480 de ruble. | 150 UAH | 7,5 USD ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Disertație - 480 RUR, livrare 10 minute, non-stop, șapte zile pe săptămână și sărbători

Kaisheva, Anna Leonidovna. Identificarea spectrometrică de masă a proteinelor și a complexelor proteice pe cipurile microscopului de forță atomică: disertație... Candidat la științe biologice: 01/03/04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Locul de protecție: Cercetare științifică. Institutul de Biomed. chimie numită după V.N. Orekhovich RAMS]. - Moscova, 2010. - 104 p.: ill. RSL OD, 61 10-3/1308

Introducere

Capitolul 1. Revizuirea literaturii 10

1.1. Analiza progresului științific și tehnic în domeniul tehnologiilor proteomice extrem de sensibile

1.2 Caracteristicile virusului hepatitei C 20

1.2.1 Metode de diagnosticare a hepatitei C 22

1.2.2 Markeri proteici serologici ai hepatitei C 25

Capitolul 2. Materiale și metode 28

2.1 cipuri AFM 28

2.2 Preparate proteice și reactivi 29

2.3 Analiza AFM 30

2.4 Pregătirea probelor pentru analiza spectrometrică de masă 31

2.5 Analiza spectrometrică de masă 33

2.5.1 Analiza MALDI-MS a proteinelor de pe suprafața unui cip AFM 33

2.5.2 Analiza ESI-MS a proteinelor de pe suprafața unui cip AFM 34

Capitolul 3. Rezultate și discuții 35

3.1 MS - identificarea proteinelor prinse folosind „phishing chimic” pe suprafața unui cip AFM dintr-o soluție de analit

3.2 Identificarea MS a proteinelor capturate biospecific pe suprafața unui cip AFM dintr-o soluție de analit

3.3 Identificarea MS a proteinelor de pe suprafața unui cip AFM, capturate biospecific din probe de ser de sânge

Concluzia 83

Literatură

Introducere în lucrare

Relevanța lucrării.

Una dintre domeniile prioritare în biochimia modernă este crearea de metode analitice eficiente pentru analiza proteomică, a căror sarcină principală este să detecteze și să inventarieze proteinele organismului, să studieze structura, funcțiile acestora și să identifice interacțiunile dintre proteine. Rezolvarea acestei probleme va face posibilă crearea de noi sisteme pentru diagnosticarea bolilor și tratamentul acestora. Metodele standard de analiză proteomică modernă se bazează pe separarea amestecurilor de proteine ​​multicomponente folosind cromatografia, electroforeza în combinație cu metodele spectrometrice de masă (MS) pentru identificarea proteinelor. În ciuda avantajelor neîndoielnice ale analizei MS standard în ceea ce privește viteza și fiabilitatea identificării moleculelor de proteine, aceasta are limitări semnificative în utilizarea sa datorită

sensibilitatea la concentrare a analizei la nivelul de 10" "10" M și un interval dinamic ridicat de conținut de proteine ​​​​în materialul biologic. În același timp, numărul copleșitor de proteine ​​​​funcționale, inclusiv biomarkeri ai unor astfel de boli semnificative din punct de vedere social precum hepatita virală B și C, markeri tumorali etc., sunt prezenți în plasma sanguină în intervalul de concentrație de 10" Mi mai puțin.

Una dintre modalitățile de a depăși această limitare metodologică a sensibilității la concentrație a analizei este utilizarea detectorilor biomoleculari, care fac posibilă înregistrarea moleculelor individuale și a complexelor acestora și, teoretic, nu au limitări în sensibilitatea la concentrație. Detectoarele biomoleculare includ detectoare bazate pe dispozitive nanotehnologice, cum ar fi microscoape de forță atomică (AFM), detectoare de nanofir, nanopori și o serie de alți detectoare. Sensibilitatea unică a detectorilor AFM face posibilă vizualizarea moleculelor de proteine ​​individuale și numărarea numărului acestora. Când se utilizează AFM ca detector biomolecular, este necesar să se utilizeze cipuri speciale care să permită concentrarea macromoleculelor de analiți biologici dintr-un volum mare de soluție de incubare pe o suprafață limitată a cipului. Obiectele proteice studiate pot fi concentrate pe suprafața cipului atât datorită adsorbției fizice sau chimice, cât și datorită interacțiunilor biospecifice (phishing AFM-biospecific).

Cu toate acestea, în practică, o limitare a utilizării nanodetectorilor bazați pe AFM este că, în ciuda capacității de a vizualiza molecule de proteine ​​individuale pe suprafața unui cip, astfel de detectoare nu sunt capabile să le identifice, ceea ce este deosebit de important în studiul complexului. amestecuri de proteine, inclusiv material biologic. Prin urmare, dezvoltarea unei metode de analiză care să completeze capacitățile metodei AFM pare a fi o sarcină urgentă. Până în prezent, singura metodă proteomică care permite identificarea fără ambiguitate și fiabilă a moleculelor de proteine ​​este analiza MS. Lucrarea de disertație a dezvoltat o abordare care combină sensibilitatea ridicată a metodei AFM și identificarea MS fiabilă pentru detectarea proteinelor și a complexelor acestora dintr-o soluție de analit.

Scopul și obiectivele studiului.

Scopul acestei lucrări a fost identificarea spectrometrică de masă a proteinelor și a complexelor proteice identificate în biomateriale folosind microscopia cu forță atomică.

Pentru a atinge acest obiectiv, au fost rezolvate următoarele sarcini:

A fost dezvoltată o schemă pentru identificarea MS a proteinelor prinse pe suprafața unui cip AFM folosind phishing chimic sau biospecific;

Au fost dezvoltate condiții pentru hidroliza enzimatică a proteinelor pe suprafața unui cip AFM pentru identificarea ulterioară a MS;

Identificarea MS a proteinelor model pe suprafața unui cip AFM a fost efectuată;

S-a efectuat identificarea MS a proteinelor de pe suprafața unui cip AFM, capturate biospecific dintr-un amestec multicomponent (ser).

Noutatea științifică a lucrării .

Dizertația a dezvoltat o schemă care permite identificarea MS a proteinelor și a complexelor proteice capturate dintr-o soluție sau un amestec multicomponent de pe suprafața unui cip AFM. În acest scop, au fost selectate condiții optime de preparare a probei, inclusiv modul de hidroliză (temperatura, umiditatea, compoziția amestecului tripsinolitic, timpul de tripsinoliză) a moleculelor de proteine ​​imobilizate covalent și necovalent pe suprafața cipului AFM. Particularitatea acestei lucrări a fost că, în comparație cu protocoalele proteomice standard pentru hidroliza enzimatică, pregătirea probelor pentru analiza MS a fost efectuată nu în soluție, ci într-o zonă limitată.

suprafața așchiilor. Schema dezvoltată a făcut posibilă efectuarea eficientă a analizei MS și identificarea atât a proteinelor individuale, cât și a complexelor proteice de pe suprafața cipului AFM. Analiza MS a peptidelor proteotipice ale proteinelor studiate a fost efectuată folosind două tipuri de ionizare (MALDIȘi EST)și două tipuri de detectoare (timp de zbor și capcană de ioni). Schema dezvoltată pentru cuplarea phishing-ului biospecific AFM și MS a fost, de asemenea, testată cu succes pentru detectarea markerilor proteici ai virusului hepatitei C (HCV) (HCVcoreAg și E2) în probele de ser sanguin.

Semnificația practică a lucrării .

Rezultatele acestei lucrări fac posibilă crearea unor metode proteomice extrem de sensibile fără utilizarea etichetelor și a procedurilor suplimentare de preparare a probelor pentru detectarea proteinelor găsite în concentrații scăzute în materialul biologic, inclusiv în serul sanguin. A fost propusă o abordare bazată pe microscopia de forță atomică și spectrometrie de masă, care va permite detectarea și identificarea markerilor proteici ai virusului hepatitei C în serul sanguin uman.

Abordarea poate fi utilizată în dezvoltări care vizează crearea de noi cipuri de diagnostic și căutarea biomarkerilor unei game largi de boli semnificative din punct de vedere social.

Aprobarea lucrării.

Principalele rezultate ale cercetării au fost prezentate în cadrul „Forumului Internațional de Nanotehnologie I, II și III” (Moscova, 2008-2010); „IV Congres al Societății Ruse de Biochimiști și Biologi Moleculari”, Novosibirsk, 2008; la Congresul Internațional „Human Proteome”, Amsterdam, 2008; la Congresul Internațional Human Proteome, Sydney, 2010.

Publicaţii.

Structura și scopul disertației.

Teza constă dintr-o introducere, o trecere în revistă a literaturii, o descriere a materialelor și metodelor de cercetare, rezultatele cercetării și discuția acestora, o concluzie, concluzii și o listă de referințe. Lucrarea este prezentată pe 104 pagini, ilustrate cu 33 de figuri și 4 tabele, bibliografia fiind formată din 159 de titluri.

Analiza progresului științific și tehnic în domeniul tehnologiilor proteomice extrem de sensibile

Unul dintre domeniile prioritare în știința modernă este descoperirea și clarificarea rolului diferitelor tipuri de proteine ​​în organism, precum și înțelegerea mecanismelor moleculare care conduc la dezvoltarea bolilor.

În ciuda îmbunătățirii continue a metodelor proteomice, numărul de biomarkeri ai bolii nou descoperiți a rămas practic neschimbat în ultimul deceniu. Acest lucru se datorează faptului că limita de concentrație de detectare a metodelor proteomice tradiționale nu depășește 10"9 M. În același timp, este important ca proteomica să dezvolte noi abordări analitice pentru identificarea proteinelor cu un interval de concentrație mai scăzut, în special molecule de proteine ​​cu copii reduse (cu o concentrație de 10"13 M și mai puțin), inclusiv biomarkeri în materialul biologic. Deoarece se poate presupune că în aceste intervale de concentrație sunt localizați markerii proteici ai majorității bolilor.

Una dintre domeniile în curs de dezvoltare, care face posibilă creșterea ușoară a sensibilității la concentrație a analizei, este crearea de complexe analitice bazate pe sisteme nanocromatografice și nanoelectroforetice compatibile cu spectrometrele de masă.

Un sistem nanocromatografic în combinație cu spectrometria de masă și ionizarea prin electrospray a făcut posibilă creșterea sensibilității detectării proteinelor cu două ordine de mărime în comparație cu cromatografia de înaltă rezoluție (HPLC). Limita sensibilității la concentrație a unor astfel de sisteme cuplate este limitată de sensibilitatea etapei de electroforeză/cromatografie și nu depășește 10-12 M pentru proteinele individuale (de exemplu, pentru citocromul C și bradikinină).

În prezent, metodele cromatografice s-au dezvoltat în zone independente separate - analiză SELDI MS (spectrometrie de masă cu laser de suprafață îmbunătățită și ionizare/timp de zbor), metode de phishing a proteinelor folosind microparticule magnetice. În aceste tehnologii, suprafețele hidrofobe sau încărcate ale cipurilor SELDI sunt... sau microparticule magnetice în combinaţie cu analiza spectrometrică de masă sunt utilizate cu succes: pentru? identificarea - și identificarea ca tipuri separate; proteine ​​și pentru profilarea proteinelor/peptidelor din serul sanguin [c, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ este o abordare puternică care permite studierea unui biomaterial prin adsorbția de biomolecule (proteine, peptide) pe activate chimic? suprafață (cipuri de schimb cationic/anion) urmată de analiza spectrometrică de masă a moleculelor adsorbite:. se aplică abordarea SEEDPMЄ; pentru profilarea proteică a biomaterialului; și recent: a început să fie folosit ca „diagnostic bazat pe coduri de bare proteomice” [17].. Esența unui astfel de „diagnostic cod de bare” este de a identifica? caracteristici ale profilului proteic al probei biologice; asociat cu o anumită boală: Deci, se știe; ce g at. În bolile canceroase, „codul de bare proteomic” al biomaterialului diferă semnificativ de cel al grupurilor de indivizi sănătoși1: Prin urmare, controlul asupra modificărilor proteinelor; Compoziția biomaterialului poate deveni baza pentru diagnosticarea precoce a bolilor. Pe; astăzi, folosind abordarea SELDI? Au fost identificați markeri MЄ. cancer de stomac, ovarian, prostată și sân: limitarea acestei metode5 este incapacitatea de a identifica proteinele cu rezoluție și fiabilitate ridicate, ceea ce este deosebit de important atunci când; analiza amestecurilor multicomponente, cum ar fi materialul biologic.

Pe lângă problema sensibilității la concentrație scăzută a sistemelor analitice existente, o piatră de poticnire pentru analiza proteomică a materialului biologic a devenit o gamă dinamică largă de concentrații de proteine, în special în serul sanguin, care variază de la 1 (G M până la moleculele individuale de proteine. Proteinele cu copii mari (majore) interferează cu astfel de sisteme de detectare și identificare a proteinelor (minore) cu copii reduse.

Problema unei game largi de concentrații de proteine ​​într-un biomaterial poate fi rezolvată prin utilizarea metodelor de epuizare a serului sanguin din fracțiile majore de proteine, metode de separare a amestecurilor multicomponente și metode nanotehnologice bazate pe pescuitul biospecific și chimic al moleculelor de analiți proteici din amestecuri complexe. pe suprafața cipurilor către diverși biosenzori sau pe o suprafață activată microsfere magnetice.

În mod tradițional, electroforeza pe gel unidimensională, mai adesea bidimensională este utilizată pentru a separa amestecurile de proteine ​​cu mai multe componente. Principiul separării proteinelor prin metode bidimensionale de electroforeză pe gel se bazează pe diferența dintre proteine ​​în funcție de valorile punctelor izoelectrice ale acestora Hf greutăți moleculare. În proteomică, aceste abordări sunt utilizate pentru cartografierea proteinelor biomaterialului (țesut, plasmă sanguină etc.). Combinația electroforezei unidimensionale și/sau bidimensionale cu spectrometria de masă permite identificarea proteinelor separate și vizualizate. Cu toate acestea, procedura de electroforeză pe gel bidimensională nu este încă automatizată, este destul de complexă și necesită o muncă intensivă, necesită un operator înalt calificat, iar rezultatele analizei sunt adesea slab reproductibile.

O procedură mai convenabilă pentru separarea proteinelor în comparație cu electroforeza bidimensională este cromatografia de înaltă rezoluție (HPLC); care este o procedură automată care permite îndepărtarea proteinelor cu copii mari dintr-un amestec complex pentru a identifica ulterior proteinele cu copii mici.

În scopul identificării directe a proteinelor în amestecuri complexe, o coloană de cromatografie poate fi cuplată la un spectrometru de masă. Cu toate acestea, proteinele intacte nu sunt practic predispuse la o separare de înaltă calitate prin HPLC, deoarece sunt denaturate în timpul analizei (din cauza valorilor scăzute ale pH-ului mediului și a concentrațiilor mari de solvenți organici), precum și datorită acuratețea analizei spectrometrice de masă, prin urmare, identificarea directă a majorității proteinelor intacte, în special cu o greutate moleculară care depășește 10 kDa, este adesea imposibilă. Precizia analitică a măsurării poate fi îmbunătățită prin scindarea hidrolitică a proteinelor în fragmente de peptide cu o greutate moleculară de 700 până la 4000 Da folosind proteaze; precum tripsina (tehnologie de jos în sus). Pentru a obține o separare de înaltă calitate a proteinelor într-un amestec, se utilizează o combinație de mai multe proceduri cromatografice, așa-numita cromatografie multidimensională.

Metode de diagnosticare a hepatitei

În prezent, sistemele de testare pentru identificarea anti-HCVcore sunt utilizate pentru diagnosticarea proteică a hepatitei C. Primele teste ELISA care detectau prezența anticorpilor anti-HCVcore au devenit disponibile la începutul anilor 1990, dar aveau sensibilitate și selectivitate scăzute. Mai târziu, la sfârșitul anilor 90, a apărut o nouă generație de teste ELISA pentru anti-HCVcore, care avea o sensibilitate destul de mare de aproximativ 95-99% și putea detecta HCV la câteva luni după infectare.

De exemplu, în 1996, pe piața rusă au apărut sisteme de testare dezvoltate de Vector-Best (Novosibirsk) și Diagnostic Systems (Nijni Novgorod) pentru a detecta anticorpi - clasa IgM anti-HCV. Rolul anticorpilor din clasa IgM în serodiagnostic nu a fost suficient studiat, totuși, unele studii au arătat importanța acestui marker pentru identificarea hepatitei cronice C. De asemenea, s-a stabilit că corelația dintre detectarea ARN viral și IgM anti-HCV la pacienți este de 80-95%. Pentru a determina faza de dezvoltare a hepatitei virale C, Afanasyev A.Yu. et al. au folosit un coeficient care reflectă raportul dintre IgG anti-HCV și IgM anti-HCV din sângele pacienților. Până în prezent, au fost dezvoltate multe sisteme de testare imunosorbantă legată de enzime (ELISA) care detectează anticorpii circulanți la mulți epitopi ai virusului hepatitei E.

Diagnosticul modern de laborator pentru: hepatita virală E se efectuează în majoritatea instituțiilor medicale din Moscova; în conformitate cu ordinele existente ale Ministerului Sănătății al Federației Ruse și Departamentului de Sănătate: Moscova și constă în determinarea imunoglobulinelor? clasa G la virusul hepatitei E (IgG anti-HGV) în serul sanguin al pacienţilor. Identificarea acestui marker permite să se judece prezența unei infecții curente sau trecute.

Dezavantajele metodelor; detectarea bazată pe EEISA, pe lângă sensibilitatea scăzută (mai mult de GO "12 M)j se datorează și detectării false; hepatita virală E la pacienți - datorită imunității post-infecțioase, reactivității încrucișate a anticorpilor, precum și sensibilității insuficiente. în perioada acută) faze BFG BI CONEXIUNI CU: ACEASTA continuă căutarea activă a metodelor sensibile, specifice, rapide și ușor de utilizat pentru depistarea markerilor de hepatită E.

Un alt grup de metode de depistare a hepatitei virale în ser: sângele constă în înregistrarea ARN BE folosind PCR; Determinarea ARN. metode BFG; HSR nu poate fi folosit ca test primar pentru - confirmare sau excludere; diagnostic; Dar; Pot fi; util pentru confirmarea diagnosticului: Diagnosticul1 de BFG se realizează prin analiza regiunii 5 -necodante a ARN. Cu toate acestea, rezultatele testelor variază între diferitele genotipuri BFG.

Pe piața rusă au apărut microcipuri biologice, permițând genotiparea BFG și determinarea unui regim antiviral eficient; terapie. Acest biocip este un cip de oligonucleotide pentru genotiparea BFG pe baza analizei regiunii NS5B. Rezultatele obținute indică capacitatea biocipului de a identifica toate cele 6 genotipuri și 36 de subtipuri de VHC, inclusiv cele mai virulente și rezistente la medicamente.

Pe de o parte, metodele de analiză PCR sunt ultrasensibile și permit detectarea și amplificarea unui semnal de la o singură moleculă de ARN dintr-o probă, dar, pe de altă parte, aceste metode sunt caracterizate de rezultate fals pozitive din cauza contaminării aleatorii a probelor, false. rezultate negative datorită mutabilității ridicate a virusului și costului relativ ridicat al analizei. Chiar și la aceeași persoană, nivelul de ARN HCV se poate schimba periodic cu mai mult de miliori, ducând la rezultate fals negative în cazul unui nivel scăzut? replicarea virusului sau dacă virusul persistă în țesuturi fără a intra în sânge. Rezultatele determinării cantitative a RIG și HCV în diferite laboratoare nu sunt suficient de bine de acord.

De o valoare deosebită pentru detectarea precoce a biomaterialului viral hepatitei C Bt sunt antigenele proteice VHC, datorită faptului că acestea apar1 în serul sanguin cu câteva săptămâni mai devreme, chiar înainte de dezvoltarea unui răspuns imunitar cu drepturi depline al organismului.

Antigenul de suprafață HCVcoreAg al virusului hepatitei C este principalul marker al infecției cu virusul hepatitei C. Este detectat cu 16 săptămâni înainte de apariția anticorpilor în sânge datorită răspunsului imun al organismului și înainte de apariția semnelor clinice. se inregistreaza atat in faza acuta cat si in boala cronica. Există un singur produs comercial străin (Ortho Clinical Diagnostics) pentru diagnosticul ELISA al hepatitei C în faza acută, bazat pe detectarea HCVcoreAg.

Proteina structurală HCVcoreAg, constând din 121 de resturi de aminoacizi, este situată la capătul N-terminal al polipeptidei și se formează sub influența proteazelor celulare. Prima hidroliză proteolitică are loc între resturile 191 și 192 (locul C1) și duce la formarea glicoproteinei E1. Al doilea loc de tăiere (C2) este situat între aminoacizii 174 și 191. Produsele de tăiere corespunzătoare sunt denumite p21 și p23. Analiza expresiei într-un număr de celule de mamifere a arătat că p21 este produsul principal, iar p23 se găsește în cantități minore. Este posibil ca clivajul la situsurile C1 și C2 să fie procese interconectate, deoarece p21 se formează în condițiile în care hidroliza la G2 nu este observată [G45]. HCVcoreAg este o proteină de bază de legare a ARN-ului care pare să formeze nucleocapsidul viral. Proprietățile biochimice ale acestei proteine ​​sunt încă slab caracterizate. Studiile AFM ale particulelor virale hepatitei C au făcut posibilă obținerea unei imagini a capsidei VHC.

cipuri AFM

În partea experimentală a lucrării au fost utilizate două tipuri de cipuri AFM. Folosind primul tip, a fost efectuată identificarea MS a proteinelor model pe suprafața cipurilor AFM. Aceste cipuri erau substraturi cu grupe chimice active funcțional (denumite în continuare cipuri AFM cu o suprafață activată chimic), pe care moleculele studiate au fost prinse și imobilizate ireversibil prin legături covalente, așa-numita procedură de „phishing chimic”. Al doilea tip de cipuri AFM a fost utilizat pentru identificarea MS a proteinelor de pe suprafața lor, capturate biospecific dintr-o soluție de analit. Sondele biologice au fost anterior imobilizate pe suprafața acestor cipuri în zonele de lucru. Anticorpii monoclonali împotriva proteinelor marker ale hepatitei virale B și C (BFB și BFC) sau aptamerii împotriva proteinei gpl20 și trombinei au fost utilizați ca sonde biologice. Pentru procedura de phishing biospecific, au fost incubate cipuri cu molecule de sondă imobilizate covalent. într-o soluție de analiză % care conține numai proteina detectată sau probe de ser de sânge

Pentru a îndeplini sarcina de identificare MS a proteinelor model imobilizate covalent pe suprafața cipurilor AFM de primul tip, în lucrare au fost utilizate următoarele: avidin (Agilent, SUA), HSA (Agilent, SUA), P450 VMZ (furnizat cu amabilitate). de profesorul A.V Munro, Universitatea din Manchester, Marea Britanie), trombina (Sigma, SUA), a-FP și anti-a-FP (USBio, SUA); Pentru a îndeplini sarcina de identificare MS a proteinelor pe suprafața cipurilor AFM de al doilea tip, captate biospecific dintr-o soluție de analit, au fost utilizați anticorpi monoclonali (MAb) ca molecule sondă: anti-HCVcore (Virogen, SUA), anti-HBVcore (Institutul de Cercetare de Diagnostic Molecular, Moscova), anti-HBsAg (Aldevron, SUA), ca molecule țintă: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, SUA) și HBsAg (Aldevron, SUA), gpl20 (Sigma, SUA), troponina (USBio, STATELE UNITE ALE AMERICII).

În plus, în lucrare au fost utilizate următoarele substanțe: acetonitril, izopropanol, acid formic, apă distilată (Merck, SUA), acid trifluoracetic (TFA), bicarbonat de amoniu (Sigma, SUA), acid α-ciano-4-hidroxicinamic ( HCCA), acid dihidroxibenzoic (DHB) (Bruker Daltonics, Germania), tripsină (Promega, SUA).

Probele de ser de sânge pentru cercetarea AFM au fost furnizate de Departamentul de Boli Infecțioase la Copii al Universității Medicale de Stat din Rusia, Institutul Central de Cercetare Epidemiologie din Rospotrebnadzor, Institutul de Cercetare de Epidemiologie Gabrichevsky Moscova: Prezența particulelor de virusul hepatitei C (HCV) în probele de ser de sânge a fost confirmată prin metoda reacției în lanț a polimerazei (PCR) folosind sistemul de testare „Amplisense HCV Monitor” (Institutul Central de Cercetare Epidemiologie, Ministerul Sănătății al Federației Ruse, Moscova).

Analiza AFM a fost efectuată în Laboratorul de Nanobiotehnologie al Institutului de Chimie Biomedicală, Academia Rusă de Științe Medicale. Numărarea proteinelor și a complexelor antigen/anticorp de pe suprafața cipului AFM a fost efectuată pe baza corelării înălțimilor imaginilor corespunzătoare ale proteinelor și complecșilor acestora măsurate folosind AFM, conform metodei descrise în. A fost utilizat ACM NTEGRA (NT-MDT, Rusia). Măsurătorile AFM au fost efectuate în modul semi-contact. Ca sonde au fost folosite cantilever din seria NT-MDT NSG10. Raza de curbură tipică a acelor a fost de 10 nm, frecvența de rezonanță a variat de la 190 la 325 kHz. Zona de scanare a cipului a fost de 400 μm2. Fiecare măsurătoare a fost efectuată de cel puțin 3 ori.

Imobilizarea proteinelor și aptamerilor pe suprafața unui cip AFM a fost efectuată conform următoarei proceduri.

La o soluție de proteină (0,1 mM) cu un volum de 2 μl, s-au adăugat 8 μl dintr-o soluție de amestec NHS/EDC (v/v=l/l) și s-au amestecat bine. Amestecul rezultat a fost aplicat pe suprafața cipului silanizat și incubat timp de 2 minute la temperatura camerei. Cipul a fost apoi spălat de două ori într-un agitator termic cu 1 ml de apă deionizată la 800 rpm și 37C. Calitatea imobilizării proteinei pe suprafața cipului AFM a fost controlată prin microscopie cu forță atomică.

Imobilizarea aptamerilor pe suprafața activată chimic a unui cip AEM a fost efectuată după cum urmează. La o soluție stoc de DSP cu o concentrație de 1,2 mM în DMSO/etanol (v/v=l/l)4, s-a adăugat și o soluție de tampon PBS 50 mM (pH 7,4) într-un raport de 1/1 în volum. . Soluția de lucru astfel obținută a fost aplicată pe suprafața cipului AFM și incubată timp de 10 minute. După aceea, s-a efectuat spălarea cu o soluție de etanol 50% în apă cu un volum de 1 ml la 15 C timp de 10 minute. O soluție de aptamer cu o concentrație de 3 JIM a fost aplicată pe zona activată a cipului AFM și incubată timp de 4 minute în timp ce se agită la o viteză de 800 rpm. Blocarea grupărilor amino nereacționate ale agentului de reticulare DSP a fost efectuată în prezența unei soluții de Tris-HCI 5 mM timp de 10 minute la 37°C Etapa finală de spălare a fost efectuată de două ori cu o soluție apoasă de 1 ml timp de 10 minute la 25C.

Un amestec tripsinolitic care conține o soluție tampon de 150 mM NH4HCO3, acetonitril, clorhidrat de guanidină 0,5 M și glicerol (pH 7,4) a fost aplicat pe suprafața unui cip AFM cu molecule de sondă imobilizate. Apoi s-au adăugat la soluția tampon 0,5 μl dintr-o soluție de tripsină porcină modificată cu o concentrație de 0,1 μM. Cipul AFM a fost incubat într-un mediu umed timp de 2 ore la o temperatură constantă de 45C, s-au adăugat din nou 0,5 μl de soluție de tripsină (0,1 μM) la suprafața sa și incubarea a continuat încă 12 ore. Amestecul tripsinolitic a fost spălat de pe suprafața cipului AFM cu o soluție de eluție de 10 μL care conține 70% acetonitril în acid trifluoracetic (TFA) 0,7%. Hidrolizatul astfel obținut de pe suprafața cipului AFM a fost uscat într-un evaporator cu vid la 45°C și 4200 rpm. Apoi, amestecul de peptide a fost dizolvat în 10 μl dintr-o soluție de acid formic 5% sau în 10 μl dintr-o soluție 0,7% TFA pentru analiza MS ulterioară.

La efectuarea analizei MS cu tip de ionizare MALDI, probele au fost preparate după cum urmează. Probele dizolvate în soluție de TFA 0,7% într-un volum de 10 μl au fost concentrate și desarate folosind microtips ZipTip C18 (Millipore, SUA) în conformitate cu protocolul producătorului și amestecate cu o soluție saturată de matrice care conține HCCA sau DHB într-o soluție de acetonitril 50% cu 0,7% TFU. Amestecul rezultat a fost aplicat pe o țintă MALDI de dimensiune MTP.

- identificarea proteinelor prinse folosind „phishing chimic” pe suprafața unui cip AFM dintr-o soluție de analit

În această etapă a lucrării experimentale, s-au obținut spectre MS pentru proteine ​​model imobilizate chimic pe suprafața cipurilor AFM dintr-o soluție de analit. Gama de concentrații ale proteinelor studiate în soluția de analit pentru avidină, HSA, anti-aFP a fost de 10"-10"9 M, troponină, aFP și P450 VMZ - 10"6-10"8 M.

Analiza MS a fost efectuată pentru 6 tipuri de proteine, diferite ca origine, greutate moleculară, număr de situsuri de tripsinoliză și accesibilitate spațială, gradul de hidrofobic al secvenței de aminoacizi (raportul dintre aminoacizi hidrofobi și hidrofili), care au fost imobilizați covalent. pe suprafața cipului AFM dintr-o soluție de analit (Tabelul 1). În aceste experimente s-au folosit cipuri AFM, care conțineau zone de lucru și de control. Zona de lucru a fost o zonă activată chimic a suprafeței cipului AFM, pe care a avut loc „phishingul chimic” al proteinelor model; zona de control era o zonă inactivă din punct de vedere chimic a suprafeței cipului. Numărările de molecule capturate vizualizate au fost înregistrate folosind AFM. Datele experimentale ale analizei AFM obținute pentru proteinele model menționate mai sus, și anume numărul de molecule prinse pe suprafața zonei de lucru a cipului AFM, sunt prezentate în Tabelul 2. Coloana „Concentrația moleculelor proteice în soluție ” din Tabelul 2 prezintă datele pentru concentrația minimă înregistrată a proteinei corespunzătoare în soluția de analit.

După cum se poate observa din Tabelul 2, numărul de molecule înregistrate în zona de lucru a cipului AFM pentru toate proteinele prezentate a fost de -1040 de molecule. Limita de sensibilitate a detectorilor MS este de aproximativ 105 molecule. Astfel, pentru proteinele model prezentate, imobilizarea ireversibilă cu succes a fost efectuată pe suprafața cipului AFM, iar numărul de obiecte proteice înregistrate în AFM a fost suficient pentru identificarea ulterioară a MS. În același timp, concentrația minimă înregistrată de proteine ​​model în soluția de incubare a fost destul de scăzută, 10" -10" M.

Analiza spectrometrică de masă a probelor a fost efectuată utilizând tipurile de ionizare MALDI și ESI. Cipul AFM după incubare în soluția corespunzătoare de avidină cu o concentrație de 10"9 M. Analiza acestor spectre a făcut posibilă identificarea fiabilă a avidinei (Gallus Gallus) prin cele două peptide proteotipice ale sale: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) și VGINIFTR ( m/z= 460,4). Ambele peptide au avut vârfuri bine definite ale ionilor lor dublu încărcați (spectre MS utilizând analiza AFM-MS a zonei de lucru activate chimic a cipului AFM după incubare într-o soluție de proteină analită). cu o concentrație de 10"8 M, a fost identificată o altă proteină mică - troponina I. Spectrele MS și MS/MS corespunzătoare ionului peptidic dublu încărcat 1449 Da sunt prezentate în Figura 3. Analiza MS a spectrelor obținute experimental a făcut posibilă pentru a detecta și identifica în mod fiabil troponina umană (gi 2460249) pe suprafața cipului AFM cu o probabilitate de peste 95%.

Figura 5 prezintă spectre de fragmentare în tandem ale unei proteine ​​globulare - albumina serică umană (HSA), care îndeplinește funcții de transport în plasma sanguină. Spectrele au fost obținute din zona de lucru activată chimic a cipului AFM după incubare în soluția adecvată de albumină cu o concentrație de 10"9 M. Analiza acestor spectre a făcut posibilă identificarea fiabilă a albuminei umane prin cele două peptide proteotipice ale sale: VPQVSTPTLVEVSR (m/z = 756,5) și YLYEIAR (m/z = 464,3) Ambele peptide au avut vârfuri bine definite ale ionilor lor dublu încărcați (spectre MS).

Spectrele MS/MS ale obiectelor tripsinizate de pe suprafața activată chimic a unui cip AFM incubat într-o soluție de albumină serică umană (C = 109 M). Peptida VPQVSTPTLVEVSR cu m/z=756,5 (A), peptidă YLYEIAR cu m/z=464,3 (B). Condiții experimentale: măsurătorile au fost efectuate pe un spectrometru de masă LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent).

Astfel, analiza MS a permis identificarea proteinelor detectate de AFM. Pe baza datelor obținute, a fost identificată o relație între numărul de peptide proteotipice identificate de pe suprafața cipului AFM și conținutul de proteină dorită în soluția de analit. Această dependență, de exemplu, pentru proteinele P450 BMZ și HSA, imobilizate covalent pe suprafața activată chimic a unui cip AFM, este prezentată în Figura 6. După cum se poate observa în Figura 6, cu cât este mai mare concentrația de proteine ​​în soluția de analit ( -KG6 M), cu atât numărul de peptide poate fi identificat în mod fiabil atât în ​​cazul analizei MALDI-MS, cât și în cazul analizei ESI-MS. Nu au existat diferențe semnificative între numărul de peptide identificate în intervalul de concentrație 10"6-10"9 M între proteinele analizate în soluția de analit.

Dependența numărului de peptide identificate ale moleculelor de analit de concentrația de proteine ​​din soluția de incubare. (A) - analiza unui amestec de peptide de proteine ​​model HSA, VMS pe spectrometre de masă cu ionizare de tip MALDI Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Germania) și Autoflex III (Bruker Daltonics, Germania); (B) - analiza unui amestec de peptide de proteine ​​model HSA, VMS pe un spectrometru de masă cu ionizare de tip ESI LC/MSD Trap XST Ultra (Agilent, SUA).

Rezultatele obținute ne-au permis să concluzionam că AFM-MS (MALDI și ESI) face posibilă detectarea și identificarea moleculelor de proteine, diferite în proprietățile lor fizico-chimice, captate covalent dintr-o soluție de analit pe suprafața unui cip AFM.

Totodată, în zona de control a cipului AFM (neactivat) după incubarea acestuia în soluția de analit, metoda AFM nu a detectat prezența obiectelor pe suprafața cipului corespunzătoare în înălțime moleculelor de proteine. Analiza MS nu a relevat nici obiecte de natură proteică. Astfel, s-a dovedit experimental că AFM înregistrează în mod adecvat obiectele dorite - moleculele proteice ale analitului.

Următoarea etapă a acestei lucrări a fost dezvoltarea unei scheme de combinație AFM-MS pentru identificarea proteinelor prinse din soluție. luarea în considerare a interacțiunilor biospecifice.

Schema de realizare a analizei spectrometrice de masă în cazul pescuitului biospecific AFM a proteinelor din soluție este prezentată în Figura 7. Conform schemei date, moleculele sondei au fost mai întâi imobilizate pe suprafața zonei de lucru a cipurilor AFM, care au fost anticorpi monoclonali1 împotriva markerilor proteici ai hepatitei virale B și C sau aptameri împotriva glicoproteinei HIV-1 gpl20 și trombinei, în timp ce suprafața zonei de control nu conținea molecule sondă imobilizate. Controlul calității imobilizării moleculelor sondei a fost efectuat prin vizualizarea AGM. Apoi un astfel de cip a fost incubat într-o soluție de analit care conține proteina studiată. După etapa de spălare a moleculelor adsorbite nespecific pe suprafața cipului și etapa de pregătire a probei pentru analiza spectrometrică de masă ulterioară, analiza MS a proteinelor înregistrate cu AFM a fost efectuată pe suprafața cipului AFM.

Partea experimentală a acestei secțiuni a implicat două etape de analiză. În prima etapă, a fost necesar să se efectueze identificarea MS a moleculelor sondei proteice imobilizate covalent pe cipul AFM, în a doua etapă, proteinele țintă prinse pe moleculele partenere corespunzătoare din soluție sau din probele de ser sanguin din cauza interacțiunilor biospecifice; În acest scop, a fost efectuată analiza MS a mAb-urilor împotriva proteinelor marker HCV și HBV, anti-HCVcore și anti-HBVcore, imobilizate covalent pe suprafața cipurilor AFM. Pentru MAb împotriva proteinelor anti-HCVcore și anti-HBVcore, spectrele de fragmentare în tandem și spectrele hărții de peptide au fost obținute pentru prima dată în această lucrare.

2. STUDIUL LITERATURII.

2.1 Spectrometria de masă în proteomică.

2.1.1 Principii generale.

2.1.2 Analiza proteomică folosind spectrometrie de masă.

2.1.3 Identificarea proteinelor folosind metoda amprentei masei peptidice.

2.1.4 Identificarea proteinelor folosind metoda de fragmentare a amprentei peptidice.

2.2 Interpretarea rezultatelor identificării prin spectrometrie de masă a proteinelor.

2.2.1 Determinarea listei proteinelor identificate.

2.2.2 Identificarea proteinelor foarte omoloage.

2.2.3 Baze de date ale secvențelor de aminoacizi ale proteinelor.

2.3 Analiza spectrometrică de masă a produselor cu o singură genă.

2.3.1 Proteotiparea și proteomica populației.

2.3.2 Identificarea microeterogeneității proteinelor folosind metoda „de sus în jos”.

2.3.3 Identificarea polimorfismului proteic determinat genetic folosind metoda „de jos în sus”.

2.3.4 Baze de date ale polimorfismelor de proteine ​​și gene.

2.3.5 Arhivele de date de spectrometrie de masă.

3 MATERIALE ȘI METODE.

3.1 Materiale.

3.1.1 Date spectrometrice de masă pentru proteinele fracției microzomale a ficatului uman.

3.1.2 Setul de control al spectrelor de masă „Aurum Dataset”.

3.1.3 Date spectrometrice de masă din depozitul proteomic PRIDE.

3.1.4 Baze de date ale secvențelor de aminoacizi ale proteinelor umane.

3.1.5 Date despre posibilele polimorfisme ale proteinelor umane.

3.2 Metode.

3.2.1 Server web pentru identificarea proteinelor prin spectre de masă.

3.2.2 Procesarea în serie a spectrelor de masă folosind metoda amprentei de masă peptidică.

3.2.3 Prelucrarea discontinuă a spectrelor de masă în tandem.

3.2.4 Harta proteomică unidimensională.

3.2.5 Implementarea software a unui algoritm iterativ pentru identificarea PDA-urilor.

3.2.6 Validarea algoritmului de identificare OAP.

4 REZULTATE ȘI DISCUȚII.

4.1 Creșterea gradului de acoperire a secvențelor de aminoacizi de către peptidele identificate.

4.1.1 Identificarea proteinelor în secțiuni de gel.

4.1.2 Hărți proteomice unidimensionale și proprietățile acestora.

4.1.3 Identificarea proteinelor foarte omoloage ale superfamiliei citocromului P450 prin creșterea gradului de acoperire a secvențelor de aminoacizi de către peptidele identificate.

4.2 Identificarea PDA-urilor în proteinele superfamiliei citocromului P450.

4.3 Algoritm pentru identificarea PDA.

4.3.1 Schema iterativă de procesare a spectrelor de masă în tandem.

4.3.2 Sensibilitatea și specificitatea algoritmului de identificare PDA.

4.4 Aplicarea unui algoritm iterativ pentru identificarea PDA-urilor în datele spectrometrice de masă din depozitul proteomic PRIDE.

4.4.1 Date inițiale utilizate pentru identificarea PDA.

4.4.2 Identificarea peptidelor și proteinelor folosind datele de spectrometrie de masă descărcate din depozitul PRIDE.

4.4.3 Identificarea polimorfismelor de un singur aminoacid.

4.5 Analiza PDA-urilor identificate.

4.5.1 Analiza peptidelor care conțin OAP.

4.5.2 Relația PDA-urilor identificate cu bolile umane.

Lista recomandată de dizertații

• Reglarea post-translațională a citocromilor P450 subfamilia 2B 2013, doctor în științe biologice Zgoda, Viktor Gavrilovici

• Determinarea spectrometrică de masă a activității și conținutului citocromilor P450 2013, candidat la științe biologice Moskaleva, Natalya Evgenievna

• Maparea structurală și funcțională a proteinelor sistemelor monooxigenaze care conțin citocrom P450 2002, doctor în științe biologice Kolesanova, Ekaterina Fedorovna

• Metodă de recunoaștere a secvențelor de aminoacizi în spectrele de masă peptidice pentru probleme de proteomică 2007, candidat la științe tehnice Lyutvinsky, Yaroslav Igorevich

• Scara universală a timpilor de retenție cromatografică a biomacromoleculelor în problemele proteomicei „foc rapid” 2011, candidat la științe fizice și matematice Pridatchenko, Marina Leonidovna

Introducerea disertației (parte a rezumatului) pe tema „Analiza spectrelor de masă ale fragmentelor de peptide pentru identificarea polimorfismului determinat genetic al proteinelor”

Baza de date Ensembl conține informații despre 20.469 de gene codificatoare, derivate din ansamblul genomului uman efectuat la Centrul Național pentru Informații Biotehnologice din SUA (februarie 2009). Numărul mic de gene ne permite să concluzionăm că complexitatea sistemelor vii se realizează la nivelul de reglare a transcripției, traducerii și modificărilor post-translaționale. Îmbinarea și modificările alternative, cum ar fi fosforilarea, glicozilarea, împreună cu procesarea proteolitică, duc la formarea unei varietăți de proteine, al căror număr depășește numărul de gene cu câteva ordine de mărime. Estimările efectuate prin diferite metode arată că proteomul uman poate consta din câteva milioane de proteine ​​care diferă în structura lor chimică.

Abordarea tradițională a cercetării proteomului se bazează pe utilizarea colorării imunohistochimice a secțiunilor de țesut. Prima versiune a atlasului proteomic uman a fost construită folosind anticorpi. Utilizarea micromatricelor biologice care conțin anticorpi acoperiți pe acestea face posibilă identificarea și cuantificarea până la câteva sute de proteine ​​într-o singură probă. Cu toate acestea, această abordare are limitări care sunt asociate cu necesitatea de a dezvolta și verifica anticorpi, specificitate insuficientă din cauza interacțiunilor încrucișate și afinitatea relativ scăzută a complexelor antigen-anticorp. În acest sens, o metodă mai universală de identificare a proteinelor, spectrometria de masă biologică, care nu necesită reactivi imunospecifici, a căpătat o importanță deosebită pentru cercetarea proteomelor.

În analiza spectrometrică de masă a biomaterialului, identificarea moleculelor de proteine ​​se realizează prin compararea caracteristicilor măsurate de sarcină de masă ale proteinelor și/sau fragmentelor lor proteolitice cu valorile teoretice calculate pe baza secvențelor de aminoacizi codificate în genom. Trebuie luat în considerare faptul că secvența genomului nu conține în mod explicit informații despre site-uri alternative de splicing și posibile modificări post-translaționale. Identificarea cazurilor de îmbinare alternativă este posibilă pe baza datelor experimentale: sursa de informații despre izoformele de îmbinare este bazele de date de codificare ADN. Identificarea modificărilor post-translaționale se realizează folosind spectrometria de masă de înaltă precizie a proteinelor sau folosind spectrometria de masă în tandem a fragmentelor de peptide

Împreună cu splicing-ul alternativ și modificarea post-translațională, diversitatea moleculelor proteice crește datorită translației polimorfismului unic de nucleotide (nsSNP) non-sinonim. Stabilirea prezenței nsSNP se face folosind genotiparea, în timp ce se confirmă prezența unei substituții de reziduuri corespunzătoare în structura primară a proteinei, adică identificarea polimorfismelor unice de aminoacizi (SAP, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), este o sarcină de proteotipizare. .

Importanța identificării și studierii splicing-ului alternativ, PDA și modificărilor post-translaționale la nivel de proteine ​​se datorează influenței acestor procese asupra nivelului de expresie și proprietăților funcționale ale proteinelor. Se știe că modificările în activitatea sau nivelul de expresie al proteinelor pot duce la apariția și dezvoltarea unor boli semnificative din punct de vedere social, inclusiv cancer, boli cardiovasculare și neurodegenerative.

Prezența a aproximativ 65 de mii de polimorfisme nesinonime, probabil traduse în PDA, a fost stabilită în genom, cu peste 30% probabil ducând la modificări ale proprietăților funcționale ale proteinelor. Deoarece modificările activității proteinelor sunt asociate cu dezvoltarea bolilor, studiile PDA sunt necesare pentru a determina motivele structurale care stau la baza tulburărilor funcționale observate. Sarcinile de proteotipizare includ determinarea calitativă și cantitativă a expresiei variantelor alelice ale genelor la nivel proteomic, precum și monitorizarea frecvenței de apariție a variantelor alelice exprimate ale proteinelor la nivel de populație.

Identificarea PDA-urilor în modul de mare debit folosind spectrometria de masă este asociată cu limitări tehnice. Pentru sarcina de proteotipizare, cea mai adecvată abordare este abordarea „de sus în jos”, adică spectrometria de masă a proteinelor intacte (și nu fragmentele acestora). Sensibilitatea acestui demers este însă scăzută, la nivelul de 10 h-10 5 M. Drept urmare, se asigură identificarea a zeci, mai rar sute, și, numai în cazuri excepționale, până la o mie de proteine. Cel mai adesea, în spectrometria de masă biologică este utilizată o altă abordare - „de jos în sus”, în care prezența unei proteine ​​într-o probă este stabilită prin identificarea fragmentelor sale proteolitice (peptide). În majoritatea cazurilor, pentru a identifica o proteină, este suficient un număr mic de peptide, care împreună nu pot constitui mai mult de 5% din secvența biopolimerului. Pentru partea rămasă a secvenței de aminoacizi a proteinei, este imposibil să se determine prezența/absența modificărilor chimice ale resturilor de aminoacizi sau polimorfismelor de aminoacizi.

Pentru a identifica polimorfismele unice de aminoacizi ale proteinelor umane folosind spectrometria de masă biologică, este necesar să se mărească gradul de acoperire a secvenței de aminoacizi a proteinei prin identificarea peptidelor proteolitice suplimentare ale proteinei. Acest lucru este posibil prin efectuarea unui experiment cu un număr mare de analize de spectrometrie de masă parțial sau complet replicate. În plus, datele din experimentele de proteomică efectuate de mai multe grupuri de cercetare pot fi combinate într-un singur studiu. Accesul la o colecție extinsă de spectre de masă este oferit de diverse depozite proteomice, dintre care cel mai popular, PRIDE (baza de date de identificare a proteinelor), stochează rezultatele a peste 13 mii de experimente proteomice. Cu cât este mai mare gradul de acoperire a secvenței de aminoacizi a unei proteine ​​de către peptidele identificate, cu atât este mai mare probabilitatea de a confirma prezența sau absența substituțiilor unice de aminoacizi în structura proteinei.

Având în vedere disponibilitatea unei cantități mari de date spectrometrice de masă, rezolvarea problemei proteotipării este posibilă prin utilizarea metodelor computaționale de bioinformatică. De exemplu, analiza datelor de spectrometrie de masă poate fi efectuată utilizând baze de date cu fragmente exprimate (EST), care conțin informații despre variantele traduse ale polimorfismelor genelor nesinonime. A doua metodă, implementată în multe programe de identificare a proteinelor, este o comparație a spectrelor de masă cu o bază de date de secvențe teoretice de proteine, permițând inexactități sub formă de substituții ale reziduurilor de aminoacizi.

Dezavantajele abordărilor de mai sus sunt bine cunoscute. Bazele de date cu fragmente exprimate conțin informații redundante, inclusiv erori de secvențiere, ceea ce complică analiza rezultatelor spectrometriei de masă. Atunci când se analizează o probă în care au fost identificate câteva sute de proteine, spectrele de masă rezultate trebuie comparate cu sute de mii de transcrieri acumulate de-a lungul deceniilor, care conțin mai mult de 5% erori. Atunci când se analizează spectrele de masă cu presupunerea unor posibile inexactități în baza de date, informațiile despre substituțiile non-sinonime existente efectiv care au fost stabilite prin genotipizare sunt ignorate. Ipotezele artificiale introduse în baza de date sau algoritmul de identificare a proteinelor reduc fiabilitatea rezultatelor. Aceste deficiențe ale metodelor de proteotipizare existente necesită îmbunătățirea abordărilor computaționale pentru identificarea PDA.

Scopul lucrării a fost acela de a dezvolta o metodă de analiză a datelor spectrometrice de masă pentru a identifica polimorfismele unice de aminoacizi rezultate din traducerea substituțiilor de nucleotide nesinonime în genele corespunzătoare și de a utiliza metoda dezvoltată pentru a identifica substituțiile de aminoacizi în proteinele umane. Pentru atingerea scopului, au fost rezolvate următoarele sarcini:

1. Procesați spectrele de masă ale fragmentelor de peptide pentru a crește gradul de acoperire a secvențelor de aminoacizi ale proteinelor de către peptidele identificate.

2. Folosind un set model de date spectrometrice de masă care oferă un grad ridicat de acoperire a secvenței, dezvoltați o metodă pentru identificarea substituțiilor cu un singur aminoacid în proteinele umane.

3. Rezumați metoda de identificare a substituțiilor de un singur aminoacid sub forma unui algoritm universal pentru procesarea spectrelor de masă în tandem; evaluează sensibilitatea și specificitatea algoritmului creat.

4. Aplicați algoritmul creat pentru a procesa un depozit de date spectrometrice de masă, identificați polimorfisme cu un singur aminoacid și caracterizați proteinele umane care conțin polimorfismele identificate.

2. STUDIUL LITERATURII

Termenul „proteom” - setul complet de proteine ​​exprimate în organism - a fost propus pentru prima dată de Mark Wilkins în legătură cu nevoia emergentă de a completa cunoștințele despre genomi cu informații relevante despre proteinele codificate în ei. Obiectul de studiu atunci când se analizează proteomul poate fi fie un organism întreg, fie o componentă celulară, țesut, structură subcelulară, de exemplu, nucleul, fracția microzomală etc.

Rezultatele unui inventar pe scară largă de proteine ​​folosind spectrometria de masă au fost publicate în lucrarea lui Shevchenko și colab. în 1996. Apariția spectrometriei de masă biologică a marcat apariția erei tehnologiilor post-genomice de mare performanță, care fac posibilă obținerea de informații despre gene și proteine ​​la scara întregului organism ca urmare a unui singur experiment. Tehnologiile postgenomice, pe lângă proteomică, includ și genomica și transcriptomica. Atunci când se analizează materialul genetic, tehnologiile postgenomice fac posibilă determinarea prezenței polimorfismului genei utilizând resecvențierea întregului genom sau cartografierea de înaltă densitate a substituțiilor unice de nucleotide (SNP).

Abordările existente pentru studierea diversității proteinelor pot fi împărțite în două direcții. În primul caz, înainte de stabilirea experimentului, este predeterminat ce molecule de proteine ​​sunt planificate să fie identificate. În această abordare, identificarea proteinelor este efectuată folosind anticorpi, care sunt utilizați pentru colorarea histochimică a secțiunilor de țesut, urmată de obținerea de micrografii ale celulelor. Într-o microfotografie a unei secțiuni, zonele fluorescente corespund locurilor de localizare ale proteinei antigen detectate, iar intensitatea fluorescenței permite obținerea unei evaluări cantitative a conținutului acestei proteine.

Ca parte a amplului proiect internațional ProteinAtlas, se desfășoară producția pe scară largă de anticorpi împotriva proteinelor tuturor genelor umane. Acest proiect a produs și a pus la dispoziție pentru uz public mai mult de 400.000 de micrografii de secțiuni colorate imunohistochimic pentru aproape toate țesuturile umane. O analiză comparativă a distribuției colorării proteinelor specifice a făcut posibilă, în special, identificarea profilurilor caracteristice de expresie a proteinelor pentru țesuturile canceroase. Cu toate acestea, colorarea secțiunilor de țesut folosind anticorpi marcați fluorescent este o metodă destul de brută pentru studiul proteomului. În primul rând, așa cum subliniază înșiși dezvoltatorii proiectului ProteinAtlas, calitatea multor anticorpi disponibili comercial este extrem de scăzută. Când sunt verificați, aproximativ jumătate dintre anticorpii achiziționați prezintă specificitate scăzută pentru antigenul studiat, iar preparatele de anticorpi sunt adesea caracterizate de puritate scăzută. În al doilea rând, un număr mare de complexe antigen-anticorp sunt caracterizate printr-o constantă de disociere (107-108 M), care limitează sensibilitatea la măsurarea concentrațiilor de proteine.

În plus față de analiza histochimică, cercetarea proteomelor este efectuată folosind micromatrice biologice. Micromatricele de proteine ​​sunt un instrument puternic pentru medicina translațională, dar sunt limitate în capacitatea lor de a fi utilizate pentru cercetarea pe scară largă a proteomilor. Utilizarea tehnologiilor de microarray în proteomică face rareori posibilă identificarea a mai mult de zece proteine ​​simultan: odată cu creșterea numărului de proteine ​​analizate, standardizarea condițiilor pentru interacțiunea antigen-anticorp este dificilă. Astfel, utilizarea microcipurilor conduce la rezultate fals-negative în cazul în care diferențele de constante de disociere pentru complexele antigen-anticorp sunt de câteva ordine de mărime. În plus, stabilitatea anticorpilor depinde foarte mult de condițiile de depozitare a acestora, astfel încât utilizarea micromatricelor de proteine ​​este limitată la timpul imediat după fabricarea lor, ceea ce nu permite răspândirea acestui tip de analiză.

A doua direcție a cercetării proteomelor este asociată cu realizarea unui experiment în așa-numitul mod „panoramic” (survey), atunci când nu se știe dinainte ce proteine ​​pot fi identificate. Potenţial, ca urmare a unui experiment panoramic, pot fi identificate orice proteine ​​codificate în genomul organismului studiat, inclusiv produse din regiunile genomului considerate a fi necodante. Instrumentele tehnice și metodologice pentru cercetarea proteomului la nivel de genom sunt furnizate de spectrometria de masă biologică.

Teze similare la specialitatea „Biologie matematică, bioinformatică”, 01/03/09 cod VAK

• Abordare transcriptomic-proteomică pentru analiza proteoformelor liniei celulare HepG2 2018, Candidat la Științe Biologice Kiseleva, Olga Igorevna

• Transcriptomul și proteomul cromozomului 18: extrapolarea rezultatelor analizei la genomi umani și obiecte model 2017, doctor în științe biologice Ponomarenko, Elena Aleksandrovna

• Evaluarea plasticității proteomului plasmatic al unei persoane sănătoase în condiții de viață extreme 2011, Candidat la Științe Biologice Trifonova, Oksana Petrovna

• Căutarea și identificarea potențialilor biomarkeri ai cancerului ovarian în serul uman 2015, Candidatul de Științe Biologice Arapidi, Georgy Pavlovich

• Analiza fotodinamicii complexelor proteice ale membranelor tilacoide folosind spectrometrie de masă de înaltă rezoluție 2011, candidat la științe chimice Galetsky, Dmitri Nikolaevich

Încheierea disertației pe tema „Biologie matematică, bioinformatică”, Cernobrovkin, Alexey Leonidovich

1. S-a efectuat maparea proteomică a datelor spectrometrice de masă, inclusiv identificarea proteinelor folosind metoda amprentei de masă peptidică, urmată de analiză care vizează identificarea peptidelor proteotipice specifice proteinei. Folosind exemplul proteinelor superfamiliei citocromului P450, s-a demonstrat că prin maparea zonelor de localizare a proteinelor în gel, gradul de acoperire a secvenței de către fragmentele de peptide identificate crește cu 27%.

2. Au fost identificate peptide proteolitice specifice formelor citocromilor P450 CYP3A4 și CYP3A5, a căror identitate de secvență este de 82%. Au fost identificate variante alelice de translație a citocromilor CYP3A4 și CYP3A5, care conține polimorfisme cu un singur aminoacid M445N (ZA4), K96E (ZA4), L82R (ZA5) și D277E (ZA5).

3. A fost dezvoltat un algoritm iterativ pentru a identifica polimorfismele cu un singur aminoacid ale proteinelor folosind spectre de masă în tandem ale peptidelor proteolitice. Când a fost testat pe setul de control Aurum Dataset, algoritmul de detectare a polimorfismului a arătat o specificitate de peste 95%. Sensibilitatea algoritmului a fost de 30%, ceea ce corespunde acoperirii medii a secvențelor incluse în setul de control.

4. În urma analizei experimentelor de spectrometrie de masă depuse în depozitul PRIDE, au fost identificate un total de 270 de polimorfisme cu un singur aminoacid în 156 de proteine ​​umane, inclusiv 51 de PDA (45 de proteine) asociate cu boli, inclusiv tulburări ale sângelui. sistemul de coagulare și amiloidoza sistemică.

Lista de referințe pentru cercetarea disertației Candidat la științe biologice Cernobrovkin, Alexey Leonidovich, 2012

1. Archakov A.I. etc. O metodă de creștere a preciziei determinării secvenței reziduurilor de aminoacizi ale unui biopolimer pe baza datelor de analiză spectrometrică de masă, sistem informatic //2010.

2. Archakov A.I. et al. Citocromii P450, boala medicamentoasă și medicina personalizată. Partea 1 // Medicină clinică. 2008. T. 86. Nr 2. P. 4-8.

3. Klyuev N.A., Brodsky E.S. Metode moderne de analiză spectrometrică de masă a compuşilor organici // Ros. chimic. și. (J. Societatea Rusă de Chimie numită după D.I. Mendeleev). 2002. T. XLVI. Nr. 4. p. 57-63.

4. Vulpea A.B. et al. Harta proteomică unidimensională a citocromilor P450 de ficat uman // Biochimie. 2009. T. 74. Nr 2. P. 153-161.

5. Myasoedova K.N. Nou în studiul citocromilor P450 // Biochimie. 2008. T. 73. Nr. 9. p. 1199-1205.

6. Petushkova N.A. et al. Identificarea citocromilor P450 ai microzomilor celulelor hepatice umane folosind spectrometrie de masă // Chimie biomedicală. 2007. T. 53. Nr. 4. pp. 400-11.

7. Ponomarenko E.A., Ilgisonis E.V., Lisitsa A.B. Tehnologii de cunoaștere în proteomică // Chimie bioorganică. 2011. T. 37. Nr 2. P. 190-198.

8. Ponomarenko E.A. et al. Identificarea proteinelor exprimate diferențial folosind meta-analiză automată a publicațiilor proteomice // Chimie biomedicală. 2009. T. 3. Nr 1. P. 10-16.

9. Savelyeva M. și colab. Semnificația polimorfismului genetic al izoenzimelor citocromului P450 pentru selecția și regimurile de dozare personalizate ale antidepresivelor și antipsihoticelor // Medicină clinică. 2008. T. 86. Nr. 11. P. 22-28.

10. Un proiect de proteom uman centrat pe gene: HUPO~the Human Proteome organization. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2010. T. 9. Nr. 2. P. 4279.

11. Aebersold R., Mann M. Proteomică bazată pe spectrometrie de masă. //Natură. 2003. T. 422. Nr. 6928. P. 198-207.

12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Identificarea nerestricționată a proteinelor modificate folosind MS/MS // Proteomics. 2010. T. 10. Nr. 4. P. 671-686.

13. Akiyama M. h «p. Ihtioza buloasă a Siemens: diagnosticul corect facilitat de teste genetice moleculare. // Jurnalul britanic de dermatologie. 2005. T. 152. Nr. 6. C. 1353-6.

14. Alves G. h jxp. Calibrarea valorilor E pentru metodele de căutare în baza de date MS2. // Biologie directă. 2007. T. 2. Nr. 1. P. 26.

15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: server web de identificare a peptidelor bazat pe spectrometrie de masă cu integrare a cunoștințelor. // Genomica BMC. 2008. T. 9. P. 505.

16. Archakov A. h zip. Pescuit ireversibil biospecific cuplat cu microscopia cu forță atomică pentru detectarea proteinelor extrem de scăzute. // Proteomică. 2009. T. 9. Nr. 5. P. 1326-43.

17. Arhakov A. h ap. Vedere centrată pe gene asupra proiectului proteom uman: exemplul foii de parcurs rusești pentru cromozomul 18. // Proteomics. 2011. T. 11. Nr. 10. P. 1853-6.

18. Archakov A.I. h fermoar. Nanotehnologia de pescuit AFM este modalitatea de inversare a numărului Avogadro în proteomică. // Proteomică. 2007. T. 7. Nr 1. P. 4-9.

19. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Citocromul P-450 și oxigenul activ. Londra: Taylor & Francis, 1990.

20. Asara J.M. h ^p. O metodă de cuantificare fără etichetă prin MS/MS TIC în comparație cu SILAC și numărarea spectrală într-un ecran de proteomică. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr. 5. P. 994-9.

21. Bairoch A., Apweiler R. Baza de date de secvențe de proteine ​​SWISS-PROT și suplimentul său TrEMBL în 2000. // Cercetarea acizilor nucleici. 2000. T. 28. Nr. 1. P. 45-8.

22. Baldwin M. a. Identificarea proteinelor prin spectrometrie de masă: aspecte care trebuie luate în considerare. //Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2004. T. 3. Nr. 1. P. 1-9.

23. Bantscheff M. h ap. Proteomica chimică cantitativă dezvăluie mecanismele de acțiune ale inhibitorilor clinici ai kinazei ABL. // Biotehnologia naturii. 2007a. T. 25. Nr 9. P. 1035-44.

24. Bantscheff M. h,qp. Spectrometria cantitativă de masă în proteomică: o revizuire critică. //Chimie analitică și bioanalitică. 2007b. T. 389. Nr 4. P. 1017-31.

25. Barsnes H. h ap. PRIDE Converter: facilitează partajarea datelor proteomice. // Biotehnologia naturii. 2009. T. 27. Nr. 7. P. 598-9.

26. Baumgardner L.A. h Căutare rapidă paralelă în biblioteci spectrale de masă în tandem folosind accelerarea hardware GPU. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2011. T. 10. Nr. 6. P. 2882-8.

27. Beck F. h ap. Bunul, răul, urâtul: Validarea analizei spectrometrice de masă a peptidelor modificate // PROTEOMICS. 2011. C. n/a-n/a.

28. Bell A.W. h/jp. Microscopul proteic: încorporarea spectrometriei de masă în biologia celulară. //Metodele naturii. 2007. T. 4. Nr. 10. P. 783-4.

29. Binz P.-A. h ,qp. Un scaner molecular pentru automatizarea cercetării proteomice și pentru afișarea imaginilor proteomului // Chimie analitică. 1999. T. 71. Nr 21. Str. 49814988.

30. Binz P.-A. h pp. Scanerul molecular: concept și evoluții. // Opinie actuală în biotehnologie. 2004. T. 15. Nr. 1. p. 17-23.

31. Birney E. h ap. O privire de ansamblu asupra Ansembl. // Cercetarea genomului. 2004. T. 14. Nr. 5. P. 925-8.

32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Baze de date și instrumente pentru navigarea genomilor. // Revizuirea anuală a genomicii și a geneticii umane. 2002. T. 3. P. 293-310.

33. Bochet P. h flp. LC-MS fără fragmentare poate identifica sute de proteine ​​// PROTEOMICS. 2010. T. 11. Nr 1. C. n/a-n/a.

34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-database pentru „etichete de secvență exprimată”. //Genetica naturii. 1993. T. 4. Nr. 4. P. 332-3.

35. Borges C.R. hnp. Caracterizarea completă a proteinelor în populațiile umane. // Chimie clinică. 2010. T. 56. Nr 2. P. 202-11.

36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: prezice efectul polimorfismelor non-sinonime asupra funcției. //Cercetarea acizilor nucleici. 2007. T. 35. Nr. 11. P. 3823-35.

37. Brosch M. h np. Comparație între performanța Mascot și XITandem pentru spectrometria de masă cu precizie scăzută și ridicată și dezvoltarea unui prag Mascot ajustat. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2008. T. 7. Nr. 5. P. 962-70.

38. Bunger M.K. h ^p. Detectarea și validarea SNP-urilor de codare non-sinonime din analiza ortogonală a datelor de proteomică a puștilor. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2007. T. 6. Nr. 6. P. 2331-40.

39. Bunkenborg J. h jip. Screening pentru proteine ​​N-glicozilate prin spectrometrie de masă prin cromatografie lichidă. // Proteomică. 2004. T. 4. Nr. 2. P. 454-65.

40. Butenas S., Mann K.G., Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica distribuit exclusiv de Springer Science+Business Media LLC., 2002.

41. Canas B. h jyp. Tehnologii de spectrometrie de masă pentru proteomică. // Briefings în genomică funcțională și proteomică. 2006. T. 4. Nr. 4. P. 295-320.

42. Care M.A. h Predicție SNP dăunătoare: fiți atenți la datele dvs. de antrenament! // Bioinformatică (Oxford, Anglia). 2007. T. 23. Nr. 6. P. 664-72.

43. Casado-Vela J. h flp. Lumini și umbre ale tehnologiilor proteomice pentru studiul speciilor de proteine, inclusiv izoformele, variantele de îmbinare și modificările post-translaționale ale proteinelor. // Proteomică. 2011. T. 11. Nr. 4. p. 590-603.

44. Chapman P.F. hap. Gene, modele și boala Alzheimer // Trends in Genetics 2001. T. 17. Nr. 5. P. 254-261.

45. Chen M. h ap. Adnotare polimorfisme unice non-sinonime în proteomul ficatului uman prin spectrometrie de masă // litere de proteine ​​și peptide. 2010. T. 17. Nr. 3. p. 277-286.

46. ​​​​Chen R. h fermoar. Analiza glicoproteomică a țesutului hepatic uman prin combinație de digestie cu mai multe enzime și chimia hidrazidă. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2009. T. 8. Nr 2. P. 651-61.

47. Choudhary J.S. h Interogarea genomului uman folosind date neinterpretate de spectrometrie de masă. // Proteomică. 2001a. T. 1. Nr 5. P. 651-67.

48. Choudhary J.S. h "p. Potrivirea spectrelor de masă peptidice cu bazele de date EST și ADN genomic. // Tendințe în biotehnologie. 2001b. T. 19. Nr. 10 Suppl. C. S17-22.

49. Choudhury V. h ap. Două variante noi de antitrombină (L99V și Q118P) care modifică legarea heparinei // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. P. 268.

50. Colinge J., Bennett K.L. Introducere în proteomica computațională. // Biologie computațională PLoS. 2007. T. 3. Nr 7. C. el 14.

51. Cooksey A.M. hap. Identificarea biomarkerilor din sânge și a proceselor fiziologice care disting oamenii cu performanțe superioare în condiții de stres psihologic. //Plus unu. 2009. T. 4. Nr 12. P. e8371.

52. Cooper D. Baza de date privind mutațiile genelor umane // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. Nr.l.C. 285-287.

53. Côté R.G. h sus. Serviciul de căutare ontologie: mai multe date și instrumente mai bune pentru interogări controlate de vocabular. // Cercetarea acizilor nucleici. 2008. T. 36. Nr. Emisiune Web Server. C.W372-6.

54. Cottrell J.S. Identificarea proteinelor prin amprentarea masei peptidice. // Cercetare pe peptide. 1994. T. 7. Nr. 3. P. 115-24.

55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: potrivirea proteinelor cu spectre de masă în tandem. // Bioinformatică (Oxford, Anglia). 2004. T. 20. Nr. 9. P. 1466-7.

56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Sistem open source pentru analiza, validarea și stocarea datelor de identificare a proteinelor. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2004. T. 3. Nr. 6. P. 1234-42.

57. Creasy D.M., Cottrell J.S. Căutare tolerantă la erori a datelor de spectrometrie de masă în tandem neinterpretate // PROTEOMICS. 2002. T. 2. Nr. 10. P. 1426-1434.

58. Crockett D.K. hap. Proteom adnotat al unui limfom cu celule T umane. // Jurnal de tehnici biomoleculare: JBT. 2005. T. 16. Nr. 4. P. 341-6.

59. Dai D. h jvp. Identificarea variantelor CYP3A4 și caracterizarea abilităților lor de a metaboliza testosteronul și clorpirifosul // J. Pharmacol. Exp. Acolo. 2001. T. 299. Nr. 3. P. 825-831.

60. Delahunty C., Yates J.R. Identificarea proteinelor în amestecuri complexe folosind cromatografie lichidă și spectrometrie de masă. // Protocoale actuale în biologia celulară / comitet editorial, Juan S. Bonifacino. et al.. 2003. T. Capitolul 5. C. Unitatea 5.6.

61. Delahunty C.M., Iii J.R.Y. Tech Insight MudPIT: tehnologie multidimensională de identificare a proteinelor Tech Insight // Biotehnici. 2007. T. 43. Nr. 5.

62. Desiere F. h jjp. Proiectul PeptideAtlas. // Cercetarea acizilor nucleici. 2006. T. 34. Nr. Problema bazei de date. C. D655-8.

63. Deutsch E. mzML: un singur format de date unificator pentru ieșirea spectrometrului de masă. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr. 14. P. 2776-7.

64. Deutsch E.W. Proiectul PeptideAtlas. // Metode în biologie moleculară (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. p. 285-96.

65. Deutsch E.W. h ^p. Un tur ghidat al Conductei Trans-Proteomic. // Proteomică. 2010. T. 10. Nr. 6. C. 1150-9.

66. Deutsch E.W. h ^p. Atlasul de peptide plasmatice umane. // Proteomică. 2005. T. 5. Nr. 13. P. 3497-500.

67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: o resursă pentru selecția țintei pentru fluxurile de lucru de proteomică țintite emergente. // Rapoartele EMBO. 2008. T. 9. Nr. 5. P. 429-34.

68. Eckel-Passow J.E. hjsp. O perspectivă asupra datelor de spectrometrie de masă de înaltă rezoluție. // Biostatistică (Oxford, Anglia). 2009. T. 10. Nr. 3. P. 481-500.

69. ing. J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. O abordare pentru a corela datele spectrale de masă în tandem ale peptidelor cu secvențele de aminoacizi într-o bază de date de proteine ​​// Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1994. T. 5. Nr. 11. P. 976-989.

70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: A Protein Identification Algorithm with Accurate Assignment of Statistical Significance of the Results // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. Nr. 1. P. 32-36.

71. Falkner J. a h sus. Spectre de masă MALDI-TOF/TOF validate pentru standardele de proteine. // Jurnalul Societății Americane pentru Spectrometrie de Masă. 2007. T. 18. Nr. 5. P. 850-5.

72. Farrah T. h Un set de referință pentru proteomul plasmatic uman de mare încredere cu concentrații estimate în PeptideAtlas. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2011.

73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. Cum comparăm sute de genomi bacterieni? // Opinie actuală în microbiologie. 2006. T. 9. Nr. 5. P. 499-504.

74. Frazer K. a h ap. O hartă a haplotipului uman de a doua generație de peste 3,1 milioane de SNP. //Natură. 2007. T. 449. Nr. 7164. P. 851-61.

75. Fredman D. h ap. HGVbase: o resursă organizată care descrie variația ADN-ului uman și relațiile fenotipului. // Cercetarea acizilor nucleici. 2004. T. 32. Nr. Problema bazei de date. C.D516-9.

76. Eliberat G.L. h ^p. Captarea diferențială a proteinelor serice pentru profilarea expresiei și descoperirea biomarkerilor în probele de cancer de cap și gât pre și post-tratament. // Laringoscopul. 2008. T. 118. Nr. 1. P. 61-8.

77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. Nr 4. P. 314-317.

78. Galeva N. Direct Identification of Cytochrome P450 Isozymes by Matrix-asistit Laser Desorbtion/Ionization Time of Flight-Based Proteomic Approach // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. Nr. 4. P. 351-355.

79. Galeva N., Altermann M. Comparația electroforezei pe gel unidimensionale și bidimensionale ca instrument de separare pentru analiza proteomică a microzomilor ficatului de șobolan: citocromii P450 și alte proteine ​​​​membranare. // Proteomică. 2002. T. 2. Nr. 6. P. 713-22.

80. Gao M. h j\p. Epuizarea pe scară largă a proteinelor cu abundență mare și analiza proteinelor cu abundență medie și scăzută în proteomul hepatic uman prin cromatografie lichidă multidimensională. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr 5. Str. 93947.

81. Garcia-Blanco M. a, Baraniak A. P., Lasda E. L. Îmbinarea alternativă în boală și terapie. // Biotehnologia naturii. 2004. T. 22. Nr. 5. P. 535-46.

82. Gatlin C.L. hap. Identificarea automată a variațiilor secvenței de aminoacizi în proteine ​​prin spectrometrie de masă în tandem HPLC/Microspray // Chimie analitică. 2000. T. 72. Nr. 4. p. 757-763.

83. Gobom J. h £p. O metodă de calibrare care simplifică și îmbunătățește determinarea precisă a maselor moleculare de peptide prin MALDI-TOF MS // Chimie analitică. 2002. T. 74. Nr. 15. P. 3915-3923.

84. Griss J. h ap. Publicat și pierit? influența bazei de date de proteine ​​căutate asupra stocării pe termen lung a datelor proteomice. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2011. T. 10. Nr 9. C. Ml 11.008490.

85. Grone J. h ^p. Expresia diferențială a genelor care codifică proteine ​​de joncțiune strânsă în cancerul colorectal: dereglarea frecventă a claudinei-1, -8 și -12. // Jurnalul internațional de boli colorectale. 2007. T. 22. Nr. 6. P. 651-9.

86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Heritance in Man (OMIM), o bază de cunoștințe despre genele umane și tulburările genetice. // Cercetarea acizilor nucleici. 2005. T. 33. Nr. Problema bazei de date. C. D514-7.

87. Hamosh A. h ap. Moștenirea online mendeliană la om (OMIM). // Mutație umană. 2000. T. 15. Nr. 1. P. 57-61.

88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Spectrometrie de masă pentru proteomică // Opinia curentă în biologie chimică. 2008. T. 12. Nr 5. P. 483-490.

89. Hedden P. h ap. Biosinteza giberelinei în plante și ciuperci: un caz de evoluție convergentă? // Jurnalul de reglare a creșterii plantelor. 2001. T. 20. Nr. 4. P. 319-331.

90. Hopfgartner G. h Spectrometru de masă cu capcană liniară de ioni triplu cvadrupol pentru analiza moleculelor mici și macromoleculelor. // Jurnal de spectrometrie de masă: JMS. 2004. T. 39. Nr. 8. P. 845-55.

91. Huang Y. n flp. Caracterizarea statistică a stării de încărcare și a dependenței de reziduuri a modelelor de disociere a peptidelor CID cu energie scăzută. // Chimie analitică. 2005. T. 77. Nr. 18. P. 5800-13.

92. Hubbard T. Proiectul bazei de date a genomului Ensembl // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. Nr. 1. p. 38-41.

93. Hustert E. h £p. Determinanții genetici ai polimorfismului CYP3A5. // Farmacogenetică. 2001. T. 11. Nr 9. str. 773-9.

94. Ilina E.N. h ^p. Profilare bacteriană directă prin spectrometrie de masă cu desorbție-ionizare asistată de matrice cu timpul de zbor pentru identificarea Neisseria patogenă. // Jurnalul de diagnostic molecular: JMD. 2009. T. 11. Nr. 1. P. 7586.

95. Ingelman-Sundberg M. Enzimele citocromului P450 care metabolizează medicamentele umane: proprietăți și polimorfisme. // Arhivele de farmacologie a lui Naunyn-Schmiedeberg 2004. T. 369. Nr. 1. P. 89-104.

96. Consorțiul Internațional de Secvențiere a Genomului Uman. Finalizarea secvenței eucromatice a genomului uman. //Natură. 2004. T. 431. Nr. 7011. P. 931 -45.

97. Ishihama Y. h pp. Indicele de abundență a proteinelor modificat exponențial (emPAI) pentru estimarea cantității absolute de proteine ​​în proteomică prin numărul de peptide secvențiate per proteină. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2005. T. 4. Nr. 9. P. 1265-72.

98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov scoruri și toleranțe intrinseci de masă pentru amprentarea masei peptidice. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2010. T. 9. Nr 2. P. 737-42.

99. Jeffrey L. Cummings. Relații genotip-proteotip-fenotip în bolile neurodegenerative. : Springer, 2005.

100. Jenkins R.E. hap. Profilarea expresiei cantitative relative și absolute a citocromilor P450 folosind etichete de afinitate codificate cu izotopi. // Proteomică. 2006. T. 6. Nr. 6. P. 1934-47.

101. Jones P. h flp. PRIDE: un depozit public de identificări de proteine ​​și peptide pentru comunitatea proteomică. // Cercetarea acizilor nucleici. 2006. T. 34. Nr. Problema bazei de date. C. D659-63.

102. Jones P. h flp. PRIDE: noi evoluții și noi seturi de date. // Cercetarea acizilor nucleici. 2008. T. 36. Nr. Problema bazei de date. C. D878-83.

103. Kalmar L. h jip. Screeningul mutațiilor genei inhibitoare CI în rândul pacienților maghiari cu angioedem ereditar. // Mutație umană. 2003. T. 22. Nr. 6. P. 498.

104. Keller A. h ap. Model statistic empiric pentru a estima acuratețea identificărilor de peptide realizate prin MS/MS și căutare în baze de date // Chimie analitică. 2002. T. 74. Nr. 20. P. 5383-5392.

105. Kersey P.J. n jjp. International Protein Index: o bază de date integrată pentru experimente de proteomică. // Proteomică. 2004. T. 4. Nr. 7. P. 1985-8.

106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Probabilități spectrale și funcții de generare a spectrelor de masă în tandem: o lovitură împotriva bazelor de date cu momeală. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2008. T. 7. Nr. 8. P. 3354-63.

107. Klie S. h £p. Analizarea proiectelor de proteomică la scară largă cu indexare semantică latentă. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2008. T. 7. Nr 1. P. 182-91.

108. Kremer H. h sus. Ihtioza buloasă a Siemens este cauzată de mutații ale genei Keratinei 2e. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. Nr. 3. P. 286-289.

109. Kuehl P. h ap. Diversitatea secvenței în promotorii CYP3A și caracterizarea bazei genetice a exprimării polimorfe a CYP3A5. //Genetica naturii. 2001. T. 27. Nr. 4. p. 383-91.

110. Kuhn R.M. h sus. Baza de date UCSC Genome Browser: actualizare 2009. // Cercetarea acizilor nucleici. 2009. T. 37. Nr. Problema bazei de date. C. D755-61.

111. Kuster B. h flp. Spectrometria de masă permite identificarea directă a proteinelor din genomi mari. //Proteomica. 2001. T. 1. Nr 5. str. 641-50.

112. Lane C.S. hap. Proteomica comparativă a citocromului P450 în ficatul șoarecilor imunodeficienți utilizând marcarea cu 180 de izotopi stabili. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2007. T. 6. Nr. 6. P. 953-62.

113. Lane C.S. h ,qp. Identificarea enzimelor citocromului P450 în metastazele colorectale umane și în ficatul înconjurător: o abordare proteomică. // Jurnalul european de cancer (Oxford, Anglia: 1990). 2004. T. 40. Nr. 14. P. 2127-34.

114. Lane E.B., McLean W.H.I. Keratine și afecțiuni ale pielii. // Jurnalul de patologie. 2004. T. 204. Nr. 4. P. 355-66.

115. Levine a J. P53, Cellular Gatekeeper for Growth and Division. // Celulă. 1997. T. 88. Nr 3. P. 323-31.

116. Levy S. h AP- Secvența genomului diploid a unui om individual. // PLoS biologie. 2007. T. 5. Nr 10. P. e254.

117. Lewis D.F.V. 57 de soiuri: citocromii umani P450. // Farmacogenomică. 2004. T. 5. Nr. 3. P. 305-18.

118. Lim A. h ap. Caracterizarea variantelor de transtiretină în amiloidoza transtiretină familială prin cartografierea peptidelor spectrometrice de masă și analiza secvenței ADN // Chimie analitică. 2002. T. 74. Nr. 4. P. 741-751.

119. Lim H. Identificarea proteinelor 2D-gel: O comparație a cartografierii masei peptidei MALDI/TOF cu spectrometria de masă tandem p LC-ESI // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. Nr. 9. P. 957-970.

120. Lisitsa A.V. h "p. Aplicarea tăierii gelurilor unidimensionale cu spectrometrie de masă slice-by-slice ulterioară pentru profilarea proteomică a citocromilor P450 de ficat uman. // Jurnalul de cercetare a proteinelor. 2010. T. 9. Nr. 1. P. 95-103.

121. Liu T. h ap. Caracterizarea intervalului dinamic înalt a proteomului plasmatic al pacientului traumatizat. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2006. T. 5. Nr 10. P. 1899913.

122. Liu T. h/ip. Analiza N-glicoproteomelor plasmatice umane prin scăderea imunoafinității, chimia hidrazidei și spectrometria de masă // Journal of proteom research. 2005. T. 4. Nr. 6. p. 2070-2080.

123. Mallick P. h flp. Predicția computațională a peptidelor proteotipice pentru proteomica cantitativă. //Biotehnologia naturii. 2007. T. 25. Nr. 1. P. 125-31.

124. Mann M., Jensen O.N. Analiza proteomică a modificărilor post-translaționale. // Biotehnologia naturii. 2003. T. 21. Nr 3. P. 255-61.

125. Mann M., Wilm M. Identificarea tolerantă la erori a peptidelor din bazele de date de secvențe prin etichete de secvență de peptide // Chimie analitică. 1994. T. 66. Nr. 24. p. 4390-4399.

126. Marchetti A. h pp. Mutații frecvente în familia de gene a receptorilor de tirozin kinazei neurotrofice în carcinomul neuroendocrin cu celule mari al plămânului. // Mutație umană. 2008. T. 29. Nr. 5. P. 609-16.

127. Marichal P. h Contribuția mutațiilor în citocromul P450 14(alfa)-demetilaza (Ergllp, Cyp51p) la rezistența la azoli în Candida albicans // Microbiologie. 1999. T. 145. Nr. 10. P. 2701-2713.

128. Martens L. h jxp. PRIDE: baza de date de identificare proteomică. // Proteomică. 2005. T. 5. Nr. 13. p. 3537-45.

129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomics faceing the combinatorial problem. // Metode în biologie moleculară (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. p. 175-86.

130. McDonald W.H., Yates J.R. Proteomica puștilor: integrarea tehnologiilor pentru a răspunde întrebărilor biologice. // Opinie actuală în terapie moleculară. 2003. T. 5. Nr. 3. P. 302-9.

131. Menon R., Omenn G.S. Caracterizarea proteomică a noilor proteine ​​alternative alternative de îmbinare în cancerele de sân induse de receptorul 2/neu-indus de factorul de creștere epidermică uman. // Cercetarea cancerului. 2010. T. 70. Nr. 9. P. 3440-9.

132. Menschaert G. h £p. Peptidomica devenirea majorității: o revizuire a contribuțiilor din unghiul bioinformaticii. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2010. T. 9. Nr 5. P. 205161.

133. Millar D.S. h Trei mutații noi missense în gena antitrombinei III (AT3) care provoacă tromboză venoasă recurentă. // Genetica umană. 1994. T. 94. Nr. 5. P. 509-12.

134. Mironov A.A. Splicing alternativă frecventă a genelor umane // Cercetarea genomului. 1999. T. 9. Nr. 12. P. 1288-1293.

135. Modrek B. Detectarea la nivel de genom a splicing-ului alternativ în secvențe exprimate de gene umane // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. Nr. 13. P. 2850-2859.

136. Mueller M. h ap. Analiza detectării experimentale a genelor legate de sistemul nervos central în seturile de date ale creierului uman și ale lichidului cefalorahidian. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr. 6. P. 1138-48.

137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker's guide to expressed sequence tag analysis (EST) // Briefings in bioinformatics 2007. T. 8. Nr. 1. P. 621.

138. Nedelkov D. Population proteomics: Investigation of protein diversity in human populations // Proteomics. 2008. T. 8. Nr. 4. P. 779-86.

139. Nedelkov D. h ap. Analiză cuprinzătoare de mare capacitate a proteinelor plasmatice umane: un pas către proteomica populației. // Chimie analitică. 2004. T. 76. Nr. 6. P. 1733-7.

140. Nedelkov D. h ^p. Investigarea diversității proteinelor plasmatice umane. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. T. 102. Nr. 31. P. 10852-7.

141. Nesvizhskii A.I. Identificarea proteinelor prin spectrometrie de masă în tandem și căutarea în baza de date de secvențe. // Metode în biologie moleculară (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. p. 87-119.

142. Nesvizhskii A.I., Vitek O., Aebersold R. Analysis and validation of proteomic data generated by tandem mass spectrometrie // Nature Methods. 2007. T. 4. Nr. 10. P. 787-797.

143. Ng P.C. hflp. Variație genetică într-un exom uman individual // PLoS Genetics. 2008. T. 4. Nr. 8.

144. Ong S.-E., Mann M. Proteomica bazată pe spectrometrie de masă devine cantitativă. // Biologie chimică a naturii. 2005. T. 1. Nr 5. str. 252-62.

145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Optimizarea condițiilor de căutare pentru identificarea în masă a proteinelor pe bază de amprentă. // Proteomică. 2006. T. 6. Nr. 7. P. 2079-85.

146. Overbeek R. h, np. Adnotarea genomurilor bacteriene și arheale: îmbunătățirea acurateței și consecvenței. // Recenzii chimice. 2007. T. 107. Nr. 8. P. 3431-47.

147. Pedrioli P.G.A. Conducta trans-proteomică: o conductă pentru analiza proteomică. // Metode în biologie moleculară (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. p. 213-38.

148. Perkins D.N. h ^p. Identificarea proteinelor bazată pe probabilitate prin căutarea în baze de date de secvențe folosind date de spectrometrie de masă // Electroforeză. 1999. T. 20. Nr. 18. p. 3551-3567.

149. Perry D.J., Carrell R.W. Genetica moleculară a deficitului de antitrombină umană. // Mutație umană. 1996. T. 7. Nr. 1. P. 7-22.

150. Petrak J. h ap. Déjà vu în proteomică. O paradă de succes a proteinelor exprimate diferențiat identificate în mod repetat. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr. 9. P. 1744-9.

151. Pevzner P.A. şold. Eficiența căutării bazelor de date pentru identificarea proteinelor mutante și modificate prin spectrometrie de masă. // Cercetarea genomului. 2001. T. 11. Nr 2. P. 290-9.

152. Porter C.J., Talbot C.C., Cuticchia A.J. Baze de date centrale cu mutații - o revizuire. // Mutație umană. 2000. T. 15. Nr. 1. P. 36-44.

153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Este un proiect de proteom uman centrat pe gene cea mai bună modalitate prin care proteomica să servească biologiei? // Proteomică. 2010. p. 1-6.

154. Rapsilber J. h £p. Analiza proteomică la scară largă a spliceosomeului uman. // Cercetarea genomului. 2002. T. 12. Nr. 8. P. 1231-45.

155. Redlich G. h zip. Distincția dintre izoformele citocromului uman P450 (CYP) și identificarea de noi situsuri de fosforilare prin spectrometrie de masă. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2008. T. 7. Nr 11. P. 4678-88.

156. Reid G.E., McLuckey S.A. Caracterizarea proteinelor „de sus în jos” prin spectrometrie de masă în tandem. // Jurnal de spectrometrie de masă: JMS. 2002. T. 37. Nr. 7. P. 663-75.

157. Rodriguez C. h zip. Proteotiparea haptoglobinei umane prin profilare MALDI-TOF: distribuția fenotipului într-o populație de pacienți cu sindromul uleiului toxic. // Proteomică. 2006. T. 6. C. S272--81.

158. Roher A. h zip. Alterările structurale în scheletul peptidic al proteinei de bază beta-amiloid pot explica depunerea și stabilitatea acesteia în boala Alzheimer // J. Biol 1993. T. 268. Nr. 5. pp. 3072-3083.

159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simularea și predicția metabolismului medicamentului in vivo la populațiile umane din date in vitro. // Recenzii de natură. Descoperirea drogului. 2007. T. 6. Nr. 2. P. 140-8.

160. Roth M.J. h fermoar. „Proteotiparea”: proteomica populației de leucocite umane folosind spectrometria de masă de sus în jos. // Chimie analitică. 2008. T. 80. Nr. 8. P. 285766.

161. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14alfa -Demetilază (CYP51) și spermatogeneză // Drug Metab. Dispos. 1998. T. 26. Nr. 12. P. 1199-1201.

162. Rubina A.Y. h fermoar. De ce 3-D? Micromatrice pe bază de gel în proteomică. // Proteomică. 2008. T. 8. Nr. 4. pp. 817-31.

163. Sadygov R.G., Cociorva D., Iii J.R.Y. Căutarea la scară largă a bazelor de date folosind spectre de masă în tandem: Căutarea răspunsului în partea din spate a cărții // Nature Methods. 2004. T. 1. Nr 3. P. 195-202.

164. Sarkozy A. h zip. Mutațiile BRAF ale liniei germinale în sindroamele Noonan, LEOPARD și cardiofaciocutanate: diversitatea moleculară și spectrul fenotipic asociat. // Mutație umană. 2009. T. 30. Nr. 4. P. 695-702.

165. Sattelle D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Genomul insectelor: provocări și oportunități pentru neuroștiință. // Neuroștiința nevertebratelor: IN. 2007. T. 7. Nr. 3. P. 133-6.

166. Schandorff S. h, np. O bază de date prietenoasă cu spectrometria de masă pentru identificarea cSNP. //Metodele naturii. 2007. T. 4. Nr. 6. P. 465-6.

167. Schmuth M. h Ichthyosis update: to a function-driven model of pathogenesis of the disorders of cornification and the role of corneocyte proteins in these troubles. //Avansuri în dermatologie. 2007. T. 23. p. 231-56.

168. Schweigert F.J., Wirth K., Raila J. Caracterizarea microheterogeneității transtiretinei în plasmă și urină folosind imunotestul SELDI-TOF-MS. // Știința proteomelor. 2004. T. 2. Nr. 1. P. 5.

169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Îmbunătățirea sensibilității prin combinarea probabilistică a rezultatelor din mai multe metodologii de căutare MS/MS. // Jurnalul de cercetare a proteomelor. 2008. T. 7. Nr 1. P. 245-53.

170. Seo J., Lee K.-J. Modificări post-translaționale și funcțiile lor biologice: analiză proteomică și abordări sistematice. // Jurnal de biochimie și biologie moleculară. 2004. T. 37. Nr. 1. p. 35-44.

171. Sherry S.T. dbSNP: baza de date NCBI a variației genetice // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. Nr. 1. P. 308-311.

172. Şevcenko A. h j\p. Secvențierea spectrometrică de masă a proteinelor din geluri de poliacrilamidă colorate cu argint // Chimie analitică. 1996. T. 68. Nr. 5. P. 850858.

173. Shi W.-feng h up. Proteotiparea: O nouă abordare care studiază evoluția virusului gripal la nivel de proteine ​​// Virologica Sinica. 2008. T. 22. Nr. 5. P. 405-411.

174. Shteynberg D. h np. iProphet: Analiza integrativă pe mai multe niveluri a datelor proteomice de pușcă îmbunătățește ratele de identificare a peptidelor și proteinelor și estimările erorilor. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.

175. Smigielski E.M. dbSNP: o bază de date cu polimorfisme de un singur nucleotide // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. Nr. 1. P. 352-355.

176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. Legătura dintre splicing și cancer. // Jurnalul de știință celulară. 2006. T. 119. Nr Pt 13. P. 2635-41.

177. Stamm S. h zip. ASD: o resursă bioinformatică privind îmbinarea alternativă. // Cercetarea acizilor nucleici. 2006. T. 34. Nr. Problema bazei de date. C. D46-55.

178. Stein P.E., Carrell R.W. Ce ne spun serpinele disfuncționale despre mobilitatea moleculară și boală? // Nature Structural Biology. 1995. T. 2. Nr. 2. P. 96-113.

179. Supek F. n zip. Puterea analitică îmbunătățită a SDS-PAGE folosind algoritmi de învățare automată. //Proteomica. 2008. T. 8. Nr. 1. p. 28-31.

180. Taylor C.F. Cerințe minime de raportare pentru proteomică: un primer MIAPE. // Proteomică. 2006. T. 6 Suppl 2. p. 39-44.

181. Taylor C.F. h fermoar. Informațiile minime despre un experiment de proteomică (MIAPE). // Biotehnologia naturii. 2007. T. 25. Nr. 8. P. 887-93.

182. Thiede B. h zip. Amprentarea în masă a peptidelor. // Metode (San Diego, California). 2005. T. 35. Nr. 3. P. 237-47.

183. Tsvetkov P.O. h fermoar. Izomerizarea reziduului Asp7 are ca rezultat oligomerizarea indusă de zinc a peptidei beta(l-16) a bolii Alzheimer // Chembiochem: a European Journal of chemical biology 2008. T. 9. Nr. 10. P. 1564-7.

184. Uhlen M. h zip. Un atlas de proteine ​​umane pentru țesuturi normale și canceroase bazat pe proteomica anticorpilor. // Proteomică moleculară și celulară: MCP. 2005. T. 4. Nr. 12. P. 1920-32.

185. Ullrich A. h zip. PROTEIN KINAZE LEGATE DE CANCER // Aplicația de brevet SUA. 12/. 2007.

186. Venter J.C. h fermoar. Secvența genomului uman. // Știință (New York, N.Y.). 2001. T. 291. Nr. 5507. P. 1304-51.

187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Proteomics data repositories: Providing a safe haven for your data and acting as a trampoline for continue research // Journal of Proteomics. 2010. p. 1-11.

188. W Vogel K. h zip. Dezvoltarea testelor pentru descoperirea medicamentelor kinazei de unde au venit progresele? // 2007.

189. Westlind-Johnsson A. Analiza comparativă a expresiei CYP3A în ficatul uman sugerează doar un rol minor pentru CYP3A5 în metabolismul medicamentelor // Metabolismul și eliminarea medicamentelor. 2003. T. 31. Nr >6. p. 755-761.

190. Wheeler D.L. h fermoar. Resurse baze de date ale Centrului Național de Informare în Biotehnologie. //Cercetarea acizilor nucleici. 2007. T. 35. Nr. Problema bazei de date. C. D5-12.

191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications. //Recenzii ale naturii. Cancer. 2009. T. 9. Nr. 2. P. 95-107.

192. Wilkins M.R. şold. De la proteine ​​la proteomi: identificarea proteinelor la scară largă prin electroforeză bidimensională și analiza aminoacizilor // Bio/Tehnologie. 1996. T. 14. Nr. 1. P. 61-65.

193. Wu C.H. hap. Resursa universală de proteine ​​(UniProt): un univers în expansiune de informații despre proteine. // Cercetarea acizilor nucleici. 2006. T. 34. Nr. Problema bazei de date. C. D187-91.

194. Yates J R., ing. J. K., McCormack A. L. Mining Genomes: Corelating Tandem Mass Spectre of Modified and Nemodified Peptides to Sequences in Nucleotide Databases // Chimie analitică. 1995. T. 67. Nr. 18. P. 3202-3210.

195. Yip Y.L. h Adnotarea polimorfismelor unice de aminoacizi în baza de cunoștințe UniProt/Swiss-Prot. // Mutație umană. 2008. T. 29. Nr. 3. P. 3616.

196. Zanger U.M. hap. CYP2B6 polimorf: mecanisme moleculare și semnificație clinică emergentă. //Farmacogenomica. 2007. T. 8. Nr. 7. P. 743-59.

197. Zgoda V.G. h £p. Proteomica microzomilor hepatici de șoarece: performanța diferitelor fluxuri de lucru de separare a proteinelor pentru LC-MS/MS. // Proteomică. 2009. T. 9. Nr. 16. P. 4102-5.

198. Zhou H. h ap. Analiza cantitativă a proteomului prin etichetare izotopică în fază solidă și spectrometrie de masă. //Biotehnologia naturii. 2002. T. 20. Nr. 5. P. 512-5.

199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Captarea/transferul de electroni versus disocieri activate/induse prin coliziune: solo sau duet? // Jurnalul Societății Americane pentru Spectrometrie de Masă. 2008. T. 19. Nr. 6. P. 753-61.

Vă rugăm să rețineți că textele științifice prezentate mai sus sunt postate doar în scop informativ și au fost obținute prin recunoașterea textului disertației originale (OCR). Prin urmare, ele pot conține erori asociate cu algoritmii de recunoaștere imperfect. Nu există astfel de erori în fișierele PDF ale disertațiilor și rezumatelor pe care le livrăm.

Cartea este primul manual în limba rusă despre elementele de bază ale spectrometriei de masă a proteinelor și peptidelor. Scopul acestei publicații este de a interesa tinerii cercetători într-o disciplină informativă, frumoasă și solicitată în întreaga lume, pentru a oferi o oportunitate de a utiliza mai eficient spectrometria de masă pentru a rezolva probleme științifice fundamentale și aplicate. Cartea este scrisă într-un format de prelegere pentru începători, bine ilustrată și însoțită de o listă reprezentativă a literaturii citate.

Publicația este destinată studenților de licență și absolvenți ai specialităților chimie, fizico-chimice, biologice și medicale; va fi util cercetătorilor care lucrează deja în domeniul cercetării proteinelor și peptidelor sau interesați de acest domeniu științific.

		7
Abrevieri folosite		9
Introducere		11
Capitolul 1. Metode de ionizare a moleculelor de peptide și proteine		14
1.1. Bombardarea rapidă a atomilor (FAB)		14
1.2. Desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice, MALDI (Desorbție/ionizare cu laser asistată Martix, MALDI) 16
1.3. Ionizare prin electrospray (ESI)		19
Capitolul 2: Măsurarea greutății moleculare a peptidelor și proteinelor		25
Capitolul 3. Stabilirea structurii primare a peptidelor		34
3.1. degradare Edman		34
3.2. Identificarea peptidelor prin secvența ADNc		36
3.3. Secvențierea scării		37
Capitolul 4. Secvențierea spectrometrică de masă		39
4.1. Nomenclatura ionilor fragmentului peptidic		39
4.2. Spectre de masă cu ioni negativi		45
4.3. Metode de inițiere a fragmentării ionilor moleculari 46
4.3.1. Disocierea activată prin coliziune (CAD)		47
4.3.2. Disocierea indusă de suprafață (SID)		56
4.3.3. Disocierea prin captură de electroni, ECD		59
4.3.4. Disocierea prin transfer de electroni, ETD		64
4.3.5. Disocierea fotoactivarii		65
4.3.6. Disocierea activată de electroni		69
4.3.7. Disocierea ionilor negativi la extracția electronilor		70
4.4. Metode de secvențiere a peptidelor folosind dispozitive de desorbție/ionizare cu laser asistate de matrice		71
4.4.1. Metoda de extracție întârziată. Degradare în sursă, RVI (In Source Decay, ISD)		71
4.4.2. Degradare în afara sursei, PSD (Post Source Decay, PSD)		72
Capitolul 5. Identificarea proteinelor și peptidelor		7 6
5.1. Identificare folosind baze de date		76
5.1.1. Metoda de identificare a proteinelor de jos în sus		76
5.1.2. Metoda de identificare a proteinelor de sus în jos		91
5.2. Identificarea manuală a peptidelor		94
Capitolul 6. Principalele dificultăți ale secvențierii spectrometrice de masă a peptidelor și modalități de depășire a acestora		97
6.1. Acoperirea secvenței		98
6.2. Aminoacizi cu aceeași masă în număr întreg		102
6.2.1. Lizina si glutamina		102
6.2.2. Fenilalanina si metionina oxidata		104
6.3. Aminoacizi izomeri: leucină și izoleucină		106
6.4. Ciclizarea peptidelor scurte		108
6.5. Peptide care conțin o legătură disulfurică		116
Capitolul 7: Utilizarea ionilor spectronegativi de masă pentru secvențiere		121
Capitolul 8. Analiza cantitativă a proteinelor folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță-spectrometrie de masă. Proteomica cantitativă		126
8.1. Proteomica comparativă (cantitativă).		129
8.1.1. Metoda fără izotopi		129
8.1.2. Metode izotopice		132
8.2. Stabilirea cantităților absolute		145
Bibliografie		149
Aplicație. Bruker: O cale multidimensională pentru dezlegarea proteomei		163

Prefaţă

Dedicat
profesori ai Facultății de Chimie
Universitatea de Stat din Moscova poartă numele M.V. Lomonosov
Alexander Leonidovici Kurts
Kim Petrovici Butin

Cele mai importante realizări ale spectrometriei de masă din ultimii 20 de ani sunt asociate cu studiul compușilor naturali, inclusiv biopolimerii. Odată cu apariția ionizării prin electrospray și a tehnicilor de desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice, zaharurile, acizii nucleici, proteinele, lipidele și alte macromolecule bioorganice au devenit disponibile pentru spectrometria de masă. Desigur, cel mai mare succes a fost obținut în studiul proteinelor. Datorită sensibilității, conținutului informațional, expresivității și capacității de a lucra cu amestecuri, spectrometria de masă este astăzi principala metodă de analiză a acestor obiecte greu de studiat.

Poate că putem admite că spectrometria de masă modernă a câștigat competiția cu metoda clasică de stabilire a secvenței primare a aminoacizilor din peptide conform lui Edman, deoarece secvențierea spectrometrică de masă s-a dovedit a fi semnificativ mai rapidă, mai sensibilă, mai informativă și chiar mai ieftină. . Determinarea rapidă și fiabilă a structurii primare a proteinelor, adică secvența de unități de aminoacizi, în sine este un rezultat excelent. Cu toate acestea, spectrometria de masă este capabilă să studieze structuri de ordine mai complexe (de la 2 la 4), inclusiv interacțiunile necovalente ale proteinelor cu apariția formațiunilor supraproteice, stabilirea tipului și locației modificărilor post-translaționale, lucrând cu glicoproteine. , lipoproteine, fosfoproteine ​​etc. Spectrometria de masă a devenit indispensabilă în medicină deoarece poate diagnostica rapid și fiabil bolile cardiovasculare, genetice și oncologice. Succesele spectrometriei de masă au fost cele care au condus la formarea unei noi direcții științifice – proteomica – la sfârșitul secolului trecut. Rolul metodei în metabolomică este, de asemenea, enorm.

Din păcate, în literatura de limbă rusă nu au existat încă manuale sau monografii pe această temă cea mai importantă și cu mai multe fațete. Rusia este fundamental în urma țărilor dezvoltate atât în ​​studiul acestei discipline, cât și în utilizarea realizărilor sale. Spectrometriștii de masă care lucrează în Rusia trebuie să se bazeze pe ediții de cărți, articole originale și recenzii în limba engleză. În 2012, a fost publicată cartea „Principii de spectrometrie de masă aplicată la biomolecule” în limba rusă, editată de J. Laskin și X. Lifshitz (traducere din engleză, editura Technosphere), care este o colecție de articole ale experților de top în domeniul spectrometria de masă în câmp aplicată în biologie. Cartea este destinată cititorilor avansați. Ea oferă

o bună oportunitate, în multe privințe, de corespondență de a face cunoștință cu realizările moderne în domeniul spectrometriei de masă a biomoleculelor, deoarece majoritatea metodelor descrise în aceasta nu sunt încă utilizate în țara noastră.

Cartea „Fundamentals of mass spectrometria proteinelor și peptidelor” oferită cititorilor este primul manual în limba rusă care stabilește bazele spectrometriei de masă a proteinelor și peptidelor. Cartea este scrisă în format de prelegeri pentru începători, ilustrată cu un număr mare de desene, spectre, diagrame și este însoțită de o listă reprezentativă a literaturii citate. Este destinat studenților de licență și absolvenți ai specialităților chimice, fizico-chimice, biologice și medicale; va fi util cercetătorilor care lucrează deja în domeniul cercetării proteinelor și peptidelor sau interesați de acest domeniu științific.

Scopul publicării unei astfel de cărți este de a interesa tinerii cercetători într-o disciplină informativă, foarte frumoasă și solicitată în întreaga lume, pentru a oferi o oportunitate de a utiliza mai eficient spectrometria de masă pentru a-și rezolva propriile probleme științifice fundamentale și aplicate.

Manualul se concentrează pe metodele de ionizare a proteinelor și peptidelor și pe procesele de fragmentare a acestor compuși în faza gazoasă. Problemele spectrometriei de masă în tandem și metodele existente pentru inițierea fragmentării sunt discutate suficient de detaliat. Această secțiune este foarte importantă în spectrometria de masă modernă. Este util pentru cercetătorii care lucrează cu orice compuși chimici și biopolimeri. Mai multe capitole sunt dedicate identificării proteinelor și peptidelor. Aceasta include opțiuni pentru identificarea automată, interpretarea manuală a spectrelor și o descriere a anumitor dificultăți în secvențierea spectrometrică de masă și opțiuni pentru depășirea acestora. Sunt luate în considerare avantajele și dezavantajele a două abordări principale pentru determinarea structurii chimice a proteinelor: spectrometria de masă „de sus în jos” și „de jos în sus”. Un capitol separat este dedicat problemelor analizei cantitative.

Cartea este dedicată lui Alexander Leonidovich Kurtz și Kim Petrovici Butin, doi prieteni, profesori minunați ai Facultății de Chimie a Universității de Stat din Moscova, numită după M.V. Lomonosov, foarte apropiat de noi în termeni umani, direct implicat în educația noastră chimică și umanitară. Întotdeauna am apreciat foarte mult erudiția chimică și calitățile personale uimitoare ale acestor oameni de știință. Comunicarea cu acești oameni a fost cea care ne-a inspirat să începem cercetările în domeniul spectrometriei de masă cu peptide chiar la începutul secolului al XXI-lea.

LA. Lebedev
K.A. Artemenko
T.Yu. Samgina

Cele mai caracteristice proprietăți fizico-chimice ale proteinelor sunt: ​​vâscozitatea ridicată a soluțiilor, difuzia nesemnificativă, capacitatea de a se umfla în limite mari, activitatea optică, mobilitatea în câmp electric, presiunea osmotică scăzută și presiunea oncotică mare, capacitatea de a absorbi razele UV la 280 nm ( aceasta din urma proprietate, datorita prezentei aminoacizilor aromatici in proteine, este folosita pentru determinarea cantitativa a proteinelor).

Proteinele, ca și aminoacizii, sunt amfotere datorită prezenței grupărilor libere NH2 și COOH și sunt caracterizate în consecință prin toate proprietățile acizilor și bazelor.

Proteinele au proprietăți hidrofile pronunțate. Soluțiile lor au presiune osmotică foarte scăzută, vâscozitate ridicată și capacitate de difuzie scăzută. Proteinele sunt capabile să se umfle în limite foarte mari.

O serie de proprietăți caracteristice sunt asociate cu starea coloidală a proteinelor, în special fenomenul de împrăștiere a luminii, care stă la baza determinării cantitative a proteinelor prin nefelometrie. Acest efect este folosit și în metodele moderne de microscopie a obiectelor biologice. Moleculele de proteine ​​nu sunt capabile să treacă prin membrane artificiale semipermeabile (cellofan, pergament, colodion), precum și biomembranele țesuturilor vegetale și animale, deși cu leziuni organice, cum ar fi rinichii, capsula glomerulului renal (Shumlyansky-). Bowman) devin permeabile la albumina serică și apar în urină.

Denaturarea proteinelor sub influența diverșilor factori fizici și chimici face ca proteinele să se coaguleze și să precipite, pierzându-și proprietățile native. Astfel, denaturarea trebuie înțeleasă ca o încălcare a planului general - structura unică a moleculei de proteină nativă, ceea ce duce la pierderea proprietăților sale caracteristice (solubilitate, mobilitate electroforetică, activitate biologică etc.). Majoritatea proteinelor sunt denaturate atunci când sunt încălzite cu o soluție peste 50-60o C. Manifestările externe de denaturare se reduc la pierderea solubilității, mai ales la punctul izoelectric, la creșterea vâscozității soluțiilor proteice, la creșterea cantității de liber. SH-rpypp funcțional și o schimbare a naturii împrăștierii razelor X. Semnul cel mai caracteristic de denaturare este o scădere bruscă sau pierderea completă a activității biologice a unei proteine ​​(antigenic catalitic sau hormonal) În timpul denaturarii, în principal legăturile necovalente (în special, de hidrogen) și punțile disulfură sunt distruse și legăturile peptidice ale proteinei. coloana vertebrală a lanțului polipeptidic nu este afectată. În acest caz, globulele celor native desfășoară molecule de proteine ​​și se formează structuri aleatoare și dezordonate.

sărând afară: precipitare cu săruri ale metalelor alcaline, alcalino-pământoase (clorură de sodiu, sulfat de magneziu), sulfat de amoniu; structura primară a proteinei nu este perturbată;

depunere: folosirea substanțelor de îndepărtare a apei: alcool sau acetonă la temperaturi scăzute (aproximativ –20 С).

Atunci când se folosesc aceste metode, proteinele își pierd învelișul de hidratare și precipită în soluție.

Denaturarea- încălcarea structurii spațiale a proteinelor (structura primară a moleculei este păstrată). Poate fi reversibilă (structura proteinei este restabilită după îndepărtarea agentului de denaturare) sau ireversibilă (structura spațială a moleculei nu este restabilită, de exemplu, atunci când proteinele sunt precipitate cu acizi minerali concentrați, săruri ale metalelor grele).

Metode de separare a proteinelor Separarea proteinelor de impuritățile cu greutate moleculară mică

Dializă

Se folosește o membrană polimerică specială, care are pori de o anumită dimensiune. Moleculele mici (impurități cu greutate moleculară mică) trec prin porii din membrană, iar moleculele mari (proteinele) sunt reținute. Astfel, proteinele sunt spălate de impurități.

Separarea proteinelor după greutatea moleculară

Cromatografia pe gel

Coloana cromatografică este umplută cu granule de gel (Sephadex), care are pori de o anumită dimensiune. În coloană se adaugă un amestec de proteine. Proteinele a căror dimensiune este mai mică decât dimensiunea porilor Sephadex sunt reținute în coloană, deoarece sunt „blocate” în pori, în timp ce restul ies liber din coloană (Fig. 2.1). Mărimea unei proteine ​​depinde de greutatea sa moleculară.

Orez. 2.1. Separarea proteinelor prin filtrare pe gel

Ultracentrifugarea

Această metodă se bazează pe viteze diferite de sedimentare (precipitare) a moleculelor de proteine ​​în soluții cu gradienți de densitate diferită (tampon de zaharoză sau clorură de cesiu) (Fig. 2.2).

Orez. 2.2. Separarea proteinelor prin ultracentrifugare

Electroforeză

Această metodă se bazează pe rate diferite de migrare a proteinelor și peptidelor într-un câmp electric, în funcție de sarcină.

Gelurile, acetatul de celuloză și agar pot servi ca purtători pentru electroforeză. Moleculele separate se deplasează în gel în funcție de dimensiunea lor: cele care sunt mai mari vor fi întârziate pe măsură ce trec prin porii gelului. Moleculele mai mici vor întâlni mai puțină rezistență și, prin urmare, se vor mișca mai repede. Ca urmare, după electroforeză, moleculele mai mari vor fi mai aproape de început decât cele mai mici (Fig. 2.3).

Orez. 2.3. Separarea proteinelor prin electroforeză pe gel

Electroforeza poate fi folosită și pentru a separa proteinele după greutatea moleculară. Pentru aceasta folosesc Electroforeza PAGE în prezența dodecil sulfat de sodiu (SDS-Na).

Izolarea proteinelor individuale

Cromatografia de afinitate

Metoda se bazează pe capacitatea proteinelor de a se lega puternic de diferite molecule prin legături necovalente. Folosit pentru izolarea și purificarea enzimelor, imunoglobulinelor și proteinelor receptorilor.

Moleculele de substanțe (liganzi), la care anumite proteine ​​se leagă în mod specific, sunt combinate covalent cu particule dintr-o substanță inertă. Amestecul de proteine ​​este adăugat în coloană, iar proteina dorită este atașată ferm de ligand. Proteinele rămase părăsesc coloana liber. Proteina reținută poate fi apoi spălată din coloană folosind o soluție tampon care conține ligand liber. Această metodă extrem de sensibilă permite izolarea unor cantități foarte mici de proteine ​​în formă pură dintr-un extract celular care conține sute de alte proteine.

Focalizarea izoelectrică

Metoda se bazează pe diferite valori IET ale proteinelor. Proteinele sunt separate prin electroforeză pe o placă cu amfolină (aceasta este o substanță în care se formează un gradient de pH în intervalul de la 3 la 10). În timpul electroforezei, proteinele sunt separate în funcție de valoarea lor IET (în IET, sarcina proteinei va fi zero și nu se va mișca în câmpul electric).

Electroforeza 2D

Este o combinație de focalizare izoelectrică și electroforeză cu SDS-Na. Electroforeza se efectuează mai întâi în direcția orizontală pe o placă cu amfolină. Proteinele sunt separate în funcție de sarcină (IET). Apoi placa este tratată cu o soluție SDS-Na și se efectuează electroforeza în direcția verticală. Proteinele sunt separate în funcție de greutatea moleculară.

Imunoelectroforeză (Western blot)

O metodă analitică utilizată pentru a identifica proteine ​​specifice dintr-o probă (Figura 2.4).

Izolarea proteinelor din materialul biologic.

Separarea proteinelor în funcție de greutatea moleculară prin electroforeză în PAGE cu SDS-Na.

Transferul proteinelor din gel pe o placă de polimer pentru a facilita munca ulterioară.

Tratarea plăcii cu o soluție de proteină nespecifică pentru a umple porii rămași.

Astfel, după această etapă, se obține o placă, ai cărei pori conțin proteine ​​separate, iar spațiul dintre ele este umplut cu o proteină nespecifică. Acum trebuie să stabilim dacă printre proteine ​​există una pe care o căutăm și care este responsabilă pentru o boală. Tratamentul cu anticorpi este utilizat pentru depistare. Anticorpii primari sunt anticorpi la proteina de interes. Anticorpi secundari înseamnă anticorpi împotriva anticorpilor primari. O etichetă specială suplimentară (așa-numita sondă moleculară) este adăugată anticorpilor secundari, astfel încât rezultatele să poată fi apoi vizualizate. Un fosfat radioactiv sau o enzimă strâns legată de un anticorp secundar este utilizat ca etichetă. Legarea mai întâi de anticorpi primari și apoi de secundari are două scopuri: standardizarea metodei și îmbunătățirea rezultatelor.

Tratamentul cu o soluţie de anticorpi primari  legarea are loc în locul plăcii unde se află antigenul (proteina dorită).

Îndepărtarea anticorpilor nelegați (spălare).

Tratament cu o soluție de anticorpi secundari marcați pentru dezvoltarea ulterioară.

Îndepărtarea anticorpilor secundari nelegați (spălare).

Orez. 2.4. Imunoelectroforeză (Western blot)

Dacă proteina dorită este prezentă în materialul biologic, pe placă apare o bandă care indică legarea acestei proteine ​​de anticorpii corespunzători.