Методи ідентифікації білків. Мас-спектрометрична ідентифікація білків та білкових комплексів на чіпах атомно-силового мікроскопа кайшева, анна леонідівна. Методи діагностики гепатиту

480 руб. | 150 грн. | 7,5 дол. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC", BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Дисертація - 480 руб., доставка 10 хвилин, цілодобово, без вихідних та свят

Кайшева, Анна Леонідівна. Мас-спектрометрична ідентифікація білків та білкових комплексів на чіпах атомно-силового мікроскопа: дисертація... кандидата біологічних наук: 03.01.04 / Кайшева Ганна Леонідівна; [Місце захисту: Наук.-дослід. ін-т біомед. хімії ім. В.М. Орєховича РАМН]. - Москва, 2010. - 104 с.: іл. РДБ ОД, 61 10-3/1308

Вступ

Розділ 1. Огляд літератури 10

1.1. Аналіз науково-технічного доробку в галузі високочутливих протеомних технологій

1.2 Характеристика вірусу гепатиту С20

1.2.1 Методи діагностики гепатиту З 22

1.2.2 Серологічні білкові маркери гепатиту С25

Глава 2. Матеріали та методи 28

2.1 АСМ-чіпи 28

2.2 Препарати білків та реактиви 29

2.3 АСМ-аналіз 30

2.4 Підготовка зразків для мас-спектрометричного аналізу 31

2.5 Мас-спектрометричний аналіз 33

2.5.1 МАЛДІ-МС-аналіз білків на поверхні АСМ-чіпа 33

2.5.2 ЕСІ-МС-аналіз білків на поверхні АСМ-чіпа 34

Розділ 3. Результати та їх обговорення 35

3.1 МС-ідентифікація білків, виловлених за допомогою «хімічного фішингу» на поверхню АСМ-чіпа із розчину аналіту

3.2 МС-ідентифікація білків, біоспецифічно виловлених на поверхні АСМ-чіпа із розчину аналіту

3.3 МС-ідентифікація білків на поверхні АСМ-чіпа, біоспецифічно виловлених із зразків сироватки крові

Висновок 83

Література

Введення в роботу

Актуальність роботи.

Одним із пріоритетних напрямів у сучасній біохімії є створення ефективних аналітичних методів для протеомного аналізу, головне завдання яких полягає у виявленні та інвентаризації білків організму, дослідженні їх структури, функцій, виявленні білкових взаємодій. Вирішення даної задачі дозволить створити нові системи діагностики захворювань та їх лікування. Стандартні методи сучасного протеомного аналізу базуються на поділі багатокомпонентних білкових сумішей за допомогою хроматографії, електрофорезу в комбінації з мас-спектрометричними методами (МС) ідентифікації білків. При безперечній гідності стандартного МС-аналізу в плані швидкодії та достовірності ідентифікації білкових молекул, він має суттєві обмеження застосування, обумовлені низькою

концентраційною чутливістю аналізу на рівні 10" "10" М і високим динамічним діапазоном вмісту білків у біологічному матеріалі. ., присутні в плазмі крові в області концентрацій 10" Мі менш.

Один із шляхів подолання такого методологічного обмеження концентраційної чутливості аналізу полягає у використанні біомолекулярних детекторів, які дозволяють реєструвати поодинокі молекули та їх комплекси та теоретично не мають обмежень концентраційної чутливості. До біомолекулярних детекторів відносяться детектори на базі нанотехнологічних пристроїв, таких як атомно-силові мікроскопи (АСМ), нанопровідні детектори, нанопори та інші детектори. Унікальна чутливість АСМ-детекторів дозволяє візуалізувати окремі молекули білків та підраховувати їх кількість. При використанні АСМ як біомолекулярний детектор необхідно застосування спеціальних чіпів, що дозволяють сконцентрувати біологічні макромолекули аналіту з великого об'єму інкубаційного розчину на обмеженій поверхні чіпа. Досліджувані білкові об'єкти можуть бути сконцентровані на поверхні чіпа як за рахунок фізичної або хімічної адсорбції, так і за рахунок біоспецифічних взаємодій (АСМ-біоспецифічний фішинг).

Однак на практиці обмеження застосування нанодетекторів на базі АСМ полягає в тому, що, незважаючи на можливість візуалізації окремих білкових молекул на поверхні чіпа, такі детектори не здатні ідентифікувати їх, що особливо важливо у дослідженні складних білкових сумішей, у тому числі біологічного матеріалу. Тому розробка методу аналізу, що доповнює можливості методу АСМ, є актуальним завданням. На сьогоднішній день єдиним протеомним методом, що дозволяє однозначно та достовірно ідентифікувати білкові молекули, є МС-аналіз. У дисертаційній роботі розроблено підхід, що поєднує високу чутливість методу АСМ та достовірну МС-ідентифікацію для детекції білків та їх комплексів із розчину аналіту.

Мета та завдання дослідження.

Мета справжньої роботи полягала у мас-спектрометричній ідентифікації білків та білкових комплексів, виявлених у біоматеріалі за допомогою атомно-силової мікроскопії.

Для досягнення поставленої мети було вирішено такі завдання:

Розроблено схему МС-ідентифікації білків, виловлених на поверхню АСМ-чіпа за допомогою хімічного або біоспецифічного фішингу;

Розроблено умови ферментативного гідролізу білків на поверхні АСМ-чіпа для подальшої МС-ідентифікації;

Проведено МС-ідентифікацію модельних білків на поверхні АСМ-чіпа;

Проведено МС-ідентифікацію білків на поверхні АСМ-чіпа, біоспецифічно виловлених із багатокомпонентної суміші (сироватки).

Наукова новизна роботи .

У дисертації розроблено схему, що дозволяє проводити МС-ідентифікацію білків і білкових комплексів, виловлених з розчину або багатокомпонентної суміші на поверхні АСМ-чіпа. Для цього було підібрано оптимальні умови підготовки зразків, у тому числі режим проведення гідролізу (температурний режим, вологість, склад трипсинолітичної суміші, час трипсинолізу) білкових молекул, ковалентно та нековалентно іммобілізованих на поверхні АСМ-чіпа. Особливість цієї роботи полягала в тому, що в порівнянні зі стандартними протеомними протоколами ферментативного гідролізу підготовка зразків для МС-аналізу проводилася не в розчині, а на обмеженій площі

поверхні чіпа. Розроблена схема дозволила ефективно провести МС-аналіз та ідентифікувати на поверхні АСМ-чіпа як окремі білки, так і білкові комплекси. МС-аналіз протеотипічних пептидів досліджуваних білків проводився з використанням двох типів іонізації (MALDIі EST)і двох типів детекторів (часопролітного та типу іонна пастка). Розроблена схема сполучення АСМ-біоспецифічний фішинг та МС також була успішно апробована для детекції білкових маркерів вірусного гепатиту С (ВГС) (HCVcoreAg та Е2) у зразках сироватки крові.

Практична значущість роботи .

Результати даної роботи дають можливість створення високочутливих протеомних методів без використання міток та додаткових процедур підготовки зразків для виявлення білків, що перебувають у біологічному матеріалі у низькій концентрації, у тому числі у сироватці крові. Запропоновано підхід на основі атомно-силової мікроскопії та мас-спектрометрії, який дозволить виявляти та ідентифікувати білкові маркери вірусу гепатиту С у сироватці крові людини.

Підхід може бути використаний у розробках, спрямованих на створення нових діагностичних чіпів, пошук біомаркерів широкого діапазону соціально-значимих захворювань.

Апробація роботи.

Основні результати дослідження були представлені на «1-му, 2-му та 3-му Міжнародному форумі з нанотехнологій» (Москва, 2008-2010); «IV з'їзді Російського товариства біохіміків та молекулярних біологів», Новосибірськ, 2008; на Міжнародному конгресі "Протеом людини", Амстердам, 2008; на Міжнародному конгресі "Протеом людини", Сідней, 2010.

Публікації.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків, висновків та списку літератури. Робота викладена на 104 сторінках, ілюстрована 33 малюнками та 4 таблицями, список літератури складається із 159 найменувань.

Аналіз науково-технічного доробку в галузі високочутливих протеомних технологій

Одним із пріоритетних напрямів у сучасній науці є виявлення та з'ясування ролі різних типів білків в організмі, а також розуміння молекулярних механізмів, що призводять до розвитку захворювань.

Незважаючи на постійне вдосконалення протеомних методів, кількість новостворених біомаркерів захворювань залишається практично / незмінною за останнє десятиліття. Це пов'язано з тим, що концентраційна межа детекції традиційних протеомних методів не перевищує 10”9 М . і менше), у тому числі біомаркерів у біологічному матеріалі. Оскільки можна припускати, що у цих концентраційних діапазонах перебувають білкові маркери більшості захворювань .

Один з напрямків, що активно розвивається, що дозволяє дещо підвищити концентраційну чутливість аналізу, полягає у створенні аналітичних комплексів на основі нанохроматографічних і наноелектрофоретичних систем, сумісних з мас-спектрометрами.

Нанохроматографічна система в комбінації з мас-спектрометрією та електроспрейним типом іонізації- дозволили підвищити чутливість виявлення білків на два порядки в порівнянні з хроматографією високої роздільної здатності (ВЕРХ). Межа концентраційної чутливості таких сполучених систем обмежена чутливістю стадії електрофорезу/хроматографії і не перевищує 10"12 М для окремих білків (наприклад, для цитохрому С і брадикініну).

В даний час хроматографічні методи розвинулися в окремі самостійні напрямки - SELDI МС аналіз, методи фішингу білків з використанням магнітних мікрочастинок. У цих технологіях гідрофобні або заряджені поверхні SELDI-чіпів -. або магнітних мікрочасток, комбінації з мас-спектрометричним аналізом, успішно використовуються: для? виявлення- та ідентифікації, як окремих типів; білків, так для білкового/пептидного профілювання сироватки крові [в, 8; Ъ, 15]. SEbDIi МЄ є: потужним підходом, що дозволяє досліджувати біоматеріал за рахунок адсорбції біомолекул (білківj. пептидів) на хімічно активовану? поверхню (катіоно-/аніонообмінні чіпи) з наступним мас-спектрометричним аналізом адсорбованих: молекул:. SEEDPМЄ підхід застосовується; для-білкового-профілювання біоматеріалу;. а останнім часом: став використовуватися як «діагностика, за протеомними штрих-кодами» [17].. Суть такої «штрих-кодової діагностики» полягає у виявленні? особливостей білкового профілю біологічного зразка; пов'язаних із певним захворюванням: Так, відомо; що г при. ракових захворюваннях «протеомний штрих-код» бйоматеріалу-значно відрізняється від такого у здорових груп» осіб: Тому, контроль над зміною білкового; складу біоматеріалу може стати основою для ранньошдіагностики захворювань На; сьогоднішній день, за допомогою підходу SELDI? МЄ було виявлено маркери. раку шлунка, яєчників, простати, і молочної залози: Обмеження цього методу5 полягає в неможливості ідентифікувати білки з високою роздільною здатністю і достовірністю, що особливо важливо при; аналізі багатокомпонентних сумішей, таких як біологічний матеріал.

Крім проблеми низької концентраційної чутливості існуючих аналітичних систем, каменем спотикання для протеомного аналізу біологічного матеріалу став широкий динамічний діапазон концентрацій білків, особливо в сироватці крові, який варіює від 1(Г М аж до окремих білкових молекул. Висококопійні (мажорні) білки перешкоджають виявлення та ідентифікації низькокопійних (мінорних) білків .

Проблему широкого концентраційного діапазону білків в біоматеріалі можливо вирішити шляхом застосування методів збіднення сироватки крові від мажорних фракцій білків, методів сепарації багатокомпонентних сумішей і нанотехнологічних методів, заснованих на біоспецифічному і хімічному фішингу. магнітних мікросфер.

Традиційно для поділу багатокомпонентних білкових сумішей використовують одновимірний, найчастіше двовимірний гель-електрофорез. Принцип поділу білків методами-двовимірного гель-електрофорезу заснований на відмінності білків за значеннями їх ізоелектричних точок Hf молекулярних мас. У протеоміці ці підходи застосовуються для білкового картування біоматеріалу (тканина, плазма крові та ін.). Комбінація одновимірного та/або двовимірного електрофорезу з мас-спектрометрією дозволяє ідентифікувати розділені та візуалізовані білки. Однак процедура двовимірного гель-електрофорезу досі не автоматизована, досить складна і трудомістка у виконанні, вимагає високої кваліфікації оператора, а результати аналізу часто погано відтворюються.

Більш зручна порівняно з двовимірним електрофорезом процедура поділу білків - це хроматографія високої роздільної здатності (ВЕРХ); яка є автоматизованою процедурою, що дозволяє видаляти висококопійні білки зі складної суміші з метою подальшого виявлення низькокопійних білків .

З метою прямої ідентифікації білків у складних сумішах, хроматографічна колонка може бути з'єднана з мас-спектрометром. Однак інтактні білки практично не піддаються високоякісному поділу за допомогою ВЕРХ, оскільки денатурують при проведенні аналізу (через низькі значення рН середовища і високої концентрації органічних розчинників), а також внаслідок низької точності мас-спектрометричного аналізу, тому, пряма ідентифікація більшості інтактних білків , особливо з молекулярною масою, що перевищує 10 кДа, часто неможлива. Аналітичну точність виміру можна покращити шляхом гідролітичного розщеплення білків до пептидних фрагментів, молекулярною масою від 700 до 4000 Так за допомогою протеаз; таких як тріпсин (технологія "bottom-up"). Щоб досягти якісного поділу білків у суміші, застосовують комбінацію декількох хроматографічних процедур, так звана, багатовимірна хроматографія .

Методи діагностики гепатиту

В даний час для білкової діагностики гепатиту С використовуються тест-системи виявлення анти-HCVcore. Перші ІФА-тести, що детектирують наявність антитіл анти-HCVcore, стали доступні на початку 1990-х р., але вони мали низьку чутливість і селективність. Пізніше, в кінці 90-х рр., з'явилися ІФА-тести на анти-HCVcore нового покоління, які мали досить високу чутливість близько 95-99% і могли виявляти ВГС через кілька місяців після інфікування.

Наприклад, 1996 р. на російському ринку з'явилися тест-системи, розроблені у «Вектор-Бест» (Новосибірськ) і «Діагностичних системах» (Нижній Новгород) виявлення антитіл - анти-HCV класу IgM. Роль антитіл класу IgM у серодіагностиці вивчена недостатньо, проте деякими дослідженнями показано значення даного маркера виявлення хронічного гепатиту С . Встановлено також, що кореляція між виявленням РНК вірусу та анти-HCV IgM у хворих становить 80-95%. Для визначення фази розвитку вірусного гепатиту С. Афанасьєв А.Ю. із співавторами використовували коефіцієнт, що відображає відношення вмісту в крові хворих на анти-HCV IgG до анти-HCV IgM . На сьогоднішній день розроблено безліч систем твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), які виявляють циркулюючі антитіла до багатьох епітопів, вірусу гепатиту Є.

Сучасна лабораторна діагностика: вірусного гепатиту Є у більшості лікувальних закладів м. Москви, що здійснюється; відповідно до існуючих наказів МОЗ РФ і Департаменту Охорони здоров'я: м. Москви і полягає у визначенні імуноглобулінів? класу G до вірусу гепатиту Є (анти-HGV IgG) у сироватці крові хворих. Виявлення даного маркера дозволяє судити, про наявність поточної перенесеної інфекції.

Недоліки методів; детекції на основі EEISA, крім, низької чутливості (більше ГО"12 M)j обумовлені також помилковою-детекцією; вірусного гепатиту Є у пацієнтів-внаслідок постінфекційного-імунітету,., крос-реактивності антитіл, а також недостатньою чутливістю в. період гострої) фази BFG . BI ЗВ'ЯЗКУ? С: ЦИМ продовжуються активні пошуки;

Інша- група методів детекції, вірусного гепатиту в сироватці: крові полягає-ВІреєстрації; РНК ВЕЄ за допомогою ПЛР; Визначення РНК. BFG методами; ГЩР не може використовуватися як первинний тест для - підтвердження або виключення; діагнозу; але; може бути; корисний для підтвердження діагнозу: Діагностика BFG здійснюється за допомогою аналізу 5 -некодируемого ділянки РНК. Однак результати аналізу варіюють серед різних генотипів BFG.

На російському ринку з'явилися біологічні мікрочіпи, що дозволяють проводити генотипування BFG і визначати, ефективну, схему противірусної; терапії. Цей биочип-олігонуклеотиднийшикрочіп для генотипування BFG на основі аналізу області NS5B. Отримані результати свідчать про здатність біочіпа ідентифікувати всі 6 генотипів та 36 підтипів ВГС, у тому числі найбільш вірулентні та лікарсько стійкі форми.

З одного боку, методи ПЛР-аналізу надчутливі і дозволяють детектувати і ампліфікувати сигнал всього від однієї молекули РНК у зразку, але з іншого боку, для цих методів характерні хибнопозитивні результати внаслідок випадкової контамінації зразків, хибнонегативні результати через високу мутацію вірусу і порівняно висока вартість аналізу. Навіть у однієї і тієї ж людини рівень РНК ВГС може періодично змінюватися більш ніж у міліотраз, приводячи до хибнонегативних результатів, у разі низької? реплікації вірусу або якщо вірус зберігається у тканинах, не потрапляючи у кров. Результати кількісного визначення РІЖ, ВГС в різних лабораторіях недостатньо добре узгоджуються.

Особливу цінність для ранньої детекції вірусного гепатиту С Bt біоматеріалі представляють білкові антигени ВГС у зв'язку з тим, що з'являються1 в сироватці крові на кілька тижнів раніше, ще до розвитку повноцінної імунної відповіді організму.

Поверхневий антиген HCVcoreAg вірусу гепатиту С є основним маркером інфікування - вірусом, гепатиту С. Він виявляється за 16 тижнів до появи антитіл у крові внаслідок імунної відповіді організму і до розвитку клінічних ознак, при цьому він реєструються як в гостру, так і в хронічну фази захворювання. Існує лише один зарубіжний комерційний продукт (Ortho Clinical Diagnostics) ІФА-діагностики гепатиту С в період гострої фази, заснований, на детекції HCVcoreAg.

Структурний білок HCVcoreAg, що складається з 121 амінокислотного залишку, розташований на N-кінці поліпептиду і утворюється під впливом клітинних протеаз. Перший протеолітичний гідроліз відбувається між залишками 191 і 192 (сайт С1) і призводить до утворення глікопротеїну Е1 . Друге місце розрізання (С2) знаходиться між 174 і 191 амінокислотами.. Відповідні продукти розрізання отримали назви р21 і р23 . Аналіз експресії в ряді клітин ссавців показав, що р21 є основним продуктом, а р23 виявляється в мінорних кількостях. Можливо, що розщеплення по сайтам С1 і С2 - взаємопов'язані процеси, оскільки р21 утворюється в умовах, коли гідролізу по G2 не спостерігається [Г45]. HCVcoreAg являє собою основні РНК-зв'язуючий білок, який, мабуть, формує вірусний нуклеокапсид. Біохімічні властивості цього білка досі погано охарактеризовані. Дослідження методом-АСМ вірусних частинок гепатиту С дозволили отримати зображення капсиду HCV.

АСМ-чіпи

В експериментальній частині роботи використовувалися два типи АСМ-чіпів. З допомогою першого типу проводилася МС-ідентифікація модельних білків лежить на поверхні АСМ-чипов. Ці чіпи являли собою підкладки з функціонально активними хімічними групами (надалі звані АСМ-чіпи з хімічно активованою поверхнею), на яку були виловлені досліджувані молекули і незворотно іммобілізовані за рахунок ковалентних зв'язків, так звана процедура «хімічного фішингу». Другий тип АСМ-чіпів використовувався для МС-ідентифікації на їх поверхні білків, біоспецифічно виловлених з розчину аналіту. На поверхні даних чіпів-в- робочих зонах, попередньо були мобілізовані біологічні зонди. Як біологічні зонди використовувалися моноклональні антитіла проти- маркерних білків вірусних гепатитів В і.С (BFB і BFC) або аптамерьр проти білка gpl20 і тромбіну. Для процедури біоспецифічного фішингу чіпи з ковалентно іммобілізованими молекулами-зондами інкубувалися. в% розчині аналіту, що містить тільки детектований білок, або зразки сироватки кровш

Для виконання завдання МС-ідентифікації модельних білків, ковалентно іммобілізованих на поверхні АСМ-чіпів першого типу, у роботі були використані: авідин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любовно наданий професором А.В. Мунро, Манчестерський університет, Великобританія), тромбін (Sigma, США), a-FP та анти-a-FP (USBio, США); Для виконання завдання МС-ідентифікації білків на поверхні АСМ-чіпів другого типу, біоспецифічно виловлених з розчину аналіту, як молекул-зонди використовувалися моноклональні антитіла (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НДІ молекулярної діагностики, Москва), анти-HBsAg (Aldevron, США), як молекул-мішені: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) та HBsAg (Aldevron, США), gpl20 (Sigma, США), тропонін (USBio, США).

Крім того, в роботі використовувалися наступні речовини: ацетонітрил, ізопропанол, мурашина кислота, дистильована вода (Merck, США), трифтороцтова кислота (ТФУ), бікарбонат амонію (Sigma, США), а-ціано-4-гідроксикорична кислота (НССА) дигідроксибензойна кислота-(DHB) (Bruker Daltonics, Німеччина), трипсин (Promega, США).

Зразки сироваток крові для АСМ-дослідження були надані Кафедрою інфекційних хвороб у дітей РГМУ, ЦНДІ епідеміології Росспоживнагляду, МНДІЕМ ім. з використанням тест-системи "Амплісенс HCV Монітор" (ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ, Москва).

АСМ-аналіз проводився у лабораторії нанобіотехнології ІБМХ РАМН. Підрахунок білків і комплексів антиген/антитіло- на поверхні АСМ-чіпа проводився на основі співвіднесення висот відповідних зображень білків та їх комплексів, виміряних за допомогою АСМ, згідно з методикою, викладеною в . Був використаний» ACM NTEGRA (NT-MDT, Росія). АСМ-вимірювання проводилися в напівконтактношмоді. Як зонди використовувалися кантилевери фірми NT-MDT серії NSG10. Типовий радіус кривизни голок становив 10 нм, резонансна частота лежала від 190 до 325 кГц. Площа сканування чіпа становила 400 мкм2. Кожен вимір проводився щонайменше 3 раз.

Іммобілізацію білків та аптамерів на поверхню АСМ-чіпа проводили за наступною процедурою.

До білкового розчину (0,1 цМ) об'ємом 2 мкл додавали 8 мкл розчину суміші NHS/EDC (v/v=l/l) і ретельно перемішували. Отриману суміш наносили на поверхню силанізованого чипа і інкубували протягом 2 хвилин при кімнатній температурі. Чіп потім двічі промивали в термошейкері 1 мл деіонізованої води при 800 rpm та 37С. Якість иммобилизации.белков лежить на поверхні АСМ-чипа контролювалося атомно-силовой мікроскопією.

Іммобілізація аптамерів на хімічно активовану поверхню АЄМ-чіпа проводилася в такий спосіб. До розчину DSP концентрацією 1,2 мМ в DMSO/етанол (v/v=l/l)4 додавали розчин буфера PBS 50 мМ (рН 7.4,) також у співвідношенні 1/1 за обсягом. Отриманий таким чином робочий розчин наносили на поверхню АСМ-чіпа і інкубували протягом 10 хвилин. Після чого проводили відмивання 50%-ним розчином-етанолу, воді об'ємом 1 мл при 15С протягом 10 хвилин. Розчин аптамера з концентрацією JIM 3 наносили на активовану зону АСМ-чіпа і інкубували протягом 4 хвилин і при перемішуванні зі швидкістю 800 об./хв. Блокування аміногруп, що не прореагували, крос-лінкеру DSP здійснювалося в присутності 5 мМ розчину Tris-HCl протягом 10 хвилин при 37С Заключна стадія відмивання проводилася двічі водним розчином об'ємом 1 мл протягом 10 хвилин при 25С.

На поверхню АСМ-чіпа з іммобілізованими молекулами-зондами наносилася трипсинолітична суміш, що містить буферний розчин 150 мМ NH4HCO3, ацетонітрил, 0,5 М гуанідин гідрохлорид, гліцерол (рН 7,4). Потім до буферного розчину додавали 0,5 мкл розчину модифікованого свинячого трипсину з концентрацією 0,1 мкМ. АСМ-чіп інкубувався у вологому середовищі протягом 2 годин при постійній температурі 45С, на його поверхню знову додавали 0,5 мкл розчину трипсину (0,1 мкМ), і інкубація тривала ще 12 годин. Трипсинолітична суміш змивалася з поверхні АСМ-чіпа розчином елюції об'ємом 10 мкл, що містить 70% ацетонітрил у 0,7% трифтороцтової кислоти (ТФУ). Отриманий таким чином з поверхні АСМ-чіпа гідролізат висушувався у вакуумному випарнику при 45С та 4200 об./хв. Далі пептидна суміш розчинялася в 10 мкл 5% розчину мурашиної кислоти або 10 мкл 0,7% розчину ТФУ для подальшого МС-аналізу.

Під час проведення МС-аналізу з МАЛДИ-типом іонізації підготовка зразків здійснювалася так. Проби, розчинені в 0,7% розчині ТФУ об'ємом 10 мкл, концентрувалися і знесолювалися з використанням мікронаконечників ZipTip С18 (Millipore, США) відповідно до протоколу виробника і змішувалися з насиченим розчином матриці, що містить НССА або DHB в 50% розчині ацетоні 7% ТФУ. Отриману суміш наносили на МАЛДІ-мішень розміру МТР.

-ідентифікація білків, виловлених за допомогою "хімічного фішингу" на поверхню АСМ-чіпа з розчину аналіту

На даному етапі експериментальної роботи було отримано МС-спектри для модельних білків, хімічно іммобілізованих на поверхні АСМ-чіпів із розчину аналіту. Діапазон концентрацій досліджуваних білків у розчині аналіту для авідину, HSA, анти-aFP становив 10" -10"9 М, тропоніну, aFP та Р450 ВМЗ - 10"6-10"8 М.

МС-аналіз проводився для 6 типів білків, різних за своїм походженням, молекулярної маси, кількості сайтів трипсинолізу та їх просторової доступності, ступеня гідрофобності амінокислотної послідовності (співвідношення гідрофобних амінокислот до гідрофільних), які були ковалентно іммобілізовані на поверхні АС Таблиця 1). В цих експериментах використовувалися АСМ-чіпи, які містили робочу і контрольну зони. Робоча зона була хімічно активованою областю поверхні АСМ-чіпа, на якій відбувався «хімічний фішинг» модельних білків; контрольною зоною була хімічно неактивна область поверхні чипа. Підрахунок візуалізованих виловлених молекул реєстрували за допомогою АСМ. Експериментальні дані АСМ-аналізу, отримані для перерахованих вище модельних білків, а саме число молекул, виловлених на поверхні робочої зони АСМ-чіпа, представлені в таблиці 2. У колонці «концентрація білкових молекул в розчині» таблиці 2 наведені дані для мінімально зареєстрованої концентрації відповідного- білка у розчині аналіту.

Як видно з таблиць2, число молекул, зареєстрованих у робочій зоні АСМ-чіпа для всіх представлених білків, склало -1040 молекул. Межа чутливості МС-детекторів становить близько 105 молекул. Таким чином, для представлених модельних білків було проведено успішну необоротну іммобілізацію на поверхні АСМ-чіпа, і кількості АСМ-зареєстрованих білкових об'єктів було достатньо для подальшої МС-ідентифікації. При цьому мінімально зареєстрована концентрація модельних білків в інкубаційному розчині була досить низькою 10" -10" М.

Мас-спектрометричний аналіз зразків проводили з використанням МАЛДІ- та ЕСІ-типів іонізації. АСМ-чіпа після інкубації у відповідному розчині авідину з концентрацією 10"9 М. Аналіз цих спектрів дозволив достовірно ідентифікувати авідин (Gallus Gallus) по двох його протеотипічних пептидів: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) та VGINIF ( 460,4).Обидва пептиди мали добре виражені піки своїх двозарядних іонів (МС-спектри). тропонін I. Відповідні пептидному двозарядному іону 1449 Так МС- і МС/МС-спектри представлені на малюнку 3. МС-аналіз експериментально отриманих спектрів, дозволив достовірно з ймовірністю більше 95% виявити та ідентифікувати тропонін людини (gi 246024 .

На малюнку 5 представлені тандемні спектри фрагментації глобулярного білка - сироваткового альбуміну людини (HSA), який виконує у плазмі транспортні функції. Спектри були отримані з хімічно активованої робочої зони АСМ-чіпа після інкубації у відповідному розчині альбуміну з концентрацією 10"9 М. Аналіз цих спектрів дозволив достовірно ідентифікувати альбумін людини за двома його протеотипічними пептидами: VPQVSTPTLVEV YLYEIAR (m/z=464,3). Обидва пептиди мали добре виражені піки своїх двозарядних іонів (МС-спектри).

МС/МС спектри трипсинолізованих об'єктів з хімічно активованої поверхні АСМ-чіпа, інкубованого в розчині сироваткового альбуміну людини (С=109 М). Пептид VPQVSTPTLVEVSR з m/z=756,5 (А), пептид YLYEIAR з m/z=464,3 (Б). Експериментальні умови: вимірювання було проведено на мас-спектрометрі LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).

Таким чином, МС аналіз дозволив ідентифікувати білки, виявлені за допомогою АСМ. На підставі отриманих даних була виявлена залежність між числом ідентифікованих протеотипічних пептидів на поверхні АСМ-чіпа і вмістом білка, що шукається в розчині аналіту. Така залежність, наприклад, для білків Р450 ВМЗ та HSA, ковалентно іммобілізованих на хімічно активованій поверхні АСМ-чіпа, наведена на малюнку 6. Як видно на малюнку 6, чим вище концентрація білка в розчині аналіту (-КГ6 М), тим більша кількість пептидів вдається достовірно ідентифікувати як у випадку Малді-МС-, так і ЕСІ-МС-аналізу. Значних відмінностей між числом ідентифікованих пептидів у діапазоні концентрацій 10"6-10"9 М серед аналізованих білків у розчині аналіту не спостерігалося.

Залежність числа ідентифікованих пептидів молекул аналіту від концентрації білка в інкубаційному розчині. (А) - аналіз суміші пептидів модельних білків HSA, ВМЗ на мас-спектрометрах з МАЛДІ-типом іонізації Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Німеччина) та Autoflex III (Bruker Daltonics, Німеччина); (Б) – аналіз суміші пептидів модельних білків HSA, ВМЗ на мас-спектрометрі з ЕСІ-типом іонізації LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США).

Отримані результати дозволили зробити висновок, що АСМ-МС (МАЛДІ та ЕСІ) дозволяє виявляти та ідентифікувати ковалентно виловлені з розчину аналіту на поверхні АСМ-чіпа білкові молекули, різні за своїми фізико-хімічними властивостями.

У той же час, у контрольній зоні АСМ-чіпа (неактивованої) після його інкубації в розчині аналіту методом АСМ не було зареєстровано наявності на поверхні чіпа об'єктів, відповідних за висотою білкових молекул. МС-аналіз також не виявив об'єктів білкової природи. Таким чином, експериментально було доведено, що АСМ адекватно реєструє об'єкти, що шукаються - білкові молекули аналіту.

Наступним етапом даної роботи стало відпрацювання схеми комбінації АСМ-МС для ідентифікації білків, виловлених з розчину. рахунок біоспефічних взаємодій.

Схема проведення, мас-спектрометричного аналізу - у разі біоспецифічного АСМ-фішингу білків з розчину представлена на малюнку 7. Згідно з наведеною схемою спочатку проводилася іммобілізація молекул-зондів на поверхню робочої області АСМ-чіпів, в якості яких виступала моноклональні антитіла проти білкових маркерів гепатитів В і С або аптамери проти білків глікопротеїну ВІЛ-1 gpl20 і тромбіну, при цьому поверхня контрольної зони не містила іммобілізованих молекул-зондів. Контроль якості іммобілізації молекул-зондів проводили AGM-візуалізації. Потім такий чіп інкубували в розчині аналіту, що містить білок, що досліджується. Після стадії відмивання від неспецифічно сорбованих молекул на поверхні чіпа і етапу підготовки зразка для подальшого мас спектрометричного аналізу на поверхні АСМ-чіпа проводили МС-аналіз АСМ-зареєстрованих білків.

Експериментальна частина цього розділу передбачала проведення двох етапів аналізу. На першому етапі необхідно було провести МС-ідентифікацію ковалентно іммобілізованих на АСМ-чіпі білкових молекул-зондів, на другому етапі - білків-мішеней, виловлених на відповідні молекули-партнери з розчину або зразків сироватки крові за рахунок біоспецифічних взаємодій. Для цього було проведено МС-аналіз ковалентно іммобілізованих на поверхні АСМ-чіпів МКА проти маркерних білків ВГС та ВГВ: анти-HCVcore та анти-HBVcore. Для МКА проти білків анти-HCVcore та анти-HBVcore у цій роботі вперше були отримані тандемні спектри фрагментації та спектри пептидних карт.

2 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ.

2.1 Мас-спектрометрія у протеоміці.

2.1.1. Загальні принципи.

2.1.2 Протеомний аналіз із використанням мас-спектрометрії.

2.1.3 Ідентифікація білків шляхом відбитків пептидних мас.

2.1.4 Ідентифікація білків шляхом відбитків фрагментації пептидів.

2.2 Інтерпретація результатів мас-спектрометричної ідентифікації білків.

2.2.1 Визначення списку ідентифікованих білків.

2.2.2 Ідентифікація високогомологічних білків.

2.2.3. Бази даних амінокислотних послідовностей білків.

2.3 Мас-спектрометричний аналіз продуктів одного гена.

2.3.1 Протеотипування та популяційна протеоміка.

2.3.2 Ідентифікація мікрогетерогенності білків методом «згори донизу».

2.3.3 Ідентифікація генетично детермінованого поліморфізму білків методом «знизу-вгору».

2.3.4 Бази даних поліморфізмів білків та генів.

2.3.5 Репозиторії мас-спектрометричних даних.

3 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ.

3.1 Матеріали.

3.1.1 Мас-спектрометричні дані для білків мікросомальної фракції печінки людини.

3.1.2 Контрольний набір мас-спектрів "Aurum Dataset".

3.1.3 Мас-спектрометричні дані протеомного репозиторію PRIDE.

3.1.4. Бази даних амінокислотних послідовностей білків людини.

3.1.5 Дані про можливі поліморфізми білків людини.

3.2 Методи.

3.2.1 Веб-сервер ідентифікації білків за мас-спектрами.

3.2.2 Пакетна обробка мас-спектрів методом відбитків пептидних мас.

3.2.3 Пакетне оброблення тандемних мас-спектрів.

3.2.4 Одновимірне протеомне картування.

3.2.5. Програмна реалізація ітеративного алгоритму ідентифікації ОАП.

3.2.6 Валідація алгоритму ідентифікації ОАП.

4 РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

4.1. Збільшення ступеня покриття амінокислотних послідовностей ідентифікованими пептидами.

4.1.1 Ідентифікація білків у зрізах гелю.

4.1.2 Одновимірні протеомні карти та їх властивості.

4.1.3 Виявлення високогомологічних білків надродини цитохромів Р450 за рахунок збільшення ступеня покриття амінокислотних послідовностей ідентифікованими пептидами.

4.2 Ідентифікація ОАП у білках надродини цитохромів Р450.

4.3 Алгоритм ідентифікації ОАП.

4.3.1 Ітеративна схема обробки тандемних мас-спектрів.

4.3.2 Чутливість та специфічність алгоритму ідентифікації ОАП.

4.4 Застосування ітеративного алгоритму виявлення ОАП в мас-спектрометричних даних протеомного репозиторію PRIDE.

4.4.1 Вихідні дані, що використовуються для виявлення ОАП.

4.4.2 Ідентифікація пептидів та білків з використанням мас-спектрометричних даних, завантажених з репозиторію PRIDE.

4.4.3 Ідентифікація одноамінокислотних поліморфізмів.

4.5 Аналіз ідентифікованих ОАП.

4.5.1 Аналіз ОАП-вмісних пептидів.

4.5.2 Зв'язок виявлених ОАП із захворюваннями людини.

Введення дисертації (частина автореферату) на тему "Аналіз мас-спектрів пептидних фрагментів для ідентифікації генетично детермінованого поліморфізму білків"

У базі даних Ensembl містяться відомості про 20 469 генів, що кодують, отримані на основі результатів складання геному людини, виконаної в Національному центрі біотехнологічної інформації США (лютий 2009). Невелика кількість генів дозволяє зробити висновок, що складність живих систем досягається на рівні регуляції транскрипції, трансляції та пост-трансляційних модифікацій. Альтернативний сплайсинг і такі модифікації, як фосфорилювання, глікозилювання, поряд з протеолітичним процесингом призводять до формування різноманіття білків, кількість яких на кілька порядків перевищує кількість генів. Проведені різними методами оцінки показують, що протеом людини може налічувати кілька мільйонів білків, що відрізняються за своєю хімічною будовою.

Традиційний підхід до дослідження протеома ґрунтується на використанні імуногістохімічного фарбування тканинних зрізів. Перший варіант протеомного атласу людини запал побудований із застосуванням антитіл. Використання біологічних мікрочіпів, що містять нанесені на них антитіла, дозволяє ідентифікувати та кількісно виміряти до кількох сотень білків в одному зразку. Однак цей підхід має обмеження, які пов'язані з необхідністю напрацювання та верифікації антитіл, недостатньою специфічністю за рахунок перехресних взаємодій та відносно низькою афінністю комплексів антиген-антитіло. У зв'язку з цим особливу важливість для дослідження протеома набув більш універсального методу ідентифікації білків, що не вимагає імуноспецифічних реагентів, - біологічна мас-спектрометрія.

При мас-спектрометричному аналізі біоматеріалу ідентифікація білкових молекул здійснюється шляхом зіставлення виміряних мас-зарядних характеристик білків та/або їх протеолітичних фрагментів з теоретичними значеннями, обчисленими на підставі кодованих в геномі амінокислотних послідовностей. Необхідно враховувати, що в послідовності геному в явному вигляді не міститься інформації про сайти альтернативного сплайсингу і про можливі посттрансляційні модифікації. Виявлення випадків альтернативного сплайсингу можливе на підставі експериментальних даних: джерелом відомості про сплайс-ізоформ є бази даних кодують ДНК . Виявлення посттрансляційних модифікацій здійснюється з використанням високоточної мас-спектрометрії білків або із застосуванням тандемної мас-спектрометрії пептидних фрагментів

Поряд з альтернативним сплайсингом та посттрансляційною модифікацією, різноманітність білкових молекул збільшується за рахунок трансляції несинонімічних однонуклеотидних поліморфізмів (non-synonymous Single Nucleotide Polymorphism, nsSNP). Встановлення наявності nsSNP проводиться з використанням генотипування, тоді як підтвердження наявності відповідної заміни залишку в первинній структурі білка, тобто виявлення одноамінокислотних поліморфізмів (ОАП, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), відноситься до задач протеотипування.

Важливість ідентифікації та дослідження на білковому рівні альтернативного сплайсингу, ОАП та посттрансляційних модифікацій обумовлена впливом даних процесів на рівень експресії та функціональні властивості білків. Відомо, що зміна активності або рівня експресії білків може призводити до виникнення та розвитку соціально-значущих захворювань, включаючи онкологічні, серцево-судинні та нейродегенеративні захворювання.

У геномі встановлено наявність близько 65 тисяч несинонімічних поліморфізмів, які, ймовірно, транслюються в ОАП, причому більше 30% ймовірно призводять до зміни функціональних властивостей білків. Оскільки зміна активності білків пов'язані з розвитком захворювань, дослідження ОАП необхідні визначення структурних причин, які у основі спостерігаються функціональних порушень . У завдання протеотипування входить якісне та кількісне визначення експресії алельних варіантів генів на протеомному рівні, а також моніторинг частоти народження експресованих алельних варіантів білків на популяційному рівні.

Ідентифікація ОАП у високопродуктивному режимі з використанням мас-спектрометрії пов'язана з технічними обмеженнями. Для задачі протеотипування найбільш адекватним є підхід «згори донизу», тобто мас-спектрометрія інтактних білків (а не їх фрагментів). Проте, чутливість такого підходу невелика, лише на рівні 10ч-10 5 М. Як наслідок, забезпечується ідентифікація десятків, рідше сотень, і лише у виняткових випадках до тисячі білків. Найчастіше в біологічній мас-спектрометрії застосовують інший підхід - «знизу-вгору», у якому наявність у зразку білка встановлюється шляхом ідентифікації його протеолітичних фрагментів (пептидів). Найчастіше для ідентифікації білка досить невеликої кількості пептидів, які у сукупності можуть становити трохи більше 5% послідовності біополімеру. Для частини амінокислотної послідовності білка, що залишилася, неможливо встановити наявність/відсутність хімічних модифікацій амінокислотних залишків або амінокислотних поліморфізмів.

Для ідентифікації одноамінокислотних поліморфізмів білків людини з використанням біологічної мас-спектрометрії необхідно підвищити ступінь покриття послідовності амінокислотної білка за рахунок виявлення додаткових протеолітичних пептидів білка. Це можливо в результаті проведення експерименту з великим числом мас-спектрометричних аналізів, що частково або повністю повторюються. Крім того, в рамках одного дослідження можна поєднувати дані протеомних експериментів, виконаних безліччю дослідницьких груп. Доступ до великої колекції мас-спектрів надається різними протеомними репозиторіями, в найбільш популярному з яких – PRIDE (Protein Identification Database) – зберігаються результати понад 13 тисяч протеомних експериментів. Чим вище виявиться ступінь покриття послідовності амінокислотної білка ідентифікованими пептидами, тим більше ймовірність підтвердити наявність або відсутність одноамінокислотних замін в структурі білка.

За наявності великого обсягу мас-спектрометричних даних рішення задачі протеотипування можливе за рахунок використання обчислювальних методів біоінформатики. Наприклад, аналіз мас-спектрометричних даних може здійснюватися з використанням баз даних експресованих фрагментів (EST), в яких міститься інформація про трансльовані варіанти несинонімічних генів поліморфізму . Другий спосіб, реалізований у багатьох програмах ідентифікації білків, є порівняння мас-спектрів з базою даних теоретичних послідовностей білків, що допускає наявність неточностей у вигляді замін амінокислотних залишків .

Недоліки зазначених вище підходів добре відомі. У базах даних фрагментів, що експресуються, міститься надмірна інформація, включаючи помилки секвенування, що ускладнює аналіз результатів мас-спектрометричного дослідження . Аналізуючи зразок, у якому ідентифіковано кілька сотень білків, отримані мас-спектри необхідно зіставляти із накопиченими за десятки років сотнями тисяч транскриптів, серед яких міститься понад 5% помилок. При аналізі мас-спектрів з допущенням можливих неточностей у базі даних ігнорується інформація про реально існуючі несинонімічні заміни, які були встановлені генотипуванням. Штучні припущення, введені в базу даних або алгоритм ідентифікації білків, призводять до зниження достовірності результатів. Зазначені недоліки існуючих методів протеотипування спричиняють необхідність удосконалення обчислювальних підходів до ідентифікації ОАП.

Метою роботи була розробка способу аналізу мас-спектрометричних даних для ідентифікації одиничних амінокислотних поліморфізмів, що виникають в результаті трансляції несинонімічних нуклеотидних замін у відповідних генах, та застосування розробленого способу виявлення амінокислотних замін у білках людини. Досягнення мети вирішувалися такі:

1. Провести обробку мас-спектрів пептидних фрагментів підвищення ступеня покриття амінокислотних послідовностей білків ідентифікованими пептидами.

2. На модельному наборі мас-спектрометричних даних, що забезпечують високий рівень покриття послідовностей, розробити метод виявлення одноамінокислотних замін у білках людини.

3. Узагальнити метод виявлення одноамінокислотних замін у формі універсального алгоритму обробки тандемних мас-спектрів; оцінити чутливість та специфічність створеного алгоритму.

4. Застосувати створений алгоритм для обробки репозиторію мас-спектрометричних даних, визначити одноамінокислотні поліморфізми та охарактеризувати білки людини, які містять виявлені поліморфізми.

2 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Термін «протеом» - повна сукупність експресованих в організмі білків - був вперше запропонований Марком Вілкінсом у зв'язку з необхідністю доповнити знання про геноми відповідною інформацією про кодовані в них білки. Об'єктом дослідження під час аналізу протеома може бути як цілий організм, і клітинний компонент, тканина, субклітинна структура, наприклад, ядро, микросомальная фракція та інших.

Результати проведення широкомасштабної інвентаризації білків з використанням мас-спектрометрії були опубліковані у роботі Шевченка та співавторів у 1996 році. Поява біологічної мас-спектрометрії ознаменувала настання ери високопродуктивних постгеномних технологій, що дозволяють в результаті проведення одного експерименту отримати інформацію про гени та білки в масштабі всього організму. До постгеномних технологій, крім протеоміки, відносяться також геноміка та транскриптоміка. При аналізі генетичного матеріалу постгеномні технології дозволяють встановлювати наявність поліморфізму генів із застосуванням повногеномного ресеквенування або високощільного картування однонуклеотидних замін (SNP).

Існуючі підходи до вивчення різноманіття білків можна поділити на два напрямки. У першому випадку перед постановкою експерименту наперед задано, ідентифікацію яких саме білкових молекул планується провести. При такому підході ідентифікацію білків проводять з використанням антитіл, які застосовують для гістохімічного фарбування зрізів тканин з подальшим отриманням мікрофотографій клітин. На мікрофотографії зрізу флуоресцирующие ділянки відповідають місцям локалізації білка-антигена, що виявляється, причому інтенсивність флуоресценції дозволяє отримати кількісну оцінку вмісту цього білка.

У рамках великого міжнародного проекту ProteinAtlas здійснюється масштабне напрацювання антитіл до білків всіх генів людини. У ході виконання цього проекту було отримано та розміщено для громадського користування понад 400 000 мікрофотографій імуногістохімічних забарвлених зрізів практично для всіх тканин людини. Порівняльний аналіз розподілу специфічного фарбування білків дозволив, зокрема, виявити характерні профілі експресії білків для ракових тканин. Однак, фарбування тканинних зрізів з використанням флуоресцентно-мічених антитіл є досить грубим методом дослідження протеома. По-перше, як вказують самі розробники проекту ProteinAtlas, якість багатьох комерційно доступних антитіл вкрай низька. Приблизно половина закуплених антитіл при верифікації показує низьку специфічність до антигену, що досліджується, а також препарати антитіл часто характеризуються низькою чистотою. По-друге, велика кількість комплексів антиген-антитіло характеризуються константою дисоціації (107-108 М), що зумовлює обмеження чутливості при вимірюванні концентрації білків.

Крім гістохімічного аналізу дослідження протеома здійснюється з використанням біологічних мікрочіпів. Білкові мікрочіпи є ефективним інструментом трансляційної медицини, але обмеженим на можливості використання для широкомасштабного дослідження протеома. Застосування мікрочіпових технологій в протеоміці рідко дозволяє проводити ідентифікацію більше десяти білків одноразово: зі збільшенням кількості аналізованих білків стандартизація умов перебігу взаємодії антиген-антитіло утруднена. Так, застосування мікрочіпів призводить до появи хибно-негативних результатів у разі, коли для комплексів антиген-антитіло відмінності констант дисоціації становлять кілька порядків. Крім того, стабільність антитіл дуже залежить від умов їх зберігання, тому використання білкових мікрочіпів обмежено часом безпосередньо після їх виготовлення, що не дозволяє даному виду аналізу набути широкого поширення.

Другий напрямок досліджень протеома пов'язаний із постановкою експерименту в званому «панорамному» (survey) режимі, коли заздалегідь невідомо, які білки можуть бути ідентифіковані. Потенційно, в результаті панорамного експерименту можуть бути ідентифіковані будь-які білки, закодовані в геномі досліджуваного організму, включаючи навіть продукти ділянок геному, що вважаються не кодуючими. Технічні та методичні засоби для повногеномного дослідження протеома забезпечуються біологічною мас-спектрометрією.

Подібні дисертаційні роботи за спеціальністю "Математична біологія, біоінформатика", 03.01.09 шифр ВАК

Транскриптомно-протеомний підхід для аналізу протеоформ клітинної лінії HepG2 2018 рік, кандидат біологічних наук Кисельова, Ольга Ігорівна
Транскриптом та протеом хромосоми 18: екстраполяція результатів аналізу на геноми людини та модельних об'єктів 2017 рік, доктор біологічних наук Пономаренко, Олена Олександрівна
Оцінка пластичності протеома плазми крові здорової людини в екстремальних умовах життєдіяльності 2011 рік, кандидат біологічних наук Трифонова, Оксана Петрівна
Пошук та ідентифікація потенційних біомаркерів раку яєчників у сироватці крові людини 2015 рік, кандидат біологічних наук Арапіді, Георгій Павлович
Аналіз фотодинаміки білкових комплексів тилакоїдних мембран за допомогою мас-спектрометрії високої роздільної здатності 2011 рік, кандидат хімічних наук Галецький, Дмитро Миколайович

Висновок дисертації на тему «Математична біологія, біоінформатика», Чорнобровкін, Олексій Леонідович

1. Проведено протеомне картування мас-спектрометричних даних, що включає ідентифікацію білків методом відбитка пептидних мас з подальшим аналізом, спрямованим на виявлення протеїпічних білок-специфічних пептидів. На прикладі білків надродини цитохромів Р450 показано, що за рахунок картування зон локалізації білків у гелі ступінь покриття послідовності ідентифікованими пептидними фрагментами збільшується на 27%.

2. Ідентифіковані протеолітичні пептиди, специфічні для форм цитохромів Р450 CYP3A4 та CYP3A5, ідентичність послідовностей яких становить 82%. Виявлено алельні варіанти трансляції цитохромів CYP3A4 та CYP3A5, що містять одноамінокислотні поліморфізми M445N (ЗА4), К96Е (ЗА4), L82R (ЗА5) та D277E (ЗА5).

3. Розроблено ітеративний алгоритм, призначений для ідентифікації одноамінокислотних поліморфізмів білків за тандемними мас-спектрами протеолітичних пептидів. При тестуванні на контрольному наборі Aurum Dataset алгоритм виявлення поліморфізмів показав специфічність більше 95%. Чутливість алгоритму була лише на рівні 30%, що відповідає середнього ступеня покриття послідовностей, включених у контрольний набір.

4. В результаті аналізу мас-спектрометричних експериментів, депонованих у репозиторії PRIDE, виявлено загалом 270 одноамінокислотних поліморфізмів у 156 білках людини, у тому числі 51 ОАП (45 білків) асоційовані із захворюваннями, включаючи порушення в системі згортання крові та системні амило.

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Чернобровкін, Олексій Леонідович, 2012 рік

1. Арчаков А.І. та ін. Спосіб підвищення точності визначення послідовності амінокислотних залишків біополімеру на основі даних масспектрометричного аналізу, обчислювальна система //2010.

2. Арчаков А.І. та ін. Цитохроми Р450, лікарська хвороба та персоніфікована медицина. Частина 1// Клінічна медицина. 2008. Т. 86. № 2. С. 4-8.

3. Клюєв H.A., Бродський Є.С. Сучасні методи мас-спектрометричного аналізу органічних сполук // Ріс. хім. ж. (Ж. Рос. хім. про-ва ім. Д.І. Менделєєва). 2002. Т. XLVI. № 4. С. 57-63.

4. Лисиця A.B. та ін Одномірне протеомне картування цитохромів Р450 печінки людини // Біохімія. 2009. Т. 74. № 2. С. 153-161.

5. М'ясоїдова К.М. Нове у вивченні цитохромів Р450 // Біохімія. 2008. Т. 73. №9. З. 1199-1205.

6. Пєтушкова H.A. та ін. Ідентифікація цитохромів Р450 мікросом клітин печінки людини за допомогою мас-спектрометрії // Біомедична хімія. 2007. Т. 53. №4. З. 400-11.

7. Пономаренко Є.А., Ільгісоніс Є.В., Лисиця A.B. Технології знань у протеоміці // Біоорганічна хімія. 2011. Т. 37. № 2. С. 190-198.

8. Пономаренко О.О. та ін. Виявлення білків, що диференціально-експресуються, з використанням автоматичного мета-аналізу протеомних публікацій // Біомедична хімія. 2009. Т. 3. №1. С. 10-16.

9. Савельєва М. та ін. Значення генетичного поліморфізму ізоферментів цитохрому Р450 для персоналізованого вибору та режимів дозування антидепресантів та антипсихотиків // Клінічна медицина. 2008. Т. 86. № 11. С. 22-28.

10. A gene-centric human proteome project: HUPO~the Human Proteome organization. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2010. Т. 9. №2. С. 4279.

11. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. / / Nature. 2003. T. 422. № 6928. C. 198-207.

12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Unrestricted identification modified proteins using MS/MS // Proteomics. 2010. T. 10. №4. C. 671-686.

13. Akiyama M. h «p. Іхтиозіс bullosa of Siemens: його коректна diagnosis зроблено з молекулярної genetic testing. // The British journal of dermatology. 2005. T. 152. №6. З. 1353-6.

14. Alves G. h jxp. Calibrating E-values for MS2 database search methods. //Biology direct. 2007. T. 2. №1. C. 26.

15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: мас-spectrometery базується на peptide identification web server with knowledge integration. / / BMC genomics. 2008. T. 9. C. 505.

16. Archakov A. h zip. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy для виявлення дуже low-abundant proteins. // Proteomics. 2009. T. 9. №5. C. 1326-43.

17. Archakov A. h ap. Gene-centric view on human proteome project: example of the Russian roadmap for chromosome 18. // Proteomics. 2011. T. 11. №10. C. 1853-6.

18. Арчаков А.І. h zip. AFM фішинг нанотехнології є спосіб, щоб перевірити Avogadro номер в proteomics. // Proteomics. 2007. T. 7. №1. C. 4-9.

19. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 і активний оксиген. London: Taylor & Francis, 1990.

20. Asara J.M. h ^p. A label-free quantification method by MS/MS TIC compared to SILAC і spectral counting в proteomics screen. // Proteomics. 2008. T. 8. №5. C. 994-9.

21. Bairoch A., Apweiler R. SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. // Nucleic acids research. 2000. T. 28. № 1. C. 45-8.

22. Baldwin M. a. Protein identification by mass spectrometry: issues to be considered. //Molecular & cellular proteomics: MCP. 2004. T. 3. №1. C. 1-9.

23. Bantscheff M. h ap. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. / / Nature biotechnology. 2007a. T. 25. № 9. C. 1035-44.

24. Bantscheff M. h, qp. Quantitative mass spectrometry в proteomics: critical review. / / Analytical and bioanalytical chemistry. 2007b. T. 389. № 4. C. 1017-31.

25. Barsnes H. h ap. PRIDE Converter: making proteomics data-sharing easy. / / Nature biotechnology. 2009. T. 27. № 7. C. 598-9.

26. Baumgardner L.A. h Fast parallel tandem mass spectral library searching using GPU hardware acceleration. // Journal of proteome research. 2011. T. 10. №6. C. 2882-8.

27. Beck F. h ap. Добре, погано, погано: Зображення маси спектрометричної analysis modified peptides // PROTEOMICS. 2011. C. n/a-n/a.

28. Bell A.W. h/jp. Protein microscope: incorporation mass spectrometry в cell biology. //Nature methods. 2007. T. 4. №10. C. 783-4.

29. Binz P.-A. h, qp. A Molecular Scanner До Automate Proteomic Research and Display Proteome Images // Analytical Chemistry. 1999. T. 71. № 21. C. 49814988.

30. Binz P.-A. h pp. Molecular scanner: concept and developments. // Current opinion in biotechnology. 2004. T. 15. №1. C. 17-23.

31. Birney E. h ap. An overview of Ensembl. // Genome research. 2004. T. 14. № 5. C. 925-8.

32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Databases and tools for browsing genomes. // Annual review of genomics and human genetics. 2002. T. 3. C. 293-310.

33. Bochet P. h flp. Fragmentation-free LC-MS може identify hundreds of proteins // PROTEOMICS. 2010. T. 11. № 1. C. n/a-n/a.

34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-database для "expressed sequence tags". / / Nature genetics. 1993. T. 4. №4. C. 332-3.

35. Borges C.R. h np. Full-length characterization of proteins in human populations. // Clinical chemistry. 2010. T. 56. №2. C. 202-11.

36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: пов'язаний з несинонімним polymorphisms on function. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № 11. C. 3823-35.

37. Brosch M. h np. Comparison of Mascot і XITandem розв'язання для низької і високої тяжкості маси spectrometry і розробка необмеженого Mascot threshold. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2008. T. 7. № 5. C. 962-70.

38. Bunger M.K. h ^p. Detection and validation of non-synonymous coding SNPs від ортогональних analysis of shotgun proteomics data. // Journal of proteome research. 2007. T. 6. № 6. C. 2331-40.

39. Bunkenborg J. h jip. Скринінг для N-glycosylated proteins liquid chromatography mass spectrometry. // Proteomics. 2004. T. 4. №2. C. 454-65.

40. Butenas S., Mann KG, Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica distributed exclusive by Springer Science+Business Media LLC., 2002.

41. Canas B. h jyp. Масс spectrometry технології для proteomics. // Briefings в functional genomics & proteomics. 2006. T. 4. №4. C. 295-320.

42. Care M.A. h Deleterious SNP prediction: be mindful of your training data! //Біоінформатики (Oxford, England). 2007. T. 23. № 6. C. 664-72.

43. Casado-Vela J. h flp. Світли й шари біологічних технологій для вивчення сировинних видів включаючи ізоформи, сполучні варіанти і білки post-translational modifications. // Proteomics. 2011. T. 11. №4. C. 590-603.

44. Chapman P.F. h ap. Genes, models and Alzheimer's disease // Trends in Genetics. 2001. T. 17. № 5. C. 254-261.

45. Chen M. h ap. Annotation of Non-Synonymous Single Polymorphisms in Human Liver Proteome by Mass Spectrometry // Protein and Peptide Letters. 2010. T. 17. №3. C. 277-286.

46. Chen R. h zip. Глікопротеомічні аналізи людської життєвої дисципліни при комбінації multiple enzyme digestion and hydrazide chemistry. // Journal of proteome research. 2009. T. 8. №2. C. 651-61.

47. Choudhary J.S. h Interrogating людський genome використовуючи uninterpreted маси spectrometry data. // Proteomics. 2001a. T. 1. № 5. C. 651-67.

48. Choudhary J.S. h «p. Matching peptide mass spectra до EST і genomic DNA databases. // Trends in biotechnology. 2001b. T. 19. №10 Suppl. C. S17-22.

49. Choudhury V. h ap. Два novel antithrombin variantes (L99V і Q118P), які враховують хепарин binding // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. C. 268.

50. Colinge J. Bennett K.L. Утворення до computational proteomics. // PLoS computational biology. 2007. T. 3. № 7. C. el 14.

51. Cooksey A.M. h ap. Identifying blood biomarkers and physiological process that distinguish humans with superior performance under psychological stress. // PloS one. 2009. T. 4. № 12. C. e8371.

52. Cooper D. Human gene mutation database // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. № l.C. 285-287.

53. Côté R.G. h up. Онтологія Lookup Service: more data and better tools for controlled vocabulary queries. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Web Server issue. C. W372-6.

54. Cottrell J.S. Protein identification by peptide mass fingerprinting. / / Peptide research. 1994. T. 7. №3. C. 115-24.

55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. //Біоінформатики (Oxford, England). 2004. T. 20. № 9. C. 1466-7.

56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. // Journal of proteome research. 2004. T. 3. № 6. C. 1234-42.

57. Creasy DM, Cottrell J.S. Error tolerant searching uninterpreted tandem mass spectrometry data // PROTEOMICS. 2002. T. 2. № 10. C. 1426-1434.

58. Crockett D.K. h ap. Аннотований proteome of human T-cell lymphoma. // Journal of biomolecular techniques: JBT. 2005. T. 16. №4. C. 341-6.

59. Dai D. h jvp. Identification of Variants of CYP3A4 and Characterization of Their Abilities to Metabolize Testosterone and Chlorpyrifos // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. T. 299. № 3. C. 825-831.

60. Delahunty C., Yates J.R. Identification of proteins in complex mixtures з допомогою хімічної хроматографії і маси спектрометрії. // Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino. et al. 2003. T. Chapter 5. C. Unit 5.6.

61. Delahunty C.M., Iii J.R.Y. Tech Insight MudPIT: multidimensional protein identification technology Tech Insight // Biotechniques. 2007. T. 43. №5.

62. Desiere F. h jjp. The PeptideAtlas project. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D655-8.

63. Deutsch E. mzML: a single, unifying data формат для маси spectrometer output. // Proteomics. 2008. T. 8. № 14. C. 2776-7.

64. Deutsch E.W. The PeptideAtlas Project. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 285-96.

65. Deutsch E.W. h ^p. На керованій турі з Trans-Proteomic Pipeline. // Proteomics. 2010. T. 10. №6. C. 1150-9.

66. Deutsch E.W. h ^p. Human Plasma PeptideAtlas. // Proteomics. 2005. T. 5. № 13. C. 3497-500.

67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: ресурс для target selection for emerging targeted proteomics workflows. // EMBO reports. 2008. T. 9. №5. C. 429-34.

68. Eckel-Passow J.E. h jsp. An insight в high-resolution mass-spectrometry data. // Biostatistics (Oxford, England). 2009. T. 10. №3. C. 481-500.

69. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. На прикладі до correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in protein database // Journal of American Society for Mass Spectrometry. 1994. T. 5. № 11. C. 976-989.

70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: A Protein Identification Algorithm with Accurate Assignment of Statistical Significance of Results // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. №1. C. 32-36.

71. Falkner J. a h up. Validated MALDI-TOF/TOF маса spectra for protein standards. // Journal of American Society for Mass Spectrometry. 2007. T. 18. №5. C. 850-5.

72. Farrah T. h Висока конфіденційність людського plasma proteome reference set with estimated concentrations in PeptideAtlas. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011 року.

73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. How do we compare hundreds of bacterial genomes? // Current opinion in microbiology. 2006. T. 9. №5. C. 499-504.

74. Frazer K. a h ap. У другій generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. //Nature. 2007. T. 449. № 7164. C. 851-61.

75. Fredman D. h ap. HGVоснова: сприйняті ресурси, що закривають людську DNA варіацію і фонові типи відносин. // Nucleic acids research. 2004. T. 32. № Database issue. C.D516-9.

76. Freed G.L. h ^p. Різноманітний малюнок серії proteínів для expression profiling і biomarker discovery в попередньому і післязалежному head and nick cancer samples. // The Laryngoscope. 2008. T. 118. № 1. C. 61-8.

77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. №4. C. 314-317.

78. Galeva N. Direct Identification of Cytochrome P450 Isozymes з Matrix-асоційована Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Based Proteomic Approach // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. № 4. C. 351-355.

79. Галева N., Altermann M. Comparison з одним-двомісним і дво-dimensional гель electrophoresis як відокремлення інструменту для біологічного аналізу ліхтарних мікросомів: cytochromes P450 і інші мембрани білків. // Proteomics. 2002. T. 2. № 6. C. 713-22.

80. Gao M. h jp. Великий значний відхилення високої аbundance proteins і analysis of middle- і low-abundance proteins в human liver proteome з multidimensional liquid chromatography. // Proteomics. 2008. T. 8. №5. C. 93947.

81. Garcia-Blanco M. a, Baraniak A.P., Lasda E.L. Абсолютна суперечка в умовах і терапіі. / / Nature biotechnology. 2004. T. 22. № 5. C. 535-46.

82. Gatlin C.L. h ap. Automated Identification of Amino Acid Sequence Variations in Proteins by HPLC/Microspray Tandem Mass Spectrometry // Analytical Chemistry. 2000. T. 72. № 4. C. 757-763.

83. Gobom J. h £p. A Calibration Method That Simplifies and Improves Accurate Determination of Peptide Molecular Masses by MALDI-TOF MS // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 15. C. 3915-3923.

84. Griss J. h ap. Published and Perished? influence of searched protein database on the long-term storage of proteomics data. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. T. 10. №9. C. Ml 11.008490.

85. Grone J. h^p. Різноманітний вираз генів, що викидають тій шлунок білків у барвистий текст: конкретна дисрегуляція claudin-1, -8 і -12. // International journal of colorectal disease. 2007. T. 22. № 6. C. 651-9.

86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), знанняоснови людських генів і genetic disorders. // Nucleic acids research. 2005. T. 33. № Database issue. C. D514-7.

87. Hamosh A. h ap. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). // Human mutation. 2000. T. 15. № 1. C. 57-61.

88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Масс spectrometry for proteomics // Current Opinion in Chemical Biology. 2008. T. 12. №5. C. 483-490.

89. Hedden P. h ap. Gibberellin Biosynthesis in Plants and Fungi: A Case of Convergent Evolution? // Journal of plant growth regulation. 2001. T. 20. №4. C. 319-331.

90. Hopfgartner G. h Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer для аналізу малих молекул і макромолекулярних. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2004. T. 39. № 8. C. 845-55.

91. Huang Y. n flp. Statistical characterization of the charge state and residue dependence of low-energy CID peptide dissociation patterns. // Analytical chemistry. 2005. T. 77. № 18. C. 5800-13.

92. Hubbard T. Ensembl genome database project // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. №1. C. 38-41.

93. Hustert E. h £p. Генетичні фактори CYP3A5 polymorphism. // Pharmacogenetics. 2001. T. 11. № 9. c. 773-9.

94. Ilina E.N. h ^p. Direct bacterial profiling by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for identification of pathogenic Neisseria. // The Journal of molecular diagnostics: JMD. 2009. T. 11. №1. C. 7586.

95. Ingelman-Sundberg M. Human drug metabolising cytochrome P450 enzymes: properties and polymorphisms. // Naunyn-Schmiedeberg"s archives of pharmacology. 2004. T. 369. № 1. C. 89-104.

96. International Human Genome Sequencing Consortium. Відображення euchromatic sequence of human genome. / / Nature. 2004. T. 431. № 7011. C. 931-45.

97. Ishihama Y. h pp. Досліджувано встановлений білкову оболонку index (emPAI) для виміру абсолютної сировини на основі proteínів відповідно до числа послідовних пептидів для proteínів. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 9. C. 1265-72.

98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov скороти і intrinsic mass tolerance для peptide mass fingerprinting. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. №2. C. 737-42.

99. Jeffrey L. Cummings. Genotype-proteotype-phenotype відносини в neurodegenerative diseases. : Springer, 2005.

100. Jenkins R.E. h ap. Відносний і повноцінний expresion profiling cytochromes P450 використовуючи isotope-coded affinity tags. // Proteomics. 2006. T. 6. № 6. C. 1934-47.

101. Jones P. h flp. PRIDE: public repositoiy protein and peptide identifications for proteomics community. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D659-63.

102. Jones P. h flp. PRIDE: нові розробки та нові datasets. // Nucleic acids research. 2008. T. 36. № Database issue. C. D878-83.

103. Kalmar L. h jip. Mutation screening of CI inhibitor gene among Hungarian patients with hereditary angioedema. // Human mutation. 2003. T. 22. № 6. C. 498.

104. Keller A. h ap. Empirical Statistical Model для того, щоб пристосувати додаток до Peptide Identifications Made by MS/MS and Database Search // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 20. C. 5383-5392.

105. Kersey PJ. n jjp. The International Protein Index: an integrated database для proteomics experiments. // Proteomics. 2004. T. 4. № 7. C. 1985-8.

106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: strike against decoy databases. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 8. C. 3354-63.

107. Klie S. h £p. Analyzing великих-шляху proteínових проектів з латентним semantic indexing. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. №1. C. 182-91.

108. Kremer H. h up. Ichthyosis Bullosa of Siemens Is Caused by Mutations в the Keratin 2e Gene. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. №3. C. 286-289.

109. Kuehl P. h ap. Секція diversity в CYP3A promoters і характер genetic basis polymorphic CYP3A5 expresion. / / Nature genetics. 2001. T. 27. №4. C. 383-91.

110. Kuhn R.M. h up. The UCSC Genome Browser Database: update 2009. // Nucleic acids research. 2009. T. 37. № Database issue. C. D755-61.

111. Kuster B. h flp. Маса spectrometry дозволяє пряма identifikation proteins в великих genomes. // Proteomics. 2001. T. 1. № 5. c. 641-50.

112. Lane C.S. h ap. Comparative cytochrome P450 proteomics в краях імунонедостатніх mice використовуючи 180 стабільний isotope етикетці. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2007. T. 6. № 6. C. 953-62.

113. Lane C.S. h, qp. Identification cytochrome P450 enzymes в людському кольоровому metastases і surrounding liver: a proteomic approach. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). 2004. T. 40. № 14. C. 2127-34.

114. Lane E.B., McLean W.H.I. Keratins and skin disorders. // The Journal of pathology. 2004. T. 204. № 4. C. 355-66.

115. Levine a J. P53, Cellular Gatekeeper для Growth and Division. // Cell. 1997. T. 88. №3. C. 323-31.

116. Levy S. h AP-Diploid genome sequence of an individual human. // PLoS biology. 2007. T. 5. № 10. C. e254.

117. Lewis D.F.V. 57 варіантів: людські cytochromes P450. // Pharmacogenomics. 2004. T. 5. №3. C. 305-18.

118. Lim A. h ap. Характеристика Transthyretin варіантів у сімейному Transthyretin Amyloidosis Mass Spectrometric Peptide Mapping and DNA Sequence Analysis // Analytical Chemistry. 2002. T. 74. № 4. C. 741-751.

119. Lim H. Identification of 2D-gel proteins: A comparison of MALDI/TOF peptide mass mapping to p LC-ESI tandem mass spectrometry // Journal of American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. № 9. C. 957-970.

120. Лісіта А.В. h «p. Application of slicing of one-dimensional gels with subsequent slice-by-slice mass spectrometry for proteomic profiling of human liver cytochromes P450. // Journal ofproteome research. 2010. T. 9. №1. C. 95-103.

121. Liu T. h ap. Висока динамічна зміна характеру з trauma пацієнта plasma proteome. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2006. T. 5. № 10. C. 1899-913.

122. Liu T. h/ip. Human Plasma N-Glycoproteome Analysis з Immunoaffinity Subtraction, Hydrazide Chemistry, і Mass Spectrometry // Journal of proteome research. 2005. T. 4. №6. C. 2070-2080.

123. Mallick P. h flp. Computational prediction of proteotypic peptides for quantitative proteomics. //Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 1. C. 125-31.

124. Mann M., Jensen O.N. Proteomic analysis post-translational modifications. / / Nature biotechnology. 2003. T. 21. №3. C. 255-61.

125. Mann M., Wilm M. Error-Tolerant Identification of Peptides in Sequence Databases by Peptide Sequence Tags // Analytical Chemistry. 1994. T. 66. № 24. C. 4390-4399.

126. Marchetti A. h pp. Frequent mutations в neurotrophic tyrosine receptor kinase gene family в великому секторі neuroendocrine carcinoma of the lung. // Human mutation. 2008. T. 29. № 5. C. 609-16.

127. Marichal P. h Contribution of mutations in cytochrome P450 14(alpha)-demethylase (Ergllp, Cyp51p) до azole resistance in Candida albicans // Microbiology. 1999. T. 145. № 10. C. 2701-2713.

128. Martens L. h jxp. PRIDE: proteomics identifications database. // Proteomics. 2005. T. 5. №13. C. 3537-45.

129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomics facing the combinatorial problem. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. C. 175-86.

130. McDonald W.H., Yates J.R. Shotgun proteomics: integrating technologies до answer biological questions. // Current opinion in molecular therapeutics. 2003. T. 5. №3. C. 302-9.

131. Menon R., Omenn G.S. Proteomic characterization of novel alternative splice variant proteins in human epidermal growth factor receptor 2/neu-induced breast cancers. // Cancer research. 2010. T. 70. № 9. C. 3440-9.

132. Menschaert G. h £p. Peptidomics coming of age: review з contributions від bioinformatics angl. // Journal of proteome research. 2010. T. 9. №5. C. 205161.

133. Millar D.S. h Три novel missense mutations в антитромбін III (AT3) gene causing recurrent venous thrombosis. // Human genetics. 1994. T. 94. № 5. C. 509-12.

134. Міронов А.А. Frequent Alternative Splicing of Human Genes // Genome Research. 1999. T. 9. № 12. C. 1288-1293.

135. Modrek B. Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes //Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 13. C. 2850-2859.

136. Mueller M. h ap. Analysis of the experimental detection of central nervous system-related genes in human brain and cerebrospinal fluid datasets. // Proteomics. 2008. T. 8. №6. C. 1138-48.

137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker"s guide to expresed sequence tag (EST) analysis. // Briefings in bioinformatics. 2007. T. 8. № 1. C. 621.

138. Nedelkov D. Population proteomics: Investigation of protein diversity in human populations // Proteomics. 2008. T. 8. №4. C. 779-86.

139. Nedelkov D. h ap. High-throughput comprehensive analysis of human plasma proteins: a step доward population proteomics. // Analytical chemistry. 2004. T. 76. № 6. C. 1733-7.

140. Nedelkov D. h ^p. Investigating diversity в human plasma proteins. // Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America. 2005. T. 102. № 31. C. 10852-7.

141. Несвіжскій А.І. Protein identification by tandem mass spectrometry and sequence database searching. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. C. 87-119.

142. Несвіжскій А.І., Вітек О., Аеберсолд Р. Analysis і validation proteomic data generated by tandem mass spectrometry // Nature Methods. 2007. T. 4. №10. C. 787-797.

143. Ng P.C. h flp. Genetic Variation in an individual human exome // PLoS Genetics. 2008. T. 4. №8.

144. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. / / Nature chemical biology. 2005. T. 1. № 5. c. 252-62.

145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Optimizing search conditions for mass fingerprint-based identification of proteins. // Proteomics. 2006. T. 6. № 7. C. 2079-85.

146. Overbeek R. h, np. Annotation of bacterial and archaeal genomes: Improving accuracy and consistency. // Chemical reviews. 2007. T. 107. № 8. C. 3431-47.

147. Pedrioli P.G.A. Trans-proteomic pipeline: pipeline для proteomic analysis. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 213-38.

148. Perkins D.N. h ^p. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. T. 20. № 18. C. 3551-3567.

149. Perry DJ, Carrell R.W. Молекулярні генетики людської антитромбінової недостатності. // Human mutation. 1996. T. 7. №1. C. 7-22.

150. Petrak J. h ap. Déjà vu in proteomics. Причому розрізнено помітно identified differentially expressed proteins. // Proteomics. 2008. T. 8. № 9. C. 1744-9.

151. Pevzner P.A. h / ip. Efficiency of database search for identification of mutated and modified proteins via mass spectrometry. // Genome research. 2001. T. 11. № 2. C. 290-9.

152. Porter CJ, Talbot CC, Cuticchia AJ. Central mutation databases-a review. // Human mutation. 2000. T. 15. №1. C. 36-44.

153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Чи є gene-centric human proteome project the best way for proteomics to serve biology? // Proteomics. 2010. C. 1-6.

154. Rappsilber J. h £p. Великий-кількість proteomic analysis of human spliceosome. // Genome research. 2002. T. 12. № 8. C. 1231-45.

155. Redlich G. h zip. Відмінність між людським cytochrome P450 (CYP) ізоформи і виявлення нових фосфоріляційних вузлів з масою спектрометрії. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. № 11. C. 4678-88.

156. Reid G.E., McLuckey S.A. "Top down" proteín characterization via tandem mass spectrometiy. // Journal of mass spectrometry: JMS. 2002. T. 37. № 7. C. 663-75.

157. Rodriguez C. h zip. Proteotyping людського haptoglobin по MALDI-TOF profiling: phenotype distribution в population of toxic oil syndrome patients. // Proteomics. 2006. T. 6. C. S272-81.

158. Roher A. h zip. Structural alterations в пептиді backbone beta-amyloid core proteín може бути для його втрату і stability в Alzheimer's disease // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. № 5. c. 3072-3083.

159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simulation and prediction of vivo drug metabolism in human populations from in vitro data. / / Nature reviews. Drug discovery. 2007. T. 6. №2. C. 140-8.

160. Roth MJ. h zip. "Proteotyping": population proteomics людських леукоцитів використовуючи top down mass spectrometry. // Analytical chemistry. 2008. T. 80. № 8. C. 285766.

161. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14alpha-Demethylase (CYP51) та Spermatogenesis // Drug Metab. Dispos. 1998. T. 26. № 12. C. 1199-1201.

162. Rubina A.Y. h zip. Why 3-D? Gel-based microarrays в proteomics. // Proteomics. 2008. T. 8. №4. C. 817-31.

163. Садигов R.G., Cociorva D., Iii J.R.Y. Великий-шаровий 데이터베이스 searching using tandem mass spectra: Використовуючи повідомлення в back of the book // Nature Methods. 2004. T. 1. №3. C. 195-202.

164. Sarkozy A. h zip. Німецькі BRAF мутації в Noonan, LEOPARD, і кардіофазіоcutaneous syndromes: молекулярної diversity і поєднані phenotypic spectrum. // Human mutation. 2009. T. 30. №4. C. 695-702.

165. Sattelle D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Вміст геномів: Challenges and opportunities for neuroscience. //Invertebrate neuroscience: IN. 2007. T. 7. №3. C. 133-6.

166. Schandorff S. h, np. Як маса spektrometry-friendly database for cSNP identification. //Nature methods. 2007. T. 4. №6. C. 465-6.

167. Schmuth M. h Ichthyosis update: доwards function-driven model pathogenesis disorders cornification and role corneocyte proteins in these disorders. //Advances in dermatology. 2007. T. 23. C. 231-56.

168. Schweigert FJ, Wirth K., Raila J. Характеристика microheterogeneity transthyretin в plasma і urine використовуючи SELDI-TOF-MS імуноassay. // Proteome science. 2004. T. 2. №1. C. 5.

169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Improving sensitivity by probabilistically з'єднує результати з різних MS/MS search metodologies. // Journal of proteome research. 2008. T. 7. №1. C. 245-53.

170. Seo J., Lee K.-J. Post-translational modifications and їх біологічних функцій: proteomic analysis і systematic approaches. // Journal of biochemistry and molecular biology. 2004. T. 37. №1. C. 35-44.

171. Sherry S.T. dbSNP: NBC Database of genetic variation // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. № 1. C. 308-311.

172. Шевченко А. h jp. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins від Silver-Stained Polyacrylamide Gels // Analytical Chemistry. 1996. T. 68. №5. C. 850858.

173. Shi W.-feng h up. Proteotyping: Нові методи дослідження influenza virus evolution на proteínовому рівні // Virologica Sinica. 2008. T. 22. № 5. C. 405-411.

174. Shteynberg D. h np. iProphet: Multi-level integrative analysis of shotgun proteomic data improves peptide and protein identification rates and error estimates. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.

175. Smigielski E.M. dbSNP: Database of single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. № 1. C. 352-355.

176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. З'єднання між splicing and cancer. // Journal of cell science. 2006. T. 119. № Pt 13. C. 2635-41.

177. Stamm S. h zip. ASD: bioinformatics resource on alternative splicing. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D46-55.

178. Stein P.E., Carrell R.W. What do dysfunctional serpins tell us про molecular mobility and disease? //Nature Structural Biology. 1995. T. 2. № 2. C. 96-113.

179. Supek F. n zip. Збільшена аналітична енергія SDS-PAGE використовує техніку розпізнавання algoritms. // Proteomics. 2008. T. 8. №1. C. 28-31.

180. Taylor C.F. Minimum reporting requirements for proteomics: a MIAPE primer. // Proteomics. 2006. T. 6 Suppl 2. C. 39-44.

181. Taylor C.F. h zip. Мінімальна інформація про proteomics experiment (MIAPE). / / Nature biotechnology. 2007. T. 25. № 8. C. 887-93.

182. Thiede B. h zip. Peptide mass fingerprinting. //Методи (San Diego, Calif.). 2005. T. 35. №3. C. 237-47.

183. Цвєтков П.О. h zip. Isomerization of Asp7 residue results in zinc-induced oligomerization of Alzheimer's disease amyloid beta(l-16) peptide.// Chembiochem: European journal of chemical biology. .

184. Uhlen M. h zip. А людський proteín atlas для normal і cancer tissues базується на antibody proteomics. // Molecular & cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. № 12. C. 1920-32.

185. Ullrich A. h zip. CANCER-RELATED PROTEIN KINASES // US Patent App. 12/. 2007.

186. Venter J.C. h zip. Sequence of the human genome. // Science (New York, N.Y.). 2001. T. 291. № 5507. C. 1304-51.

187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Proteomics data repositories: Забезпечуючи безпечний для вашого часу і працюючи як jarboard для різних досліджень // Journal of Proteomics. 2010. C. 1-11.

188. W Vogel K. h zip. Розвиток assays для kinase drug discovery where have advances come from? // 2007.

189. Westlind-Johnsson A. Comparative analysis CYP3A expression в людській природі suggests тільки minor role для CYP3A5 в drug metabolism // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. №> 6. C. 755-761.

190. Wheeler D.L. h zip. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. //Nucleic acids research. 2007. T. 35. № Database issue. C. D5-12.

191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications. //Nature reviews. Cancer. 2009. T. 9. №2. C. 95-107.

192. Wilkins M.R. h / ip. З Proteins до Proteomes: Великий Scale Protein Identification by 2-Dimensional Electrophoresis and Amino Acid Analysis // Bio/Technology. 1996. T. 14. №1. C. 61-65.

193. Wu C.H. h ap. Universal Protein Resource (UniProt): an expanding universe of protein information. // Nucleic acids research. 2006. T. 34. № Database issue. C. D187-91.

194. Yates J R., Eng JK, McCormack A.L. Mining Genomes: Correlating Tandem Mass Spectra of Modified and Unmodified Peptides to Sequences in Nucleotide Databases // Analytical Chemistry. 1995. T. 67. № 18. C. 3202-3210.

195. Yip Y.L. h Застосування єдиного амінохімічного polymorphisms в UniProt/Swiss-Prot знанняоснови. // Human mutation. 2008. T. 29. № 3. C. 3616.

196. Zanger U.M. h ap. Polymorphic CYP2B6: молекулярні механізми і випромінювання клінічної значущості. //Pharmacogenomics. 2007. T. 8. № 7. C. 743-59.

197. Zgoda V.G. h £p. Proteomics mouse liver microsomes: Діяльність різних proteínових відокремлення workflows for LC-MS/MS. // Proteomics. 2009. T. 9. №16. C. 4102-5.

198. Zhou H. h ap. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and spectromometry. //Nature biotechnology. 2002. T. 20. № 5. C. 512-5.

199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Electron capture/transfer versus collisionally activated/induced dissociations: solo or duet? // Journal of American Society for Mass Spectrometry. 2008. T. 19. № 6. C. 753-61.

Зверніть увагу, наведені вище наукові тексти розміщені для ознайомлення та отримані за допомогою розпізнавання оригінальних текстів дисертацій (OCR). У зв'язку з чим у них можуть бути помилки, пов'язані з недосконалістю алгоритмів розпізнавання. У PDF файлах дисертацій та авторефератів, які ми доставляємо, таких помилок немає.

Книжка являє собою перший навчальний посібник російською мовою з основ мас-спектрометрії білків та пептидів. Мета справжнього видання – зацікавити молодих дослідників інформативною, красивою та затребуваною у всьому світі дисципліною, дати можливість більш ефективно застосовувати мас-спектрометрію для вирішення фундаментальних та прикладних наукових завдань. Книга написана у форматі лекцій для початківців, добре ілюстрована та супроводжується представницьким списком цитованої літератури.

Видання розраховане на студентів та аспірантів хімічних, фізико-хімічних, біологічних та медичних спеціальностей; буде корисно науковим співробітникам, які вже працюють у галузі досліджень білків і пептидів або цікавиться цим науковим напрямом.

		7
Використані скорочення		9
Вступ		11
Глава 1. Методи іонізації молекул пептидів та білків		14
1.1. Бомбардування швидкими атомами БВА (Fast Atom Bombardment, FAB)		14
1.2. Матрично-активована лазерна десорбція/іонізація, МАЛДІ (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16
1.3. Іонізація електророзпорошенням, ІЕР (Electrospray Ionization, ESI)		19
Глава 2. Вимірювання молекулярної маси пептидів та білків		25
Глава 3. Встановлення первинної структури пептидів		34
3.1. Деградація за Едманом		34
3.2. Ідентифікація пептидів по сіквенсу кДНК		36
3.3. Леддерне секвенування		37
Глава 4. Мас-спектрометричне секвенування		39
4.1. Номенклатура фрагментних іонів пептидів		39
4.2. Мас-спектри негативних іонів		45
4.3. Методи ініціювання фрагментації молекулярних іонів 46
4.3.1. Дисоціація, активована сусудненнями, ДАС (Collisionally Activated Dissociation, CAD)		47
4.3.2. Дисоціація індукована зіткненнями з поверхнею, ДІП (Surface Induced Dissociation (SID)		56
4.3.3. Дисоціація під час захоплення електрона, ДЗЕ(Electron Capture Dissociation, ECD)		59
4.3.4. Дисоціація при перенесенні електрона, ДПЕ(Electron Transfer Dissociation, ETD)		64
4.3.5. Фотоактивація дисоціації		65
4.3.6. Дисоціація, активована електронами		69
4.3.7. Дисоціація негативних іонів при відриві електрона		70
4.4. Методи секвенування пептидів на приладах з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією		71
4.4.1. Метод затриманої екстракції. Розпад у джерелі, РВІ (In Source Decay, ISD)		71
4.4.2. Розпад поза джерелом, РПИ (Post Source Decay, PSD)		72
Глава 5. Ідентифікація білків та пептидів		7 6
5.1. Ідентифікація з використанням баз даних		76
5.1.1. Метод ідентифікації білків "знизу догори"("Bottom-up")		76
5.1.2. Метод ідентифікації білків "згори донизу"("Top-down")		91
5.2. Ручна ідентифікація пептидів		94
Глава 6. Основні складності мас-спектрометричного секвенування пептидів та шляхи їх подолання		97
6.1. Покриття сіквенсу		98
6.2. Амінокислоти з однаковою цілою масою		102
6.2.1. Лізин та глутамін		102
6.2.2. Фенілаланін та окислений метіонін		104
6.3. Ізомерні амінокислоти: лейцин та ізолейцин		106
6.4. Циклізація коротких пептидів		108
6.5. Пептиди, що містять дисульфідний зв'язок		116
Глава 7. Використання для секвенування мас-спектрів негативних іонів		121
Глава 8. Кількісний аналіз білків з використанням високоефективної рідинної хроматографії мас-спектрометрії. Кількісна протеоміка		126
8.1. Порівняльна (кількісна) протеоміка		129
8.1.1. Безізотопний метод		129
8.1.2. Ізотопні методи		132
8.2. Встановлення абсолютних кількостей		145
Список літератури		149
Додаток. Bruker: Багатовимірний шлях до розгадки протеома		163

Передмова

Присвячується
професорам хімічного факультету
МДУ ім. М.В. Ломоносова
Олександру Леонідовичу Курцю
Кіму Петровичу Бутіну

Найважливіші досягнення мас-спектрометрії за останні 20 років пов'язані з дослідженнями природних сполук, включаючи біополімери. З появою методів іонізації електророзпорошенням та матрично-активованої лазерної десорбції/іонізації для мас-спектрометрії стали доступні цукри, нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди та інші біоорганічні макромолекули. Безперечно, найбільших успіхів вдалося досягти у дослідженні білків. Завдяки чутливості, інформативності, експресності, можливості працювати із сумішами, мас-спектрометрія сьогодні – основний метод аналізу цих складних для вивчення об'єктів.

Мабуть, можна визнати, що сучасна мас-спектрометрія виграла конкурентну боротьбу з класичним методом встановлення первинної послідовності амінокислот у пептидах за Едманом, оскільки мас-спектрометричне секвенування виявилося суттєво швидше, чутливіше, інформативно і навіть дешевше. Швидке та надійне визначення первинної структури білків, тобто. послідовності амінокислотних ланок, саме собою вже чудовий результат. Однак мас-спектрометрія здатна вивчати структури складніших порядків (від 2 до 4), включаючи нековалентні взаємодії білків з появою надбілкових утворень, встановлювати тип і місце посттрансляційних модифікацій, працювати з глікопротеїни, ліпопротеїни, фосфопротеїни і т.д. Мас-спектрометрія стала незамінною в медицині, оскільки здатна швидко та надійно діагностувати серцево-судинні, генетичні та онкологічні захворювання. Саме успіхи мас-спектрометрії призвели до формування наприкінці минулого століття нового наукового спрямування – протеоміки. Величезною є роль методу і в метаболоміці.

На жаль, у російськомовній літературі досі не існувало навчальних посібників чи монографій щодо цієї найважливішої та багатогранної за своїм застосуванням тематики. Росія кардинально відстає від розвинутих країн і вивчення цієї дисципліни, і використання її досягнень. Мас-спектрометристам, які працюють у Росії, доводиться орієнтуватися на англомовні видання книг, оригінальні статті та огляди. У 2012 р. російською мовою було видано книгу "Принципи мас-спектрометрії в додатку до біомолекул" під редакцією Дж. Ласкін і X. Ліфшиц (переклад з англійської, вид-во "Техносфера"), що є збіркою статей провідних фахівців в області мас-спектрометрії у додатку до біології. Книжка розрахована на підготовлених читачів. Вона надає

хорошу, багато в чому, заочну можливість познайомитися з сучасними досягненнями в галузі мас-спектрометрії біомолекул, оскільки більшість методів, що описуються в ній, поки не використовується в нашій країні.

Пропонована читачам книга "Основи мас-спектрометрії білків та пептидів" є першим навчальним посібником російською мовою, що викладає основи мас-спектрометрії білків та пептидів. Книга написана у форматі лекцій для початківців, ілюстрована великою кількістю малюнків, спектрів, схем та супроводжується представницьким списком цитованої літератури. Вона розрахована на студентів та аспірантів хімічних, фізико-хімічних, біологічних та медичних спеціальностей; буде корисна науковим співробітникам, які вже працюють у галузі досліджень білків і пептидів або цікавиться цим науковим напрямом.

Мета видання такої книги – зацікавити молодих дослідників інформативною, дуже гарною та затребуваною у всьому світі дисципліною, дати можливість більш ефективно застосовувати мас-спектрометрію для вирішення своїх власних фундаментальних та прикладних наукових завдань.

Основну увагу у навчальному посібнику приділено методам іонізації білків та пептидів, процесам фрагментації цих сполук у газовій фазі. Досить докладно розглядаються питання тандемної мас-спектрометрії, існуючі методи ініціювання фрагментації. Цей розділ дуже важливий у сучасній мас-спектрометрії. Він корисний для дослідників, які працюють з будь-якими хімічними сполуками та біополімерами. Декілька розділів присвячені ідентифікації білків і пептидів. Сюди входять варіанти автоматизованої ідентифікації, розшифрування спектрів вручну, опис певних складнощів мас-спектрометричного секвенування та варіантів їх подолання. Розглянуто переваги та недоліки двох основних підходів встановлення хімічної структури білків: мас-спектрометрії "зверху-вниз" та "знизу-вгору". Окрема глава присвячена питанням кількісного аналізу.

Книга присвячена Олександру Леонідовичу Курцю та Кіму Петровичу Бутіну, двом друзям, чудовим професорам хімічного факультету Московського державного університету імені М.В. Ломоносова, дуже близьких нам у людському відношенні, які безпосередньо брали участь у нашій хімічній та гуманітарній освіті. Ми завжди високо оцінювали хімічну ерудицію та приголомшливі особисті якості цих вчених. Саме спілкування з цими людьми надихнуло нас на початку ХХІ століття розпочати дослідження в галузі мас-спектрометрії пептидів.

А.Т. Лебедєв
К.А. Артеменко
Т.Ю. Самгіна

Найбільш характерними фізико-хімічними властивостями білків є: висока в'язкість розчинів, незначна дифузія, здатність до набухання у великих межах, оптична активність, рухливість в електричному полі, низький осмотичний тиск та високий онкотичний тиск, здатність до поглинання УФ-променів при 280 нм (це остання властивість, обумовлена наявністю в білках ароматичних амінокислот, використовується для кількісного визначення білків).

Білки, як і амінокислоти, амфотерні завдяки наявності вільних NH2-і СООН-груп і характеризуються відповідно всіма св-вами кислот та основ.

Білки мають явно виражені гідрофільні властивості. Їхні розчини мають дуже низький осмотичний тиск, високу в'язкість і незначну здатність до дифузії. Білки здатні набухання в дуже великих межах.

З колоїдним станом білків пов'язаний ряд характерних властивостей, зокрема явище світлорозсіювання, що лежить в основі кількісного визначення білків методом нефелометрії. Цей ефект використовується, крім того, у сучасних методах мікроскопії біологічних об'єктів. Молекули білка не здатні проходити через напівпроникні штучні мембрани (целофан, пергамент, колодій), а також біомембрани рослинних і тваринних тканин, хоча при органічних ураженнях, наприклад нирок, капсула ниркового клубочка (Шумлянського-Боумена) стає проникною для альбумінів сироватки. вони з'являються у сечі.

Денатурація білка під впливом різних фізичних та хімічних факторів білки піддаються зсіданню і випадають в осад, втрачаючи нативні властивості. Таким чином, під денатурацією слід розуміти порушення загального плану - унікальної структури нативної молекули білка, що призводить до втрати характерних для неї властивостей (розчинності, електрофоретичної рухливості, біологічної активності і т. д.). Більшість білків денатурують при нагріванні їх розчином вище 50-60о С. Зовнішні прояви денатурації зводяться до втрати розчинності, особливо в ізоелектричній точці, підвищення в'язкості білкових розчинів, збільшення кількості вільних функціональних SH-rpyпп та зміни характеру розсіювання рентген. Найбільш характерною ознакою денатурації є різке зниження або повна втрата білком його біологічної активності (каталітичної антигенної або гормональної). білкових молекул і утворюються випадкові та безладні структури.

висолення: осадження солями лужних, лужноземельних металів (хлорид натрію, сульфат магнію), сульфатом амонію; у своїй не порушується первинна структура білка;

осадження: використання водовіднімних речовин: спирт або ацетон за низьких температур (близько –20 С).

При використанні цих методів білки позбавляються гідратної оболонки та випадають в осад у розчині.

Денатурація- Порушення просторової структури білків (первинна структура молекули зберігається). Може бути оборотна (структура білка відновлюється після усунення агента, що денатурує) або незворотна (просторова структура молекули не відновлюється, наприклад, при осадженні білків мінеральними концентрованими кислотами, солями важких металів).

Методи поділу білків Відділення білків від низькомолекулярних домішок

Діаліз

Використовують спеціальну полімерну мембрану, яка має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а великі (білки) затримуються. Таким чином, білки відмивають від домішок.

Поділ білків за молекулярною масою

Гель-хроматографія

Хроматографічну колонку заповнюють гранулами гелю (сефадекс), що має пори певної величини. У колонку вносять суміш білків. Білки, розмір яких менший, ніж розмір пір сефадекса, затримуються в колонці, оскільки «застрягають» у порах, а інші вільно виходять із колонки (рис. 2.1). Розмір білка залежить з його молекулярної маси.

Мал. 2.1.Поділ білків методом гель-фільтрації

Ультрацентрифугування

Цей метод ґрунтується на різній швидкості седиментації (осадження) білкових молекул у розчинах з різним градієнтом щільності (сахарозний буфер або хлорид цезію) (рис. 2.2).

Мал. 2.2.Поділ білків методом ультрацентрифугування

Електрофорез

Даний метод ґрунтується на різній швидкості міграції білків та пептидів в електричному полі залежно від заряду.

Носіями для електрофорезу можуть бути гелі, ацетатцелюлоза, агар. Молекули, що розділяються, рухаються в гелі залежно від розміру: ті з них, які мають більші розміри, будуть затримуватися при проходженні через пори гелю. Найменші молекули зустрічатимуть менший опір і, відповідно, рухатимуться швидше. В результаті, після проведення електрофорезу, більші молекули будуть ближче до старту, ніж менші (рис. 2.3).

Мал. 2.3. Поділ білків методом електрофорезу в гелі

Методом електрофорезу можна розділити білки і молекулярної масі.Для цього використовують електрофорез у ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (ДДS-Na).

Виділення індивідуальних білків

Афінна хроматографія

Метод заснований на здатності білків міцно зв'язуватися з різними нековалентними молекулами зв'язками. Використовується для виділення та очищення ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків.

Молекули речовин (ліганди), з якими зв'язуються специфічно певні білки, ковалентно з'єднують з частинками інертної речовини. Суміш білків вносять у колонку, і білок, що шукається, міцно приєднується до ліганду. Інші білки вільно виходять із колонки. Затриманий білок можна вимити з колонки за допомогою буферного розчину, що містить у вільному стані ліганд. Цей високочутливий метод дозволяє виділити в чистому вигляді дуже малі кількості білка клітинного екстракту, що містить сотні інших білків.

Ізоелектрофокусування

Метод заснований на різній величині ІЕТ білків. Білки розділяють методом електрофорезу на пластині з амфоліном (це речовина, у якої заздалегідь сформовано градієнт pH в діапазоні від 3 до 10). При електрофорезі білки поділяються відповідно до значення їх ІЕТ (в ІЕТ заряд білка дорівнюватиме нулю, і він не пересуватися в електричному полі).

Двовимірний електрофорез

Є поєднанням ізоелектрофокусування і електрофорезу з ДДС-Na. Проводять спочатку електрофорез у горизонтальному напрямку на пластині з амфоліном. Білки поділяються залежно від заряду (ІЕТ). Потім обробляють пластину розчином ДДС-Na та проводять електрофорез у вертикальному напрямку. Білки поділяються залежно від молекулярної маси.

Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)

Аналітичний метод, який використовується визначення специфічних білків у зразку (рис 2.4).

Виділення білків із біологічного матеріалу.

Поділ білків за молекулярною масою методом електрофорезу в ПААГ із ДДС-Na.

Перенесення білків із гелю на полімерну пластину з метою полегшення подальших робіт.

Обробка пластини розчином неспецифічного білка для заповнення пір, що залишилися.

Таким чином, після цього етапу отримана пластинка, у порах якої містяться розділені білки, а простір між ними заповнений неспецифічним білком. Тепер треба виявити, чи серед білків є шуканий, відповідальний за якесь захворювання. Для виявлення використовують обробку антитілами. Під первинними антитілами розуміють антитіла до білка. Під вторинними антитілами розуміють антитіла до первинних антитіл. До складу вторинних антитіл додатково вводять спеціальну мітку (т.зв. молекулярний зонд), щоб потім можна було візуалізувати результати. Як мітки використовуються радіоактивний фосфат або фермент, що міцно пов'язані з вторинним антитілом. Зв'язування спочатку з первинними, а потім із вторинними антитілами переслідує дві мети: стандартизація методу та покращення результатів.

Обробка розчином первинних антитіл  зв'язування відбувається там пластини, де є антиген (шуканий білок).

Видалення антитіл, що не зв'язалися (промивання).

Обробка розчином мічених вторинних антитіл для подальшого прояву.

Видалення вторинних антитіл (промивання), що не зв'язалися.

Мал. 2.4. Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)

У разі присутності білка в біологічному матеріалі – на платівці з'являється смуга, що свідчить про зв'язування цього білка з відповідними антитілами.

Аналіз науково-технічного доробку в галузі високочутливих протеомних технологій

Методи діагностики гепатиту

АСМ-чіпи

-ідентифікація білків, виловлених за допомогою "хімічного фішингу" на поверхню АСМ-чіпа з розчину аналіту

Рекомендований список дисертацій

Посттрансляційне регулювання цитохромів Р450 підродини 2В 2013 рік, доктор біологічних наук Згода, Віктор Гаврилович

Мас-спектрометричне визначення активності та вмісту цитохромів P450 2013 рік, кандидат біологічних наук Москальова, Наталія Євгенівна

Структурно-функціональне картування білків цитохром Р450 містять монооксигеназних систем 2002 рік, доктор біологічних наук Колесанова, Катерина Федорівна

Метод розпізнавання амінокислотних послідовностей у мас-спектрах пептидів для протеоміки задач 2007 рік, кандидат технічних наук Лютвинський, Ярослав Ігорович

Введення дисертації (частина автореферату) на тему "Аналіз мас-спектрів пептидних фрагментів для ідентифікації генетично детермінованого поліморфізму білків"

Подібні дисертаційні роботи за спеціальністю "Математична біологія, біоінформатика", 03.01.09 шифр ВАК

Транскриптомно-протеомний підхід для аналізу протеоформ клітинної лінії HepG2 2018 рік, кандидат біологічних наук Кисельова, Ольга Ігорівна

Оцінка пластичності протеома плазми крові здорової людини в екстремальних умовах життєдіяльності 2011 рік, кандидат біологічних наук Трифонова, Оксана Петрівна

Пошук та ідентифікація потенційних біомаркерів раку яєчників у сироватці крові людини 2015 рік, кандидат біологічних наук Арапіді, Георгій Павлович

Висновок дисертації на тему «Математична біологія, біоінформатика», Чорнобровкін, Олексій Леонідович

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Чернобровкін, Олексій Леонідович, 2012 рік

Передмова

Методи поділу білків Відділення білків від низькомолекулярних домішок

Поділ білків за молекулярною масою

Аналіз науково-технічного доробку в галузі високочутливих протеомних технологій

Методи діагностики гепатиту

АСМ-чіпи

-ідентифікація білків, виловлених за допомогою "хімічного фішингу" на поверхню АСМ-чіпа з розчину аналіту

Рекомендований список дисертацій

Посттрансляційне регулювання цитохромів Р450 підродини 2В 2013 рік, доктор біологічних наук Згода, Віктор Гаврилович

Мас-спектрометричне визначення активності та вмісту цитохромів P450 2013 рік, кандидат біологічних наук Москальова, Наталія Євгенівна

Структурно-функціональне картування білків цитохром Р450 містять монооксигеназних систем 2002 рік, доктор біологічних наук Колесанова, Катерина Федорівна

Метод розпізнавання амінокислотних послідовностей у мас-спектрах пептидів для протеоміки задач 2007 рік, кандидат технічних наук Лютвинський, Ярослав Ігорович

Введення дисертації (частина автореферату) на тему "Аналіз мас-спектрів пептидних фрагментів для ідентифікації генетично детермінованого поліморфізму білків"

Подібні дисертаційні роботи за спеціальністю "Математична біологія, біоінформатика", 03.01.09 шифр ВАК

Транскриптомно-протеомний підхід для аналізу протеоформ клітинної лінії HepG2 2018 рік, кандидат біологічних наук Кисельова, Ольга Ігорівна

Оцінка пластичності протеома плазми крові здорової людини в екстремальних умовах життєдіяльності 2011 рік, кандидат біологічних наук Трифонова, Оксана Петрівна

Пошук та ідентифікація потенційних біомаркерів раку яєчників у сироватці крові людини 2015 рік, кандидат біологічних наук Арапіді, Георгій Павлович

Висновок дисертації на тему «Математична біологія, біоінформатика», Чорнобровкін, Олексій Леонідович

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Чернобровкін, Олексій Леонідович, 2012 рік

Передмова

Методи поділу білків Відділення білків від низькомолекулярних домішок

Поділ білків за молекулярною масою

Читайте також