különböző sűrűségű szilárd anyag elkülönítésére. A nehezen oldódó szilárd anyagok mosására gyakran szifonos dekantálást alkalmaznak (118. ábra). A dekantáló mosás sokkal hatékonyabb, mint a szűrőpogácsa mosás, ahol a folyadék általában nem hatol be egyenletesen a szilárd részecskék közé.

Szűrés a folyadék saját tömegének hatására

Ezt a szűrési módszert általában olyan esetekben alkalmazzák, amikor a szűrt szilárd fázisra nincs szükség (a mechanikai szennyeződések eltávolítása az oldatokból), vagy amikor a csapadék megfelelő oldószerrel történő ismételt kezelésével a folyékony fázis teljesen eltávolítható.

Hagyományos szűrést alkalmazunk, ha forró koncentrált oldatokat vagy kristályos anyagok illékony oldószerekkel készült oldatait kell szűrni. Ha az ilyen oldatokat vákuumban szűrjük, az oldószer elpárolog a szűrő alatt, amely gyorsan lehűl és eltömődik a kicsapódott kristályokkal.

Szűrőanyagként elsősorban különböző minőségű szűrőpapírt, kész papír zsír- és hamumentes szűrőket használnak.

A közvetlen felhasználásra szánt szűrőpapír két minőségben készül: FNB - gyors szűrés 3,5-10 mikron pórusmérettel és FNS - közepes sebességű szűrés 1-2,5 mikron pórusmérettel. Az ilyen minőségű papírok hamutartalma legfeljebb 0,2%.

A hamumentes és zsírmentes papírszűrők gyártásához három osztályú szűrőpapírt gyártanak: FOB - gyors szűrés; FOS - közepes szűrés; POF - lassú szűrés.

Kör alakú, zsírmentes (sárga szalaggal) és hamumentes kész papírszűrők különböző átmérőben, 100 db-os kiszerelésben készülnek. A szűrőméret megválasztása a leválasztandó szilárd anyagok tömegétől függ, nem a szűrendő folyadék mennyiségétől.

A laboratóriumi munkákhoz használt hamumentes szűrők elválasztó (megtartó) képességükben különböznek. Ezt a különbséget a papírszalag színe határozza meg, amelyet a csomagra ragasztottak.

A következő megnevezések elfogadottak: fehér szalag - gyors szűrés, piros - közepes szűrés, kék - lassú szűrés, finomszemcsés üledékek (BaSO4 típusú) szűrésére szolgál.

A szűrő márkájának megválasztása minden esetben a leválasztott szilárd anyag tulajdonságaitól függ. Nagyon sűrű szűrőket csak akkor szabad használni, ha feltétlenül szükséges.

Erős savak vagy lúgok tömény oldatainak szűrésére szűrőpapírt és kész szűrőket nem lehet használni, mivel ez csökkenti a szűrők mechanikai szilárdságát.

A papírszűrők egyszerűek és hajtogatottak (sima). Egy egyszerű, sima szűrő elkészítéséhez egy meghatározott méretű kerek szűrőpapírt négyszer össze kell hajtani, és ollóval vágva kör alakú szektort alkotnak. A szűrő átmérőjének függése a szűréshez használt üvegtölcsér átmérőjétől az alábbiakban látható:

A sima szűrőnek szorosan illeszkednie kell a tölcsér falaihoz, különösen a tetején. Ehhez a szűrő összecsukásakor ajánlatos a félkört nem a középső vonal mentén meghajlítani, hanem egy ahhoz közeli párhuzamos vonal mentén.

Az összehajtott szűrőt egy tölcsérbe helyezzük (legfeljebb 1/3-ban vagy 1/2-ben tölthetjük fel üledékkel), nedvesítsük meg desztillált vízzel, és töltsük meg vízzel a tölcsér kifolyóját (csövét). Ehhez a szűrőt felemeljük és gyorsan leengedjük. A szűrő szélei 5-10 mm-rel a tölcsér széle alatt legyenek. A nedves szűrőt finoman a tölcsérhez kell nyomni. A szűrés azonnal megkezdődik, hogy a tölcsér kifolyócső tele maradjon folyadékkal. Ne töltse meg a tölcsért több mint 3/4 térfogatú oldattal. A kifolyócső hegyének érintenie kell a szűrőpohár belső falát, hogy elkerülje a kifröccsenést.

Az analitikai laboratóriumokban általában egyszerű sima szűrőket használnak híg oldatok szűrésére.

Redős szűrők használata esetén a szűrés nagymértékben felgyorsul. Ezeket a szűrőket könnyű elkészíteni (119. ábra). A szűrő ráncai nem közeledhetnek a középpontjához, különben a szűrő közepén lévő papír áttörhet. A kész szűrőt úgy helyezzük be a tölcsérbe, hogy az a falai mellett legyen. Ha a tölcsér szöge nagyobb vagy kisebb, mint 60°, a szűrőt a második hajtás helyzetének változtatásával hozzá kell igazítani. Szükséges, hogy a szűrőnek kellően éles vége legyen, a szűrőpapír ne sérüljön meg az ismételt hajlítástól.

Mielőtt az előkészített szűrőt a tölcsérbe helyezné, szét kell hajtani és össze kell hajtani úgy, hogy a szűrőpapír külső oldala a szűrő belső oldalára kerüljön. A tölcsérbe megfelelően elhelyezett szűrőt szűrt folyadékkal vagy desztillált vízzel meg kell nedvesíteni.

Forró oldatok szűrésekor és nagy átmérőjű tölcsérek használatakor a szűrő teteje áttörhet. Ennek a veszélynek a kiküszöbölésére egy nagy tölcsérbe kisméretű vagy speciális perforált porcelánbetétet helyezünk, és a legjobb, ha két összehajtott redős szűrőn keresztül szűrjük át.

A légköri nyomáson és szobahőmérsékleten történő szűrésre szolgáló berendezés egyszerű, tölcsérből, szűrőből, vevőből és állványból áll. A szilárd anyagok forró, telített oldatainak szűrésére széles, rövidített tölcséreket, nagy mennyiségű folyadék gyors szűrésére pedig hullámos tölcséreket használnak, amelyek egyenetlen falai sima szűrőkkel kombinálva növelik a hatékony szűrőfelületet. A tölcsért egy laboratóriumi állványhoz rögzített gyűrűben rögzítik, vagy közvetlenül a lombik nyakába helyezik - a szűrlet befogadójába. Ez utóbbi esetben a tölcsér alá szűrőpapírcsíkot kell helyezni, hogy a szűrlet által kiszorított levegő ki tudjon távozni a lombikból.

A szűrés gyakran nehézkes, ha a papírszűrő és a tölcsér fala között légrés (légzseb) képződik. Ennek elkerülése érdekében a tölcsér belsejében enyhe túlnyomás keletkezik: a tölcsért a szélei mentén megnedvesített szűrőpapírral és egy azonos átmérőjű fordított tölcsérrel borítják. A levegőt a felső tölcsér csövén keresztül egy gumiburával nyomják át, és ezáltal megszűnik a légzsák.

A szűrés felgyorsítása érdekében a tölcsércsövet meghosszabbítják: gumicsővel azonos (vagy valamivel kisebb) belső átmérőjű üvegcső csatlakozik a kifolyóhoz. Egy idő után az egész csövet megtöltjük egy szűrletoszloppal, vákuumot hozva létre.

Az erősen lúgos oldatokat és a hidrogén-fluorid oldatokat porózus polietilénből készült tölcséren keresztül kell szűrni. Egy ilyen tölcsér gyártásához (120. ábra) két üvegtölcsért használnak, amelyek közül a külsőt a szűkületi pontnál parafával zárják le, a belsőt pedig ugyanitt olvasztják. A tölcsérek falai közé polietilénpor és finomra őrölt nátrium-klorid 1:4 tömegarányú keverékét helyezzük, és 130-150 °C-os kemencében tartjuk. A belső tölcsért időről időre nyomás alatt elforgatják, hogy a félfolyékony masszát egyenletesen vigyék fel a külső tölcsér belső felületére. Lehűlés után a belső tölcsért eltávolítjuk, a külső tölcsér csövéről eltávolítjuk a dugót, és a szinterezett masszát meleg vízzel mossuk a nátrium-klorid eltávolítása céljából.

A szűrési sebesség egyenesen arányos a szűrendő folyadék hidrosztatikai nyomásával, ezért nagy térfogatú folyadékok szűrésekor célszerű állandó folyadékszintet tartani a szűrőn. ábrán. A 121 egyszerű házi készítésű eszközöket mutat be, amelyek automatikusan folyadékot töltenek a szűrőbe. A folyadéktartály tiszta gumidugóval van lezárva, amely folyadékbevezető csővel és levegőbevezető csővel van ellátva. A levegőbeszívó cső alsó végének szintje határozza meg a folyadék szintjét a szűrőn. Ha a szint lecsökken, akkor a levegő belép az edénybe, és a folyadékot a szűrőre préseli. Ennek eredményeként a folyadék szintje a szűrőn megemelkedik, és az edény belsejében lévő levegő bezárul.

Szűrés fűtés vagy hűtés közben

A fűtőszűrést akkor hajtják végre, ha meg kell tisztítani a forró koncentrált oldatokat a szennyeződésektől, a viszkózus oldatokat, valamint a normál hőmérsékleten könnyen kristályosodó anyagokat tartalmazó oldatokat.

A folyamat felgyorsítása érdekében először is gondosan meg kell választani a szűrőpapír minőségét, a szűrő méretét és a tölcsért. Mielőtt a forró oldatot a szűrőre öntjük, a behelyezett szűrővel ellátott tölcsért felmelegítjük úgy, hogy a szűrőn forró tiszta oldószert vagy oldószergőzt engedünk át, ha azt fürdőben forrásig melegítjük. Ez utóbbi esetben a tölcsért óraüveg borítja. Szűrés előtt a tartályból kiöntjük az oldószert, hogy ne hígítsa fel a szűrletet. A szűrés felgyorsítása érdekében tartson magas folyadékszintet a szűrőn.

A szűrővel ellátott tölcsért melegszűrésre fémtölcsérrel (122. ábra, a) vagy tölcsérrel is fel lehet fűteni, melynek kettős falai között forró vizet, gőzt vagy forró levegőt vezetnek át (122. ábra, b). A melegítés történhet úgy is, hogy az elektromos fűtőtestet a szűrt oldatba merítjük, ha az utóbbi nem tartalmaz a fémmel reakcióba lépő anyagokat.

A laboratóriumi üvegedények egyenletes melegítésére elektromos fűtésű kötött huzatokat (sapkák) is alkalmaznak. Általában vékony üvegszálból készülnek, és rugalmas fűtőelemet tartalmaznak vékony huzal vagy tekercs formájában.

A hűtött szűrés végezhető jéghűtésű tölcsérben vagy olyan tölcsérben, amelyben a kettős falak között hűtött sóoldat folyik.

Szűrés csökkentett nyomáson

A csökkentett nyomáson végzett szűrés lehetővé teszi a szilárd anyag teljesebb elválasztását a folyadéktól, és növeli a folyamat sebességét.

A vákuumszűrő berendezés egy szűrőberendezésből, egy vevőből, egy vízsugárszivattyúból és egy biztonsági palackból áll.

Nagy mennyiségű anyag szűrésekor leggyakrabban perforált porcelán vagy hasított üveghengeres Buchner-tölcséreket használnak, amelyeket Erlenmeyer-lombikokba helyeznek vákuum alatti szűréshez csővel; utóbbiak biztonsági palackon keresztül csatlakoznak a vízsugárszivattyúhoz. Szükséges, hogy a tölcsér mérete megfeleljen a szűrt szilárd anyag mennyiségének, amelynek teljesen le kell fednie a szűrő felületét. A túl vastag üledékréteg azonban megnehezíti a leszívást és az azt követő mosást.

A Buchner tölcsérek szűrője egy kerek szűrőpapír, amelyet a tölcsér perforált válaszfalára helyeznek. A szűrő átmérőjének valamivel kisebbnek kell lennie, mint a terelőlemez átmérője. A nagy Buchner-tölcsérek általában két szűrőt helyeznek egymásra. Annak érdekében, hogy a ráillesztett papírszűrő kellően illeszkedjen a tölcsér perforált válaszfalához, előzetesen megnedvesítjük a tölcséren oldószerrel, és egyenletesen rányomjuk. Ezután az oldószer eltávolítása után a szűrendő keveréket a tölcsérbe öntjük és leszívjuk.

Vizes oldatok esetén a szűrő nedvesítésére használt kis mennyiségű víz nem számít. Azokban az esetekben, amikor a víz jelenléte elfogadhatatlan, a nedves szűrőt a szoros illeszkedés elérése után etil-alkohollal vagy acetonnal, majd olyan oldószerrel mossuk, amelynek jelenléte a szűrletben elfogadható. A szerves oldószerrel megnedvesített szűrőpapír nem tapad olyan jól a tölcsérhez, ha vízzel nedvesítjük.

A Buechner-tölcséreket Erlenmeyer-lombikban rögzítik gumidugóval vagy vastag lapos gumidarabokkal, amelyek felülről borítják a lombik nyakát; az utóbbiak kényelmesek, mivel szűrés közben nem szívhatók be a lombikba.

Az anyalúg teljes elválasztásához a szűrőn lévő csapadékot üvegdugó lapos felületével, vagy vastag falú, lapos fenekű hengerrel addig préselik ki, amíg a folyadék csöpögés meg nem szűnik. Ebben az esetben gondoskodni kell arról, hogy a vastag üledékréteg felületén ne keletkezzenek repedések, mert ez az anyalúg hiányos leszívásához és az üledék szennyeződéséhez vezet. A visszamaradt anyalúg eltávolítására a csapadékot a szűrőn kis mennyiségű oldószerrel atmoszférikus nyomáson mossuk. Amikor a szűrőpogácsát oldószerrel telítjük, a vákuumot újra alkalmazzuk.

Szívással történő szűrésnél a hagyományos papírszűrők mellett szűrőanyagként szintetikus szálas szűrőket használnak. Tehát a PVC vagy poliészter szálból készült szűrők ellenállnak a savaknak és lúgoknak, de a szerves oldószerek tönkreteszik őket.

A nehezen szűrhető ragadós üledékek szétválasztására gyakran használnak azbesztmasszát, amely szívótölcséren vagy Gooch-tégelyen tömöríthető. Az azbesztmasszát a következőképpen készítjük el: az azbesztet porcelánmozsárban tömény. HCl-t, öntsük át a masszát egy főzőpohárba, és forraljuk 20-30 percig páraelszívóban. Ezután a masszát 20-30-szoros térfogatú desztillált vízzel hígítjuk, Buchner-tölcséren leszűrjük, és vízzel mossuk, amíg a szűrletben a savas reakció el nem tűnik. Ezután a masszát 100-120 °C-on szárítjuk, és tokosban kalcináljuk. A kalcinált azbesztet vízzel addig rázzák, amíg homogén masszát nem kapnak, áthelyezik egy tölcsér vagy Gooch-tégely szűrőlapjára, leszívják és tömörítik.

A szinterezett üvegporból forrasztott lemezzel ellátott tölcsérek, tégelyek és gázszűrők rendkívül kényelmesek a szűréshez. Az üvegszűrők a szilárd anyagok és a folyadékok elkülönítésére szolgálnak szűrés és extrakció során, a ködrészecskék gázokból történő eltávolítására, valamint a gázok folyadékokban való buborékolására (elosztására). Az üvegszűrők azonban kényelmetlenek olyan esetekben, amikor mennyiségi csapadékra van szükség, mivel nehéz a csapadékot teljesen eltávolítani a szűrőből. Nem alkalmasak lúgok és alkálifém-karbonátok nagyon tömény forró oldatainak szűrésére.

Az üvegszűrő lemezek porozitása és megnevezésük gyakran változott. A GOST 9775-69 szerint a szűrőosztály a pórusmérettől függ (8. táblázat).

A porózus szűrővel ellátott üvegtölcsérek és tégelyek típusait a 2. ábra mutatja. 123.

A folyadékszűrős üvegtermékek mellett a gázok szűrésére és mosására szolgáló szűrőkkel ellátott termékeket is gyártják.

Rendelkezésre állnak továbbá hőmérséklet-szabályozott csővel és hőmérséklet-szabályozott köpennyel ellátott szűrőtölcsérek (124. ábra). Az elektromos fűtésű tölcsérek szobahőmérsékleten kristályosodó és viszkózus oldatok és szuszpenziók felmelegített szűrésére szolgálnak. A szűrőtölcsér 130°C-ra történő felmelegítése kiküszöböli az oldat megszilárdulását, és a szűrés gyorsan megy végbe.

Az elektromos fűtésű, szabályozott hőmérsékletű csővel ellátott szűrőtölcsér fő eleme egy 40 mm átmérőjű, forrasztott vékonyfalú üvegcsővel ellátott üvegszűrő, amely 30 W-os elektromos fűtőtestet tartalmaz. A tölcsérek szűrőkkel kaphatók, amelyek mérete 40, 100, 160 mikron.

A fűtött szűrőtölcsérben a hőmérséklet szabályozását egy áramló hőhordozó biztosítja. A szűrő feletti tölcsér térfogata szabályozott hőmérsékletű csővel 80 ml, hőmérséklet-szabályozott köpennyel - 58 ml.

A folyadék és a szilárd anyag elkülönítésére fordított merülő szűrőtölcsért használnak (123. ábra, d). A szűrő belemerül a folyadékba, és a szűrlet belép a vevőbe, amelyhez a szűrő csatlakoztatva van. Ezzel a készülékkel kényelmesebb a szűrést alacsonyabb hőmérsékleten végezni, miközben hűtőfürdő segítségével alacsony hőmérsékleten tartjuk a szűrendő keveréket.

Kis mennyiségű anyagok leválasztásához használjon üveg "csappal" ellátott tölcsért, amelyet egy kerek szűrőpapírral borítanak. Ehhez az üvegrúd végét egy égő lángjában meglágyítják, majd egy fémlemez sík vízszintes felületéhez nyomva lelapítják. Szükséges, hogy a szűrő szorosan illeszkedjen a „szegfűhöz”, és a szűrő szélei 1-2 mm-rel meghajlítva legyenek a tölcsér fala mentén. A szűrletgyűjtő egy szűrőcső (oldalsó kimenettel).

Alacsony olvadáspontú vagy szobahőmérsékleten jól oldódó anyagok szűrésére a hűtés során vákuumot alkalmaznak. Kis mennyiségű üledék esetén a tölcsért és az oldatot hűtőben előhűtjük. Más esetekben a Buchner-tölcsért egy levágott fenekű palackba építik be, és ez utóbbit jéggel vagy hűtőkeverékkel töltik meg.

Inert gáz atmoszférában történő szűréskor az 1. ábrán látható telepítések. 125.

Analitikai aeroszol szűrők AFA

Az AFA szűrők a levegőben vagy más gázokban lévő aeroszolok tanulmányozására és szabályozására szolgálnak. Az AFA szűrők különálló vagy a tartógyűrűre ragasztott szűrőelemből és kiemelkedésekkel ellátott védőpapírgyűrűkből állnak.

Szűrőelemként az ultravékony polimer szálakból (cellulóz-acetát, perklórvinil, polisztirol) készült FP szűrőanyagot (Petryanov filter) használják. A szűrő kerek szakaszának munkafelülete 3, 10, 20 és 160 cm2.

centrifugálás

A centrifugálás a heterogén rendszerek (folyadék - folyékony, folyékony - szilárd részecskék) szétválasztásának egyik módja; rotorokban centrifugális erők hatására. A centrifugálás akkor előnyös, ha a szűrt anyagok eltömítik a szűrő pórusait, a szűrőanyaggal érintkezve megromlanak, vagy finoman diszpergálódnak.

A centrifugálás speciális berendezésben, úgynevezett centrifugában történik. A centrifuga fő része egy nagy sebességgel forgó rotor.

A centrifugáknak számos típusa van; elsősorban az elválasztási tényező nagysága szerint vannak felosztva. Ez egyenlő a centrifugában kialakuló centrifugális tér gyorsulásának a gravitáció gyorsulásához viszonyított arányával. Az elválasztási tényező egy dimenzió nélküli mennyiség. A centrifuga elválasztó hatása az elválasztó tényezővel arányosan növekszik.

A hazai ipar által gyártott elektromos centrifugák elválasztási tényezője 1600 és 300 000 között, a rotor fordulatszáma 1000 és 50 000 ford./perc között változik.

A centrifugákban lévő heterogén rendszereket ülepítéssel vagy szűréssel választják el. Ettől függően a centrifugák tömör rotorral vagy perforált, fedett szűrőanyaggal készülnek.

Az ülepítő centrifugálást lebegő szilárd anyagot tartalmazó folyadék derítésére vagy szilárd fázis ülepítésére végezzük. Ez a szilárd fázis ülepedéséből, a csapadék tömörítéséből és a felülúszó felszabadulásából áll.

A laboratóriumi gyakorlatban különféle típusú centrifugákat használnak: kézi vagy elektromos meghajtású, asztali (hordozható), mobil és helyhez kötött. Az elválasztási tényező nagysága szerint a centrifugákat rendes (3500-nál kisebb elválasztási tényezővel), szupercentrifugákra és ultracentrifugákra (legalább 3500 elválasztási tényezővel) osztják. A hagyományos centrifugákat elsősorban alacsony diszperziójú (10-50 mikronnál nagyobb) különböző koncentrációjú szuszpenziók leválasztására használják. A szupercentrifugákat főként emulziók és finom (10 mikronnál kisebb méretű) szuszpenziók elkülönítésére használják. Nagymértékben diszpergált rendszerek és makromolekuláris vegyületek elválasztására és tanulmányozására általánosak a 100 000-nél nagyobb elválasztási tényezőjű analitikai és preparatív ultracentrifugák.A makromolekuláris vegyületek molekulatömegének és polimerizációs fokának meghatározására analitikai centrifugákat, a preparatív centrifugákat pedig olyan oldatokból izolálják az anyagokat, amelyek általában kolloid állapotban vannak, vagy elválaszthatatlan szuszpenziók formájában (fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok).

Az ultracentrifuga rotorja általában vákuumkamrában forog hűtés közben (hűtött centrifugák), a forgórész forgási sebességét és forgási idejét, valamint a centrifugálás hőmérsékleti rendszerét elektronikus eszközök szabályozzák.

A feldolgozott oldatot egy speciális edénybe helyezik, amelyet azután nagy sebességgel forgatnak a centrifuga rotorján. Ebben az esetben a keverék komponensei centrifugális erő hatására rétegenként oszlanak el különböző mélységekbe (a részecskék tömegének megfelelően); a legnehezebb részecskék az edény aljára préselődnek.

Kémcsöves kisméretű, kézi vagy elektromos meghajtású, hordozható centrifugák használatakor a szuszpenziót a főtengely körül forgó üveg vagy műanyag kémcsövekbe helyezik, amelyek csonkra függesztve vannak. A kis mennyiségű anyag időszakos elválasztására szolgáló csőcentrifugák kétféleek lehetnek. Egyes esetekben a csöveket a forgórészen lévő csonkok tartják, és forgás közben vízszintes helyzetet vesznek fel, másokban pedig mereven vannak rögzítve bizonyos szögben a forgástengelyhez (szögrotorok).

ábrán. A 126. ábra a csövek helyzetét mutatja szögrotorban és lengőüveges rotorban végzett centrifugálás során.

A centrifuga leállítása után a tiszta folyékony fázist (centrifuga) leengedjük vagy pipettával felvesszük. A csapadékot mossuk és ismét centrifugáljuk. Ha a kémcsőből a maximális mennyiségű üledéket ki kell vonni, akkor a centrifugát eldobjuk, és a csapadékot vákuum-exszikkátorban szárítjuk anélkül, hogy a centrifuga üvegcsőből kivennénk.

Kémcsöves centrifugák használatakor vastag falú üvegből vagy szintetikus anyagból készült kémcsöveket védő fémpoharakba helyeznek. Az üveg kémcsövek alját gumi tömítések védik. Az üvegkémcsöveket a térfogat feléig megtölthetjük, a szintetikus anyagból készült kémcsöveket pedig nagy forgórész fordulatszámon (5000 ford./perc) szinte a tetejéig meg kell tölteni, hogy a centrifugális erő hatására ne deformálódjanak. A munkavégzés biztonsága érdekében nagyon pontosan kell kiegyensúlyozni a csöveket a centrifugált szuszpenzióval. Az egyensúlyhiány nagy fordulatszámon károsíthatja a forgórészt. Figyelembe véve, hogy az illékony oldószerek a centrifugálás során elpárologhatnak, jobb, ha a csöveket dugókkal zárja le.

A laboratóriumi kémcsöves centrifugák forgórészei – a kézi centrifugák kivételével – fém védőburkolatokba (fedelekbe) helyezkednek el, hogy ne veszélyeztesse a dolgozókat, ha az akasztókról leesik az üveges kémcső.

A gyártó erre a centrifugára vonatkozó utasításában megadott utasításokat szigorúan be kell tartani, a használati utasításban megadott forgórész fordulatszámot nem szabad túllépni. A centrifuga csak zárt biztonsági burkolat mellett indítható el; A fedelet csak a centrifuga teljes leállása után szabad kinyitni.

Kézi centrifuga RTs-4. Ezt a centrifugát a különböző sűrűségű folyadékok elválasztására, illetve a lebegő vagy kevert részecskék folyadékoktól való elkülönítésére tervezték. A centrifuga fő részei: öntöttvas test, amelybe fogaskerekek (csigahajtómű) vannak felszerelve, kémcsőtartó, fogantyú és bilincs. A kémcsőtartó csuklós felfüggesztésein négy karbolitból készült hüvely található. A különböző sűrűségű folyadékok és szilárd részecskék a kémcső különböző helyein oszlanak el forgás közben. Az elválasztás egyidejűleg négy kémcsőben végezhető el. A fogantyú egy fordulatára a csőtartó nyolc fordulatot tesz meg. A működéshez a centrifugát egy bilinccsel rögzítik a laboratóriumi asztal fedelére vagy egy speciális állványra.

Laboratóriumi asztali centrifuga TsLN-2. A TsLN-2 centrifuga RU 6x10 szögletes rotorral működik. A centrifugálandó anyag maximális térfogata 60 cm3. A rotor fordulatszáma 3000-8000 ford./perc; a kapcsoló által szabályozott forgási frekvencia intervalluma 1000 fordulat. Az elválasztási tényező eléri az 5500. A rotor gyorsulási ideje a maximális sebességre 10 perc; fékezési idő legfeljebb 8 perc. Folyamatos munkaidő 60 perc; a minimális kötelező szünet 15 perc. A centrifuga munkakamrája önzáró szerkezettel ellátott fedéllel van lezárva. Centrifuga súlya 8 kg.

A TsLN-2 centrifugával végzett munka során tilos: földelés nélkül dolgozni; növelje a fordulatszámot 8000 ford./perc fölé; munka a rotor és a centrifuga nyitott fedeleivel; üveg kémcsövekkel dolgozzon 4000 ford./perc feletti rotorfordulatszámmal; a centrifugált anyaggal töltött csövek elhelyezése nem átlósan ellentétes.

Az átmérőben elhelyezkedő, centrifugált anyaggal töltött kémcsövek tömegének különbsége nem haladhatja meg a 0,5 g-ot A polimer anyagból készült kémcsövekben leválasztott folyadék sűrűsége nem haladhatja meg a 2 g/cm3-t, az üvegkémcsövekben az 1,5 g-ot. g/cm3.

Sarok kis méretű centrifuga TsUM-1. A centrifuga keresztrotorral rendelkezik a folyadékok egyidejű centrifugálásához négy 25 ml-es, négy 10 ml-es és nyolc 5 ml-es csőben. A rotor fordulatszáma 2000 és 8000 ford./perc között állítható lépésenként. Az elválasztási tényező eléri a 6000-et. A forgórész gyorsulási ideje 8-10 perc. A centrifuga elektromos órával van felszerelve, amely lehetővé teszi a centrifugálási idő 0 és 60 perc közötti beállítását, majd az automatikus fékezést. Centrifuga súlya 16 kg.

A centrifugálási módszer a részecskék eltérő viselkedésén alapul a centrifuga által létrehozott centrifugális mezőben. A centrifugatartályban lévő mintát egy centrifugahajtással meghajtott rotorba helyezzük. A részecskék keverékének szétválasztásához bizonyos feltételeket kell kiválasztani, például a forgási sebességet, a centrifugálási időt és a rotor sugarát. A gömb alakú részecskék esetében az ülepedési (ülepedési) sebesség nemcsak a gyorsulástól függ, hanem a részecskék sugarától és sűrűségétől, valamint a közeg viszkozitásától is, amelyben a minta lerakódik.

A centrifugálás két típusra osztható: preparatív és analitikai. Preparatív centrifugálást alkalmaznak, ha a minta egy részét további elemzés céljából izolálni kell. Ezt a módszert a sejtek szuszpenzióból, biológiai makromolekulákból stb.

Az analitikai centrifugálást a biológiai makromolekulák viselkedésének tanulmányozására használják centrifugális mezőben. Ez a módszer lehetővé teszi a viszonylag kis mintatérfogatban jelenlévő molekulák tömegére, alakjára és méretére vonatkozó adatok beszerzését. A napi laboratóriumi gyakorlatban a preparatív centrifugálás a leggyakrabban alkalmazott technika.

Az előkészítő laboratóriumi centrifugákat pedig céljuk szerint csoportokra osztják: preparatív ultracentrifugák, általános célú centrifugák és nagy sebességű centrifugák. Az általános célú centrifugáknak van a legnagyobb gyakorlati alkalmazása az orvosi laboratóriumokban, maximális sebességük akár 6 ezer fordulat / perc. Az ilyen típusú készülékek fő jellemzője a viszonylag nagy kapacitásuk - akár 6 liter is, amely lehetővé teszi nemcsak 100 ml-es centrifugacsövek, hanem akár 1,25 literes tartályok használatát is centrifugáláshoz. Minden általános célú centrifugánál a forgórészek mereven vannak a hajtótengelyre szerelve, így a centrifugált tartályokat meglehetősen pontosan ki kell egyensúlyozni. A törés elkerülése érdekében páratlan számú kémcsövet nem szabad a rotorba betölteni, hiányos töltés esetén a tartályt egymással szemben kell elhelyezni.

A nagy sebességű centrifugák maximális fordulatszáma 25 ezer ford./perc, gyorsulásuk pedig akár 89 ezer g. A rotort és a centrifugált mintákat tartalmazó kamra hűtőrendszerrel van felszerelve, amely megakadályozza a súrlódásból származó hőt, amikor a rotor nagy sebességgel forog. Ezek a centrifugák jellemzően akár 1,5 liter térfogatot is képesek kezelni, és ferde vagy cserélhető edényrotorral vannak felszerelve.

Az előkészítő ultracentrifugák 75 000 fordulat/perc sebességre gyorsulnak, és maximális centrifugális gyorsulásuk 510 ezer g. Hűtő- és vákuumegységekkel vannak felszerelve, hogy megakadályozzák a forgórész túlmelegedését a levegő súrlódása miatt. Ezeknek a centrifugáknak a rotorjai nagy szilárdságú titánból vagy alumíniumötvözetből készülnek. Az ultracentrifugák tengelye, ellentétben a nagy sebességűekkel és az előkészítőkkel, rugalmassá teszi, hogy csökkentse a vibrációt, ha a rotor kiegyensúlyozatlan. A forgórészben lévő kapacitásokat gondosan ki kell egyensúlyozni a tized gramm pontossággal.

2.5.1 A gradiensek jellege

Az oldatok sűrűséggradiensének létrehozásához leggyakrabban szacharóz oldatokat használnak, néha rögzített pH-val. Egyes esetekben jó elválasztást érünk el, ha közönséges víz helyett D 2 0-t használunk. A 2.1 néhány szacharózoldat tulajdonságait mutatja be.

A gradiens kiválasztását a frakcionálás konkrét feladatai határozzák meg. Például a Pharmacia Fine Chemicals által gyártott ficol helyettesítheti a szacharózt olyan esetekben, amikor nagy sűrűségű és alacsony ozmotikus nyomású gradienseket kell létrehozni. A ficol másik előnye, hogy nem jut át ​​a sejtmembránokon. Nehézfémsókat, például rubídiumot és céziumot használnak nagyobb sűrűségű gradiensek létrehozására, azonban a CsCl korrozív hatása miatt ilyen gradienseket csak ellenálló fémekből, például titánból készült rotoroknál alkalmaznak.

2.5.2 Lépéssűrűség gradiens technika

A sűrűséggradiens létrehozásához több, egymás után csökkenő sűrűségű oldatot óvatosan pipettával egy centrifugacsőbe juttatunk. Ezután a legfelső rétegre, amely a legkisebb sűrűségű, a mintát keskeny zóna formájában rétegezik, majd a csövet centrifugálják. Sima lineáris gradiensek érhetők el, ha az oldat hosszabb állása során lépcsőzetes gradienseket simítunk. A folyamat felgyorsítható, ha a cső tartalmát egy dróttal finoman megkeverjük, vagy a tubus finoman rázzuk.

2.5.3 Sima sűrűséggradiens létrehozásának technikája

A legtöbb esetben egy speciális eszközt használnak a sima sűrűséggradiens létrehozására. Két, szigorúan meghatározott, azonos átmérőjű hengeres edényből áll, amelyek alul egy vezérlőszelepes üvegcsővel kommunikálnak egymással, amely lehetővé teszi a két edény tartalmának keverési arányának beállítását. Az egyik keverővel van felszerelve, és van egy kimenete, amelyen keresztül az oldat a centrifugacsövekbe áramlik. Sűrűbb oldatot helyezünk egy keverőbe; a második hengert kisebb sűrűségű oldattal töltjük meg. Az oldatoszlop magassága mindkét hengerben úgy van beállítva, hogy a hidrosztatikus nyomás bennük azonos legyen. A sűrűbb oldat fokozatosan távozik a keverőből a centrifugacsövekbe, és ezzel egyidejűleg helyettesíti a keverőbe a második hengerből a szabályozószelepen keresztül azonos térfogatú kisebb sűrűségű oldattal. A keverőben lévő oldat homogenitását az oldat keverővel való folyamatos keverése biztosítja. Ahogy az oldatot centrifugacsövekbe engedjük le, sűrűsége csökken, és a csövekben lineáris sűrűséggradiens jön létre. Nemlineáris gradiensek hozhatók létre két nem egyenlő átmérőjű hengerből álló rendszer segítségével.

Különböző meredekségű sűrűséggradiensek kialakításához két, mechanikusan vezérelt fecskendőből álló rendszert használnak, amelyeket nem egyenlő sűrűségű oldatokkal töltenek meg. A dugattyúk relatív sebességének változtatásával különféle gradiensek hozhatók létre.

2.5.4 Gradiensek kinyerése centrifugacsövekből

A centrifugálás befejezése és a részecskék elválasztása után a kialakult zónákat el kell távolítani. Ez többféleképpen történik, leggyakrabban eltolásos módszerrel. Egy centrifugacsövet átszúrnak az alján, és az alsó részébe lassan nagyon sűrű közeget, például 60-70%-os szacharózoldatot vezetnek. A felső oldatot kiszorítják, és a frakciókat fecskendővel, pipettával vagy speciális eszközzel gyűjtik össze, amely egy csövön keresztül a frakciógyűjtőhöz van csatlakoztatva. Ha a csövek celluloidból vagy nitrocellulózból készülnek, a frakciókat a cső speciális pengével történő levágásával vonják ki. Ehhez egy állványra rögzített centrifugacsövet közvetlenül a kívánt zóna alá vágunk, és a frakciót fecskendővel vagy pipettával leszívjuk. A vágószerkezet megfelelő kialakításával az oldatveszteség minimális lesz. A frakciók összegyűjtése a kémcső aljának vékony üreges tűvel történő átszúrásával is történik. A csőből a tűn keresztül kifolyó cseppeket egy frakciógyűjtőbe gyűjtik további elemzés céljából.

2.5.5 Preparatív centrifugák és alkalmazásaik

Az előkészítő centrifugák három fő csoportba sorolhatók: általános célú centrifugák, nagy sebességű centrifugák és preparatív ultracentrifugák. Általános célú centrifugák a maximális fordulatszám 6000 ford/perc -1 és az OCU 6000-ig g . Csak kapacitásukban különböznek egymástól, és számos cserélhető rotorral rendelkeznek: szögletes és függőüveges. Az ilyen típusú centrifugák egyik jellemzője a nagy - 4-6 dm 3 -es kapacitás, amely lehetővé teszi, hogy ne csak 10,50 és 100 cm 3 -es centrifugacsövekkel töltsék fel őket, hanem akár 1,25 űrtartalmú edényekkel is. dm 3 . Minden ilyen típusú centrifugánál a forgórészek mereven vannak a hajtótengelyre szerelve, és a centrifugacsöveket a tartalommal együtt gondosan ki kell egyensúlyozni, és a tömegük legfeljebb 0,25 g-mal különbözhet egymástól. más, így biztosítva a kémcsövek egyenletes eloszlását a rotor forgástengelyéhez képest.

Nagy sebességű centrifugák 25 000 rpm -1 végsebességet és akár 89 000 g OCU-t biztosít. A rotorkamra hűtőrendszerrel van felszerelve, amely megakadályozza a forgórész forgása során fellépő súrlódás miatt felmelegedést. A nagy sebességű centrifugák általában 1,5 dm 3 kapacitásúak, és cserélhető rotorokkal vannak felszerelve, mind ferde, mind függő üvegekkel.

Preparatív ultracentrifugák 75 000 1/perc végsebességet és 510 000 maximális centrifugális gyorsulást biztosít g . Hűtővel és vákuumegységgel is fel vannak szerelve, hogy megakadályozzák a forgórész túlmelegedését a levegővel való súrlódás miatt. Az ilyen centrifugák rotorjai nagy szilárdságú alumíniumból vagy titánötvözetből készülnek. Főleg alumíniumötvözetből készült rotorokat használnak, azonban olyan esetekben, amikor különösen nagy fordulatszámra van szükség, titán rotorokat használnak. A centrifugacsövek egyenetlen töltéséből adódó rotor kiegyensúlyozatlanságból eredő vibráció csökkentése érdekében az ultracentrifugák rugalmas tengelyűek. A centrifugacsöveket és azok tartalmát gondosan ki kell egyensúlyozni 0,1 g pontossággal Hasonló követelményeket kell betartani a centrifugák rotorjainak általános célú betöltésekor.

2.6 A rotorok kialakítása

2.6.1 Szögrotorok és függőkanalakkal ellátott rotorok

A preparatív centrifugák rotorjai általában két típusúak - szögletes és függővödrök. Szögletesnek nevezik őket, mert a bennük elhelyezett centrifugacsövek mindig bizonyos szöget zárnak be a forgástengelyhez képest. A függőüveges rotorokban a kémcsövek függőlegesen vannak felszerelve, és a keletkező centrifugális erő hatására elforgatva vízszintes helyzetbe kerülnek; a dőlésszög a forgástengelyhez képest 90°.

A szögletes rotoroknál a részecskék által a kémcső megfelelő faláig megtett távolság nagyon kicsi, ezért az ülepedés viszonylag gyorsan megtörténik. A kémcső falával való ütközés után a részecskék lecsúsznak és üledéket képeznek az alján. A centrifugálás során konvekciós áramlások keletkeznek, amelyek nagymértékben megnehezítik a hasonló ülepedési tulajdonságú részecskék elválasztását. Ennek ellenére a hasonló felépítésű rotorokat sikeresen használják olyan részecskék elválasztására, amelyek ülepedési sebessége meglehetősen változó.

A lógó poharas rotoroknál konvekciós jelenségek is megfigyelhetők, de ezek nem annyira hangsúlyosak. A konvekció annak az eredménye, hogy centrifugális gyorsítás hatására a részecskék a forgástengelyre nem szigorúan merőleges irányban leülepednek, és ezért a szögrotorokhoz hasonlóan a kémcső falának ütköznek, és elcsúsznak az alsó.

A konvekciós és örvénylési hatások bizonyos mértékig elkerülhetők szektorális alakú csövek használatával a függőcsészős rotorokban és a forgórész fordulatszámának beállításával; A fent felsorolt ​​​​sűrűséggradiens centrifugálási módszer szintén megfosztja a hátrányait.

2.6.2 Folyamatos forgórészek

A folyamatos rotorokat viszonylag kis mennyiségű szilárd anyag nagy sebességű frakcionálására tervezték nagy térfogatú szuszpenziókból, például sejtek izolálására a tápközegből. A centrifugálás során a részecskék szuszpenzióját folyamatosan adják a rotorhoz; a rotor áteresztőképessége a lerakott készítmény jellegétől függ, és 100 cm 3 és 1 dm 3 között változik percenként. A rotor sajátossága, hogy egy speciális kialakítású szigetelt kamra; tartalma nem kommunikál a külső környezettel, ezért nem szennyeződik vagy permetezett.

2.6.3 Zóna vagy Anderson rotorok

A zónarotorok alumíniumból vagy titánötvözetből készülnek, amelyek igen jelentős centrifugális gyorsulásokat képesek ellenállni. Általában hengeres üregük van, levehető fedéllel zárva. Az üreg belsejében a forgástengelyen egy axiális cső található, amelyre egy lapátokkal ellátott fúvókát helyeznek, amely a rotor üreget négy szektorra osztja. A lapátok vagy terelőlemezek sugárirányú csatornákkal rendelkeznek, amelyeken keresztül gradienst fecskendeznek be az axiális csőtől a forgórész kerületébe. A pengék ilyen kialakításának köszönhetően a konvekció minimálisra csökken.

A forgórész feltöltése forgása közben történik, körülbelül 3000 rpm -1 fordulatszámmal. Egy előre elkészített gradienst pumpálnak a rotorba, a legkisebb sűrűségű rétegből kiindulva, amely egyenletesen oszlik el a rotor kerülete mentén, és a külső falánál a forgástengelyre merőlegesen van tartva a centrifugális erő hatására. . A nagyobb sűrűségű gradiens rétegek ezt követő hozzáadásával folyamatos eltolódás következik be a kevésbé sűrű rétegek közepe felé. Miután a teljes gradienst a forgórészbe pumpáltuk, azt teljes térfogatára megtöltjük egy „párnának” nevezett oldattal, amelynek sűrűsége megegyezik az előre kialakított gradiens legnagyobb sűrűségével, vagy kissé meghaladja azt.

Ezután az axiális csövön keresztül a vizsgálati mintát rétegezzük , amelyet egy kisebb sűrűségű oldat segítségével a csőből a rotor térfogatába tolnak ki, míg a perifériáról eltávolítják az azonos térfogatú "párnát". Mindezen eljárások után a forgórész forgási sebességét a munkasebességre állítják, és vagy zonális sebességű vagy zóna-izopiknikus frakcionálást hajtanak végre a szükséges ideig. . A frakciók extrakcióját 3000 rpm -1 forgórész-fordulatszámmal végezzük. A rotor tartalmát a perifériáról egy „párna” hozzáadásával elmozdítják, először is a kevésbé sűrű rétegeket helyezik el . Az Anderson rotor axiális csatornájának speciális kialakítása miatt nem keverednek össze a zónák az elmozdulásuk során. A kimenő gradienst egy rögzítőeszközön, például spektrofotométer cellán vezetik át, amellyel a fehérjetartalom 280 nm-en történő abszorpcióval határozható meg, vagy egy speciális radioaktivitás-detektoron keresztül, amely után frakciókat gyűjtenek.

A közepes fordulatszámon használt zónarotorok kapacitása 650 és 1600 cm 3 között változik, ami meglehetősen nagy mennyiségű anyag előállítását teszi lehetővé. A zónás rotorokat a különböző készítményekből származó fehérjeszennyeződések eltávolítására, valamint a mitokondriumok, lizoszómák, poliszómák és fehérjék izolálására és tisztítására használják.

2.6.4 A szubcelluláris frakciók elemzése

A frakcionálással nyert szubcelluláris részecskék készítményének tulajdonságai csak akkor tulajdoníthatók maguknak a részecskéknek, ha a készítmény nem tartalmaz szennyeződéseket. Ezért mindig szükséges a kapott készítmények tisztaságának értékelése. A homogenizálás hatékonysága és a szennyeződések jelenléte a készítményben mikroszkópos vizsgálattal meghatározható. A látható szennyeződések hiánya azonban még nem megbízható bizonyítéka a gyógyszer tisztaságának. A kapott készítmény tisztaságának mennyiségi meghatározásához kémiai elemzésnek vetik alá, amely lehetővé teszi a fehérje- vagy DNS-tartalmának meghatározását, lehetőség szerint enzimatikus aktivitásának és immunológiai tulajdonságainak meghatározását.

Az enzimek frakcionált szövetekben való eloszlásának elemzése két általános elven alapul. Ezek közül az első az, hogy egy adott szubcelluláris populáció minden részecskéje ugyanazt az enzimkészletet tartalmazza. A második feltételezi, hogy minden enzim a sejten belül valamilyen meghatározott helyen található. Ha ez az álláspont igaz, akkor az enzimek a megfelelő organellumok markereiként működhetnének: például a citokróm-oxidáz és a monoamin-oxidáz mitokondriális markerenzimként, a savas hidrolázok lizoszómamarkerként, a kataláz peroxiszóma markerként és a glükóz-6- foszfatáz - mikroszomális membrán marker. Kiderült azonban, hogy egyes enzimek, mint például a malát-dehidrogenáz, R A -glükuronidáz, a NADP "H-citokróm-c-reduktáz egynél több frakcióban lokalizálódik. Ezért a szubcelluláris frakciók enzimmarkereinek megválasztását minden egyes esetben nagy körültekintéssel kell megközelíteni. Sőt, a markerenzim hiánya nem jelenti a megfelelő Organellumok hiányát. Valószínű, hogy az enzimet a frakcionálás során elveszítik az organellumok, vagy gátolják vagy inaktiválják, ezért minden frakcióhoz általában legalább két markerenzimet határoznak meg.

Töredék	Térfogat, cm"	Általános tenyésztés	Exnuláció, 660 nm	Az enzimaktivitás egységei	Az aktivitás hozama frakciókban,%

2.7 Frakcionálás differenciális centrifugálással

2.7.1 Az eredmények bemutatása

A szövetfrakcionálás során kapott eredményeket legkényelmesebben grafikonok formájában mutatjuk be. Így az enzimek szövetekben való eloszlásának vizsgálatakor az adatok legjobban hisztogramok formájában jeleníthetők meg, amelyek lehetővé teszik a kísérletek eredményeinek vizuális értékelését.

A minta fehérjetartalmának enzimaktivitását mind az eredeti homogenizátumban, mind az egyes izolált szubcelluláris frakciókban külön-külön határozzuk meg. A frakciók teljes enzimaktivitása és fehérjetartalma nem térhet el jelentősen az eredeti homogenizátum megfelelő értékétől.

Ezután minden frakcióban kiszámítjuk az enzimaktivitást és a fehérjetartalmat az összhozam %-ában, amely alapján hisztogramot készítünk. Az egyes frakciókban lévő fehérje relatív mennyiségét szekvenciálisan ábrázoljuk az abszcissza tengely mentén az elkülönítés sorrendjében, és az egyes frakciók relatív fajlagos aktivitását az ordináta tengely mentén ábrázoljuk. Így az egyes frakciók enzimaktivitását a rudak területe alapján határozzuk meg.

2.7.2. Analitikai ultracentrifugálás

Ellentétben a preparatív centrifugálással, amelynek célja az anyagok szétválasztása és tisztítása, az analitikai ultracentrifugálást elsősorban biológiai makromolekulák és egyéb szerkezetek ülepedési tulajdonságainak vizsgálatára használják. Ezért az analitikai centrifugálás során speciális kialakítású rotorokat és rögzítőrendszereket használnak: lehetővé teszik az anyag ülepedésének folyamatos nyomon követését. ban ben centrifugális mező.

Az analitikai ultracentrifugák akár 70 000 fordulat/perc fordulatszámot is elérhetnek, miközben centrifugális gyorsulást 500 000-ig. g . Rotoruk általában ellipszoid alakú, és egy zsinórral csatlakozik a motorhoz, ami lehetővé teszi a rotor forgási sebességének változtatását. A rotor egy hűtőberendezéssel felszerelt vákuumkamrában forog, és két elemző és kiegyensúlyozó cellával rendelkezik, amelyeket szigorúan függőlegesen, a forgástengellyel párhuzamosan helyeznek el a centrifugában. A kiegyensúlyozó cella az analitikai cella kiegyensúlyozására szolgál, és egy fémtömb precíziós rendszerrel. A forgástengelytől szigorúan meghatározott távolságban elhelyezett két indexfurattal is rendelkezik, amelyek segítségével meghatározzák a megfelelő távolságokat az analitikai cellában. Az általában 1 cm 3 térfogatú analitikai cella szektorális alakú. Megfelelően beszerelve a rotorba, annak ellenére, hogy függőlegesen áll, ugyanazon az elven működik, mint a felfüggesztett serlegekkel ellátott rotor, így szinte ideális ülepedési feltételeket teremt. Az analitikai cella végein kvarcüveges ablakok vannak. Az analitikai ultracentrifugák optikai rendszerekkel vannak felszerelve, amelyek lehetővé teszik a részecskék ülepedésének nyomon követését a teljes centrifugálási időszak alatt. Előre meghatározott időközönként le lehet fényképezni az ülepedő anyagot. A fehérjék és a DNS frakcionálásakor az ülepedést ultraibolya sugárzásban történő abszorpcióval, illetve azokban az esetekben, amikor a vizsgált oldatok eltérő törésmutatókkal rendelkeznek, schlieren rendszerrel vagy Rayleigh-féle interferenciarendszerrel követik nyomon. Az utolsó két módszer azon alapul, hogy amikor a fény áthalad egy átlátszó oldaton, amely különböző sűrűségű zónákból áll, a fény a zóna határán megtörik. Az ülepedés során a nehéz és könnyű részecskéket tartalmazó zónák között határvonal képződik, amely fénytörő lencseként működik; ilyenkor egy csúcs jelenik meg a detektorként használt fényképezőlapon. Az ülepedés során elmozdul a határ, következésképpen a csúcs, melynek sebessége alapján meg lehet ítélni az anyag ülepedési sebességét. Az interferometrikus rendszerek érzékenyebbek, mint a schlieren rendszerek. Az analitikai cellák egyszektorosak, amelyeket leggyakrabban használnak, és kétszektorosak, amelyeket az oldószer és az oldott anyag összehasonlító vizsgálatára használnak.

A biológiában analitikai ultracentrifugálást alkalmaznak a makromolekulák molekulatömegének meghatározására, a kapott minták tisztaságának ellenőrzésére, valamint a makromolekulák konformációs változásainak vizsgálatára.

2.8. Analitikai ultracentrifugálás alkalmazása

2.8.1 A molekulatömeg meghatározása

Három fő módszer létezik a molekulatömeg meghatározására analitikus ultracentrifugálással: az ülepedési sebesség meghatározása, az ülepedési egyensúlyi módszer és az ülepedési egyensúlyi közelítés módszere.

A molekulatömeg meghatározása ülepedési sebességgel - ez a legelterjedtebb módszer. A centrifugálást nagy sebességgel hajtják végre, így a részecskék, amelyek kezdetben egyenletesen oszlanak el a térfogatban, sorrendben elkezdenek mozogni a forgásközépponttól számított sugár mentén. Az oldószer részecskéktől már mentes területe és az azokat tartalmazó része között világos határfelület képződik. Ez a határ a centrifugálás során elmozdul, ami lehetővé teszi a részecskék ülepedési sebességének meghatározását a fenti módszerek valamelyikével, ezt a mozgást egy fényképező lemezen regisztrálva.

Az ülepedési sebességet a következő összefüggés határozza meg:

ahol x - távolság a forgástengelytől cm-ben,

t - idő másodpercben,

w a szögsebesség rad-s -1-ben,

s - ülepedési együttható "molekula.

Az ülepedési együttható az egységnyi gyorsulási sebesség, mértékegysége Seedberg egységek ; 1 Swedberg-egység egyenlő 10 _13 másodperccel. Az s számértéke a részecskék molekulatömegétől és alakjától függ, és egy adott molekulára vagy szupramolekuláris szerkezetre jellemző érték. Például a lizozim ülepedési együtthatója 2,15 S; A kataláz ülepedési együtthatója 11,35S, a bakteriális riboszóma alegységei 30-50S, az eukarióta riboszóma alegységei pedig 40-60S.

ahol M a molekula molekulatömege, R a gáz állandó, T - abszolút hőmérséklet, s - a molekula ülepedési együtthatója, D a molekula diffúziós együtthatója, v - részleges fajtérfogat, amely az oldott anyag egy grammja által elfoglalt térfogatnak tekinthető, p - az oldószer sűrűsége.

Az ülepedési egyensúly módszere. A molekulatömeg-meghatározás ezzel a módszerrel viszonylag alacsony, 7000-8000 ford./perc -1 nagyságrendű forgórész-fordulatszámon történik, így a nagy molekulatömegű molekulák nem ülepednek a fenékre. Az ultracentrifugálást addig végezzük, amíg a részecskék el nem érik az egyensúlyt, amely egyrészt a centrifugális erők, másrészt a diffúziós erők hatására jön létre, azaz amíg a részecskék mozgása meg nem áll. Ezután a kapott koncentráció gradiensnek megfelelően kiszámítjuk az anyag molekulatömegét "a képlet szerint

ahol R a gáz állandó, T - abszolút hőmérséklet, o - szögsebesség, p - az oldószer sűrűsége, v - részleges fajlagos térfogat, Val vel x és Val vel 2 az oldott anyag koncentrációja távolságonként G G és r 2 a forgástengelytől.

Ennek a módszernek az a hátránya, hogy hosszú időbe telik az ülepedési egyensúly elérése - több naptól több hétig a centrifuga folyamatos működése mellett.

Az ülepedési egyensúly megközelítésének módszerét azért dolgozták ki, hogy megszabaduljanak az előző módszer hátrányaitól, amelyek az egyensúly megteremtéséhez szükséges nagy időbefektetéssel jártak. Ezzel a módszerrel molekulatömegek határozhatók meg, amikor a centrifugált oldat Először a makromolekulák egyenletesen oszlanak el az analitikai cella teljes térfogatában, majd a centrifugálás előrehaladtával a molekulák leülepednek, és az oldat sűrűsége a meniszkusz régióban fokozatosan csökken. gondosan rögzítjük, majd összetett számításokkal, nagyszámú változóval, egy adott vegyület molekulatömegét a következő képletekkel határozzuk meg:

ahol R a gáz állandó, T az abszolút hőmérséklet, v - részleges fajlagos térfogat, p - oldószersűrűség, dcldr - a makromolekula koncentráció-gradiense, g m és g d - távolság a meniszkusztól és a cső aljától, c m és s d - a makromolekulák koncentrációja a meniszkuszban, illetve a cső alján, M m és M R - a molekulatömegek értékei, amelyeket az anyag koncentrációjának eloszlása ​​határoz meg a meniszkuszban, illetve a kémcső alján.

2.8.2 A készítmények tisztaságának értékelése

Az analitikai ultracentrifugálást széles körben használják a DNS-, vírus- és fehérjekészítmények tisztaságának értékelésére. A készítmények tisztasága kétségtelenül nagyon fontos olyan esetekben, amikor a molekula molekulatömegének pontos meghatározása szükséges. A legtöbb esetben a készítmény homogenitása az ülepedési határ jellege alapján ítélhető meg, az ülepedési sebesség módszerével: egy homogén készítmény általában egy élesen meghatározott határt ad. A készítményben jelenlévő szennyeződések további csúcsként vagy vállként jelennek meg; ezek határozzák meg a főcsúcs aszimmetriáját is.

2.8.3 A makromolekulák konformációs változásainak vizsgálata

Az analitikai ultracentrifugálás másik alkalmazási területe a makromolekulák konformációs változásainak vizsgálata. A DNS-molekula lehet például egy- vagy kétszálú, lineáris vagy cirkuláris. Különböző vegyületek hatására vagy megemelt hőmérsékleten a DNS számos reverzibilis és irreverzibilis konformációs változáson megy keresztül, ami a minta ülepedési sebességének változtatásával határozható meg. Minél tömörebb a molekula, annál kisebb a súrlódási együtthatója az oldatban, és fordítva: minél kevésbé tömör, annál nagyobb a súrlódási együttható, és ennek következtében annál lassabban ülepedik. Így a minta ülepedési sebességének különbségei a különböző hatások előtt és után lehetővé teszik a makromolekulákban előforduló konformációs változások kimutatását.

Az alloszterikus fehérjékben, mint például az aszpartát-transzkarbamoiláz, konformációs változások következnek be a szubsztráthoz és a kis ligandumokhoz való kötődésük eredményeként. Egy fehérje alegységekre való disszociációja előidézhető olyan anyagokkal történő kezeléssel, mint a karbamid vagy paraklór-mercuribenzoát. Mindezek a változások könnyen nyomon követhetők analitikai ultracentrifugálással.

Cső alakú termékek öntése módszerrel centrifugálás. Alatt centrifugálás az építőanyag-iparban ... amelyeket ilyen hatást hajtanak végre neveznek centrifugálás. A Fehérorosz Köztársaság iparában vízszintes centrifugákat használnak ...

Részecskelerakódás

Laboratóriumi munka >> Kémia

A sejtek már kis sebességgel felszabadultak centrifugálás a sejtmagból, mitokondriumból és... ultracentrifugálás E típus jellemzői centrifugálás tükröződik a nagyon... számunkra használati eseteiben centrifugálás a szacharóz sűrűség gradiensében, ...

Centrifuga segítségével

Tanfolyam >> Ipar, termelés

A szakaszos centrifugákban különféle műveletek centrifugálás- betöltés, szétválasztás, kirakodás - előfordulnak ... különbséget tenni preparatív és analitikus között centrifugálás. Előkészítővel centrifugálás biológiai forrásanyagot veszünk...